PROCESO DE OBTENCIóNDE EXTRACTOS DE CACAO CONELEVADO CONTEMDODEPOLD7ENOLES

Sector de la técnica

La invención se refiere a extractos de cacao, más concretamente se refiere a un proceso de obtención de extractos de cacao con elevado contenido en polifenoles a partir de semillas de cacao sin fermentar.

Estado de Ia técnica

En los últimos años se ha desarrollado un creciente interés en productos alimentarios tales como el té verde, la manzana, las aceitunas, el vino y el cacao como fuente de polifenoles debido al carácter antioxidante de estos compuestos. La utilización del cacao y el chocolate en medicina y la idea de sus posibles beneficios para la salud viene de antiguo. Ya los indígenas del "nuevo mundo" dejaron evidencia de su utilización en su vida diaria, siendo Hernán Cortés el primero de los conquistadores españoles que mencionó los términos "cacao" y "chocolate". Sin embargo, fue el sueco naturalista Karl von Linné (conocido como Carolus Linnaeus) el que publicó un estudio taxonómico donde los ligaba con su genero y especie, Theobroma Cacao, que significa, "alimento de los dioses". En el pasado, el Theobroma Cacao se utilizó para curar enfermedades varias pero desapareció progresivamente hasta que estudios recientes han demostrado de forma inesperada que el cacao posee un gran potencial para "aumentar la salud" (T.L. Dillinger et al., "Food of the Gods: Cure for the Humanity? A cultural history of the medicinal and ritual use of chocolate", J.Nutr., 130, 2057S-2072S (2000)).

Hoy día existe bastante literatura patente y no patente que respalda los posibles beneficios de incluir cacao en la dieta debido a sus contenido de polifenoles, concretamente los fiavonoides y su clase específica los flavanoles, que proporcionan un efecto beneficioso en la circulación (L.I. Meneen et al., "Consumption of foods rich in flavonoids is related to a decreased cardiovascular risk in apparently healthy French women", J.Nutr. K3, 923-926 (2004)), para el corazón (M.G. Hertog et al., "Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary desease: the Zutphen Elderly Study", Lancet 342, 1007-1011 (1993)), contra el cáncer (M.G. Hertog et al., "Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart desease and cáncer in the seven countries study", Arch.

ínter. Med. 155, 381-386 (1995)), y contribuyen a Ia prevención de enfeπnedades neurodegenerativas y de la diabetes mellitus (A. Scalbert et al., "Dietary polyphenols and the prevention of deseases", Crit. Rev. Food ScL Nutr. 45, 287-306 (2005))

Durante siglos la utilización de los granos de cacao ha evolucionado a lo que hoy día llamamos chocolate (granos de caco procesado con distintos componentes adicionales como azúcares y leche entre otros). Se han hecho estudios de los componentes del chocolate por medio de cromatografía líquida y se ha visto que los compuestos monómericos purificados principales contenidos en el chocolate son los flavanoles catequina y epicatequina (J.F. Hammerstone et al., "Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cacao) and chocolate using hígh- performance liquid chromatography/mass spectrometry", J. Agrie. Food Chem., 47, 490-496 (1999)).

Se conocen varios procesos para obtener extractos de cacao. En la patente US 5,554,645, publicada el 10.09.1996, se describe la preparación de extractos de cacao de varios genotipos en la que los granos de cacao se secan por congelación, una vez congelados se despulpan y descascarillan y la masa resultante se desgrasa y extrae con un disolvente, tal como metanol, acetona acuosa, o acetato de etilo, de donde se obtiene el extracto de cacao. Se han ensayado los extractos de cacao de varios fenotipos así como fenoles sintéticos en composiciones antioxidantes, antitumorales y anticancerígenos. También se reivindica un kit que sirva para tratar tumores o cáncer.

En la patente US 6,015,913, publicada el 18.01.2000, las semillas de cacao se calientan a 100- HO ⁰ C por medio de rayos infrarrojos, sin que lleguen a tostarse, separándose la cascara. Las semillas descascarilladas se pasan por una prensa para desgrasarlas obteniéndose un sólido de cacao que contiene procianidinas.

En la patente US 6,312,753, publicada el 06.11.2001, semillas de cacao que tienen un factor de fermentación de 275 o menor, se separa la cascara con ayuda de rayos infrarrojos, se tuestan hasta una temperatura de 15O ⁰ C, moliéndose después para obtener un licor de cacao. Opcionalmente, de las semillas tostadas se obtiene un sólido parcialmente desgrasado que se utiliza como componente en la fabricación de barritas y otros productos alimenticios.

En la patente US 6,627,232, publicada el 30.09.2003, de los mismos autores de las dos anteriores, utilizan los procesos de cualquiera de los métodos descritos, con semillas fermentadas y sin fermentar, tostadas y sin tostar, alternativamente, para obtener sólidos de cacao. De dichos sólidos prueban distintos métodos y disolventes (el método preferido es el de contra corriente) para extraer la cafeína y la teobromina de los mismos.

Así, hay que tener en cuenta que el contenido de polifenoles en los granos de cacao depende en gran medida del origen de dichos granos, su tipo, la zona geográfica donde se han desarrollado, con qué tipo de agricultura han sido cuidados, como se han recolectado y como se han procesado (fermentación, secado, tostado, desgrasado, etc) las plantas y sus granos hasta obtener los productos finales que contienen los flavonoies (J. Wollgast, E. Anklam, "Review on polyphenols in Theobroma cacao: changes in composition during the manufacture of chocolate and methodology for identification and quantification", Food Research International, 33_, 423- 447 (2000)).

En la patente WO 2005/115160 Al, publicada el 08.12.2005, los autores de la presente invención describen un proceso por el que se obtiene un concentrado de polifenoles en cacao, que comprende las etapas de: a) someter las semillas de cacao sin fermentar a un escaldado en agua a una temperatura de 85-100 ⁰ C durante un tiempo de 3 a 15 minutos; b) secar las semillas a una temperatura no mayor de 85 ⁰ C obteniéndose unas semillas con una humedad de no más de 15%; c) moler las semillas obtenidas en la etapa anterior hasta que al menos un 99% del producto tenga un tamaño de partícula de 300 μm; d) someter las semillas molidas a una extracción; y e) concentrar dicho extracto de cacao con polifenoles; en cuyo proceso opcionalmente se puede incluir una etapa de desgrasado que se realiza antes de la etapa (d).

Además, en la solicitud de patente española P 200600462, los mismos autores describen un proceso para la obtención de polvo de cacao rico en polifenoles y de bajo contenido en materia grasa que se caracteriza porque consta de las siguientes etapas: 1) pelado; 2) despulpado; 3) escaldado; 4) secado; 5) desgrasado; 6) estabilizado; 7) molido; y 8) micronizado, por el que se obtiene un polvo de cacao que presenta un contenido de polifenoles superior al 18% en peso de materia seca, un contenido de materia grasa inferior a un 1% en peso, un contenido de agua de un 7% en peso y un tamaño de grano en un 99% inferior a 75 mieras.

Otro efecto de los polifenoles en los mamíferos es que la capacidad antioxidante del plasma se altera dependiendo de la cantidad de flavonoides que circulan en dicho plasma (J.P.E. Spencer et al., "Bioavailability of flavan-3-ols and procyanidins: gastrointestinal tract influences and their relevance to be active forms in vivo", Antioxid. Redox. Signal, 3, 1023-1039 (2000)). Es decir, el efecto causado por los polifenoles en el organismo depende de varios factores, siendo uno de los más importantes su biodisponibilidad. Esta característica está estrechamente relacionada con la estructura del compuesto. Así la importancia de los contenidos de catequina y epicatequina se basa en que al ser compuestos de estructura monomérica, estos se absorben con mayor facilidad en comparación a compuestos de mayor tamaño molecular, las moléculas de mayor tamaño necesitan ser hidrolizadas para facilitar su absorción. Por este motivo los monómeros presentan una mayor biodisponibilidad en el organismo.

Por todo lo expuesto sería muy beneficioso para la salud obtener unos productos a partir de granos de cacao, mejores que los que ya existen en el estado de la técnica, que tengan unas características especiales no solo de selección, crecimiento, recogida y almacenamiento, sino también que se obtengan mediante un proceso que cuide especialmente de que no se dañen ni se eliminen los polifenoles, es decir, los flavonoides presentes en dichos granos.

Así, el objetivo de la presente invención es obtener un producto de cacao que no solo tenga un alto contenido en polifenoles sino que esos polifenoles posean un alto contenido de los monómeros Flavan-3-ol (catequina y epicatequina), sus dímeros (procianidina Bl y procianidina B2) y el resto de procianidinas de mayor tamaño molecular (trímeros, tetrámeros y procianidinas poliméricas).

Para alcanzar este objetivo se ha empezado por la selección del producto de partida ya que éste tendrá una influencia significativa no solo en el contenido final y total de polifenoles sino en el contenido de monómeros y dímeros de los productos obtenidos.

También con objeto de obtener cacao con los más altos niveles de catequina, epicatequina y procianidinas Bl y B2 se ha llevado a cabo un proceso en el que las semillas de cacao no se fermentan, ya que en varios estudios que hemos llevado a cabo los resultados claramente indican que las semillas de cacao no fermentadas contienen unos niveles significativamente superiores que las fermentadas ya que durante la fermentación se puede degradar hasta un 70- 80% de los polifenoles (Véase por ejemplo [0008] de la patente US 2004/0096566 Al).

Además, el cacao obtenido es de bajo contenido en grasa ya que hoy día se sabe que una dieta baja en grasa es mucho más beneficiosa para la salud.

Descripción de las figuras

Figura 1: la prünera hoja representa el diagrama de flujo del proceso de obtención de extractos de cacao ricos en polifenoles desde la recogida de la mazorca de cacao hasta la torta/barquillo molida estabilizada.

La segunda hoja representa la continuación del diagrama de flujo del proceso de obtención de extractos de cacao ricos en polifenoles: desde la extracción de la torta/barquillo hasta la obtención de los extractos hidroalcohólico, semi-purifϊcado y purificado.

Descripción de la invención

El proceso correspondiente a esta invención para obtener extractos de cacao ricos en polifenoles, a partir de semillas de cacao sin fermentar, consta de las etapas siguientes:

a) Pelado del fruto (desengrullado) b) Despulpado de las semillas c) Escaldado de las semillas d) Secado de las semillas e) Desgrasado por prensado f) Estabilización del producto desgrasado g) Molienda h) Extracción sólido-líquido i) Separación sólido-líquido j) Concentración del extracto líquido k) Obtención del extracto hidroalcohólico obtenido por secado del concentrado obtenido en (j)

1) Extracción líquido-líquido del extracto concentrado en (j) y separación de las fases acuosa y orgánica m) Concentración de la fase acuosa obtenida en (1) n) Obtención del extracto semi-purificado por secado del concentrado obtenido en (m) o) Concentración de la fase orgánica obtenida en (1) p) Obtención del extracto purificado por secado del concentrado obtenido en (o)

A continuación se describen de forma detallada cada una de las fases del proceso de producción de los extractos de cacao.

a) Pelado del fruto o desengrullado

La mazorca de cacao es el fruto a partir del cual se obtiene la materia prima que se empleará para desarrollar todo el proceso de obtención de los extractos de cacao con elevado contenido en polifenoles.

Esta fase del proceso consiste en abrir la mazorca de cacao y extraer las semillas frescas de su vaina original, la cual se lleva a cabo de forma manual manteniendo las condiciones de higiene necesarias para evitar la en la medida de lo posible la contaminación de los granos de cacao. En esta etapa se obtienen las semillas frescas de cacao.

Con la finalidad de preservar los polifenoles presentes en las semillas frescas de cacao, así como la eliminación parcial de la pulpa que las recubre, las semillas frescas se pueden enfriar. El enfriamiento se lleva a cabo por inmersión de las semillas en agua, la cual debe estar a una temperatura no inferior a I ^o C ni superior a 25° C. Con este procedimiento se consigue un descenso de la temperatura interna del grano, reduciéndose el riesgo de fermentación de los granos de cacao durante su almacenamiento y evitándose el contacto de los granos de cacao con el oxígeno, lo que ralentiza las reacciones de pardeamiento enzimático. El grano de cacao puede permanecer en estas condiciones por un tiempo máximo de 24 horas.

b) Despulpado de las semillas

Esta fase del proceso tiene como objeto retirar total o parcialmente la pulpa que recubre las semillas frescas de cacao con el fin de optimizar el rendimiento de la etapa de secado y evitar el apelmazamiento de las semillas una vez secas. El despulpado se realiza por ejemplo con una despulpadora de acero inoxidable, de marca CI Talsa, modelo D500, adaptado para este tipo de procesado. Este tipo de máquinas despulpan de 500 a 700 Kg/h, y están provistas de una tolva de recepción donde se descarga el grano, el cual pasa por gravedad a un tamiz cilindrico de luz de malla comprendida entre 3 y 5 mm. Este tamiz tiene un eje concéntrico con unas palas de acabado de caucho que impulsan el grano hacia las paredes del tamiz. La pulpa pasa a través de la malla del tamiz y el grano limpio sale por la boca del cilindro.

c) Escaldado de las semillas

Esta fase del proceso consiste en realizar un escaldado de las semillas con agua a una temperatura interna de la semilla no inferior a 85 ⁰ C y no superior a los 100 ⁰ C durante un periodo de tiempo no inferior a 3 minutos y no superior a 15 minutos, preferentemente a una temperatura de 95 ⁰ C durante 5 minutos. Esta fase tiene como principales objetivos realizar una inactivación total o parcial de la actividad de la enzima Polifenoloxidasa presente en el grano de cacao, lo que ayuda a preservar el contenido inicial de polifenoles presentes en la semilla.

La Polifenoloxidasa es una enzima endógena del cacao, su característica estructural más importante es la presencia en su centro activo de dos átomos de cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas. Esta enzima posee dos actividades enzimáticas, una que hidroxila los monofenoles a difenoles (cresolasa) y otra que oxida los difenoles dando lugar a quinonas (catecolasa), las quinonas pueden convertirse en trifenoles y posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas, estos compuestos son muy reactivos por lo que pueden dar lugar reacciones de polimerización, dando lugar a las melaninas. Todo este conjunto de reacciones ocasiona la degradación y reducción de los compuestos fenólicos del cacao, por lo que la inactivación de la polifenoloxidasa ayuda a preservar el contenido de estos compuestos. Por tanto el objetivo de esta etapa es minimizar la reducción del contenido de polifenoles totales, así como de los monómeros catequina y epicatequina y de los dímeros procianidina BI y procianidina B2. Otro de los objetivos alcanzados en esta fase es la reducción de la posible carga microbiana del grano. ^{" " ~ "" ~ " ~} —

Para realizar esta etapa se utiliza por ejemplo un sistema de escaldado continuo. En este caso, el grano pasa directamente de la despulpadora a una malla cilindrica donde es trasportado longitudinalmente a través del cilindro por un tomillo sinfín, durante este proceso el grano es sumergido en agua hirviendo para conseguir una temperatura interna del grano de 95°C, con un tiempo de residencia de 5 minutos. El calentamiento del agua se realiza mediante una camisa de vapor y el tiempo de residencia del grano se controla variando la velocidad del tornillo sinfín. También se puede emplear un sistema de escaldado discontinuo, este sistema puede consistir en sumergir cantidades limitadas de grano de cacao en un depósito de acero inoxidable, equipado con unas resistencias que calientan el agua. Para sumergir el grano, se emplea un cilindro fabricado con una malla de acero inoxidable que permite la entrada de agua caliente e impide la salida del grano. Una vez que se completa el tiempo de residencia, se retira el cilindro con el grano.

d) Secado de las semillas

Esta fase del proceso tiene como finalidad reducir el contenido de humedad de la semilla no fermentada escaldada para minimizar la proliferación microbiana en la misma. La humedad de las semillas tras el secado debe estar comprendida entre el 1% y el 12% expresado en peso/peso. El secado se puede realizar a temperatura ambiente secando las semillas al sol o en secaderos a una temperatura no superior a 8O ⁰ C.

En esta etapa se obtiene una semilla de cacao seca, con un contenido de polifenoles totales usualmente mayor de 5%, llegándose a alcanzar valores de 15 % expresado en porcentaje de peso seco y medido según el método de Folin-Ciocalteu modificado, en el que se expresan los polifenoles como equivalentes de catequina (Singleton, V.; Rossi,J. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16, 144- 158, (1965);

El secado del grano se realiza por ejemplo en un secadero de etapas con sistema de aireación, en este secadero la humedad es retirada mediante un proceso que conlleva varias etapas de calentamiento, las cuales se pueden realizar en cámaras independientes. En cada cámara se aplican unos parámetros de calentamiento que varían la velocidad de secado de cada una de las etapas, optimizándose así el secado del grano y evitándose el cierre de los poros del mismo. Tras la última etapa de secado, se puede incluir una etapa de enfriamiento, donde se baja la temperatura de la semilla hasta alcanzar los 30 ⁰ C. El aire se calienta a la entrada del sistema y su temperatura se controla a través de todo el proceso mediante la disposición de sondas en cada una de las cámaras. A la salida del secadero, la humedad contenida en el aire es retirada mediante un proceso de condensación, de manera que éste puede ser recirculado. El secado también puede hacerse en un secadero discontinuo en plataformas de secado.

e) Desgrasado por prensado La fase de prensado tiene como objetivo retirar parcialmente la grasa presente en los granos de cacao no fermentados. Este proceso se realiza mediante extrusión de los granos de cacao. Para llevar a cabo esta fase del proceso se puede emplear una prensa de tornillo (screw), también llamada de expulsión (expeller) o extrusor (extruser). Este equipo consiste en un extractor mecánico continuo donde los granos son prensados y la manteca de cacao es extraída por presión.

Estos equipos están formados por una tolva donde se descargan los granos de cacao, pasando posteriormente a una artesa donde se caliéntala a una temperatura no inferior a 35 ⁰ C, este material es prensado por un tornillo helicoidal que gira dentro de un cilindro, de forma que la grasa es expedida y drenada. El producto obtenido en esta fase puede denominarse torta si

proviene de granos descascarillados o barquillo si proviene de granos con cascarilla. La temperatura de este producto a la salida de la prensa debe ser inferior a 8O ⁰ C. En esta fase del proceso se obtiene la torta de cacao no fermentado inactivado parcialmente desgrasada. El contenido de grasa de esta torta debe estar comprendido entre un 8% y un 30 % expresado en porcentaje de peso seco, por ejemplo un 12 %.

f) Estabilización del producto desgrasado

Esta fase del proceso tiene como objeto disminuir la temperatura de la torta (o barquillo) obtenida en la etapa anterior hasta una temperatura no superior a los 35 ⁰ C, para facilitar la posterior etapa de molienda. El proceso de estabilización se puede realizar con un enfriador, equipado en su interior con unas paletas que van agitando el producto. Este equipo puede estar dotado de una camisa por la que se hace circular agua fría para facilitar la reducción de la temperatura en el producto.

g) Molienda

Esta fase del proceso tiene como objeto reducir el tamaño de partícula de la torta o barquillo con el fin de mejorar la superficie de contacto en el momento de realizar la extracción. En esta etapa se obtiene un producto de cacao del cual al menos un 80%, preferiblemente al menos un 95%, y todavía más preferiblemente al menos un 99% de las partículas de cacao tienen un tamaño de partícula inferior a 0.5 mm.

El molido se puede realizar con un molino de martillos equipado con tamiz, o con cualquier otro sistema de molienda que permita llegar a alcanzar el tamaño de partícula deseado.

h) Extracción Sólido-Líquido Esta fase tiene como finalidad realizar una extracción selectiva de los polifenoles presentes en la torta o barquillo de cacao. La migración de los polifenoles de la torta o barquillo de cacao al solvente de extracción depende de un conjunto de factores como son la relación sólido-líquido, el tamaño de partícula del material a extraer, la mezcla extractiva, la temperatura de extracción y el tiempo de extracción. La relación sólido/líquido debe ser mayor de 1/3, por ejemplo 1/5. Esta extracción se realiza preferiblemente empleando torta o barquillo molido ya que la disminución del tamaño de partícula aumenta la superficie de contacto y facilita la extracción de los polifenoles. Esta etapa del proceso se realiza empleando una mezcla extractiva de carácter polar compuesta de etanol y

agua, pudiendo variar la proporción de estos disolventes un 30 % de etanol y 70% de agua (v/v), hasta un 100% de etanol, siendo la mezcla preferida de un 70% de etanol y un 30% de agua (v/v).

La temperatura de extracción puede variar desde los 4O ⁰ C hasta los 8O ⁰ C, por ejemplo 70 ⁰ C. El tiempo de extracción empleado suele ser mayor a 30 minutos, por ejemplo 1 hora y media.

Esta etapa se realiza preferiblemente en extractores de acero inoxidable provistos de camisas con agua caliente o vapor para mantener la temperatura deseada de extracción. Frecuentemente, la mezcla se agita con palas de acero inoxidable, las cuales son accionadas mediante motores provistos de dispositivos para variar la velocidad (mecánicos o eléctricos) con el fin de optimizar el proceso extractivo.

i) Separación Sólido - Líquido

Esta fase tiene como finalidad separar el sólido semi-agotado (fase sólida) y el extracto hidroalcohólico enriquecido en polifenoles (fase líquida). El sólido semi-agotado puede ser sometido a una nueva etapa de extracción o ser eliminado como residuo, esto se realiza en función del contenido de polifenoles remanente en el mismo. Usualmente se suelen realizar hasta dos etapas de extracción con la misma materia prima ya que por lo general en la tercera etapa de extracción se suelen obtener unos rendimientos másicos muy bajos. El rendimiento másico corresponde a la relación porcentual entre la cantidad de sólidos recuperados en el extracto hidroalcohólico y la cantidad de toita o barquillo iniciales.

El extracto hidroalcohólico obtenido en la primera etapa de extracción suele tener un residuo seco comprendido entre 5 y 100 g/L, por ejemplo 25 g/L. El residuo seco expresa el contenido de sólidos en el extracto. Este valor puede disminuir si se realiza un lavado durante la separación. En caso sucesivas extracciones, estas se realizan en las mismas condiciones descritas anteriormente. El extracto obtenido en la segunda etapa de extracción se puede combinar con el extracto obtenido en la primera etapa.

La separación puede realizarse utilizando varios equipos; por ejemplo empleando un decantador, un sistema de filtración a vacío con adición opcional de tierras de filtración, o a través de un filtro de placas.

j) Concentración del extracto líquido

Esta fase tiene como objetivo retirar el etanol y opcionalmente parte del agua del extracto hidroalcohólico. El proceso se realiza por ejemplo en concentradores de acero inoxidable que

pueden ser de una, dos y hasta tres etapas. La temperatura de concentración puede variar entre los 30 ⁰ C y los 70 ⁰ C en función de la presión de vacío alcanzada en el equipo. Los disolventes retirados del extracto pueden ser recuperados y separados en una torre de rectificación para ser reutilizados en futuros procesos de extracción. En esta etapa se elimina preferentemente de forma completa el etanol del extracto hidroalcohólico y de manera parcial el agua, de forma que el extracto queda en medio acuoso.

Este concentrado en medio acuoso, puede ser destinado para obtener tres productos finales. Puede ser secado directamente para obtener el extracto hidroalcohólico, o purificado con acetato de etilo con el fin de obtener el extracto purificado y el extracto semi-purificado.

k) Obtención del extracto hidroalcohólico obtenido por secado del concentrado obtenido en Q)

Esta fase tiene como objetivo reducir el contenido de humedad del extracto hasta que este posea las características de un polvo. Esta etapa se puede realizar empleando por ejemplo un spray-dryer, o un secadero con sistema alternativo de vacío. Preferentemente las temperaturas de secado no deben ser inferiores a 4O ⁰ C y no superiores a 100 ⁰ C.

Opcionalmente se pueden utilizar otros equipos con la finalidad de alcanzar el tamaño de partícula deseado en el producto final, como por ejemplo molinos. El extracto hidroalcohólico obtenido debe tener un contenido de humedad inferior a 10% expresado en peso/peso, preferentemente menor al 5 %, por ejemplo 3%.

El extracto hidroalcohólico debe tener un tamaño de partícula menor a 500 mieras, preferentemente menor a 200 mieras, por ejemplo menor a 50 mieras.

El contenido de polifenoles totales está comprendido entre el 35% y el 55% expresado en base seca, por ejemplo un 40%. El contenido de polifenoles totales se midió según el método de Folin-Ciocalteau.

Este extracto es significativamente diferente a otros extractos en cuanto a su contenido de Flavan-3-ol y procianidinas. Así, el extracto hidroalcohólico presenta niveles de catequina entre 10 y 70 mg/g; epicatequina entre 80 y 350 mg/g; procianidina Bl entre 1 y 10 mg/g; y procianidína B2 entre 30 y 125 mg/g. La determinación del contenido de flavonoles en cada uno de los extractos se ha llevado a cabo por cromatografía en columna utilizando un cromatógrafo Alginet 1100 con un relleno de columna de Cl 8 y eluyendo con Agua Acidificada y Acetonitrilo con un detector de UV Diodo Array a una longitud de onda a 200 nm. Los patrones fueron proporcionados por Sigma Aldrich (catequina y epicatequina), y Extrasynthese (Procianidinas Bl y B2).

Extracción líquido-líquido del extracto concentrado en (j) y separación de las fases acuosa y orgánica

Purificación del concentrado hidroalcohólico por extracción líquido-líquido. Esta fase tiene como finalidad obtener el extracto purificado y el extracto semi-purificado a partir del concentrado hidroalcohólico.

Para llevar a cabo la purificación se realiza una extracción líquido-líquido con acetato de etilo.

La purificación se produce por migración de una parte de los polifenoles del concentrado hidroalcohólico al acetato de etilo. Dado que el concentrado hidroalcohólico se encuentra en medio acuoso, al añadir el acetato de etilo, por diferencia de polaridad ambos forman dos fases no miscibles que corresponden a una fase acuosa (semi-purificado) y una fase orgánica de acetato de etilo (purificado).

El proceso de purificación se realiza en un sistema de contra-corriente a una temperatura preferiblemente mayor de 2O ⁰ C y menor de 7O ⁰ C; por ejemplo a 50 ⁰ C. Posterioπnente se separan las fases por diferencia de polaridad. Una vez separadas las fases, estas se concentran y se secan obteniéndose dos productos distintos. Estos son el extracto semi-purifícado obtenido de la fracción acuosa, y el extracto purificado obtenido de la fracción orgánica del acetato de etilo.

m) Concentración de la fase acuosa obtenida en (1) Esta fase tiene como objetivo retirar el agua del extracto semi-purificado. La concentración se puede realizar en concentradores de acero inoxidable que pueden ser de una, dos y hasta tres etapas. La temperatura de concentración puede variar entre los 3O ⁰ C y los 70 ⁰ C en función de la presión de vacío alcanzada por el sistema. El extracto puede tener una concentración de sólidos preferiblemente entre 15 % y 40 % peso/peso; por ejemplo 20% peso/peso.

n) Obtención del extracto semi-purificado por secado del concentrado obtenido en (m) La fase de secado tiene como objetivo reducir el contenido de humedad hasta que el extracto posea las características de un polvo. Esta etapa se puede realizar empleando por ejemplo un spray-dryer, o un secadero con sistema alternativo de vacío. Preferentemente las temperaturas de secado no deben ser inferiores a 4O ⁰ C ni superiores a 8O ⁰ C.

Opcionalmente se pueden utilizar otros equipos con la finalidad de alcanzar el tamaño de partícula deseado en el producto final, como por ejemplo molinos. El extracto semi-purificado debe tener un tamaño de partícula menor a 500 mieras, preferentemente menor a 200 mieras, por ejemplo menor a 50 mieras.

El extracto semi-purificado obtenido debe tener un contenido de humedad inferior a 10% expresado en peso/peso, preferentemente menor al 5 %, por ejemplo 3%. El contenido de polifenoles totales comprendido entre el 20% y el 45% expresado en base seca, por ejemplo un 35%. El contenido de polifenoles totales se midió según el método de Folin- Ciocalteau.

El extracto semi-purificado presenta niveles de catequina entre 10 y 50 mg/g; epicatequina entre

50 y 250 mg/g; procianidina Bl entre 1 y 8 mg/g; y procianidina B2 entre 25 y 90 mg/g.

El análisis del perfil de polifenoles se realiza con el mismo descrito para el extracto hidroalcohólico.

o) Concentración de la fase orgánica obtenida en (1)

Esta fase tiene como objetivo retirar el disolvente orgánico, en este caso el acetato de etilo, del extracto purificado. La concentración se puede realizar en concentradores de acero inoxidable que pueden ser de una, dos y hasta tres etapas. La temperatura de concentración puede variar entre los 3O ⁰ C y los 70 ⁰ C en función de la presión de vacío alcanzada por el sistema. El extracto puede tener una concentración de sólidos preferiblemente entre 15 % y 40 % peso/peso; por ejemplo 20% peso/peso.

p) Obtención del extracto purificado por secado del concentrado obtenido en (o) La fase de secado tiene como objetivo reducir el contenido de disolvente hasta que el extracto posea las características de un polvo. Esta etapa se puede realizar empleando por ejemplo un spray-ώyer, o un secadero con sistema alternativo de vacío. Preferentemente las temperaturas de secado no deben ser inferiores a 4O ⁰ C ni superiores a 8O ⁰ C.

Opcionalmente se pueden utilizar otros equipos con la finalidad de alcanzar el tamaño de partícula deseado en el producto final, como por ejemplo molinos. El extracto purificado debe tener un tamaño de partícula menor a 500 mieras, preferentemente menor a 200 mieras, por ejemplo menor a 50 mieras.

El extracto purificado obtenido debe tener un contenido de humedad inferior a 10% expresado en peso/peso, preferentemente menor al 5 %, por ejemplo 3%. El contenido de polifenoles totales comprendido entre el 60% y el 90% expresado en base seca, por ejemplo un 85%. El contenido de polifenoles totales se midió según el método de Folin-

Ciocalteau.

El extracto purificado presenta niveles de catequina entre 40 y 100 mg/g; epicatequina entre 200 y 500 mg/g; procianidina Bl entre 5 y 20 mg/g; y procianidina B2 entre 80 y 250 mg/g.

El análisis del perfil de polifenoles se realiza con el mismo descrito para el extracto hidroalcohólico y para el extracto semi-purificado. Fases opcionales

- Limpieza

La fase de limpieza es opcional, y tiene como objetivo eliminar restos de sustancias extrañas que acompañan a las semillas de cacao. Esta limpieza se puede realizar empleando un equipo Bulher, que consiste en un sistema de tamizado, con luz de malla comprendida entre 2 y 10 mm, y provista de un sistema opcional de aspiración de aire que permite la separación de sustancias extrañas.

- Descascarillado

La fase de descascarillado es opcional y tiene como objetivo retirar parcialmente la cascara que envuelve las semillas de cacao. Este proceso se lleva a cabo de forma mecánica. Las semillas de cacao no fermentadas secas pasan por un sistema automatizado donde son fragmentadas, la cascarilla desprendida es retirada por un proceso de aspiración, obteniéndose así los nibs de cacao (el término nib hace referencia a los fragmentos de cacao libres de cascarilla). Para llevar a cabo este proceso se pueden emplear equipos como los fabricados por Martin Lloverás, Bauermeister, Lehmann y otros, llegándose a alcanzar unos rendimientos del 2% en peso de cascara residual sobre nib.

En esta fase se obtienen nibs de cacao con un contenido de cascarilla residual que debe ser inferior al 7%, y preferiblemente menor al 2%.

Ejemplo 1. Ensayo de laboratorio: Comparación de los Extractos Hidroalcohólicos de polifenoles obtenidos empleando como materia prima torta de cacao con distinto contenido graso.

En este ensayo se realiza una comparación de los diferentes extractos de cacao que pueden ser obtenidos, según el proceso descrito en la invención, en función de la materia prima empleada en la extracción. Para ello se realizaron dos procesos de extracción con tres etapas de extracción consecutivas, empleando como materia prima torta de cacao con diferente contenido graso y diferente contenido de polifenoles.

Las condiciones de proceso para ambos extractos son similares variando únicamente la torta de cacao empleada para la extracción.

Descripción de las materias primas empleadas en los ensayos de extracción: En ambos casos la torta de cacao empleada proviene de la semilla de cacao procedente de Ecuador de variedad Amazónica, clon CCN51 no fermentada, escaldada, seca y descascarillada, siendo la única variación entre ambas las condiciones del proceso de prensado.

1. En el proceso de extracción 1 se empleó una torta de cacao con un contenido graso del 30% y un contenido de polifenoles del 10 % expresado en base seca con una humedad del 5.82 %.

2. En el proceso de extracción 2 se empleó una torta de cacao con un contenido graso del 12% y un contenido de polifenoles del 18 % expresado en base seca con una humedad del 6.77%.

Descripción de las condiciones del proceso:

Las condiciones de procesado se describen a continuación, siendo estas similares para los dos ensayos

• Extracción sólido-líquido 100 g de torta de cacao se someten a una extracción sólido-líquido con una mezcla de etanol:agua en proporción (70:30), empleando un matraz-reactor de vidrio de 2 litros equipado con sistema de refrigeración. La agitación se realiza de forma mecánica empleando para ello un motor Heidolph equipado con palas en forma de hélice. Las condiciones de extracción son 7O ⁰ C durante una hora y media con una relación sólido/líquido de 1/5.

• Separación sólido-líquido

El extracto se separa del sólido semi-agotado mediante un proceso de filtración a vacío empleando para ello un sistema de filtración de laboratorio con un filtro de 15-25 mieras marca ALBET n ⁰ 411. El sólido semi-agotado se lava varias veces con agua destilada y posteriormente se somete de nuevo a una segunda y tercera etapa de extracción sólido-líquido con el fin de estudiar los rendimientos másicos y la recuperación de polifenoles obtenidos en cada etapa.

• Concentración del extracto

El extracto obtenido se concentra a una temperatura de 55 ⁰ C y con una presión de vacío inferior a 150 mbar, empleando para ello un sistema de evaporación rotatorio de laboratorio marca Heidolph modelo V V2000.

• Secado del extracto

El extracto concentrado se seca a 70 ⁰ C en una estufa de laboratorio marca Gallenkarn Modelo 5

A-5799 OVL-570010J equipada con un sistema de vacío.

El contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos se cuantifica según el método de

Folin-Ciocalteu modificado, en el que se expresan los polifenoles como equivalentes de 0 catequina (Singleton, V.; RossLJ. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol Vitic. 16, 144-158, 1965)

En la tabla 1 se muestran los contenidos de polifenoles totales de los extractos hidroalcohólicos, los rendimientos de recuperación másica y los rendimientos de recuperación de polifenoles 5 obtenidos en los procesos de extracción, empleando torta de cacao con un 30 % y un 12% de materia grasa. Los rendimientos de la segunda y tercera etapa están referidos a los contenidos iniciales de la materia prima.

Tabla 1. Comparación de los contenidos de polifenoles, rendimiento másico y de recuperación 0 de polifenoles de los ensayos con diferente materia prima

(*) Rendimientos referidos a la materia prima inicial

Ejemplo 2. Ensayo de laboratorio: Comparación de los Extractos Hidroalcohólicos de polifenoles obtenidos variando la concentración de etanol en la mezcla extractiva.

En este ensayo se realiza una comparación de los diferentes extractos de cacao que pueden ser obtenidos en función de la concentración de etanol de la mezcla extractiva. Se realizan tres procesos de extracción a nivel de laboratorio a tres concentraciones de etanol distintas. Las concentraciones empleadas son 50 %, 70 % y 90 % (v/v).

Las condiciones de proceso son similares en los tres ensayos, únicamente se varía la concentración de etanol. La materia prima empleada es la torta de cacao procedente del procesado de la semilla de cacao de variedad Amazónica, clon CCN 51 no fermentada, escaldada, seca y descascarillada. La torta tiene un contenido graso del 12 % y un contenido de polifenoles del 18 % expresado en base seca. La humedad de esta torta es del 6.77 %.

Descripción de las condiciones del proceso de obtención de los extractos hidroalcohólicos:

• Extracción Sólido-Líquido

100 g de torta de cacao se someten a una extracción sólido-líquido en una única etapa de extracción. La extracción se realiza en un matraz-reactor de vidrio de 2 litros equipado con sistema de refrigeración. La agitación se realiza de forma mecánica empleando para ello un motor Heidolph equipado con palas en forma de hélice. Las condiciones de extracción son 7O ⁰ C durante una hora y media con una relación sólido/líquido de 1/5.

Las mezclas de extracción empleadas en cada uno de los procesos son:

Proceso 1: etanohagua (50:50) Proceso 2: etanol:agua (70:30)

Proceso 3: etanol:agua (90:10)

• Separación sólido-líquido

El extracto se separa del sólido semi-agotado mediante un proceso de filtración a vacío empleando para ello un sistema de filtración de laboratorio con un filtro de 15-25 mieras marca ALBET nMI l. El residuo sólido obtenido tras la filtración se elimina.

• Concentración del extracto

El extracto obtenido se concentra a una temperatura de 55 ⁰ C y con una presión de vacío inferior a 150 mbar, empleando para ello un sistema de evaporación rotatorio de laboratorio marca Heidolph modelo V V2000.

• Secado del extracto

El extracto concentrado se seca a 70 ⁰ C en una estufa de laboratorio marca Gallenkam Modelo 5 A-5799 OVL-570010J equipada con un sistema de vacío.

El contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos se cuantifϊca según el método de Folin-Ciocalteu modificado, en el que se expresan los polifenoles como equivalentes de catequina (Singleton, V.; Rossi,J. Colorímetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16,, 144-158, 1965)

En la tabla 2 se muestran los contenidos de polifenoles, los rendimientos másicos y de recuperación de polifenoles obtenidos a distintas concentraciones de etanol.

Tabla 2. Resultados de los ensayos de extracción empleando distintas concentraciones de Etanol

Los resultados muestran que un incremento de la concentración de etanol favorece la concentración de polifenoles totales obtenida en el extracto. Consecuentemente al aumentar la concentración de polifenoles en el extracto, disminuye el rendimiento másico y la recuperación de polifenoles.

La gráfica 1 muestra el aumento de la concentración de polifenoles en función de la concentración de etanol de la mezcla extractiva.

Gráfica 1. % Polifenoles en el extracto en función de la concentración de etanol

Extracción de Polifenoles con Etanol:Agua

40 50 60 70 80 90 100 % Banol y = 0,0823x + 44,583 R ² = 0,9802

En la gráfica 2 se muestra como un incremento de la concentración de etanol disminuye los rendimientos másicos de extracción

Gráfica 2. % Rendimiento másico en función de la concentración de Etanol

Rendimientos másicos de extracción

En la gráfica 3 se muestra como disminuye la recuperación de polifenoles al aumentar la concentración de etanol

Gráfica 3. % Rendimiento de recuperación de polifenoles en el extracto en función de la concentración de Etanol

% Recuperación de polifenoles en el extracto

Ejemplo 3. Ensayo de laboratorio: Obtención del Extracto Purificado

Este ensayo se realiza empleando corno materia prima torta de cacao procedente del procesado de la semilla de cacao de variedad Amazónica, clon CCN 51 no fermentada, escaldada, seca y descascarillada. La torta tiene un contenido graso del 12 % y un contenido de polifenoles del 18 % expresado en base seca. La humedad de esta torta es del 6.77 %.

Descripción de las condiciones del proceso de obtención del extracto purificado:

• Extracción Sólido-Líquido

100 g de torta de cacao se someten a una extracción sólido-líquido en una única etapa de extracción. La extracción se realiza en un matraz-reactor de vidrio de 2 Litros equipado con sistema de refrigeración. La agitación se realiza de forma mecánica empleando para ello un motor Heidolph equipado con palas en forma de hélice. Las condiciones de extracción son 7O ⁰ C durante una hora y media con una relación sólido/líquido de 1/5.

Separación sólido-líquido

El extracto se separa del sólido serni-agotado mediante un proceso de filtración a vacío empleando para ello un sistema de filtración de laboratorio con un filtro de 15-25 mieras marca ALBET n ⁰ 411.

El residuo sólido obtenido tras la separación se elimina.

• Concentración del extracto hidroalcohólico

El extracto obtenido se concentra hasta la completa eliminación del etanol, a una temperatura de 55 ⁰ C y con una presión de vacío inferior a 150 mbar, empleando para ello un sistema de evaporación rotatorio de laboratorio.

• Extracción líquido-líquido

En esta etapa el extracto concentrado y se somete a un proceso de purificación mediante una extracción líquido-líquido con acetato de etilo. Para ello se toma el extracto concentrado y se diluye dos veces con agua, seguidamente se le añade un volumen proporcional de acetato de etilo y la mezcla se agita vigorosamente a una temperatura de 50 ⁰ C durante 30 minutos en un matraz reactor de vidrio de dos litros. La agitación se realiza de forma mecánica, empleando para ello un motor de agitación Heidolph. Posteriormente, la mezcla se separa en un embudo de decantación y se recupera la fracción correspondiente al acetato de etilo.

• Concentración del extracto purificado

El extracto obtenido se concentra hasta la completa eliminación del etanol, a una temperatura de 40 ⁰ C y con una presión de vacío inferior a 150 mbar, empleando para ello un sistema de evaporación rotatorio de laboratorio marca Heidolph modelo V V2000.

• Secado del extracto purificado

El extracto concentrado se seca en una estufa de aireación con sistema de ventilación exterior hasta una humedad del 5.4 %.

Tras esta etapa se obtuvieron 2.43 g de extracto purificado con un contenido de polifenoles totales del 87 %.

El contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos se cuantifica según el método de

Folin-Ciocalteu modificado, en el que se expresan los polifenoles como equivalentes de catequina (Singleton, V.; Rossi,J. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16, 144-158, 1965)

En la tabla 3 se muestran los contenidos de polifenoles totales, el rendimiento de recuperación másica y el rendimiento de recuperación de polifenoles obtenido en este ensayo.

Tabla 3. Porcentaje de polifenoles y rendimientos del ensayo de obtención del extracto purificado

Ejemplo 4. Ensayo industrial: Obtención de los extractos de cacao ricos en polifenoles a nivel industrial

Para llevar a cabo el proceso se utilizó un genotipo de cacao, el clon CCN51 de la variedad

Amazónica, procedente de la región de Quevedo en Ecuador.

EL proceso se realiza con 10.000 Kg de semillas frescas de cacao en baba, los contenidos de la semilla en base húmeda son aproximadamente un 65 % de humedad donde se comprende la humedad correspondiente a la pulpa, un 17% de grasa, un 4% de cascarilla, un 3,5% de polifenoles totales. Estas semillas se sometieron a un tratamiento de despulpado empleando para ello una despulpadora de acero inoxidable marca CI Talsa modelo D500 adaptada para este tipo de procesado. El grano se descarga en la tolva y por gravedad pasa a un tamiz cilindrico, este tamiz tiene una luz de malla comprendida entre 3 y 5 mm, en su interior unas palas impulsan el grano hacia las paredes del tamiz, consiguiéndose así la separación del 90 % de la pulpa presente en el grano y obteniéndose 7.210 Kg de grano despulpado con un contenido residual de pulpa del 3 %, un 47 % de humedad, un 23,5 % de grasa y un 5,5 % de cascarilla, un 4,8 % de polifenoles totales. Una vez eliminada la mayor parte de la pulpa del grano, este es sometido a un tratamiento de escaldado, para ello el grano pasa directamente de la despulpadora a una malla cilindrica donde es trasportado longitudinalmente a través del cilindro por un tomillo sinfín, durante este proceso

el grano es sumergido en agua hirviendo para conseguir una temperatura interna del grano de 95 ⁰ C, con un tiempo de residencia de 5 minutos. El calentamiento del agua se realiza mediante una camisa de vapor y el tiempo de residencia del grano se controla variando la velocidad del tornillo sinfín. El grano obtenido en la etapa de escaldado, con una humedad próxima al 50 %, se seca a 70 ⁰ C hasta reducir su humedad al 6 % aproximadamente, para ello se utiliza un secadero de etapas con sistema de aireación diseñado especialmente para este proceso. En este secadero el grano de cacao es sometido a unas condiciones de secado diferentes en cada una de las etapas variándose la velocidad de secado en cada una de ellas. Tras este proceso se obtienen 3.805 Kg de grano seco con una humedad residual del 6 %, un 44 % de grasa, un 10,5 % de cascarilla y un 9,1% de polifenoles totales, todos los contenidos expresados en base húmeda.

El grano seco es sometido a un tratamiento de limpieza en el que se eliminan los restos de partículas extrañas como cuerdas, piedras etc, esta limpieza se realiza en una limpiadora marca Buhler. Una vez limpio, el grano pasa a una etapa de fragmentado y descascarillado, en la que los granos se fragmentan, obteniéndose una granula que se clasifica por tamaño. La cascarilla es retirada por aspiración, retirándose al menos un 90 % de la cascarilla presente en el grano. Este proceso se lleva a cabo en una descascarilladora del tipo DK 100 Martin Lloverás, y de el se obtienen 3.475 Kg de nibs de cacao descascarillados con un contenido de cascarilla residual del 2 %, un 6,5 % de humedad, un 48 % de grasa y un 10 % de polifenoles totales. Los granos obtenidos en esta etapa son sometidos a un proceso de desgrasado por prensado en expeller, este proceso se realiza mediante extrusión de los nibs de cacao, consiguiéndose así retirar parte de la fracción grasa. Para realizar el prensado se empleó una prensa en continuo KP Harburguer Einsem Bronzewerke. De este proceso se obtienen 1.910 Kg de torta de cacao con un contenido graso del 9 %, un 18 % de polifenoles expresados en base húmeda, siendo la humedad de la torta del 10 %.

La torta obtenida en esta etapa sale a una temperatura> 35 ⁰ C y para realizar su molienda es necesario someterla a un proceso de enfriamiento y estabilización. Esto se lleva a cabo empleando un enfriador rotatorio de paletas. La temperatura de la torta a la salida del enfriador es aproximadamente de 15 ⁰ C. Una vez estabilizada, la torta se somete a un proceso de molienda, el cual se realiza en un molino de martillos dotado de un tamiz (MS-33-M1) Gruber Hnos. S.A. obteniéndose 1.890 Kg de torta molida con un tamaño de partícula menor de 500 mieras en un 99 % de la torta y una humedad del 10 %.

Para poder obtener los extractos con elevado contenido en polifenoles, 1.850 Kg de esta torta en peso seco son sometidos a un proceso de extracción sólido-liquido. La extracción se realiza con una mezcla de Etanol: Agua (70:30) a 70 ⁰ C en agitación constante durante una hora y media. Trascurrido este tiempo el extracto es separado del sólido agotado mediante un proceso de filtración a vacío. El extracto obtenido se concentra a 55 ⁰ C en un concentrador con una presión de vacío de 150 mbar, hasta eliminar la totalidad del etanol, obteniéndose así un Concentrado Hidroalcohólico con un rendimiento másico del 23 % y un 64 % de recuperación de polifenoles. La mitad de este extracto concentrado se seca en un sistema de spray-ώγing a 70 ⁰ C hasta reducir la humedad al 10 % aproximadamente. En esta etapa se obtienen 190 Kg de Extracto Hidroalcohólico, con un contenido de polifenoles totales del 50 % expresado en base seca, con un rendimiento másico del 11% y un rendimiento de recuperación de polifenoles del 32 % con respecto a la torta.

El resto de extracto concentrado se somete a una extracción líquido-líquido en un extractor a 50 ⁰ C. De esta etapa se obtienen dos fases una acuosa y otra de acetato de etilo. La fase acuosa se concentra en un concentrador a 55 ⁰ C y se seca con un sistema de spray-ώγing a una temperatura de 70 ⁰ C, obteniéndose 142 Kg de Extracto Semi-Purificado con un contenido de polifenoles del 40% expresados en base seca, en esta etapa se obtiene un rendimiento másico del 9 % y un rendimiento de recuperación de polifenoles del 20 % con respecto a la torta inicial. La fase de acetato de etilo se concentra a una temperatura de 40 ⁰ C y se seca en un sistema de spray-ώying obteniéndose 38 Kg de Extracto Purificado con un contenido de polifenoles del 85 % expresados en base seca, en esta etapa se obtiene un rendimiento másico del 2.5 % y un rendimiento de recuperación de polifenoles del 11.9 % con respecto a la torta inicial.