Biotechnologische Wertstoffe, d. h. biotechnologisch hergestellte Produkte, finden eine ausgedehnte industrielle Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und auch in der Lebensmittelindustrie.

Zu den biotechnologischen Wertstoffen zählen z. B. Enzyme, die in der Lebensmittelindustrie, z. B. zur Herstellung von Milchprodukten, Getränken und Backwaren, und auch in der Textilindustrie als Beizmittel und als Gerbereihilfsstoffe eingesetzt werden. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet von Enzymen sind die Wasch-, Waschhilfs-und Reinigungsmittel. Die Gewinnung von Enzymen erfolgt in der Regel über biotechnologische Verfahren. Ihre Isolierung aus den nach der Herstellung erhaltenen Enzymrohlösungen ist jedoch sehr auf-wendig, da sie meist eine große Anzahl von Begleitstoffen enthalten, die sich nur mühsam von den Enzymen abtrennen lassen.

In der europäischen Patentanmeldung 0 200 032 A2 wird ein Verfahren zur Abtrennung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus einer Zellsuspension offenbart, das sich durch Querstrom-Mikrofiltration unter Verwendung poröser polymerer Rohre mit Mikroporen zwischen 0,3 und 0,5 um und einer auf diesen liegenden trennaktiven Membran mit Mikroporen > 0,1 pm, die zu denen der porösen Rohe in einem Zahlenverhältnis zwischen 0,15 und 0,85 stehen, auszeichnet, über bzw. durch die die Fermenterlösung mit einer Geschwindigkeit > 2 m/s strömt und wobei ein Druckunterschied zwischen Konzentrat-und Permeatseite von weniger als 5 bar herrscht.

Weiteren Stand der Technik steilt das Europäische Patent EP 0 564 476 B1 dar, nach dem ein Verfahren zur Hersteliung eines Enzymgranulats beansprucht wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zunächst die unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe durch Mikrofiltration entfernt werden, die Fermentationsbrühe anschließend aufkonzentriert und schließlich mit einem bestimmten Zuschlagstoff vermischt wird.

Wegen der aufwendigen Herstellung und Isolierung von biotechnologischen Wertstoffen besteht ein ständiger Bedarf nach Verbesserung der Verfahren und Erhöhung der Ausbeute dieser Produkte.

Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von biotechnologischen Wertstoffen zur Verfügung zu stellen, worin die Wertstoffe mit hoher Ausbeute erhalten werden können.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine deutliche Verbesserung der Wertstoffausbeute erhalten werden kann, wenn man im Anschluss an die Kultivierung oder Fermentation die durch Separation der Kultur-, bzw. Fermenterbrühe abgetrennten Fest-stoffe, bzw. Feststoffkonzentrate mit dem Filtrat wäscht, welches aus der Aufkonzentrierung der separierten Flüssigkeit erhalten wird. Durch das Nachwaschen der abgetrennten Feststoffkonzentrate können darin wasserlösliche Wertstoffe, insbesondere extrazelluläre Wertstoffe herausgelöst und der Wertstofflösung zugeführt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur-und/oder Fermenterlösungen, welches das Trennen der Biomasse von einer wässerigen, den Wertstoff enthaltenden Lösung bzw. Dispersion und anschließendes Filtrieren und Aufkonzentrieren der Wertstoff-haltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Feststoffe oder Feststoffkonzentrate einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.

Ein Vorteil ist, dass die bei der Aufkonzentrierung anfallende Flüssigkeit nicht verworfen, sondern im Kreis geführt werden kann. Die anfallende Waschflüssigkeit kann, nachdem sie als Waschwasser für das abgetrennte Feststoffkonzentrat eingesetzt worden ist, dem Verfahren der Ultrafiltration wieder zugeführt und nach Aufkonzentrierung der Wertstofflösung erneut als Waschffüssigkeit gewonnen werden. Mit der Kreislaufffahrweise des Filtrates der Ultrafiltration ist auch eine mehrstufige Waschung der Biomasse realisierbar.

Als biologische Wertstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beliebige Produkte zu verstehen, die durch biotechnologische Prozessen hergestellt werden können und als Kultur-bzw. Fermenterlösungen anfallen, wobei die Wertstoffe aus diesen Lösungen durch Filtrationsverfahren gewonnen werden können. Beispiele sind biotechnologisch herstellbare pharmazeutische Wirkstoffe sowie Enzyme.

Als Enzyme kommen in erster Linie die aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, gewonnenen Proteasen, Lipasen, Amylase und/oder Cellulasen in Frage, wobei von Bacillus-Arten erzeugte und/oder abgeleitete Proteasen sowie ihre Gemische mit Amylase bevorzugt sind. Sie werden in an sich bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschriften DE 19 40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 und DE 21 21 397, den US-amerikanischen Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738 sowie der europäischen Patentanmeldung EP 006 638 beschrieben sind. Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der sehr aktiven Proteasen der sogenannten zweiten Generation verwendet werden, zu denen beispielsweise Savinase (R) und aus der internationalen Patentanmeldung WO 91/2792 bekannte Enzyme gehören.

Üblicherweise werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die als Wertstoffrohlösungen bei Fermentationsprozessen anfallenden Brühen extrazellulärer Wertstoffe eingesetzt.

In einer ersten Verfahrensstufe werden die unlöslichen Begleit-oder Feststoffe, einschließlich der Zeltrümmer und/oder der intakten Bakterien, im Folgenden auch Biomasse genannt, abgetrennt. Dazu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn man der Wertstoffrohlösung wasserlösliche Alkali-und/oder Erdalkalisalze zusetzt.

Beispiele für geeignete Salze sind die wasserlöslichen Na-, K-und Ca-Salze, vorzugsweise deren Halogenide. Diese Salze können insbesondere in einer Menge bis zu 1 Gew-%, vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.-%, bezogen auf die Wertstoffrohlösung, zugesetzt werden.

Anschließend erfolgt die Abtrennung der Biomasse mittels einer Zentrifuge, vorzugsweise über einen Tellerseparator.

Eine Verbesserung des Abtrennens der unlöslichen Biomasse kann dadurch erreicht werden, daß in einem nächsten Verfahrensschritt die in der Zentrifuge abgetrennte Flüssigkeit einer Mikrofiltration unterzogen wird. In einer möglichen Ausführungsform wird die Mikrofiltration als Sterilfiltration durchgeführt. Die Mikrofiltration wird bevorzugt als Querstrom-Mikrofiltration durchgeführt. Durch die Mikrofiltration wird gewährleistet, dass die Feststoffe und Mikro-organismen, d. h. die Biomasse, vollständig von der Wertstoffiösung abgetrennt werden.

Die anfallende Wertstofflösung enthält die hergestellten Wertstoffe in relativ niedrigen Konzentrationen. Das Aufkonzentrieren dieser Lösung kann durch Ultrafiltration und anschließendes Eindampfen der Lösung erreicht werden.

Wie bereits oben ausgeführt wurde, enthält die in den einzelnen Trennschritten abgetrennte Biomasse noch Restmengen an Wertstoffen. Erfindungsgemäß wird die Ausbeute an aktiven Wertstoffen dadurch erhöht, dass die Feststoffkonzentrate (Biomasse) einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.

Dieser Waschprozess hat den Vorteil, dass auch Restmengen an biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus der abgetrennten Biomasse isoliert werden können, wodurch die Ausbeute an gewonnenen Wertstoffen erhöht werden kann. Dadurch, dass als Waschflüssigkeit das bei der Ultrafiltration anfallende Filtrat eingesetzt wird, ist es nicht erforderlich, zusätzliche Waschflüssigkeit, z. B. Wasser, aus externen Quellen zuzufügen. Die Waschflüssigkeit wird zur Isolierung der ausgewaschenen Wertstoffe der in den Trennschritten erhaltenen Wertstofflösung zugeführt und einer Aufkonzentrierung unterworfen. Es erfolgt also eine Kreislaufffahrweise der Waschflüssigkeit, die nach Aufkonzentration als Filtrat aus der Ultrafiltration gewonnen und wieder eingesetzt wird.

Durch diese Kreislaufffahrweise können Ausbeuten an biotechnologisch hergestellten Wert-stoffen von über 90% erreicht werden.

Die Biomasse wird nach dem erfindungsgemäßen Waschschritt als wasserhaltiger Feststoff erhalten und kann in an sich bekannter Weise, üblicherweise nach einer Sterilisation, zu Düngemitteln verarbeitet werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Wertstoffkonzentrat kann der weiteren Verarbeitung zugefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie zu Granulaten verarbeitet, die sich gut in andere Produkte einarbeiten lassen.

Werden beispielsweise Enzyme durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen, so wird das erhaltene Enzymkonzentrat in einer bevorzugten Ausführungsform zu Enzymgranulaten weiterverarbeitet. Die erhaltenen Enzymkonzentrate können mit Zuschiagsstoffen vermischt und in an sich bekannter Weise, z. B. nach dem in dem europäischen Patent EP 0 564 476 B1 beschriebenen Verfahren, in Enzymgranulate überführt werden.

Beispiel Eine Fermentercharge, die Protease als Wertstoff enthielt, wurde mit einer 30 % igen CaClz-Lösung auf den pH-Wert von 7,5 eingestellt. Der so eingestellte Fermenterbrei wies einen Trockensubstanzgehalt von 16 % bei einer Proteaseaktivität von 33 000 PE/g auf, wie sie nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung"Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül-und Reini-gungsmitteln"in Tenside (1970), Bd. 7, S. 125-132, bestimmbar ist.

Bei einer Produkttemperatur von 20 °C wurden 6 m3 des eingestellten Fermenterbreies in einem Tellerseparator der Fa. Westfalia, Typ HFA 65, in eine Klarphase (4,5 m3) und eine die Biomasse enthaltende, schwere Phase (1,5 m3) aufgetrennt. Die Klarphase enthielt dabei den Wertstoff in gelöster Form. In einer nachgeschalteten Ultrafiltration wurde die Enzymlösung auf ein Volumen von ca. 6,5 % einkonzentriert. Das Filtrat der Ultrafiltration enthielt die ge-lösten Salze und an Enzymaktivität 600 PE/g Enzym. Mit diesem Filtrat wurde das Sediment der Separatorstufe aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Der Klarlauf wurde ebenfalls der Ultrafiltration zugeführt.

Die verbliebene Biomasse enthielt nur noch 5 % der anfangs enthaltenen Enzymmenge.

In diesem Beispiel wurde eine Ausbeute von 95 % Enzym erreicht.

Start : 6 m3 eingestellter Fermenterbrei mit 33.000 PE/g Ende : 0,39 m3 Konzentrat der Ultrafiltration mit 535.000 PE/g Ausbeute Enzym : 95 % Als Vergleich wurde Protease nach dem in der EP 0 564 476 beschriebenen Verfahren gewonnen. Die Ausbeute betrug 90 %, war also deutlich geringer als die, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht wurde.