LA OSTEOPOROSIS

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere a un método para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis para el tratamiento de aquellos individuos seleccionados a través de dicho método. Dicho cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento se realiza cuantificando una serie de marcadores: marcadores péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido YY, amilina, dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4), 25-OH vitamina D, calcio, fósforo, magnesio, hormona paratiroidea (PTH), osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, y telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross-laps).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El gran avance producido en los últimos años en torno a la acción que determinados péptidos intestinales desempeñan en relación al metabolismo de la glucosa y su aplicación en el tratamiento de la diabetes mellitus, ha abierto nuevas vías de investigación sobre la acción de estas sustancias en otras áreas, habiéndose mostrado la existencia de una relación de estas hormonas intestinales en la salud ósea, especialmente en la osteoporosis.

La osteoporosis y su principal complicación, las fracturas osteoporóticas, constituyen un grave problema de salud pública, siendo responsables de un exceso de mortalidad, morbilidad, dolor crónico, mayor grado de dependencia, ingreso en instituciones y costes económicos afectando seriamente la calidad de vida de personas que podrían disfrutar de los últimos años de su vida (Baim et al 2008).

La osteoporosis se define como "Trastorno del esqueleto caracterizado por alteración de la resistencia ósea que predispone a un incremento del riesgo de fractura. La resistencia del hueso es el reflejo de la integración de dos características principales: densidad y calidad ósea". El deterioro de tejido óseo que se produce en la osteoporosis es el resultado de una disminución de masa ósea y la alteración de la microarquitectura del hueso, por desequilibrio en los procesos de formación y reabsorción ósea (Baim et al 2008).

El remodelado óseo es un complejo sistema de homeostasis de la masa ósea, con un eficiente sistema de autocontrol, regulado por numerosos factores entre los que se incluyen factores genéticos, mecánicos, hormonales, nutricionales y factores de crecimiento. En circunstancias normales, los procesos de reabsorción y de formación, están estrechamente acoplados y el resultado es que no se produce un cambio neto en la masa ósea (Baim et al 2008). El remodelado óseo se produce con un ritmo circadiano, habiéndose demostrado una elevación de los marcadores de remodelado óseo durante la noche y su disminución durante el día (Yavropoulou & Yovos 2013), predominando en el período nocturno los fenómenos de reabsorción ósea (Henriksen et al 2007). Los marcadores de formación ósea también siguen un ritmo circadiano, pero la magnitud de la variación es más corta que la de reabsorción. La formación ósea disminuye después de 4 días de ayuno, concretamente, la osteocalcina (parámetro de formación ósea) no se modifica tras las primeras 24 horas de ayuno (Walsh & Henriksen, 2010). Se ha intentado explicar este hecho por el paralelismo en la secreción circadiana de hormonas como el cortisol, paratohormona (PTH) o melatonina, pero hasta ahora, no se ha podido confirmar este supuesto (Yavropoulou & Yovos 2013).

El aspecto clave en esta secuencia de ritmo del remodelado óseo, ha sido comprobar cómo la reabsorción ósea se afecta significativamente durante los períodos de ayuno (Walsh & Henriksen, 2010), habiéndose propuesto que la principal causa del ritmo circadiano del remodelado óseo es la variación en la ingesta de alimentos. El ritmo de remodelado se ve afectado dependiendo de la ingesta de alimentos, aumentando por la noche con el ayuno nocturno (Deal 2009). Como se ha comentado anteriormente, el proceso más afectado es la reabsorción, mientras que los parámetros de formación ósea no se ven afectados por la ingesta de nutrientes, siendo explicado este hecho por la existencia de un desacoplamiento de los dos procesos en el momento postprandial (Yavropoulou & Yovos 2013).

Los mecanismos mediante los cuales la alimentación regula el recambio óseo son complejos, estando implicados varios mediadores. La ingesta de glucosa, proteínas, grasas e ingesta mixta se asocia con una reducción significativa de los marcadores de reabsorción del hueso, detectable veinte minutos después de la alimentación (Henriksen et al 2003). La formación de hueso también se ve influida, pero parece ser que su respuesta a nutrientes es menor que la reabsorción (Clowes et al 2002). El análisis bioquímico de la reabsorción ósea demuestra que la ingesta de alimentos es la principal causa de reducción de la reabsorción ósea durante el día, que es seguido por un aumento nocturno de la misma (Bjarnason et al 2002).

El hecho determinante de la dramática reducción de la reabsorción ósea que se produce tras la ingesta de una comida junto con otras pruebas significativas tales como que la respuesta del remodelado óseo a la administración oral de glucosa es mucho mayor que cuando se administra esta misma glucosa vía intravenosa (Walsh & Henriksen, 2010), o el hecho de que durante el reposo digestivo que se produce con la nutrición parenteral existe una reducción de la masa ósea, reafirma la idea de una relación funcional entre intestino y metabolismo óseo, que posiblemente estaría mediado por hormonas, que responderían ante la absorción de nutrientes (Clowes et al 2005, Maibellau et al 2013).

Se ha mostrado que los más importantes efectores de la respuesta aguda que se produce en el metabolismo óseo en relación con la ingesta de alimentos son los péptidos intestinales y pancreáticos (Walsh & Henriksen, 2010).

Los péptidos intestinales, son un conjunto de péptidos (algunos con carácter hormonal) que se producen en el aparato digestivo e intervienen en la regulación de las diferentes etapas de la digestión. A diferencia de otras hormonas, estos péptidos no suelen estar producidos por glándulas concretas, sino que son secretadas al líquido extracelular y a la sangre por células endocrinas aisladas distribuidas a lo largo del tubo digestivo, constituyendo los que algunos autores denominan sistema endocrino intrínseco del sistema gastrointestinal. En otras ocasiones, son producidos por neuronas de los plexos mesentérico y submucoso, o por los islotes pancreáticos. Los péptidos intestinales son liberados en respuesta a distintos estímulos presentes en la luz intestinal, cómo el pH, distensión mecánica, tonicidad y presencia de nutrientes (Martínez de Victoria 2010).

La investigación de estos péptidos ha sido de interés fundamental en los últimos años sobre todo en relación con la diabetes mellitus, desarrollándose el concepto de incretinas, que se definen como péptidos intestinales liberados después de la ingestión de alimentos y que tienen una acción moduladora en la homeostasis de la glucosa, dando lugar al diseño de nuevos fármacos para el tratamiento de la diabetes mellitus, pero también ha puesto de manifiesto la implicación de estas sustancias en otras áreas del metabolismo intermediario, destacando sus efectos a nivel del tejido óseo. Así, se ha mostrado la existencia de una relación de estas hormonas con la formación y la reabsorción ósea, con datos preliminares sugerentes de efectos positivos de varios de estos péptidos intestinales sobre la regulación de la reabsorción ósea que se produce como respuesta a la alimentación. Esta regulación sería muy compleja y en ella participarían distintos mediadores. Los péptidos intestinales más importantes que se han relacionado con el remodelado óseo son: péptido similar al glucagon 1 y 2 (GLP - 1 , GLP - 2), péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP), también llamado péptido gastro-inhibidor, y en menor medida el Péptido YY, y hormonas producidas por las células beta pancreáticas: como la amilina, y el polipéptido pancreático (PP) (Walsh & Henriksen 2010). Fundamental sería además del concurso de estos péptidos, sustancias tales como los análogos del receptor del péptido similar al glucagon-1 (GLP-1 RA), como por ejemplo los derivados de la exendina 4 (exenatide) y de los inhibidores de la enzima dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4Í), enzima encargada de la metabolización de algunos de estos péptidos como el GLP-1 y 2 (Dicembrini et al 2012). Los péptidos que se han asociado al efecto incretina son fundamentalmente los GLP-1 y el GIP, los cuales tienen un efecto hipoglucemiante, controlando e incluso disminuyendo el peso corporal, lo que ha motivado el desarrollo de fármacos principalmente análogos del GLP-1 e inhibidores de la DPP-4, que actualmente se usan en el tratamiento de la diabetes mellitus.

Distintos estudios han evidenciado la relación entre los péptidos anteriormente mencionados y el remodelado óseo y la osteoporosis. En 2003, Henriksen y colaboradores en un doble estudio realizado en voluntarios sanos, ponen de manifiesto, como la ingesta de distintos tipos de nutrientes (proteínas, grasa, glucosa y fructosa) reducen la reabsorción ósea provocando una secreción en paralelo del GLP-1 y GLP-2. En el mismo estudio la inyección intravenosa de GLP-2 a distintas dosis en 60 mujeres postmenopáusicas provoca una reducción de la reabsorción ósea, no mostrando acción sobre los parámetros de formación ósea (Henriksen et al 2003). La disminución de la reabsorción ósea por GLP-2 requiere un tracto gastrointestinal intacto, donde los receptores del GLP-2 que han sido localizados en el plexo mesentérico, estén intactos.

Posteriormente, otro estudio del grupo de Henriksen administrando GLP-2 durante 14 días a un grupo de mujeres sanas postmenopaúsicas, muestra, por un lado la seguridad del tratamiento, y por otro la disminución significativa de la reabsorción ósea, sin que se afecte al parecer la formación ósea, como evidencian los niveles de osteocalcina estables durante el tratamiento (Henriksen et al 2007).

En un ensayo en 160 mujeres postmenopáusicas que recibieron tratamiento con GLP-2, en el día 120 tras la inyección, mostró un incremento en la densidad ósea en cadera y una reducción del incremento nocturno de la concentración C-telopeptido, marcador de reabsorción ósea, mientras que no se modificaba la osteocalcina, un marcador de formación ósea (Deal 2009).

En contraste con la evidencia del GLP-2 en relación sobre la formación y la resorción ósea que proviene principalmente de estudios en humanos, el papel fisiológico del GLP-1 sobre el hueso ha sido sólo investigado principalmente en roedores En un estudio realizado en ratas Wistar sometidas a dietas hiperlipídicas, la administración de GLP-1 , y de su análogo, estimulante del receptor, la exendina, mejoran por un lado el metabolismo lipídico y de la glucosa y por otro aumenta la expresión de genes que codifican la osteocalcina y osteoprotegerina, revirtiendo la pérdida de masa ósea (Nuche-Berenguer et al 201 1). En esta misma línea, un reciente estudio muestra como la exendina administrado a ratas ovariectomizadas favorece la formación y disminuye la reabsorción ósea (Ma et al 2013).

Respecto al GIP, se ha mostrado que existen receptores para GIP en los osteoblastos, y que la estimulación de estos receptores favorece la síntesis de colágeno tipo 1 e incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina (Bollag et al 2001), y como se demuestra en este estudio realizado en ratas, la administración de GIP provoca un aumento de la masa ósea medida mediante densitometría, curiosamente sin aumentar el peso de los roedores, argumentando que el GIP sería como una hormona centinela que además de esta acción directa sobre el hueso, podría actuar maximizando el efecto de los nutrientes y la acción de otras hormonas (amilina, insulina) sobre el tejido óseo (Bollag et al 2001). Posteriormente también se ha demostrado en un estudio realizado en cultivos celulares, que el GIP actúa asimismo sobre los osteoclastos inhibiendo la reabsorción ósea, corroborando de esta forma el hecho de que el GIP sería mediador en el efecto que la ingesta alimenticia tiene inhibiendo la reabsorción ósea (Zhong et al 2007). Por otra parte se ha podido comprobar cómo el calcio procedente de la alimentación es depositado en el tejido óseo mediante el concurso del GIP (Tsukiyama et al 2006). Estos autores muestran además como el GIP tiene una acción sobre la homeostasis del calcio, y una acción antiapoptótica en los osteoblastos, no habiéndose comprobado ninguna acción sobre los osteoclastos. En un estudio posterior realizado por el grupo de Maibellau, en ratones con deficiencia del receptor para GIP (GIPR-Knockout), se muestra como la ausencia de este receptor favorece un aumento de la masa ósea mediante un aumento de la formación, pero con un tejido óseo de baja calidad (Gaudin-Audrain et al, 2013).

Hay que destacar también un estudio en el que se muestra como en pacientes con alteración de la masa ósea existe una disminución de distintos péptidos intestinales. Este estudio se realiza en pacientes diagnosticadas de anorexia nerviosa, mostrándose una disminución de los valores de GIP y de amilina en relación con la disminución de la masa ósea (Wojcik et al 2010), aunque este estudio está limitado por el pequeño tamaño de muestra.

Por otra parte, es sabido que en la diabetes mellitus existe un aumento del riesgo de fractura osteoporótica (Dicembrini et al 201 1), y es reconocido que el tratamiento con análogos del GLP-1 conlleva una disminución de peso y la posible acción positiva de estos en la homeostasis ósea podría ser eclipsada por la disminución del peso, que como se sabe puede conllevar una disminución de masa ósea (Labouesse 2014). Sin embargo se ha podido comprobar en un ensayo con humanos, cómo el tratamiento con exenatide (agonista del receptor del GLP-1), no modifica el riesgo de fractura (Bunck et al 201 1). La osteoporosis es una enfermedad crónica, y actualmente no se puede curar, por tanto se supone que su tratamiento debe ser indefinido. Los fármacos autorizados actualmente son: Estrógenos, Estimulantes de receptores estrogénicos, Bifosfonatos, Denosumab, Teriparatida, Ranelato de estroncio (solo autorizado en osteoporosis muy graves). Debido a la escasez de medios terapéuticos, las contraindicaciones y efectos adversos, es necesario plantear tratamientos alternativos para ir modificando en función del paciente y de sus características, lo que se llama "terapia secuencial", tal como propone la Guía de la Sociedad Española de Investigación en Osteoporosis y metabolismo Mineral (SEIOMM 2014). Se hace por tanto necesario investigar nuevas líneas de tratamiento que puedan constituirse en alternativa segura y eficaz para el tratamiento de la osteoporosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende el péptido similar al glucagón 1 (GLP- 1), análogos de GLP-1 , agonistas de los receptores de GLP-1 , péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), análogos de GLP-2, agonistas de los receptores de GLP-2, inhibidores de DPP-4, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de la osteoporosis. Alternativamente se refiere al uso de una composición, que consiste en el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), análogos de GLP-1 , agonistas de los receptores de GLP-1 , péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), análogos de GLP-2, agonistas de los receptores de GLP-2, inhibidores de DPP-4, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de la osteoporosis.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, además comprende GIP, péptido YY, amilina o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables.

En otra realización preferida, se refiere a que los análogos y agonistas de los receptores de GLP-1 se seleccionan de la lista que consiste en repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, se refiere a que el análogo de GLP-2 consiste en teduglutida. En otra realización preferida, se refiere a que los inhibidores de DPP-4 se seleccionan de la lista que consiste en sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, linagliptina, gemigliptina, sitagliptina y simvastatina, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición además comprende otro principio activo, preferiblemente un agente que afecta a la estructura ósea y la mineralización que se selecciona de la lista que consiste en bifosfonatos, proteínas morfogénicas óseas, ranelato de estroncio, denosumab, estrógenos, estimulantes de receptores estrogénicos, raloxifeno, teriparatida, hormona paratiroidea, calcitonina, calcio, colecalciferol, calcifediol o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida, la composición además comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de los marcadores péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross- laps), o su combinación para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, además comprende el péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende el polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido YY, amilina, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende la 25-OH vitamina D, calcio, fósforo, magnesio, hormona paratiroidea (PTH), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende el osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross-laps), o cualquiera de sus combinaciones.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) cuantificar los productos de expresión GLP-1 , GLP-2, DPP-4 y CTX-Beta cross-laps, tal como se define en la presente invención, en una muestra biológica aislada de un individuo al que se le ha administrado previamente un preparado nutricional, y el Zscorelumbar, y b) calcular la probabilidad de un individuo de padecer osteoporosis en base a la fórmula (I):

Probabilidad : (-0,068 * GLP 1-0,772 * CTX-4,418* ZSCORELUMB\R+9,016)

Fórmula (I) donde

GLP1 : es el valor del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1);

CTX: es el valor del parámetro de remodelado óseo CTX Beta-cross laps; y

Zscorelumbar: es el valor del Z score lumbar obtenido mediante Densitometría ósea (DEXA).

En otra realización preferida, la muestra biológica aislada en el paso a) es sangre.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis, que comprende los pasos (a) y (b) según se describe en la presente invención, de ahora en adelante segundo método de la invención, y además comprende: c) asignar al individuo al grupo de individuos que presentan osteoporosis cuando el resultado de la Formula I es mayor a 0,5.

En una realización preferida, se refiere al segundo método de la invención para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis.

En otra realización preferida, la muestra biológica aislada en el paso a) es sangre.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de los individuos seleccionados por los métodos de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende un: componente A, formado por un colector de sangre, y/o componente B, formado por uno o más tubos de muestra de sangre con 10 μΙ_ de un inhibidor de la DPP-4 por cada ml_ de sangre, una placa de 96 pocilios, conjugated magnetic beads, anticuerpos específicos, estándares, buffers, disolventes, streptavidin-PE, placa filtro, placa inferior plana, cinta de sellado, y/o componente C, formado uno o más tubos de muestra de sangre, EDTA tripotásico, heparina sódica, y/o componente D, formado por dispositivo de medida del espectro de luz, y/o componente E, formado por un densitómetro, y/o o cualquiera de sus combinaciones.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

Un noveno aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Curva ROC con los valores de las probabilidades pronosticadas del modelo y la variable dependiente original.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención describen el uso de un método para cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis cuantificando una serie de marcadores, concretamente GLP-1 , GLP-2, GIP, DPP-4 y CTX-Beta cross-laps.

En este trabajo se aplicó un análisis basado en un estudio de casos y controles, para buscar potenciales marcadores, principalmente los péptidos intestinales GLP-1 , GLP-2 y GIP, así como la enzima encargada de su metabolización, DPP-4, y CTX-Beta cross-laps que puedan ayudar a entender los procesos patológicos relacionados con la osteoporosis.

Se tomaron muestras de sangre como material biológico y se analizaron por técnicas de luminiscencia. El conjunto de marcadores significativos identificados, junto con el Z-score lumbar se utilizaron para aplicar un modelo de regresión logística multivariante para agrupar a los pacientes en los grupos de riesgo de padecer osteoporosis con fines de detección precoz o cribado y diagnóstico, así como con fines de prevención, alivio, mejora y tratamiento.

COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), análogos de GLP-1 , agonistas de los receptores de GLP-1 , péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), análogos de GLP-2, agonistas de los receptores de GLP-2, inhibidores de DPP-4, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de la osteoporosis.

Alternativamente se refiere al uso de una composición, que consiste en el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), análogos de GLP-1 , agonistas de los receptores de GLP-1 , péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), análogos de GLP-2, agonistas de los receptores de GLP-2, inhibidores de DPP-4, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de la osteoporosis.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, además comprende GIP, péptido YY, amilina o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables.

En otra realización preferida, se refiere a que los análogos y agonistas de los receptores de GLP-1 se seleccionan de la lista que consiste en repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida, se refiere a que el análogo de GLP-2 consiste en teduglutida.

En otra realización preferida, se refiere a que los inhibidores de DPP-4 se seleccionan de la lista que consiste en sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, linagliptina, gemigliptina, sitagliptina y simvastatina, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición además comprende otro principio activo, preferiblemente un agente que afecta a la estructura ósea y la mineralización que se selecciona de la lista que consiste en bifosfonatos, proteínas morfogénicas óseas, ranelato de estroncio, denosumab, estrógenos, estimulantes de receptores estrogénicos, raloxifeno, teriparatida, hormona paratiroidea, calcitonina, calcio, colecalciferol, calcifediol o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, la composición además comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otra realización preferida, la administración se realiza por vía oral, sublingual, inhalatoria, transdérmica, intramuscular (IM), intravenosa (IV), o subcutánea (SC).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, cualquiera de los principios activos de la presente invención pueden administrarse a un individuo de manera simultánea, combinada, o secuencial, es decir, que los principios activos no tienen que estar interaccionando químicamente formando parte de una composición, sino que pueden encontrarse yuxtapuestos sin ser parte de una combinación verdadera.

El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica. El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

Se entiende por "osteoporosis" tal como se define en la presente invención como un trastorno del esqueleto caracterizado por alteración de la resistencia ósea que predispone a un incremento del riesgo de fractura. La resistencia del hueso es el reflejo de la integración de dos características principales: densidad y calidad ósea. El deterioro de tejido óseo que se produce en la osteoporosis es el resultado de una disminución de masa ósea y la alteración de la microarquitectura del hueso, por desequilibrio en los procesos de formación y reabsorción ósea.

Según su etiología, la osteoporosis puede clasificarse en primaria o secundaria. La osteoporosis primaria se trata del tipo más frecuente de osteoporosis. Este diagnóstico se establece cuando, tras evaluar al paciente, no se encuentra la causa que la provoca. A su vez, la osteoporosis primaria puede categorizarse como juvenil, postmenopáusica, relacionada con la edad e idiopática.

Se diagnostica osteoporosis secundaria cuando la pérdida de masa ósea es causada por otra enfermedad o por el uso de fármacos en particular. Las fracturas se dan con mayor frecuencia en los huesos de la cadera, las vértebras de la columna vertebral y los huesos de la muñeca. Las fracturas vertebrales pueden ocasionar pérdida de altura y deformidad de la caja torácica.

La osteoporosis no provoca síntomas y suele pasar desapercibida, motivo por el cual se la ha denominado "la epidemia silenciosa". Las manifestaciones clínicas de la osteoporosis aparecen como consecuencia de sus complicaciones: las fracturas. Así mismo, la osteoporosis es una enfermedad crónica, y actualmente no dispone de cura, por tanto su tratamiento es crónico. El primer paso antes de recomendar un tratamiento es evaluar al paciente para determinar si se trata de una osteoporosis primaria o secundaria, con el fin de detectar las enfermedades que la provocan, algunas de las cuales suelen pasar desapercibidas. Si se trata de manera adecuada la enfermedad causante y la baja densidad ósea para la edad persiste, el tratamiento dependerá de la dinámica de los huesos. Las pautas generales se basan en recomendar una cantidad adecuada de calcio en la dieta, la práctica de ejercicio físico y el empleo de medicamentos que contribuyan al mantenimiento o aumento de la masa ósea. Los fármacos autorizados actualmente son: estrógenos, estimulantes de receptores estrogénicos, bifosfonatos, denosumab, teriparatida, ranelato de estroncio (solo autorizado en osteoporosis muy graves).

El término "principio activo", "fármaco", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" tal como se emplea en la presente memoria significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. El término "péptido similar al glucagon 1 GLP-1" se refiere una hormona derivada de la transcripción de un gen llamado proglucagon cuya función fisiológica se fundamenta sobre la concentración sanguínea de glucosa. La fuente principal de GLP-1 en el organismo son las células L del intestino, las cuales secretan a la hormona como un producto intestinal. La forma biológicamente activa de la hormona GLP-1 son GLP-1 -(7-37) y GLP-1-(7-36)NH2.

El término "análogos de GLP-1 y agonistas de los receptores de GLP-1 " hace referencia a aquellos principios activos que tienen una acción agonistas del receptor de GLP-1 , también llamados miméticos de incretina, son un tipo de fármaco con acción incretina. Estos fármacos, repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, y dulaglutida , copian o imitan la acción del GLP-1 producido por el cuerpo. Los efectos del GLP-1 duran solo unos minutos, pero los análogos y agonistas de los receptores de GLP-1 duran aproximadamente 10 horas. Los agonistas del receptor de GLP-1 se formulan en forma líquida, que se inyecta bajo la piel del estómago, muslo o brazo. Según el el fármaco de elección, se inyecta una o dos veces al día, o una vez a la semana. El término "péptido similar al glucagon 2 GLP-2" se refiere a un péptido de 33 aminoácidos con la secuencia HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD en seres humanos. El GLP-2 es producido por la célula L endocrina intestinal y por varias neuronas en el sistema nervioso central. El GLP-2 intestinal es co-secretado junto con GLP-1 tras la ingestión de nutrientes. Cuando se administra externamente, el GLP-2 produce una serie de efectos en humanos y roedores, incluyendo el crecimiento intestinal, el aumento de la función intestinal, la reducción de la descomposición de los huesos y la neuroprotección. GLP-2 puede actuar en una forma endocrina para vincular el crecimiento intestinal y el metabolismo con la ingesta de nutrientes. GLP-2 y análogos relacionados pueden ser tratamientos para el síndrome de intestino corto, enfermedad de Crohn, osteoporosis y como terapia adyuvante durante la quimioterapia contra el cáncer.

El término "análogo de GLP-2" hace referencia a aquellos principios activos que tienen una acción similar al GLP-2, concretamente la teduglutida.

El término "polipéptido inhibidor gástrico GIP o péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa" (del inglés gastric inhibitory polypeptide), es un miembro de la familia de hormonas secretina. El GIP, junto con el péptido similar al glucagon tipo 1 (GLP-1), pertenecen a una clase de moléculas conocidas como incretinas. La función del GIP es inducir la secreción de insulina, que es estimulada principalmente por la hiperosmolaridad de glucosa en el duodeno. La cantidad de insulina secretada es mayor cuando la glucosa es administrada oralmente que por vía intravenosa. En esta memoria se entiende por "dipeptidil peptidasa-4 DPP-4, adenosina deaminasa proteína acomplejante 2 o CD26" como una proteína que, en humanos, se encuentra codificada por el gen DPP4. La DPP-4 presenta actividad enzimática y actúa degradando a las hormonas incretinicas GLP-1 y GIP. Se han desarrollado unos inhibidores de esta proteína, los "inhibidores de DPP-4" que están siendo utilizados como una nueva clase de medicamentos para el tratamiento de la diabetes tipo 2, concretamente en clínica se están utilizando sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, y linagliptina. Estos compuestos bloquean la degradación de las hormonas incretinicas, tales como la GLP-1 , y pueden incrementar sus niveles naturales en circulación favoreciendo el control glucémico en pacientes diabéticos tipo 2.

Cuando en la presente memoria se menciona los "agentes que afectan a la estructura ósea y la mineralización" se refiere a todos aquellos principios activos cuya acción principal se basa en tratar los trastornos del esqueleto caracterizado por alteración de la resistencia ósea que predispone a un incremento del riesgo de fractura. Preferiblemente, estos agentes pueden tratar la densidad y calidad ósea.

En esta memoria, cuando se hace mención al término "sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos" se refiere a cualquier sal, éster, tautómero, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, en su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto tal y como los descritos en el presente documento. No obstante, se observará que las sales farmacéuticamente inaceptables también caen dentro del alcance de la invención, ya que éstas pueden ser útiles para la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, profármacos y derivados puede ser llevada a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica.

El término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos de los compuestos presentes en la composición de la invención que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatacion conocidos por los expertos en la materia.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, además de la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

De acuerdo con la definición de la EMEA, se considera excipiente cualquier componente en la composición distinto de un principio activo. Un ejemplo de excipientes adicionales farmacéuticamente aceptables podría ser, aunque sin limitarnos, aquellos que se seleccionan de la lista que consiste en: metanol, el propilenglicol, el etilenglicol, el dimetilsulfóxido, el 2,3 butanediol, el glicerol, y otros alcoholes, la galactosa, la glucosa, la sacarosa, la trehalosa y otros carbohidratos o glúcidos, la polivinilpirrolidona, el alcohol polivinílico, el hialuronidato de sodio y otros polímeros, o cualquiera de sus combinaciones.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

Las composición farmacéutica tal como se menciona en la invención se puede administrar por vía tópica, transdérmica, oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, enteral o parenteral. Ejemplos ilustrativos de administración tópica o transdérmica incluye, aunque no se limita, iontoforesis, sonoforesis, electroporación, presión mecánica, gradiente de presión osmótica, cura oclusiva, microinyecciones, inyecciones sin agujas mediante presión, parches microeléctricos y cualquier combinación de ellas. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. Las composiciones de la presente invención pueden ser empleadas junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes. Tanto las composiciones de la presente invención, así como la preparación combinada pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Tales composiciones o preparaciones combinadas y/o sus formulaciones puede administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico.

La administración de las composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la administración intramuscular, subcutánea, o infusión intravenosa. La administración intramuscular es la preferida por la conveniencia farmacocinética y por la gravedad de la enfermedad a tratar.

La cantidad administrada de los principios activos presentes en la composición de la invención dependerá de la relativa eficacia de los compuestos elegidos, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

USO DE BIOMARCADORES

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de los marcadores péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross- laps), o su combinación para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis. En una realización preferida de este aspecto de la invención, además comprende el péptido similar al glucagón 2 (GLP-2), dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende el polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido YY, amilina, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende la 25-OH vitamina D, calcio, fósforo, magnesio, hormona paratiroidea (PTH), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida además comprende el osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross-laps), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida los marcadores se seleccionan de la lista que consiste en GLP- 1 , GLP-2, GIP, DPP-4, CTX-Beta cross-laps o cualquiera de sus combinaciones. En una realización más preferida, el marcador es el GLP-1 y el GLP-2. En una realización aún más preferida, el marcador es el GLP-1. El término "Marcador, biomarcador o marcador biológico" se utiliza para designar aquella sustancia utilizada como indicador de un estado biológico. Debe poder medirse objetivamente y ser evaluado como un indicador de un proceso biológico normal, estado patogénico o de respuesta a un tratamiento farmacológico.

El término "telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx o CTX-Beta cross-laps" hace referencia a un indicador del metabolismo óseo, y es una ayuda a la hora de valorar el tratamiento con fármacos antiresortivos (bifosfonatos, denosumab, ranelato de estroncio) o formadores (teriparatida, estimulante selectivos de receptores de estrógenos).

El término "Cribado poblacional o Screening" tal como se usa en la presente invención se refiere a la estrategia aplicada sobre una población para detectar una enfermedad en individuos sin signos o síntomas de esa enfermedad de manera temprana dentro de una comunidad. Para que esta estrategia de prevención sea considerada como cribado debe cumplir con los criterios de Frame y Carlson:

• La enfermedad buscada sea una causa común de morbimortalidad (enfermedad preval ente).

· Sea detectable en etapa presintomática.

• Las pruebas diagnósticas deben ser efectivas y eficaces (sensibilidad y especificidad aceptables).

• El tratamiento temprano debe ser mejor que en la etapa sintomática. • El daño potencial de la intervención debe ser menor que en el tratamiento no precoz.

El término "diagnóstico" en esta memoria hace mención a un procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier estado de salud o enfermedad. En la presente invención se entiende por "pronóstico" la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1 , 0,05. A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0, 1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. El término "seguimiento" tal como se recoge en esta memoria hace referencia a un proceso de atención sanitaria que continua a otra intervención diagnóstica o terapéutica, con el objetivo de finalizar el episodio de atención iniciado para conseguir su completa recuperación, o de mantener un estado de salud satisfactorio en enfermedades crónicas. MÉTODOS DE LA INVENCIÓN

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) cuantificar los productos de expresión GLP-1 , GLP-2, DPP-4 y CTX-Beta cross-laps, tal como se define en la presente invención, en una muestra biológica aislada de un individuo al que se le ha administrado previamente un preparado nutricional, y el Zscorelumbar, y b) calcular la probabilidad de un individuo de padecer osteoporosis en base a la fórmula

Fórmula (I) donde

GLP1 : es el valor del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1);

CTX: es el valor del parámetro de remodelado óseo CTX Beta-cross laps; y

Zscorelumbar: es el valor del Z score lumbar obtenido mediante Densitometría ósea (DEXA).

En una realización preferida, se refiere al primer método de la invención para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis. En otra realización preferida, la muestra biológica aislada en el paso a) es sangre. Preferiblemente la sangre es extraída de la vena antecubital. Más preferiblemente la extracción sanguínea se hace 20 minutos después de la ingesta de un preparado nutricional de composición químicamente definida. Aún más preferiblemente, el preparado nutricional tiene una concentración calórica de 1'25 kcal/ml, 18'8 g de proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis, que comprende los pasos (a) y (b) según se describe en la presente invención, de ahora en adelante segundo método de la invención, y además comprende: c) asignar al individuo al grupo de individuos que presentan osteoporosis cuando el resultado de la Formula (I) es mayor a 0,5.

En una realización preferida, se refiere al segundo método de la invención para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis.

En otra realización preferida, la muestra biológica aislada en el paso a) es sangre. Preferiblemente la sangre es extraída de la vena antecubital. Más preferiblemente la extracción sanguínea se hace 20 minutos después de la ingesta de un preparado nutricional de composición químicamente definida. Aún más preferiblemente, el preparado nutricional tiene una concentración calórica de 1 '25 kcal/ml, 18'8 g de proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos. Un "individuo" o "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un mamífero, humano o no humano, en observación, y más preferiblemente un ser humano. El individuo puede ser cualquiera, un individuo predispuesto a una enfermedad (por ejemplo PCa) o un individuo que padece dicha enfermedad.

El término "cuantificar" tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la determinación de la cantidad absoluta o relativa de los marcadores, de su concentración en sangre o plasma, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "Z-score, Z score lumbar o Zscorelumbar" es el número de desviaciones estándar de un paciente con Densidad promedio mineral del hueso (DPH) diferente del promedio de DPH por su edad, sexo, etnia. Este valor es usado en mujeres premenopáusicas, hombres debajo de los 50, y en niños. También sirve para establecer si el paciente tiene un DPH tan bajo con respecto a su grupo etario que haga presumir alguna causa secundaria. Este valor es el valor del obtenido mediante Densitometría ósea (DEXA). El término "modelo de regresión logística, modelo logístico, modelo logit, o clasificador de máxima entropía" hace referencia a un tipo de análisis de regresión, el cual utiliza la fórmula I, utilizado para predecir el resultado de una variable categórica (una variable que puede adoptar un número limitado de categorías) en función de las variables independientes o predictoras. Es útil para modelar la probabilidad de un evento ocurriendo como función de otros factores.

Una "muestra biológica" tal como se define aquí, es una pequeña parte de un sujeto, representativa del conjunto y puede estar constituida por una biopsia o una muestra de fluido corporal. Las biopsias son pequeñas piezas de tejido y pueden ser frescas, congeladas o fijas, como fijada con formalina y embebidas en parafina (formalin- fixed and paraffin embedded FFPE). Muestras de fluidos corporales pueden ser sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, leche o muestras de fluido ductal y pueden asimismo ser frescos, congelados o fijados. Las muestras se pueden extirpar quirúrgicamente, mediante extracción, es decir, con agujas hipodérmicas o de otro tipo, por microdisección o captura láser. La muestra debe contener cualquier material biológico adecuado para detectar el marcador, biomarcador o biomarcadores deseado/s, por lo tanto, dicha muestra debe comprender ventajosamente material de las células del sujeto. Por lo tanto, en una realización particular, la muestra es una muestra de fluido corporal tal como una muestra de sangre u orina; preferiblemente, la muestra es de sangre. Una "muestra de referencia", como se usa aquí, significa una muestra obtenida de los individuos, preferiblemente dos o más individuos, de los que se sabe que están libres de la enfermedad (osteoporosis) y/o, alternativamente, de la población sana. Los niveles adecuados de referencia de los marcadores se pueden determinar mediante la medición de los niveles de dichos marcadores en varios individuos adecuados, y tales niveles de referencia se pueden ajusfar para poblaciones de individuos o sujetos específicos. En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de un grupo de individuos o sujetos sanos o de sujetos sin historia previa de osteoporosis. El perfil de niveles de marcadores en la muestra de referencia puede, preferiblemente, generarse a partir de una población de dos o más individuos; por ejemplo, la población puede comprender 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más individuos o sujetos. En otra realización preferida, la población sana de referencia comprende 58 individuos o sujetos. En otra realización preferida, la población con historia previa de osteoporosis de referencia comprende 58 individuos o sujetos.

La determinación de los marcadores se puede hacer por cualquier medio conocido por el experto en la materia. En una realización preferida, las determinaciones se han realizado por métodos de luminiscencia. Un "preparado nutricional" tal como se hace referencia en la presente invención se refiere a la ingesta de un preparado de composición químicamente definida con una concentración calórica de 1 '25 kcal/ml, 18'8 g de proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos, empleado para mejorar las determinación de los marcadores en sangre de los individuos. USOS MÉDICOS

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la prevención, alivio, mejora y/o tratamiento de los individuos seleccionados por los métodos de la invención.

KIT O DISPOSITIVOS Y USOS Un sexto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende un: componente A, formado por un colector de sangre, y/o componente B, formado por uno o más tubos de muestra de sangre con 10 μΙ_ de un inhibidor de la DPP-4 por cada ml_ de sangre, una placa de 96 pocilios, conjugated magnetic beads, anticuerpos específicos, estándares, buffers, disolventes, streptavidin-PE, placa filtro, placa inferior plana, cinta de sellado, y/o componente C, formado uno o más tubos de muestra de sangre, EDTA tripotásico, heparina sódica, y/o componente D, formado por dispositivo de medida del espectro de luz, y/o componente E, formado por un densitómetro, y/o o cualquiera de sus combinaciones.

Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. El término "densitometría ósea o DEXA" se refiere a una prueba para determinar la densidad mineral ósea. Se puede realizar con rayos X, ultrasonidos o isótopos radiactivos. Sirve para el diagnóstico de osteoporosis. El test se realiza con el aparato que mide las imágenes y da una cifra de la cantidad mineral ósea por superficie. El test trabaja midiendo un hueso específico, o más, usualmente de la columna vertebral, cadera, antebrazo. La densidad de esos huesos es comparada con un valor promedio basado en edad, sexo, tamaño. La comparación de resultados se usa para determinar el riesgo de fracturas y el estado de osteoporosis en un individuo.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis.

MÉTODOS IMPLEMENTADOS POR ORDENADOR

La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento. Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética como , por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios. Un noveno aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN En pacientes osteoporóticos, los niveles de los péptidos intestinales, principalmente GLP-1 , GLP-2, o GIP están disminuidos en comparación con pacientes sin osteoporosis de la misma edad y sexo. Es por ello que la determinación de los niveles de estos marcadores, así como del marcador DPP-4 podría ser una buena estrategia para encontrar nuevas formas para el cribado, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la osteoporosis. Así mismo, los preparados análogos a los péptidos intestinales GLP-1 , GLP-2, GIP, así como la enzima encargada de su metabolización, DPP-4, junto con la amilina pueden ser utilizados como tratamiento de la osteoporosis.

Para probar esta hipótesis se diseñó el proyecto qua actualmente se está desarrollando.

En este trabajo, se aplicó un estudio de casos y controles, emparejados 1 :1 por sexo y edad (+/-1 año) para buscar potenciales marcadores, principalmente los péptidos intestinales GLP-1 , GLP-2 y GIP, así como la enzima encargada de su metabolización, DPP-4, y su relación con la osteoporosis, que puedan ayudar a entender los procesos patológicos relacionados con esta patología.

Así mismo se analizaron de manera más particular la relación de los siguientes marcadores y su asociación con la osteoporosis:

Los péptidos intestinales Péptido YY y amilina. Los parámetros sanguíneos que intervienen en el remodelado óseo y su asociación con la osteoporosis y con los péptidos intestinales GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY, amilina y la enzima DPP-4, especialmente: 25-OH vitamina D, Calcio, fósforo, Magnesio, PTH, osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, y telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta-ctx (CTX-Beta cross-laps).

Otros parámetros sanguíneos que se relacionan con la osteoporosis: hemograma, glucosa, colesterol total y fracciones, triglicéridos y HbA1 C.

Parámetros antropométricos: peso, talla, el índice de masa corporal (IMC), y los compartimentos corporales: masa libre de grasa, masa grasa (medida por impedanciometría) se asocian con los péptidos intestinales estudiados, con la osteoporosis y con los parámetros referidos de remodelado óseo (osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, CTX-Beta cross-laps).

La ingesta de los principales grupos de alimentos (lácteos, verduras y hortalizas, legumbres, frutas, carnes, pescado y huevos, aceites) y su asociación con la osteoporosis y con los péptidos referenciados anteriormente: GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY, amilina y la enzima DPP-4.

La ingesta de los macronutrientes (proteínas, lípidos, carbohidratos) y de micronutrientes (calcio, zinc, vitamina C, vitamina B12, ácido fólico, vitamina B6, vitamina D) estudiando su relación con la osteoporosis y con los péptidos intestinales: GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY, amilina y la enzima DPP-4.

La actividad física, los posibles tratamientos farmacológicos y su asociación con los péptidos intestinales GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY, amilina y la enzima DPP-4 y con la osteoporosis.

La población del estudio en este trabajo corresponde al área de influencia del Complejo Hospitalario de Jaén.

Ejemplo 1. Diseño del estudio

Como se ha mencionado anteriormente, este trabajo se basa en un estudio de casos y controles, emparejados 1 :1 por sexo y edad (+/-1 año). Se ha considerado como exposición tener niveles de péptidos intestinales disminuidos, y como efecto presentar osteoporosis.

Tamaño de muestra y Procedimiento de muestreo

Según los resultados mostrados en Wojcik et al 201 1 (2011), considerando un error α del 5%, una potencia del 90% y un 10% de pérdidas, para detectar diferencias en el contraste de la hipótesis nula mediante una Prueba T-Student bilateral para dos muestras independientes, y asumiendo que la media del grupo de Casos es de 92,20 unidades, la media del grupo Controles es de 106,30 unidades y la desviación típica de ambos grupos es de 12,00 unidades, se necesitarían 38 pacientes en el estudio.

Para salvar las diferencias que existe entre el estudio de Wojcik y el presente y para poder llevar a cabo los análisis estadísticos planteados con suficiente potencia, se ha decidido ampliar la muestra hasta un total de 58 pacientes por grupo (casos y control), en total 1 16 pacientes con edades comprendidas entre 18-65 años del área de influencia del Complejo Hospitalario de Jaén. Al tratarse de un estudio no invasivo esta ampliación de muestra no presenta ningún conflicto ético. El procedimiento de muestreo utilizado será de forma consecutiva a la identificación de los pacientes, los cuales se sometieron a una entrevista y la revisión de sus historias clínicas.

Los criterios de exclusión que se han marcado para ambos grupos son los siguientes:

Diabetes mellitus (determinada por la medición de HbA1 C).

Diagnóstico de osteoporosis secundaria.

- Enfermedades relacionadas con el metabolismo del calcio: hipo o hiperparatiroidismo, hiperfosfatemia, hipertiroidismo subclínico y clínico.

Enfermedad de Cushing.

Gestación.

Ingreso hospitalario anterior en los últimos 6 meses.

- Diagnóstico de enfermedad cancerosa grave en el momento de la inclusión en el estudio.

Enfermedad ileocólica: enfermedad inflamatoria intestinal, malabsorción intestinal, resección y fístulas intestinales.

Diagnóstico de insuficiencia renal crónica estadio 4 (FG < 30).

- En tratamiento activo con: factores biológicos; análogos del GLP-1 ; inhibidores de la DDP-4; colestiramina; anticomiciales: fenitoína, fenobarbital, carbamacepina o valproato; rifampicina; antiácidos: sales de aluminio; antineoplásicos: ciclofosfamida; bifosfonatos; ranelato de estroncio teriparatida; fluoruro sódico; corticoides; y terapia hormonal substitutiva. Casos

Se seleccionarán de forma consecutiva a su identificación entre los pacientes que sean diagnosticadas de osteoporosis primaria en el servicio de Reumatología del Complejo Hospitalario de Jaén y que cumplan los siguientes criterios de selección. Estar diagnosticados de osteoporosis por densitometría (absorciometría dual por Rayos X (DEXA)).

- Acepten la participación en el estudio a través de la firma del consentimiento informado.

Controles

Los controles o pacientes sanos se reclutaron en el entorno familiar de los incluidos en el grupo de casos, emparejados 1 :1 por edad y sexo con el grupo de controles y que además:

No presentan criterios de osteopenia ni de osteoporosis en la DEXA.

No hayan presentado fractura por fragilidad.

- Acepten la participación en el estudio a través de la firma del consentimiento informado.

Ejemplo 2. Método y Recogida de datos

A todos los pacientes se les sometió a una serie de pruebas para hacer la determinación de los marcadores expuestos anteriormente:

Determinación de masa ósea

Se ha realizado mediante densitometro marca GE HC, modelo LUNAR DPX. Después de pesar y tallar al paciente se realizó la medición en columna lumbar: concretamente se analizaron las vértebras desde L1-L4, y en la cadera se analizaron el cuello femoral. Los resultados se compararon con los considerados como normales según edad y sexo.

Los niveles o puntos de corte de la DMO medida por DXA en columna lumbar y cadera se han establecido como:

Normal: cuando los valores de DMO son mayores de -1 DE en relación con la media de adultos (T-score > -1).

- Osteopenia o masa ósea baja: valores de DMO entre -1 y -2,5 DE (T- score entre -1 Y -2,5).

Osteoporosis: valores de DMO < -2,5 DE (T- score < -2,5), y osteoporosis establecida cuando a las condiciones previas se asocia a una o más fractura osteoporótica. (WHO Scientific Group 2007).

Determinaciones sanguíneas Se realizaron dos extracciones sanguíneas:

Basal: para la determinación de parámetros de metabolismo óseo y bioquímica general.

Postprandial: A los 20 minutos de la ingesta de un preparado nutricional con formulación químicamente definida para la determinación de GLP-1 , GLP-2, amilina, péptidos YY, así como la actividad de la enzima DPP-4.

En el laboratorio de Análisis Clínicos del Complejo Hospitalario de Jaén se realizaron las siguientes determinaciones:

Generales: hemograma; bioquímica: glucosa; HBA1C; Urea; creatinina; colesterol total y fracciones; calcio; fósforo; y magnesio.

Parámetros de metabolismo y remodelado óseo: 25-OH vitamina D, PTH, osteocalcina, propéptido aminoterminal del procolágeno, CTX-Beta cross- laps. Estos parámetros se determinaron en condiciones básales después del ayuno de al menos 8 h. En la Universidad de Jaén en el departamento de Fisiología, se realizaron las determinaciones de GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY, amilina y DPP-4. La determinación de los péptidos intestinales se llevará a cabo en muestras de plasma obtenida a partir de sangre extraída a los 20 minutos de la ingesta de un preparado nutricional con composición químicamente definida (Resource protein®), de la vena antecubital, siendo los tubos colocados en hielo y centrifugados inmediatamente a 4 grados centígrados, y a 3000 x g, 30 minutos, guardándose inmediatamente después en un congelador a - 80 grados centígrados. Antes de la extracción sanguínea y solo en el tubo con la muestra de sangre correspondiente al estudio de los péptidos, se añadirá 10 de un inhibidor de la DPP-4 (DPP4/DPP4-010, Lineo Research Inc, St Charles, Missouri, USA) por cada mL de sangre, siguiendo la técnica que se indica en Hattori et al (2013). Para las determinaciones se utilizará el Kit Bio-Plex Pro Human Diabetes 10-Plex Assay, de Bio-Rad, específicamente diseñado para la determinación de los niveles de GLP-1 , GLP-2, GIP, péptido YY y amilina, utilizando la tecnología Luminex x-MAP technology. Estas determinaciones se llevarán a cabo en los servicios técnicos de investigación de la Universidad de Jaén. La actividad DPP- 4 (Dipeptidil-aminopeptidasa-4) se determinaron por técnicas fluorimétricas utilizando el Kit "DPP4 Activity Assay Kit" de Sigma-Aldrich. Este ensayo se basa en la hidrólisis por parte del enzima del Sustrato H-Gly-Pro-AMC, liberándose el producto 7-Amino-4-Methyl- Coumarin (AMC) cuya fluorescencia se medirá a una excitación de 360 nm y una emisión de 460 nm tras la incubación a 37°C. La actividad se expresará como μηιοΙ de AMC por minuto y por mi de plasma. Estos análisis se llevaron a cabo en los laboratorios del área de Fisiología de la Universidad de Jaén.

Determinaciones antropométricas y bioimpedancia

Se realizaron una serie de determinaciones de parámetros, según:

Peso, talla, perímetro de la cintura (cm), e Indice de Masa Corporal (IMC).

Comportamientos corporales: se realizaron mediante un analizador de la composición corporal mediante impedancia, marca Tanita, modelo MC-180MA, y se determinó: Segmental Multifrecuencia.Masa grasa total y segmental (%), Masa libre de grasa total y segmental (%), y Masa muscular total y segmental (%).

Encuesta alimentaria y datos de actividad física

Se utilizó un cuestionario de frecuencia de consumo alimentario semicuantitativo adaptado a población española (Martín-Moreno et al 2003) complementado con el cuestionario usado en el estudio de la cohorte SUN, valorándose la actividad física en METs, (Martínez-González et al 2003). Se recoge información de frecuencia de consumo en función del tipo de alimento (diario, semanal, mensual, anual) del año anterior. Se determinará la ingesta por día de energía (Kcal/día) macronutrientes (carbohidratos, proteínas, lípidos) en gramos/día, y micronutrientes: calcio, fósforo, zinc, vitamina D, vitamina C, vitamina B12 y ácido fólico.

Ejemplo 3. Variables del estudio

Las variables que se van a tener en cuenta en el estudio de casos y controles son: - Sociodemográficas: Edad (años); Sexo (hombre, mujer); Residencia habitual

(domicilio, institución).

Variable Dependiente: Osteoporosis

Determinaciones analíticas:

Específicas:

o Péptidos intestinales: GLP-1 (pg/ml), GLP-2 (pg/ml), GIP (pg/ml), Amilina (pg/ml), Péptido YY (pg/ml), Actividad de la DPP-4: La actividad se expresará como μηιοΙ de AMC por minuto y por mL de plasma.

o Parámetros de metabolismo y remodelado óseo: PTH (pg/ml), 25-OH vitamina D sérica (ng/ml), Osteocalcina (ng/ml), telopéptido carboxiterminal del colágeno Beta- cross laps (CTX) (ng/ml), Propéptido aminoterminal del procolágeno total tipo 1/P1 NP (ng/ml) (propéptido). • Generales:

o Hemograma: hematíes, leucocitos, plaquetas (unidades/L).

o Bioquímica estándar: glucosa (mg/dl), HbA1c (%), urea (mg/dl), creatinina (g/dl), colesterol (total y fracciones) (mg/dl), triglicéridos (mg/dl), electrolitos (mEq/L) (sodio, potasio, cloro).

o Calcio sérico (mg/dl).

o Fósforo sérico (mg/dl).

o Magnesio sérico (mg/dl).

o Albúmina sérica (g/dl).

• Masa ósea:

o Columna lumbar

o Cadera

Parámetros antropométricos:

• Peso (kg)

• Talla (cm)

• IMC (kg/m2)

Parámetros de composición corporal:

• Masa grasa total y segmental (%)

• Masa libre de grasa total y segmental (%)

• Masa muscular total y segmental (%)

Ingesta alimenticia:

• Ingesta de los principales grupos de alimentos (lácteos, verduras y hortalizas, legumbres, frutas, carnes, pescado y huevos, aceites) g/dia.

• Energía (Kcal/día).

• Macronutri entes: carbohidratos (g/día), Proteínas (g/día), Lípidos (g/día).

• Micronutrientes: Calcio (mg/día), Fósforo (mg/día), Vitamina D (mg/día), Zinc (mg/día), Vitamina C (mg/día), Vitamina B12 ^g/día), vitamina B6 ^g/día)

• Ácido fólico ^g/día).

Actividad Física: METs/día.

Tratamientos farmacológicos.

Ejemplo 4. Análisis estadístico de las variables de estudio

Los datos recogidos sobre las variables dependientes e independientes mencionadas en este estudio se registraron en una base de datos anonimizada, construida para tal fin y procesadas estadísticamente mediante el programa estadístico SPSS v21. En primer lugar se realiza un análisis estadístico descriptivo de cada una de las variables de la base de datos, para ello en el caso de las variables cualitativas se presenta una tabla de frecuencias y como representación gráfica el gráfico de sectores. Para el caso de las variables cuantitativas se presentará medidas de tendencia central y como representación gráfica el diagrama de caja y bigotes.

A continuación se presenta un análisis bivariante para evaluar los diferentes objetivos.

De este modo para comprobar la relación entre los péptidos intestinales y la presencia de la osteoporosis y el resto de variables su utilizaron los diferentes test.

En el caso de una variable cualitativa dicotómica y una variable cuantitativa el Test t-Student para muestras independientes o el test no paramétrico U-Mann Whitney, si la variable cualitativa presente 3 o más modalidades se realizó para el análisis un ANOVA o el test no paramétrico de Kruskal Wallis, en el caso de dar resultados significativos se estudiaron las correspondientes comparaciones múltiples.

En el caso de variables cualitativas el test Chi-cuadrado (en tablas r x s) o el test de Fisher (en tablas 2x2), evaluando los Odds Ratio y sus correspondientes intervalos de confianza. Si ambas variables son cuantitativas el coeficiente de correlación de Pearson, o Spearman (según la normalidad de las variables).

El estudio de la normalidad de las variables cuantitativas se realizó a través del test de Kolmogorov Smirnov o Test de Shapiro Wilks, dependiendo del tamaño de la muestra. En el análisis multivariable se utilizarán modelos de regresión logística, para determinar qué variables se asocian con la presencia o no de la osteoporosis. Se consideraron como factores de confusión, los que no sean variables intermedias entre la exposición y el efecto, y mantengan una relación con la exposición (GLP-1 , GLP-2, GIP) y el efecto (osteoporosis). Como criterio pragmático se utilizaron en la detección de un factor de confusión el cambio en el coeficiente en un 10% o más.

Para todos los análisis se consideraron significativo un valor a=0.05

En el análisis descriptivo, se valoró nivel de estudios, tipo de trabajo, antecedentes de enfermedad, tratamientos farmacológicos, ingesta alimenticia, actividad física. En el test de diferencia de medias, no se encuentran diferencias significativas entre casos y controles en tipo de trabajo, antecedentes de enfermedad ni tratamientos farmacológicos ni tampoco en tipo de alimentación, lo que indica una gran homegeneidad entre ambos grupos. No se encuentra diferencias significativas en GLP-1 y GLP-2 entre casos y controles en el test de diferencia de medias (t-test). Tampoco se ha encontrado diferencias significativas en los análisis generales de parámetros bioquímicos y hemati métricos entre casos y controles en el test de diferencia de medias.

Sí se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre casos y controles en relación a parámetros antropométricos (peso, índice de masa corporal) y en los compartimentos corporales medidos por bioimpedancia.

En relación a los resultados obtenidos en los valores de los péptidos intestinales, y aunque o se ha encontrado correlación significativa en GLP-1 y GLP-2 entre casos y controles en el test de diferencia de medias (t-test), sí se ha encontrado una asociación significativa en análisis regresión lineal entre GLP-1 y GLP-2 y el T-score y Z-score lumbar. Así se ha visto que el GLP-1 se relaciona de forma negativa con el T-score y Z-score, en el límite de la significación en el grupo de casos (p = 0,056 y 0,064 respectivamente) y estadísticamente significativa en los controles (p = 0,015 y 0,010 respectivamente), mientras que el GLP-2, presenta una asociación postiva con el T-score lumbar en el grupo de los casos (p= 0.029). En el análisis de regresión logística condicional multivariable, ajusfando por distintos factores de confusión, GLP-1 muestra una disminución significativa del riesgo de osteoporosis (OR = 0.89, intervalo de confianza del 95% (0.81 -0.98)).

En relación a la actividad de la DPP-4, existe una correlación significativa de DPP-4 con los marcadores de remodelado óseo en el análisis de regresión lineal: se muestra una asociación positiva y significativa de la actividad de la DPP-4 en el grupo de casos entre actividad DPP-4 y osteocalcina (p = 0,006), propéptido (p = 0,012), y CTX (p = 0,007), mientras que en el grupo de controles, solo muestra asociación significativa con la actividad de la DPP-4, el propéptido (p = 0,022).

No se ha encontrado relación entre el péptido YY y la osteoporosis. Los resultados respecto a la amilina han sido muy heterogéneos y no admitían análisis estadístico.

No se encuentra relación entre los Pl estudiados y variables de remodelado óseo, antropometría y bioimpedancia.

Como era de esperar sí se encuentra asociación significativa entre osteoporosis y: - Valores de masa ósea medida por DEXA (T-score y Z-score en cadera y columna).

Marcadores de remodelado óseo (osteocalcina, propétidoy CTX). - Antropometría: peso, IMC, y de bioimpedancia: masa libre de grasa (FFM), masa muscular total (Musc-T) y masa grasa total (Fat-T) que se muestra tanto en test de diferencia de medias y análisis de OR.

En resumen, teniendo en cuenta los resultados más importantes, podemos decir que: - No se ha demostrado que exista una disminución significativa de GLP-1 , GLP-2, PYY, ni aumento de la actividad de la DPP4 en pacientes con osteoporosis frente a pacientes sin osteoporosis.

El GLP-1 se correlaciona de forma negativa con el T-score y Z-score lumbar principalmente en los controles.

- El GLP-2se correlaciona de forma positiva con el T-score lumbar en los casos, no en los controles.

La actividad de DPP4se correlaciona de forma positiva y significativamente con los marcadores de remodelado óseo.

En la regresión logística condicional multivariable, el GLP-1 , se asocia con una disminución significativa del riesgo de padecer osteoporosis.

Estos resultados muestran que existe una relación del GLP-1 y GLP-2 con los valores de masa ósea medida DEXA.

En el caso de GLP-1 , se ha comprobado que aunque la asociación con el T-score y Z-score lumbar es negativa, en los análisis de regresión logística, se comprueba que los niveles de GLP-1 se asocian con el riesgo de fractura, es decir, niveles más elevados de GLP-1 disminuyen el riesgo de padecer osteoporosis.

Estos resultados, aunque pueden parecer contradictorios están en la línea de otros estudios que muestran resultados a favor y en contra del efecto del GLP-1 sobre el tejido óseo. Así, mientras que Driessen y col (2015), en un estudio de cohortes, muestran que el tratamiento con GLP-1 no incide en el riesgo de fractura, importantes estudios experimentales han puesto de manifiesto que el uso de agonistas del receptor de GLP-1 (exenatide y liraglutide) mejora la masa ósea en ratas ovariectomizadas, principalmente el hueso trabecular, e incrementando el n° de osteoclastos, demostrando que existe receptor de GLP-1 también en osteoclastos, que podría mediar el efecto beneficioso de los agonistas del receptor GLP-1 sobre el tejido óseo, disminuyendo la resorción ósea (Pereira et al 2015). Previamente, se había demostrado que existen receptores para GLP-1 en adipocitos y osteocitos lo que favorecería la formación de osteoblastos, y en las células C del tiroides lo que estimularía la secreción de calcitonina e indirectamente se inhibiría la reabsorción ósea, y también en osteoblastos, receptor de GLP-1 , que difiere del existente en células pancreática (Nuche-Berenguer et al 2010).

Por tanto los diferentes resultados serían explicados porque no existe un solo tipo de receptor. Existen distintos polimorfismos en el receptor de GLP-1. Estos diferentes polimorfismos en el receptor de GLP-1 , dan lugar a respuestas disociadas (Cantini et al 2016, Luo et al 2016), y posiblemente serían la causa de que existan individuos respondedores y no respondedores a la acción de GLP-1 sobre el tejido óseo.

Respecto al GLP-2, los resultados son coherentes con lo mostrado en anteriores estudios, principalmente los del grupo de Henriksen y colaboradores, que muestran que GLP-2 favorece el aumento de masa ósea (Henriksen, 2003, 200709 Askov-Hansen 2013).

En relación a la actividad de la DPP4, los resultados publicados hasta ahora son contradictorios. Monami y col (2011) en un metaanálisis muestran que el tratamiento con inhibidores de la DPP4 disminuye el riesgo de fractura. Bunk et al (2012), por el contrario, no mostraron relación del tratamiento con inhibidores de la DPP-4 en el remodelado óseo (Bunck et al 2012).

Más recientemente se ha mostrado asociación de la actividad de la DPP-4 con el riesgo de osteoporosis (Zheng et al 2015), y con el riesgo de fractura (Kim et al 2017). Los resultados demuestran que existe una relación positiva y significativa entre actividad de la DPP-4 con los marcadores de remodelado óseo: osteocalcina, propéptido y CTX, coincidiendo con los resultados de Notsu et al (2016), donde también se muestra una asociación de los marcadores de remodelado óseo con la DPP-4 (Notsu et al 2016).

Hay que tener en cuenta las limitaciones del estudio debido a que es un estudio transversal, y se ha realizado una sola determinación analítica.

Aunque no se ha demostrado que en pacientes osteoporóticos exista una disminución significativa de los niveles de GLP-1 , GLP-2, PYY o aumento de la actividad DPP4, sí se ha comprobado que:

GLP-2 se relaciona de forma positiva con la MO en columna lumbar en pacientes con osteoporosis.

GLP-1 disminuye el riesgo de osteoporosis.

- La actividad de la DPP4 se relaciona de forma positiva y significativamente con los marcadores de remodelado óseo.

Hacen falta más estudios que profundicen en la relación existente entre Pl y tejido óseo. Ejemplo 5. Modelo de regresión logística multivariante para la clasificación de pacientes en casos y controles

Se plantea un modelo multivariante siendo la variable dependiente la que mide si los pacientes son casos o controles, y como variables independientes GLP-1 , CTX y Z-score lumbar.

En el modelo se incluye la información de 102 pacientes, ya que 19 presentan valores perdidos.

La Pruebas ómnibus sobre los coeficientes del modelo indica que el modelo calculado es estadísticamente significativo, p_valor=0,000 (tabla 1).

Tabla 1. Pruebas ómnibus sobre los coeficientes del modelo

El coeficiente R cuadrado de Cox y Snell indica que el modelo explica el 69,4% de la variabilidad de la variable dependiente, lo que demuestra que el modelo es muy adecuado.

La Prueba de Hosmer y Lemeshow comprueba que la clasificación que hace el modelo de los pacientes a la osteoporosis no difiere significativamente de la realidad, lo cual significa que el modelo clasifica de forma correcta, p_valor= 1 ,000. Tabla 2. Prueba de Hosmer y Lemeshow

En la siguiente tabla (tabla 3) se puede comprobar que las frecuencias observadas y esperadas no difieren apenas.

Tabla 3. Tabla de contingencias para la prueba de Hosmer y Lemeshow

El modelo clasifica correctamente el 97, 1 % de los casos (tabla 4), además presenta altos valores de sensibilidad, especificidad, VPN y VPP (tabla 5).

Tabla 4. Tabla de clasificación

Tabla 5. Tabla de valores de sensibilidad, especificidad, VPN y VPP.

De acuerdo a esta información se puede comprobar que el ajuste del modelo calculado es adecuado.

Finalmente, en el modelo obtenido se puede ver que tanto GLP-1 y ZSCORCOLUM son variables estadísticamente significativas en el modelo (p_valor = 0,009 y p_valor = 0,001 respectivamente), mientras que la variable CTX no es significativa pero permanece en el modelo por su importancia en el estudio (tabla 6). Tabla 6. Variables en la ecuación.

Por lo que finalmente se obtiene una ecuación para clasificar a los pacientes con riesgo de padecer osteoporosis:

Probabilidad de padecer Osteoporoás = _{1 + g(} _ _0j068 «GLP^ _^ c^is^zscoRELUMB R^oie) De este modo, cuando se evalúe un nuevo paciente, si el resultado de la ecuación es mayor de 0,5 será clasificado como paciente osteoporótico. Mientras que si el resultado es inferior a 0,5 será clasificado como paciente no osteoporótico.

Para determinar la capacidad predictiva del modelo se calcula la Curva ROC con los valores de las probabilidades pronosticadas del modelo y la variable dependiente original. Los resultados indican que área bajo la curva ROC es de 0,994, es decir la capacidad predictiva del modelo es del 99,4%, por lo que el modelo tiene una capacidad predictiva muy alta (Figura 1).

Finalmente, como el estudio de regresión planteado incluye variables cuantitativas se ha realizado un estudio de la linealidad en el logit. A través de los coeficientes de correlación de Pearson se comprueba que dicha linealidad existe y es estadísticamente significativa (Tabla 7). Tabla 6. Correlaciones.

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