La présente invention concerne le domaine de l'ingénierie cellulaire et tissulaire du cartilage, et en particulier la culture de chondrocytes ou de chondrocytes obtenus à partir de cellules souches mésenchymateuses in vitro ou ex vivo, notamment en vue d'une thérapie cellulaire.

Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés et l'utilisation de ces chondrocytes pour le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique et des maladies ostéo-articulaires, en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose.

L'incidence importante des pathologies caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage est au moins en partie due au fait que ce tissu a un potentiel de réparation spontané très limité. Actuellement, les traitements médicamenteux des dégénérescences du cartilage ne sont que palliatifs et n'empêchent pas l'évolution de la destruction. Dans les stades ultimes, la mise en place de prothèse est incontournable.

La transplantation de chondrocytes autologues (TCA), initiée par Brittberg en 1994 pour le traitement de lésions du cartilage articulaire du genou, consiste à isoler par extraction enzymatique les chondrocytes à partir d'un prélèvement de petite taille et de faible morbidité. Cette approche thérapeutique, mondialement utilisée, implique une amplification cellulaire en culture sur plastique. Cette technique est actuellement indiquée pour le traitement de lésions limitées de cartilage. Pour combler des lésions plus importantes et en vue d'appliquer la technique aux lésions arthrosiques débutantes, la technologie s'oriente vers la combinaison de chondrocytes autologues avec des biomatériaux pour la transplantation, comme des gels de collagène. Cependant, l'amplification des chondrocytes en culture monocouche en vue d'une greffe directe ou après combinaison avec un biomatériau s'accompagne d'une dédifférenciation cellulaire, ce qui se traduit, in vivo, par la formation d'un fibrocartilage non-fonctionnel. L'implantation de chondrocytes autologues est donc une technique qui reste perfectible au niveau du contrôle de l'expression du phénotype des chondrocytes, soit lors de leur amplification en culture, soit au sein d'un biomatériau. Elle ne permet pas de reproduire un cartilage hyalin fonctionnel, riche en collagène de type II. Le tissu synthétisé est un fibrocartilage, riche en collagène de type I, ne possédant pas les mêmes propriétés biomécaniques que peut conférer un cartilage sain riche en collagène de type II, ce qui oblige à renouveler l'intervention à terme car ce fibrocartilage de substitution sera dégradé à son tour.

Ainsi, les besoins thérapeutiques pour le traitement de ces affections ne sont pas satisfaits, notamment parce qu'il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement permettant de restaurer le phénotype chondrocytaire. C'est dans ce contexte que la présente invention se propose de fournir un procédé d'obtention de chondrocytes articulaires différenciés in vitro ou ex-vivo capables de synthétiser du cartilage de type hyalin fonctionnel et ainsi conférer les propriétés biomécaniques améliorées de ce type de cartilage par rapport au fibrocartilage.

La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, les étapes suivantes :

- mettre en culture des chondrocytes articulaires dédifférenciés ou différenciés ou des cellules souches mésenchymateuses,

- cultiver ces cellules dans des conditions de faible tension en oxygène, en présence de BMP-2 (« Bone Mofphogenetic Protein-2 ») et dlnhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I.

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont démontré que les conditions de culture mises en œuvre dans le procédé tel que décrit ci-dessus permettent de promouvoir un phénotype chondrocytaire stable et le plus différencié possible, et notamment caractérisé par un index de différenciation accru. En particulier, la combinaison des conditions de culture en faible tension d'oxygène, en présence de BMP-2 et d'inhibiteur du collagène de type I favorise l'augmentation des marqueurs spécifiques du cartilage (collagène de type II et agrécanne notamment) tout en diminuant les marqueurs non spécifiques du cartilage.

Les conditions de mise en œuvre du procédé selon l'invention permettent de limiter le phénomène de dédifférenciation cellulaire inhérent à la culture cellulaire monocouche des chondrocytes in vitro ou ex vivo, et de maintenir et/ou d'induire un phénotype chondrocytaire stable. Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir in vitro des chondrocytes matures différenciés qui présentent les caractéristiques de cellules issues d'un cartilage de type hyalin sain et fonctionnel. Dans le cadre de ce procédé, on peut utiliser des chondrocytes articulaires (c'est-à-dire provenant de cartilage de différentes localisations anatomiques) différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses qui sont par définition indifférenciées. De préférence, les cellules qui sont utilisées dans le procédé selon l'invention sont des chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés, en particulier des chondrocytes articulaires adultes, notamment humains ou équins. Les chondrocytes articulaires ou les cellules souches mésenchymateuses peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier permettant de récupérer ces cellules à partir de tout échantillon biologique susceptible de les contenir.

Les cellules souches mésenchymateuses utilisées peuvent provenir de sources variées, comme par exemple de moelle osseuse, de tissu adipeux, de sang de cordon ombilical, d'origine musculaire, de lignée germinale, embryonnaires, cellules souches pluripotentes induites (iPS), etc. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les cellules utilisées sont choisies parmi les cellules souches de moelle osseuse et les progéniteurs non-hématopoïétiques du sang de cordon.

Les cellules qui sont mises en culture, c'est-à-dire les chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses, peuvent être d'origine animale, et de préférence humaine ou équine.

Dans le cas particulier de l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines, on utilisera des cellules souches non issues de la destruction d'embryons humains, comme par exemple des cellules souches pluripotentes induites (iPS).

De préférence, les cellules souches mésenchymateuses utilisées sont non- humaines lorsque ce sont des cellules souches mésenchymateuses embryonnaires ou de lignée germinale.

Les chondrocytes articulaires différenciés utilisés dans le cadre du procédé de l'invention sont de préférence issus de sujets sains, mais il est également possible d'utiliser des chondrocytes dédifférenciés, et notamment issus de malades, en particulier de malades souffrant de maladie ostéo-articulaire, en particulier caractérisée par une destruction ou une dégénérescence du cartilage. Selon un mode de réalisation particulier, les chondrocytes articulaires dédifférenciés utilisés sont issus du patient destiné à recevoir les chondrocytes qui seront obtenus par la mise en œuvre du procédé de l'invention (greffe autologue). Il est également possible de pratiquer une greffe autologue en utilisation des cellules souches mésenchymateuses pour obtenir des chondrocytes selon l'invention qui seront implantés chez un patient malade, et en particulier souffrant de pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique ou atteint de maladie ostéo-articulaire, en particulier caractérisée par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose.

Dans le cadre du procédé selon l'invention, il est également possible d'utiliser des co-cultures de chondrocytes articulaires différenciés et/ou dédifférenciés et/ou de cellules souches mésenchymateuses.

Selon la présente invention, les chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés dans des conditions de faible tension en oxygène, c'est-à-dire en condition d'hypoxie. De préférence, on utilise des conditions de culture inférieures ou égales à 10% d'0 ₂ , de préférence comprise dans une gamme allant de 1 à 10 %, et en particulier de 1 à 5 % d'0 ₂ .

Les cellules utilisées dans le procédé de l'invention sont cultivées dans un milieu de culture classique, par exemple DMEM, adapté au type cellulaire choisi, à savoir chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou cellules souches mésenchymateuses.

Les chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses utilisées dans le procédé de l'invention peuvent être cultivés sous forme de culture monocouche ou bien de préférence au sein d'un biomatériau. Par « biomatériau », on entend toute structure tridimensionnelle colonisable par des cellules, en particulier par des chondrocytes, et de préférence susceptible de pouvoir être implantée in vivo. Ainsi, le biomatériau utilisé dans le cadre de l'invention est biologiquement inactif et de préférence biodégradable. Parmi les exemples de biomatériau qui peuvent être utilisés, on peut notamment mentionner des gels de collagènes, des éponges de collagène de type I ou de type II, des gels d'alginate, des gels d'acide hyaluronique, ou de type PLGA (poly(lactic- co-glycolic acid)), ou encore d'autres matrices naturelles ou synthétiques, ou des combinaisons de ces différentes matrices. De préférence, les chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés ou les cellules souches mésenchymateuses sont cultivés au sein d'épongés de collagène de type I.

Selon la présente invention, la culture des chondrocytes articulaires différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses est réalisée en présence de BMP-2. Pour ce faire, il est possible d'ajouter directement la molécule BMP-2 dans le milieu de culture. Il est également possible d'utiliser des moyens permettant de maintenir sa présence dans le milieu de culture, par exemple en stimulant sa production et/ou en empêchant sa dégradation et/ou son inactivation ou celles de son récepteur. Par conséquent, on peut ajouter directement dans le milieu de culture une BMP-2 recombinante (Inductos, Dibotermine-alpha, ou autre, pour sa forme médicamenteuse, ou sous sa forme recombinante), et de préférence de la même espèce que les cellules utilisées, c'est- à-dire une BMP-2 humaine dans des cellules humaines, une BMP-2 équine dans des cellules équines, etc. Selon l'invention, on utilisera de préférence la BMP-2 humaine de référence NP_ 001191.1 (GL4557369, 11 septembre 2011)(SEQ ID NO : 1) ou la BMP-2 équine de référence XP_001493945.1 (GI: 149733087, 27 juin 2011)(SEQ ID NO : 2).

Selon un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, on utilise tout moyen permettant de maintenir la présence de BMP-2 dans le milieu de culture, directement ou indirectement, et notamment en stimulant sa production et/ou en empêchant la dégradation de son récepteur et/ou son inactivation. Par exemple, la présence de BMP-2 peut être obtenue par tout moyen permettant d'empêcher la présence ou d'inactiver l'action de toute molécule capable de dégrader ou d'inactiver la BMP-2, telle que des protéases et en particulier la protéase HTRA1 (Hig Température Requirement Protein ï) décrite par Zumbrunn J. et Trueb B., 1996, FEBLS Letter 398 : 187-192, ou les membres de la famille HTRA1. En particulier, l'action de la BMP-2 peut être maintenue en utilisant un siRNA HTRA1 afin d'empêcher la dégradation du récepteur à la BMP-2.

De manière particulièrement avantageuse, la présence de BMP-2 est assurée à la fois par ajout de la molécule BMP-2 directement dans le milieu de culture et en empêchant sa dégradation et/ou son inactivation ou celle(s) de son récepteur. Dans le cadre de ce mode de réalisation particulier, la présence de BMP-2 est assurée à la fois par ajout de la molécule BMP-2 directement dans le milieu de culture et en empêchant la protéase HTRA1 d'inactiver l'action de la BMP-2, de préférence par l'utilisation d'un siRNA HTRA1.

Lorsque la présence de BMP-2 est obtenue par ajout direct de cette protéine dans le milieu de culture, celle-ci est ajoutée en une concentration finale comprise dans une gamme allant de 10 à 200 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 50 ng/ml. La portée de ta présente invention n'est pas limitée à la BMP-2 en particulier. L'effet de la présence de BMP-2 lors de la culture des chondrocytes ou des cellules souches mésenchymateuses selon l'invention peut également être obtenu par la présence de toute autre molécule, ou cytokine en particulier, susceptible d'avoir les mêmes effets ou des effets similaires à ceux induits par BMP- 2 sur la différenciation chondrocytaire. En particulier, la présence de BMP-2 dans le cadre de l'invention peut être obtenue par tout autre membre de la famille BMP capables d'induire les mêmes effets ou des effets similaires à ceux induits par BMP- 2 sur la différenciation chondrocytaire.

D'autres cytokines peuvent éventuellement être ajoutées au milieu de culture, seules ou en mélange. Par exemple, le milieu de culture peut également contenir du TGF-βΙ par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, du TGF- 3 par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, de I1GF-1 par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 1 à 50 ng/ml, et de préférence de l'ordre de 10 ng/ml, de l'estradiol par exemple à une concentration finale comprise dans une gamme allant de 0,5 à 5 nM, et de préférence de l'ordre de 1 nM.

Différentes combinaisons de ces cytokines peuvent ainsi être utilisées lorsque le procédé de l'invention est mis en œuvre à partir de chondrocytes différenciés et/ou dédifférenciés et/ou de cellules souches mésenchymateuses. Par exemple, la présence de TGF-βΙ est préférée lorsque le procédé selon l'invention est mis en œuvre à partir de cellules souches mésenchymateuses, et en particulier de cellules souches mésenchymateuses issues de moelle osseuse.

Selon la présente invention, la culture des chondrocytes différenciés ou dédifférenciés ou des cellules souches mésenchymateuses est également réalisée en présence d'inhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I.

Par « inhibiteur(s) spécifique(s) du collagène de type I », on entend toute(s) molécule(s) capable(s) d'empêcher la présence ou d'inhiber l'activité, directement ou indirectement, du collagène de type I de manière spécifique. En particulier, une telle molécule n'inhibera pas de manière significative la présence et/ou l'activité d'autres facteurs et notamment des facteurs indispensables à la différenciation chondrocytaire, tels que le collagène de type II notamment. Cette inhibition spécifique du collagène de type I peut être réalisée à tous les niveaux : gène, messager, protéine etc. S'agissant d'inhibiteurs du collagène de type I au niveau du messager, on peut utiliser des agents d'interférence par i'ARN tels que des siRNA, et ceci constitue un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention. Il est également possible d'utiliser des inhibiteurs qui ciblent des facteurs de transcription qui modulent l'expression des gènes codant le collagène de type I, et éventuellement qui modulent à la fois l'expression des gènes codant le collagène de type I et II. En particulier, des inhibiteurs modulant de manière différentielle l'expression de ces gènes peuvent être utilisés, comme par exemple les facteurs c- Krox « collagen-Krox » et Sp3 « Spécifie protein-3 » qui sont des activateurs de l'expression du gène codant le collagène de type I et des inhibiteurs de l'expression du gène codant le collagène de type II. Il est également possible de cibler la sous- unité p65 du facteur NF-kappaB « Nuclear Factor-kappaB » qui inhibe la transcription du gène du collagène de type IL

La présence de BMP-2 et l'inhibition du collagène de type I peuvent être obtenues à l'aide de toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, toute méthode permettant l'introduction active ou passive de molécule(s) capable(s) de produire ces effets. Pour une action au niveau intracellulaire, toute méthode d'introduction des molécules nécessaires à l'obtention de ces effets peut être utilisée. De préférence, on utilise une méthode d'introduction active de ces molécules, notamment par transfection dans les cellules. Pour cela, on peut utiliser tout agent transfectant, et notamment des liposomes, des polyéthylèneimines, des cations polymériques, etc. Il est également possible d'utiliser une méthode d'introduction passive de ces molécules, notamment par diffusion ou par endocytose naturelle des molécules permettant de conduire les effets désirés cités ci-dessus.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, on utilise une stratégie d'interférence par I'ARN, et en particulier des siRNA, pour à la fois maintenir l'action de la BMP-2 et inhiber la synthèse du collagène de type I dans le milieu de culture pour obtenir des chondrocytes articulaires selon l'invention. Dans le cadre de ce mode de réalisation préféré, la présence de BMP-2 est elle- même assurée à la fois par l'ajout de la molécule BMP-2 directement dans le milieu de culture et également par l'utilisation d'un moyen permettant d'empêcher la protéase HTRA1 dlnactiver le récepteur de la BMP-2, et en particulier par l'utilisation d'un siRNA HTRA1. Par conséquent, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, les chondrocytes articulaires différenciés ou les cellules souches mésenchy mate uses sont cultivés dans des conditions de faible tension en oxygène. Dans ce procédé, les inhibiteurs du collagène de type I sont des siRNA et la présence de BMP-2 est assurée par l'ajout de BMP-2 directement dans le milieu de culture et par l'utilisation d'un siRNA HTRA1.

De manière similaire, lorsque ce sont des cellules souches mésenchymateuses qui sont utilisées, celles-ci sont cultivées de préférence également en présence de TGF-βΙ. Plus particulièrement, leur culture est réalisée dans des conditions de faible tension en oxygène, avec des siRNA en tant qu'inhibiteurs du collagène de type I, avec ajout de BMP-2 directement dans le milieu de culture et par utilisation d'un siRNA HTRA1, en combinaison avec du TGF- βΐ.

De préférence, et en particulier dans le cas d'utilisation médicale ultérieure des chondrocytes obtenus selon le procédé de l'invention, les moyens utilisés pour maintenir l'action de la BMP-2 dans le milieu de culture et pour inhiber ie collagène de type I sont choisis de façon à induire ces effets de manière transitoire, en particulier sans impliquer la transformation stable du génome des chondrocytes, afin de pouvoir éliminer toute trace de ces moyens utilisés lors de la culture in vitro ou ex vivo avant l'implantation des chondrocytes au sein de l'organisme receveur, et notamment de l'articulation pathologique.

De préférence, les différentes étapes du procédé selon l'invention sont réalisées dans l'ordre suivant : taux d'oxygène, présence de BMP-2 puis inhibition du collagène de type I. Dans le cas où les cellules sont cultivées au sein d'un biomatériau, la colonisation dudit biomatériau est de préférence réalisée en premier lieu, avant la réalisation des trois étapes mentionnées ci-dessus. Cependant, l'ordre de réalisation des étapes du procédé de l'invention peut être quelconque et n'est pas limitant.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet des chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus par la mise en œuvre du procédé selon l'invention qui est décrit ci-dessus et qui présentent un index de différenciation, c'est-à-dire un rapport protéique collagène de type II / collagène de type I significativement accru, de préférence d'au moins un facteur 1,5 et/ou un rapport des taux moyens des ARNm des collagènes de types II, IX, XI/COL1A1 ou Agrécanne/COLIAI significativement augmenté, de préférence au moins d'un facteur 7,5 par rapport à des cellules non re-différenciées. En particulier, l'invention concerne des chondrocytes articulaires différenciés qui sont directement obtenus par le procédé selon l'invention qui est décrit ci-dessus et qui présentent cet index de différenciation.

Ces chondrocytes peuvent être présents au sein d'un biomatériau et l'ensemble biomatériau/chondrocytes constitue également un autre objet de la présente invention.

De préférence, les chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus selon l'invention sont caractérisés par le fait qu'ils ne présentent pas ou peu d'expression du collagène de type I et/ou ne le produisent pas ou peu au niveau protéique mais expriment et synthétisent de manière significative préférentiellement le collagène de type II et l'agrécanne.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet les chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus pour leur utilisation en tant que médicament.

Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a aussi pour objet les chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus pour leur utilisation dans le traitement des pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, des maladies ostéo- articulaires, et en particulier les maladies qui sont caractérisées par une destruction ou une dégénérescence du cartilage, comme l'arthrose.

Cet aspect de l'invention peut également être défini comme l'utilisation des chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, les maladies ostéo- articulaires, et en particulier les maladies qui présentent une destruction ou une dégénérescence du cartilage, telles que l'arthrose par exemple.

Dans le cadre de l'invention, les chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention peuvent être utiles pour ou bien utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à traiter et/ou prévenir et/ou ralentir les pertes de substance chondrale liée ou non à un choc traumatique, ainsi que la destruction ou la dégénérescence du cartilage associée(s) aux maladies ostéo-articulaires, telles que l'arthrose par exemple.

Dans le cadre de ces applications médicales, l'administration des chondrocytes articulaires différenciés obtenus selon le procédé de l'invention peuvent être administrés directement au sein des lésions lorsqu'ils ont été obtenus par culture monocouche. Les chondrocytes articulaires différenciés qui sont obtenus au sein d'un biomatériau par le procédé selon l'invention peuvent être implantés au niveau des lésions à traiter. Selon un mode de réalisation préféré, les chondrocytes implantés se présentent sous la forme d'un substitut biologique constitué de chondrocytes matures différenciés au sein d'un biomatériau selon le procédé de l'invention. Celui-ci pourra être positionné au niveau de la lésion et éventuellement maintenu en place in situ, par exemple à l'aide de colle biologique, notamment de colle à base de fibrine.

D'une manière générale, tous les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés pour le procédé d'obtention des chondrocytes s'appiiquent mutatis mutandis pour les chondrocytes articulaires différenciés susceptibles d'être obtenus par ce procédé et pour toute composition ou médicament les contenants et leurs utilisations.

D'autres aspects et avantages de l'invention seront mieux compris au vu des exemples ci-après qui permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. Ces exemples se réfèrent aux figures annexées :

La figure 1 représente la quantité des messagers, mesurée par RT-PCR quantitative, du collagène de type I ou COLIAI (A), du collagène de type II ou COL2A1 (B) et sur le rapport des messagers des gènes COL2A1 ZQLÎM (C) après l'effet des siRNA COLIAI et/ou de la BMP-2 dans des chondrocytes articulaires humains (CAH).

La figure 2 représente la détection par « Western Blot » du collagène de type I et de type II après l'effet des si RIMA COLIAI et/ou de la BMP-2 dans des chondrocytes articulaires humains (CAH).

La figure 3 représente l'effet des siRNA COLIAI et/ou de la BMP-2 sur (A) la quantification des taux protéiques du collagène de type I par ELISA (n=4), (B) la quantification des taux protéiques du collagène de type II par ELISA (n=4 à 24h et n=3 à 48h) et (C) le ratio protéique du collagène de type II/ type I par ELISA (n=4 à 24h et n=3 à 48h) après l'effet des siRNA COLIAI et/ou de la BMP-2 dans des chondrocytes articulaires humains (CAH).

La figure 4 représente la quantité des messagers, mesurée par RT-PCR quantitative, du collagène de type I ou COLIAI (A), de HTRAl (B), et sur le rapport des messagers des gènes COL2A1/COL1A1 (C), Agrécanne/COLIAI (D), COL9A1/COL1A1 (E), COL11A1/COL1A1 (F), COL2B/COL1A1 (G) après l'effet des siRNA COLIAI et ou Htral et/ou de la BMP-2 dans des chondrocytes articulaires humains (CAH).

La figure 5 représente l'index de différenciation des chondrocytes de cartilage sain ou arthrosique (rapport des messagers, mesurée par RT-PCR quantitative, des gènes COL2A1/COL1A1, Agrécanne (ACAN)/C0L1A1, COL9A1/COL1A1 et COL11A1/COL1A1).

La figure 6 représente la détection par « Western Blot » du collagène de type I, de type II, de HTRAl et du collagène de type X après l'effet des siRNA COLIAI et/ou Htral et/ou de la BMP-2 dans des CAH.

La figure 7 représente la détection par immunofluorescence du collagène de type I et de type II sur des chondrocytes articulaires (CAH) après l'effet des siRNA COLIAI et/ou Htral etyou de la BMP-2.

La figure 8 représente la détection en immuno-histochimie du collagène de type I et de type II sur des chondrocytes articulaires (CAH) en présence ou en absence de la BMP-2 (A), des siRNA COLIAI en présence ou en absence de la BMP- 2 (B), des siRNA Htral en présence ou en absence de la BMP-2 (C), et des siRNA COLIAI et siRNA Htral, en présence ou en absence de la BMP-2 (D).

La figure 9 représente la quantité des messagers, mesurée par RT-PCR quantitative, du collagène de type II ou COL2A1 (A), du collagène de type I ou COLIAI (B), de HTRAl (C), de l'agrécanne (D), de COL10A1 (E), de COL3A1 (F) et le rapport des messagers des gènes COL2A1/COL1A1 (G) et Agrécanne/COLIAI (H), après l'effet des siRNA COLIAI et/ou Htral en présence ou en absence de la BMP-2 et de TGF-βΙ dans les cellules souches mésenchymateuses.

La figure 10 représente la détection par « Western Blot » du collagène de type I, de type II, de type III, de type X et de HTRAl, après l'effet des siRNA COLIAI et/ou Htral en présence ou en absence de la BMP-2 et de TGF-βΙ dans les cellules souches mésenchymateuses.

La figure 11 représente le profil phénotypique établi pour des chondrocytes isolés à partir de cartilage sain et les profils phénotypiques des chondrocytes issus de cellules souches mésenchymateuses après l'effet des siRNA COLIAI et/ou Htral en présence ou en absence de la BMP-2 et de TGF-βΙ. Les résultats de cette figure ont été obtenus avec une concentration de siRNAs de 100 nM. EXEMPLE 1 ; MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON L'INVENTION A PARTIR DE CHONDROCYTES ARTICULAIRES HUMAINS METHODOLOGIES .

SiRNAs :

siRNA COL1A1 (collagène de type I, alpha l)(brins sens et antisens),

Hs_COLlAl_6 HP Validated SiRNA (SI02757363), Qiagen.

Sens : 5'- CAAU CACC UGCG U ACAGAA - 3' (SEQ ID NO : 3)

Anti-sens : 5'- UUCUGUACGCAGGUGAUUG - 3' (SEQ ID NO : 4)

Séquence cible : ACC AAT CAC CTG CGT ACA GAA (SEQ ID NO : 5)

siRNA contrôle ou « Contrôle négatif » (siRNA double brin), Qiagen (n°

1022076)

Sens : 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU - 3' (SEQ ID NO : 6)

Anti-sens : 5'- ACGUGACACGUUCGGAGAA - 3' (SEQ ID NO : 7)

Séquence cible : AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT' (SEQ ID NO : 8)

rhBMP-2 P'recombinant human Bone Morphoqenetic Protein-2") : L'ADNc codant la BMP-2 humaine (R&D Systems) est exprimé dans des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary cells »). Après clivage protéolytique du peptide signal et du propeptide, la BMP-2 recombinante mâture forme un homodimère ou des hétérodimères avec d'autres membres de sa famille (exemple avec BMP-7), chaque monomère étant chacun constitué de 114 acides aminés. La BMP-2 a été ajoutée au milieu de culture à une concentration finale de 50 ng/ml.

Eponges de collaqènes de type I (SYMATESE Biomatériaux, Chaponost, France) : Elles sont caractérisées par un diamètre de 5 mm et une épaisseur de 2 mm. Elles présentent une structure tridimensionnelle adéquate à la culture 3D. Les réseaux de fibres de collagène I forment des pores dont le diamètre moyen est de 150 pm. Ce biomatériau est d'origine bovine, et avec ses fibres de collagène I réticulées, il est biologiquement inactif et biodégradable.

Culture cellulaire : Les chondrocytes articulaires humains (CAH) ont été prélevés sur des têtes fémorales lors de la mise en place d'une prothèse chez des patients atteints d'arthrose. Le cartilage a été disséqué en copeaux, puis ces derniers ont été digérés par deux enzymes, la pronase (Sigma-AIdrich, 2 mg/ml, 45 minutes) et la collagénase (Sigma-AIdrich, 2 mg/ml, 15 heures). Le lendemain, les copeaux de cartilage non digérés ont été éliminés par passage de la suspension cellulaire sur filtre nylon de 70 pm. Après centrifugation, le culot cellulaire a été repris dans du DMEM (« Dulbecco's modified Eagle Médium, Fisher Bioblock Scientific »). Le nombre de cellules a été déterminé par comptage sur une cellule de Malassez. Les CAH ont ensuite été ensemencés dans des boîtes de culture à raison de 4.10'' cellules / cm ² et cultivés à 37°C, dans un environnement à 5% de C0 ₂ . Les chondrocytes ont ainsi été amplifiés en culture monocouche.

Nucléofection : Les si RIMA (siRNA contrôle ou siRNA COL1A1) ont été incorporés dans les chondrocytes en employant la technique de nucléofection (Nucleofector ^® II, Lonza). Tout d'abord, les cellules ont été amplifiées en culture monocouche et n'ont subi qu'un seul passage afin de limiter leur dédifférenciation. Une fois à confluence, celles-ci ont été décollées par un mélange trypsine-EDTA (0,25% trypsine/1 mM EDTA, Fisher Bioblock Scientific). La transfection a été réalisée à partir de 2 millions de cellules à l'aide d'une solution de nucléofection contenant un microgramme (50 nM) de siRNA. Une fois transfectés, les chondrocytes sont restés une heure à 37°C dans du milieu DMEM («Dulbecco's modified Eagle Médium», Fisher Bioblock Scientific) supplémenté par 20% de SVF, (Fisher Bioblock Scientific). Après centrifugation, ils ont été ensemencés à raison de 500 000 cellules par éponge de collagène et mis à sécher pendant une heure pour permettre l'adhérence à l'éponge de collagène. Pour finir, les chondrocytes ont été placés en hypoxie, en présence ou non de 50 ng/ml de rhBMP-2 pendant une période de 24 à 48h.

« Western-blot » : Les cellules ensemencées dans les éponges de collagène de type I ont été rincées au PBS IX (« Phosphate Buffered Saline », Fisher Bioblock Scientific) et lysées à raison de 100 μΙ de tampon RIPA (« Radioimmunoprecipitatton assay buffer ») par éponge, puis ont ensuite été agitées (vortex) toutes les 10 minutes pendant une heure. L'extraction protéique s'est poursuivie en retirant chaque éponge et en les pressant une à une afin de récupérer le maximum de protéines. Le surnageant contenant les extraits cytoplasmiques a enfin été prélevé après une centrifugation de 30 minutes à 14000 g. La concentration en protéines de nos échantillons a été déterminée par la méthode de Bradford. 20 pg de chaque échantillon a été mis en contact avec un tampon de dénaturation (2,5 ml de glycérol 100%; 2 ml de SDS 10%; 1 ml de bleu de bromophénol 1%; 600 pl de Tris-HCI 1M pH 6,8; 0,5 ml de 13-mercaptoéthanol) et chauffés à 95°C pendant 5 minutes. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) a été effectuée. Les protéines du gel ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinylidène DiFluoride, Millipore) par un électro-transfert de 1 h 30. La membrane ayant été au préalable activée par trois bains successifs : méthanol 100% (1 min), eau distillée (deux fois 1 min) et tampon de transfert IX (15 min). A la fin du transfert, la membrane a été lavée par du « Tris Buffered Saline-Tween » (TBS-T). Le blocage des sites non spécifiques de la membrane a été réalisé par une incubation dans du TBS-T contenant 10% de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante et sous agitation. La membrane a ensuite été lavée par du TBS-T puis incubée pendant 15 h à 4°C en présence de l'anticorps primaire (Ac I ^aire ) dirigé contre la protéine d'intérêt (Collagène de type II, l/2000 ^ème , Novotec, Collagène de type I, l/3000 ^ème , Novotec, GAPDH (Glyceraldéhyde 3 Phosphate Déshydrogénase), l/2000 ^eme , Santa Cruz Biotechnology). Le lendemain, une série de rinçages de la membrane a été effectuée avec du TBS-T, puis celle-ci a été incubée en présence de l'anticorps secondaire (Ac II ^aire , anti-lapin, l/6000 ^ème , Tebu-Bio) 1 h à température ambiante. Les protéines ont enfin été révélées à l'aide d'un kit de détection (« Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate », PIERCE).

ELISA (« Enzyme-linked immunosorbant assay », TECOmedical SARL) : Les expériences ELISA ont été réalisées à partir des surnageants de culture selon les instructions du kit. Les niveaux protéiques du C-propeptide du Procollagène de type II ont été évalués selon la méthode dite de « compétition » alors que ceux de la partie C-terminale du collagène de type I ont été appréciés via la méthode dite « sandwich ».

RT-PCR temps réel : Les cellules ont été lysées avec du TRIzol Reagent®,

Invitrogen. 1 pg d'ARN total a été traité par 1 μΙ de désoxyribonucléase I (DNase I, Invitrogen) pendant 15 min à 25°C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 1 μΙ d'EDTA 0,5 m M, puis suivie par une incubation de 10 min à 65°C. Les échantillons digérés par la DNase ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc. La réaction a été réalisée en présence d'un mélange composé de 5 μΙ du tampon de la transcriptase inverse 10X, de 1 μΙ de la transcriptase inverse « Moloney Murine Leukemia virus » à 200 unités/μΙ (MMLV, Fisher Bioblock Scientific), de 1 μΙ d'oligodT, de 2 μΙ d'un mélange des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 μΜ au final, Fisher Bioblock Scientific) et de 1 μΙ de RNAse-out (40 U/μΙ, Invitrogen). Le volume a été complété à 15 μΙ avec de l'eau traitée par le DEPC (di-éthyl-pyro- carbonate). La réaction de transcription inverse s'est faite pendant une période de 1 h à 37°C, précédée d'un cycle de chauffage de 10 min à 25°C. Après la transcription inverse, les échantillons d'ADNc obtenus ont été dilués au l/100 ^ème puis utilisés dans des expériences de PCR en temps réel. Pour ce faire, l'amplification du gène étudié a été réalisée en triplicate dans des plaques de 96 puits, selon les instructions de l'appareil « ABI Prism 7000 SDS » (Applied Biosystems). Les échantillons ont été amplifiés à l'aide d'un mélange SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) et à l'aide des amorces tel que décrit dans le Tableau 1 ci-dessous. Les taux d'ARNm des gènes COLIAI et COL2A1 ont été estimés après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13.

Tableau 1

Analyses statistiques :

Pour les RT-PCR et les ELISA, les résultats sont représentés sous forme de « Box- plot » ou boîte à moustache, représentant n expériences réalisées de façon indépendante. Cette méthode permet de représenter sur le graphique les valeurs minimales et maximales, le premier quartile, le deuxième quartile ou la médiane, le troisième quartile, ainsi que la moyenne des expériences. Le test U de Mann- Whitney a été utilisé pour déterminer les différences significatives entres les groupes contrôles et traités. Les valeurs de P<0,05 sont considérées significatives.

RESULTATS

L'inhibition de la synthèse du collagène de type I et son effet ont été suivis au niveau des ARN messagers et au niveau protéique à l'aide d'expériences de RT-PCR (« Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ») en temps réel ainsi que de « Western-blot » et d'ELISA (« Enzyme-linked immunosorbent assay »), comme décrit ci-dessus dans la partie méthodologies (Exemple 1).

Effet des siRNA COLIAI sur les taux de messagers du collagène de type I.

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA ciblant le collagène de type I, puis cultivés dans des conditions hypoxiques (inférieur à 5% 0 ₂ ). Les taux d'ARNm du gène COLIAl ont été estimés par RT-PCR en temps réel après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13 (UA: Unité Arbitraire). Les résultats sont représentés sur la figure 1A sous forme de "box plots " correspondants à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicate. Pour chaque temps d'incubation, les différences significatives entre le contrôle et les cas traités, et entre les différents cas ont été déterminées par le test U de Mann-Whitney: *=p<0,05, ns=non significatif.

Ces résultats montrent que le siRNA COLIAl diminue fortement les taux moyens d'ARNm du collagène de type I lorsque des chondrocytes sont cultivés dans des éponges de collagène, en hypoxie, en présence de BMP-2 (« BMP-2 ») ou sans BMP-2 (« Contrôle ») et pendant 24 et 48 h. De plus, le siRNA possède une efficacité d'inhibition relative de 80 à 90%, et est capable de bloquer la légère augmentation de ces taux moyens induite par la BMP-2.

Effet des siRNA COLÎAl sur les taux de messagers du collagène de type II Les taux d'ARNm du gène COL2A1 ont été estimés par RT-PCR en temps réel comme décrit ci-dessus. Les résultats sont représentés sur la figure 1B. Ces résultats montrent que les taux moyens des messagers du collagène de type II ne sont pas affectés par la présence du siRNA contrôle et du siRNA COLIAl à 24h de culture, tout comme à 48h.

Rapport des taux de messagers des gènes COL2A1/COL1A1

Les taux d'ARNm des gènes COL2A1 et COLIAl ont été estimés comme décrit ci-dessus et le ratio taux d'ARNm de COL2A1 sur taux d'ARNm de COLIAl a été calculé dans les différentes conditions expérimentales. Ce rapport permet de définir l'index de différenciation des cultures de chondrocytes.

Les résultats sont représentés sur la figure 1C et montrent une augmentation de ce ratio suite à la transfection des chondrocytes avec le siRNA COLIAl et cultivés pendant 24 et 48 h. En conclusion, l'utilisation du siRNA COLIAl associé à un traitement par la BMP-2 induit et accroît la stabilité du phénotype chondrocytaire.

Effet des siRNA COLIAl sur les taux protéiques du collagène de type I et de type II

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA ciblant le collagène de type I ou des siRNA contrôle, puis cultivés dans des conditions hypoxiques (inférieur à 5% 0 ₂ ). Des extraits cytoplasmiques ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE en vue d'une analyse par « Western-Blot » avec des anticorps anti-collagène II, I, et anti-GAPDH.

Les résultats correspondant à un Western-Blot représentatif sont regroupés sur la figure 2. Ils montrent une importante diminution du taux protéique du collagène de type I en présence du siRNA COL1A1 alors que les taux protéiques du collagène de type II ne semblent pas être modifiés de manière significative.

Quantification des taux protéiques du collagène de type I par ELISA

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés comme décrit ci- dessus. La quantification du C-propeptide du collagène de type I a été réalisée par ELISA sur les surnageants de culture, puis rapportée à la quantité totale de protéines de l'échantillon. Les résultats sont représentés sous forme de "box plots" correspondant à 4 expériences indépendantes pour 24h et 3 expériences pour 48h. Pour chaque temps d'incubation, les différences significatives entre le contrôle et les cas traités, et entre les différents cas ont été déterminées par le test U de Mann- Whitney : *= p<0,05, ns= non significatif.

Les résultats sont regroupés sur la figure 3A et montrent une nette diminution des taux protéiques du collagène de type I, surtout après 48 h de culture des cellules. Ainsi, la concentration du collagène de type I passe en moyenne de 0,8 mg de CICP/g de protéines totales en présence du contrôle négatif, à 0,4 mg de CICP/g de protéines totales en présence de siRNA COL1A1.

Quantification des taux protéiques du collagène de type II par ELISA

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés comme décrit ci- dessus. La quantification du C-propeptide du collagène de type II a été réalisée par ELISA comme décrit ci-dessus.

Les résultats sont regroupés sur la figure 3B. Les analyses de quantification par ELISA des taux protéiques du collagène de type II rejoignent les résultats observés précédemment en « Western-blot ». En effet, le siRNA COL1A1 ne semble pas avoir d'effet significatif sur les taux protéiques du collagène de type II, à 24 h comme à 48 h de culture en éponge de collagène, en hypoxie, avec BMP- 2 (« BMP-2 ») ou sans B P-2 (« Contrôle »).

Quantification du ratio des taux protéiques du collagène de type II/ type I par ELISA.

La quantification du C-propeptide du collagène de type I et II a été réalisée par ELISA comme décrit ci-dessus et le ratio protéique du collagène de type II/ type l a été calculé. Les résultats sont regroupés sur la figure 3C et montrent une augmentation du ratio protéique collagène de type II sur collagène de type I à 24 h de culture en présence de siRNA COL1A1. Cet effet est également observé à 48 h d'incubation et la BMP-2 a un effet additif avec le siRNA COL1A1.

EXEMPLE 2 : MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON L'INVENTION A PARTIR DE CHONDROCYTES ARTICULAIRES HUMAINS METHODOLOGIES

SiRNAs :

Les siRNA COL1A1 et contrôle sont décrits ci-dessus à l'exemple 1.

siRNA HTRA1 (siRNA double brin), eurogentec.

Sens : 5'- CGGCCGAAGUUGCCUCUUUTT -3' (SEQ ID NO : 15)

Anti-sens : 5' - AAAGAGGC AACU U CGGCCGTT -3' (SEQ ID NO : 16)

Séquence cible : CGG CCG AAG TTG CCT CTT T (SEQ ID NO : 17)

rhBMP-2 "recombinant human Bone Morphoqenetic Protein-2" : L'ADNc codant la BMP-2 humaine (R&D Systems) est exprimé dans des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary cells »). Après clivage protéolytique du peptide signal et du propeptide, la BMP-2 recombinante mâture forme un homodimere ou des hétérodimères avec d'autres membres de sa famille (exemple avec BMP-7), chaque monomère étant chacun constitué de 114 acides aminés. La BMP-2 a été ajoutée au milieu de culture à une concentration finale de 50 ng/ml.

Éponges de collaqènes de type I (SYMATESE Biomatériaux, Chaponost, France) : Elles sont caractérisées par un diamètre de 5 mm et une épaisseur de 2 mm. Elles présentent une structure tridimensionnelle adéquate à la culture 3D. Les réseaux de fibres de collagène I forment des pores dont le diamètre moyen est de 150 m. Ce biomatériau est d'origine bovine, et avec ses fibres de collagène I réticulées, il est biologiquement inactif et biodégradable.

Culture cellulaire : Des chondrocytes articulaires humains (CAH) ont été prélevés sur des zones macroscopiquement saines d'un cartilage d'une articulation arthrosique (région non portante de cartilage au niveau d'une articulation saine) afin d'obtenir des chondrocytes qui ont été utilisés dans toute l'expérimentation. Le cartilage a été disséqué en copeaux, puis ces derniers ont été digérés par deux enzymes, la pronase (Sigma-AIdrich, 2 mg/ml, 45 minutes) et la collagénase (Sigma-AIdrich, 2 mg/ml, 15 heures). Le lendemain, les copeaux de cartilage non digérés ont été éliminés par passage de la suspension cellulaire sur filtre nylon de 70 pm. Après centrifugation, le culot cellulaire a été repris dans du DMEM (« Dulbecco's modified Eagle Médium, Fisher Bioblock Scientific »). Le nombre de cellules a été déterminé par comptage sur une cellule de Malassez. Les CAH ont ensuite été ensemencés dans des boîtes de culture à raison de 4.10 ⁴ cellules / cm ² et cultivés à 37°C, dans un environnement à 5% de C0 ₂ . Les chondrocytes ont ainsi été amplifiés en culture monocouche. Les cellules n'ont subi qu'un seul passage afin de limiter leur dédifférenciation. Une fois à confluence, celles-ci ont été décollées par un mélange trypsine-EDTA (0,25% trypsine/l mM EDTA, Fisher Bioblock Scientific) puis centrifugées. Après centrifugation, elles sont ensemencées à raison de 400 000 cellules par éponge de collagène et mis à sécher pendant une heure à 37°C pour permettre l'adhérence à l'éponge de collagène. 16h plus tard (J0) les chondrocytes ont été placés en hypoxie, en présence ou non de 50 ng/ml de rhBMP-2 dans du milieu DMEM («Dulbecco's modified Eagle Médium», Fisher Bioblock Scientific) contenant 2 % de SVF (Sérum de Veau Fœtal) puis sont cultivés pendant une période de 7 jours.

Parallèlement, des copeaux de cartilage ont été préparés à partir de prélèvements faits au sein même de la région arthrosique sur des têtes fémorales lors de la mise en place d'une prothèse chez de patients atteints d'arthrose.

Les chondrocytes isolés à l'issue de la digestion ont subi une extraction d'ARN totaux ou protéique et employés dans les expériences de RT-PCR en temps réel et de «Western-blot», les chondrocytes issus de patients arthrosiques étant employés comme témoins.

Transfection des siRIMAs par HNTE FE in ^® : Les si NA (siRNA contrôle, siRNA COL1A1, siRNA HTRAÎ) ont été incorporés dans les chondrocytes en employant l'INTERFERin® comme agent de transfection (Polyplus transfection™). Les siRNAs COL1A1 et HtrAl ont été transfectés dans les chondrocytes à une concentration de 50 nM dans toute l'expérimentation, à l'exception des études présentées dans les figures 4 et 5 (5 nM) car les siRNAs à cette faible concentration se révèlent tout aussi efficaces sur le blocage de l'expression des ARNm cibles (résultats non montrés).

« Western-blot » : Les cellules ensemencées dans les éponges de collagène de type I ont été rincées au PBS IX (« Phosphate Buffered Saline », Fisher Bioblock Scientific) et lysées à raison de 100 μΙ de tampon RIPA (« Radioimmunoprecipitation assay buffer ») par éponge, puis ont ensuite été agitées (vortex) toutes les 10 minutes pendant une heure. L'extraction protéique s'est poursuivie en retirant chaque éponge et en les pressant une à une afin de récupérer le maximum de protéines. Le surnageant contenant les extraits cytoplasmiques a enfin été prélevé après une centrifugation de 30 minutes à 14000 g. La concentration en protéines de nos échantillons a été déterminée par la méthode de Bradford. 20 pg de chaque échantillon a été mis en contact avec un tampon de dénaturation (2,5 ml de glycérol 100%; 2 ml de SDS 10%; 1 ml de bleu de bromophénol 1%; 600 μΙ de Tris-HCI 1M pH 6,8; 0,5 ml de β-mercaptoéthanol) et chauffés à 95°C pendant 5 minutes. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) a été effectuée. Les protéines du gel ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinylidène DiFluoride, illipore) par un électro-transfert de 1 h 30. La membrane ayant été au préalable activée par trois bains successifs : méthanol 100% (1 min), eau distillée (deux fois 1 min) et tampon de transfert IX (15 min). A ta fin du transfert, la membrane a été lavée par du « Tris Buffered Saline-Tween » (TBS-T). Le blocage des sites non spécifiques de la membrane a été réalisé par une incubation dans du TBS-T contenant 10% de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante et sous agitation. La membrane a ensuite été lavée par du TBS-T puis incubée pendant 15 h à 4°C en présence de l'anticorps primaire (Ac I ^aire ) dirigé contre la protéine d'intérêt (Collagène de type II, l/2000 ^eme , Novotec, Collagène de type I, l/3000 ^ème , Novotec, HtrAl, l/2000 ^ème , Millipore, réf. AB15852, Collagène de type X, l/1000 ^ème , Sigma , C7974-ZML et GAPDH (Glyceraldéhyde 3 Phosphate Déshydrogénase), l/2000 ^ème , Santa Cruz Biotechnology). Le lendemain, une série de rinçages de la membrane a été effectuée avec du TBS-T, puis celle-ci a été incubée en présence de l'anticorps secondaire (Ac IP ^ire anti-lapin, l/6000 ^èmÊ , Tebu- Bio, ou Ac II ^aire anti-souris, l/6000 ^ème , Tebu-Bio) 1 h à température ambiante. Les protéines ont enfin été révélées à l'aide d'un kit de détection (« Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate », PIERCE)

RT-PCR temps réel : Les cellules ont été lysées avec du TRIzol Reagent ^® , Invitrogen. 1 pg d'ARN total a été traité par 1 pi de désoxyribonucléase I (DNase I, Invitrogen) pendant 15 min à 25°C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 1 pl d'EDTA 0,5 mM, puis suivie par une incubation de 10 min à 65°C. Les échantillons digérés par la DNase ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc. La réaction a été réalisée en présence d'un mélange composé de 5 μΙ du tampon de la transcriptase inverse 10X, de 1 μΙ de la transcriptase inverse « Moloney Murine Leukemia virus » à 200 unités/μΙ (MMLV, Fisher Bioblock Scientific), de 1 μΙ d'oligodT, de 2 μΙ d'un mélange des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 μΜ au final, Fisher Bioblock Scientific) et de 1 μΙ de RNAse-out (40 U/μΙ, Invitrogen). Le volume a été complété à 15 μΙ avec de l'eau traitée par le DEPC (di-éthyl-pyro- carbonate). La réaction de transcription inverse s'est faite pendant une période de 1 h à 37°C, précédée d'un cycle de chauffage de 10 min à 25°C. Après la transcription inverse, les échantillons d'ADNc obtenus ont été dilués au l/100 ^ème puis utilisés dans des expériences de PCR en temps réel. Pour ce faire, l'amplification du gène étudié a été réalisée en triplicate dans des plaques de 96 puits, selon les instructions de l'appareil « ABI Prism 7000 SDS » (Applied Biosystems). Les échantillons ont été amplifiés à l'aide d'un mélange SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) et à l'aide des amorces tel que décrit dans le Tableau 1 ci-dessus (COLIAI, COL2A1 et RPL13) et le Tableau 2 ci-dessous. Les taux d'ARNm des gènes COLIAI, HTRAl, COL2A1, Agrécanne, COL9A1, COLllAl et COL2B ont été estimés après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13.

Tableau 2

Analyses statistiques : Pour les RT-PCR, les résultats sont représentés sous forme d'histogrammes d'une expérience représentative et représentent la moyenne de trois mesures ± l'écart-type. La significativité des valeurs a été évaluée grâce à un test t de Student (*p<0,05 ; **p<0,01 ; ***p<0,001).

Immuno-fluorescence : A la fin des incubations, les éponges sont rincées dans du tampon phosphate 0,1M, pH 7,4, puis fixées dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 16h à 4°C, et enfin rincées avec du tampon phosphate 0,1M. Les éponges sont ensuite incluses dans de l'agar à 5% (Super LM, Roth, Karlsure, France). Des sections de 50 pm sont réalisées avec un vibratome (MICROM HM 650V, Francheville, France) et montées sur lame. Elles sont incubées pendant 5 minutes dans du triton à 0,5%, rincées au PBS, incubées pendant 30 minutes à 37°C avec de la hyaluronidase à 0,2% dans du PBS, rincées et traitées avec de la BSA à 10% dans du PBS. Les marquages sont réalisés en utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques du collagène de type I et II (dilution l/100 ^ème , Novotec, Lyon, France). Ces anticorps primaires sont révélés avec des anticorps secondaires anti IgG de lapin couplés avec un fluorochrome Alexa fluor 546 (l/2000 ^eme , InVitrogen). Les anticorps primaires ne sont pas appliqués sur les lames contrôles. Les coupes sont ensuite montées entre lames et lamelles avec un milieu de montage contenant du DAPI (UltracruzTM Mounting Médium, Santa Cruz Biotechnology Inc). Les observations sont réalisées avec un microscope confocal (Olympus FV1000, Rungis, France). Les mêmes paramètres d'acquisition sont utilisés pour toutes les images qui sont représentatives de plusieurs expériences.

Etude in vivo : Les chondrocytes transférés dans les éponges de collagène sont cultivés en présence de DMEM 2% de SVF +/- BMP-2 (50 ng/ml) pendant 4 jours à faible tension d'oxygène (< 5%). Un changement de milieu est opéré avec adjonction de siRNA COL1A1 +/- siRNA HtrAl de j4 à j6 (50nM). Après 2, 4 et 6 jours de culture, le milieu est changé. Après 7 jours de culture, les éponges de collagène colonisées par des chondrocytes ont été implantées en sous-cutané (partie dorsale, à raison de 4 éponges par souris) chez la souris nude pour une période de 28 jours. Les éponges sont alors récupérées après euthanasie des souris.

- Fixation, deshydratation et inclusion des échantillons : Les éponges de collagène sont tout d'abord plongées dans une solution de paraformaldéhyde à 4% en PBS pendant au moins 18h à température ambiante, afin de fixer les antigènes. Les échantillons sont ensuite déshydratés par des bains successifs d'éthanol 100% (1 bain de 30 min, suivi de 5 bains de lh) et de toluène (1 bain de 30 min, suivi de 23 FR2011/052198

2 bains de 60 min) et enfin plongés dans de la paraffine (1 bain de 15 min, 1 bain de 30 min, 1 bain de 60 min, 1 bain de 90 min). Ces étapes ont été réalisées par un automate (Laboratoire d'Anatomie Pathologique (CHU, Caen)). Les échantillons sont finalement placés en cassette et inclus en blocs de paraffine. Des coupes de 5 μιη sont ensuite réalisées au microtome et déposées sur des lames silanisées pour les immunomarquages. Avant tout marquage des lames, les coupes sont déparaffinées par des bains successifs de toluène (2 bains de 5 min), d'alcool 100% (5 min), d'alcool 90% (5 min), d'alcool 70% (5 min) et enfin d'eau distillée.

- Immunomarquage : Après déparaffinage, un prétraitement enzymatique à la hyaluronidase (0,5% dans PBS 1X+BSA 3%, 30 minutes à température ambiante) permet de démasquer les sites antigéniques. Les anticorps polyclonaux (collagène de type I, l/1000 ^ème , Novotec Lyon France ; collagène de type II, l/250 ^ème , Novotec, Lyon France) dilués en PBS-BSA 3% sont déposés sur les coupes 3h à température ambiante. Après rinçage en PBS et PBS Tween 0,2%, les peroxydases endogènes sont inhibées par incubation en eau oxygénée à 1,5% en PBS-BSA 3%. Puis l'anticorps secondaire (anti-lapin, non dilués, Envision DAKO) est appliqué sur chaque coupe. Les complexes antigène-anticorps sont alors révélés par réaction enzymatique grâce à l'action de la péroxydase couplée à l'anticorps secondaire, qui, une fois le substrat diaminobenzidine appliqué sur les coupes, va donner un précipité brun, les lames sont ensuite contre-colorées à l'hématoxyline de Mayer puis montées en milieu aqueux. Pour les contrôles négatifs, l'anticorps primaire a été omis.

RESULTATS

L'in ibition de la synthèse du collagène de type I et son effet ont été suivis au niveau des ARN messagers et au niveau protéique à l'aide d'expériences de RT-PCR (« Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ») en temps réel ainsi que de « Western-blot », comme décrit ci-dessus dans la partie méthodologies (Exemple 2). La détection du collagène de type I et du collagène de type II a également été visualisée en immuno-fluorescence et in vivo en immunohistologie.

Effet des siRNA COL1A1 et/ou HTRA1 et/ou d'une BMP-2 recombinante sur les taux de messagers du collagène de type I et de HtrAl.

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 400 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA (5 n , entre les jours 0 à 2) ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl. Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (< 5% 0 ₂ ) en présence ou absence de BMP-2.

Les résultats obtenus sur présentés sur les figures 4A à 4G dans lesquelles les taux moyens d'ARNm du gène COLIAI (A), HtrAl (B), COL2A1, Agrécanne (ACAN), COL2B, COL9A1 et COL11A1 ont été estimés par RT-PCR en temps réel après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13 { k: Unité Arbitraire). Le ratio des taux d'ARNm COL2A1/COL1A1 (C), Agrécanne/ COLIAI (D), COL9A1/COL1A1 (E), COL11A1/ COLIAI (F), et COL2B/ COLIAI (G) dans les différentes conditions expérimentales sont représentés et permettent de définir l'index de différenciation des cultures de chondrocytes. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés.

Les résultats obtenus sur les taux d'ARNm des gènes COLIAI et HtrAl, évalués par RT-PCR en temps réel, montrent que les deux siRNAs sont efficaces pour bloquer l'expression de ces deux gènes cibles (figure 4A et B respectivement). De plus, le siRNA HtrAl diminue les taux d'ARNm COLIAI et agit en synergie avec le siRNA COLIAI et la BMP-2 pour réduire l'expression des taux d'ARNm COLIAI (figure 4A). Par ailleurs, la figure 4A et B montre que des chondrocytes articulaires obtenus à partir d'une région lésée de cartilage arthrosique, mais non cultivés, surexpriment les ARNm COLIAI et HtrAl, au regard des chondrocytes redifférenciés selon le procédé de l'invention.

Effet des siRNA COLIAI et/ou des siRNA HTRA1 et/ou d'une BMP-2 recombinante sur le ratio des taux de messagers de différents marqueurs de la différenciation chondrocytaire.

Les résultats présentés sur la figure 4C montrent que l'index de différenciation COL2A1/ COLIAI chez les chondrocytes est augmenté lorsque le siRNA COLIAI seul, ou le siRNA HtrAl seul, ou les deux types de siRNAs sont transfectés dans les cellules dans les conditions basales. La BMP-2 augmente de façon plus significative cet index de différenciation, qu'elle soit ajoutée seule ou de manière simultanée avec chaque siRNA. De manière intéressante, le traitement des chondrocytes en présence concomitante de BMP-2 et des deux siRNAs permet d'obtenir un effet synergique sur l'accroissement de l'index de différenciation qui est de l'ordre de 60 (figure 4C) alors que cet index n'est que de l'ordre que d'environ 5 dans les chondrocytes arthrosiques et de l'ordre de 200 dans les chondrocytes de cartilage articulaire sain (figure 5). Afin de caractériser au mieux la fonctionnalité de la matrice extracellulaire du néo-cartilage formé dans ces conditions expérimentales, l'expression des ARNm codant la forme mature du collagène II (COL2B) et d'autres marqueurs phénotypiques de différenciation des chondrocytes articulaires, à savoir l'agrécanne et les isotypes collagéniques IX et XI, a été étudiée. Les index de différenciation correspondants au niveau des taux d'ARNm, AGR/COL1A1, COL9A1/COL1AÎ, COL11A1/COL1A1 et C0L2B/C0L1A1 (respectivement figures 4D, 4E, 4F et 4G) ont été calculés. Les résultats présentés dans ces figures permettent de conclure de manière tout à fait similaire par rapport aux résultats présentés dans la figure 4A où avait été évalué l'index COL2A1/COL1A1. Ainsi, les deux siRIMAs employés seuls ou en combinaison favorisent ces divers index de différenciation; la BMP-2, seule ou en combinatoire avec les siRIMAs, augmente ces index. Néanmoins, la combinatoire BMP-2 et les siRNAs COL1A1 et HtrAl exercent un effet synergique, d'au moins 20 sur tous les index, ce qui est très largement supérieur à l'index obtenu dans les chondrocytes arthrosiques, et proche des index de différenciation obtenus avec des chondrocytes de cartilage sain (figure 5).

Effets des siRNAs COL1A1 et HtrAl et/ou d'une BMP-2 recombinante sur les taux protéiques des collagènes I, II, X et d'HtrAl

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de coliagène de type I à raison de 400 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA (5 nM, entre les jours 0 à 2) ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl. Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (3% 0 ₂ ) en présence ou absence de BMP-2. Des extraits protéiques totaux préparés à partir des éponges colonisées par les cellules ont été soumis à une électrophorèse SDS- PAGE en vue d'une analyse par « Western-Blot » avec des anticorps anti-collagène II, I, X, HtrAl et anti-GAPDH. La figure correspond à un « Western-Blot » représentatif.

Afin de valider en partie les résultats obtenus au niveau des taux d'ARNm, des expériences de «Western-blot» ont été entreprises afin de confirmer les effets au niveau protéique. Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites dans la figure 4. A la fin de l'incubation, des extraits protéiques totaux préparés à partir des éponges colonisées par les cellules ont été préparés et soumis à une analyse «Western-blot» avec des anticorps anti-collagènes II, I, X et anti-HtrAl.

Les résultats correspondant à un «Western-blot» représentatif sont présentés sur la figure 6. Ils démontrent la fonctionnalité des siRNA, puisque la transfection d'un siRNA COL1A1 dans les chondrocytes articulaires abolit pratiquement l'expression du collagène de type I. Il en est de même pour le siRNA HrAl qui bloque l'expression protéique de HtrAl. La combinatoire des deux siRNAs s'avère tout aussi efficace pour prévenir les expressions protéiques correspondantes. L'effet des deux siRNA s'avère être spécifique, puisqu'ils n'affectent pas du tout l'expression protéique de GAPDH et du collagène de type II.

La BMP-2, en absence de siRNA, augmente l'expression du collagène de type II mats aussi celle du collagène de type I. La combinatoire BMP-2 + siRNA seul ou BMP-2 + les deux siRNAs augmente la production de collagène II sans induction du collagène de type I, confirmant ainsi l'effet synergique des deux siRNAs + BMP-2 sur l'index de différenciation évalué dans la figure 4C.

Les résultats montrent également que les chondrocytes articulaires cultivés dans ces conditions expérimentales ne subissent pas d'hypertrophie (absence d'expression de collagène de type X, quels que soient les échantillons présentés dans la figure 6), ce qui est fréquent dans les chondrocytes arthrosiques, ce qui suggère que le phénotype chondrocytaire redifférencié est optimal.

Expression des collagènes de types I et II après effet des siRNA COL1A1 et HtrAl et/ou d'une BMP-2 recombinante

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 400 000 cellules / éponge pendant 16h dans du DMEM+2% SVF (J0), puis traités ou non avec 50 ng/ml de BMP-2 et transfectés par des siRNA (50 nM, entre les jours 4 à 6) ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl. Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (<5% 0 ₂ ). Une analyse immuno-cytologique en microscopie confocale avec des anticorps anti-collagène II et I a été réalisée. Jour 0 : J0 ; jour 7 : J7.

Afin de valider en partie les études de «Western-blot», des expériences d'immuno-cytologie ont été réalisées. Les résultats sont présentés sur la figure 7 et montrent que les chondrocytes au temps J0 expriment les isotypes collagéniques I et II. La culture des chondrocytes dans des conditions hypoxiques dans les éponges de collagène pendant 7 jours en présence du siRNA COL1A1 conduit à une diminution de l'expression du collagène de type I et la BMP-2 augmente très significativement les taux du collagène de type II (figure 7), confirmant les résultats obtenus dans les expériences de «Western-blot» (figure 6). Les mêmes conclusions peuvent être tirées lorsque le siRNA HtrAl est transfecté dans les chondrocytes et la combinatoire de ce siRNA avec la BMP-2 augmente les taux du 27 T/FR2011/052198

collagene de type II tout en réduisant ceux du collagène de type I, traduisant un index de différenciation accru (figure 7). Enfin, la transfection conjointe des siRNAs COLIAI et HtrAl diminue l'expression du collagène de type I et augmente l'expression de l'isotype II et l'addition simultanée de BMP-2 avec ces siRNAs synergise les effets observés en présence des siRNAs seuls (figure 7).

Effets des siRNAs COLIAI et HtrAl et/ou d'une BMP-2 recombinante sur le phénotype du néo-cartilage reconstruit in vivo chez la souris nude

Des chondrocytes articulaires humains ont été cultivés dans des éponges de collagène de type I à raison de 400 000 cellules / éponge après avoir été transfectés par des siRNA (50 nM, entre les jours 4 à 6) ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl. Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (<5% 0 ₂ ) en présence ou absence de BMP-2. Au jour 7, les éponges colonisées par les cellules et ayant subi les différents traitements sont implantées en sous-cutané en position dorsale chez la souris nude (4 éponges par souris). Après 28 jours, les souris sont euthanasiées, les éponges collectées et analysées par immuno- histochimie avec des anticorps anti-collagène II et I.

Suite aux résultats acquis dans les études in vitro démontrant un effet significatif et synergique des siRNAs COLIAI et HtrAl en présence de BMP-2 sur le phénotype des chondrocytes du néo-cartilage reconstruit dans des conditions hypoxiques, des études pré-cliniques ont été réalisées. Elles ont consisté à greffer les éponges de collagène colonisées par les chondrocytes articulaires et soumises au même protocole d'incubation pendant 7 jours que celui décrit dans les figures 4 à 7. A la fin de la période de culture in vitro, les éponges ont été greffées en sous- cutané sur le dos de souris nude (4 éponges par souris). Après 28 jours, les souris ont été euthanasiées, les éponges collectées et soumises à une étude en immuno- histochimie. Les résultats de ces expériences, présentés sur la figure 8, montrent qu'il subsiste une faible expression de collagène de type I (image du haut à gauche) au sein du néo-cartilage et une expression conséquente de collagène II (image du bas à gauche) en l'absence de BMP-2 et présence du siRNA contrôle (contrôle négatif) (figure 8A). La BMP-2 augmente très significativement la synthèse des isotypes I et II (figure 8A, les deux images de droite). En présence de BMP-2, le traitement par le siRNA COLIAI seul, ou le siRNA HtrAl seul, ou par la combinatoire des deux siRNAs augmente significativement l'expression du collagène de type II au détriment du collagène de type I, matérialisant un effet synergique sur l'index de différenciation du néo-cartilage (figure 8B, 8C, 8D). 28 11 052198

Ces résultats montrent que la transfection de chondrocytes articulaires avec des siRNA COLIAI et HtrAl en présence de BMP-2 dans des conditions hypoxiques est capable de provoquer l'augmentation de l'expression des marqueurs spécifiques du cartilage (collagènes II, IX et XI, agrécanne) et la diminution des marqueurs non spécifiques (collagènes I et X), ce qui conduit à une forte augmentation de l'index de différenciation des chondrocytes cultivés in vitro et le néo-cartilage reconstruit in vitro conserve des caractéristiques similaires in vivo.

EXEMPLE 3 : MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON L'INVENTION A PARTIR DE CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES fCSM^

METHODOLOGIES

Cellules souches mésenchvmateuses issues de moelle osseuse : induction du lignage chondrocytaire et étude du phénotype.

- Isolement et amplification : L'échantillon de moelle osseuse est centrifugé à la vitesse de 200 g, puis le culot de cellulaire est directement ensemencé dans une boîte de culture de 25 cm ² . Le milieu d'amplification [a-MEM (« Modification of Eagle's Médium », Fisher Bioblock Scientific), contenant 10 % de SVF, de la L- Glutamine 2 mM et du FGF-2 (« Fibroblast Growth Factor-2 », Sigma chemical Co) 1 ng/ml] est changé tous les 2 à 3 jours. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, elles sont décollées par la trypsine-EDTA (0,25% trypsine / 1 mM EDTA, Fisher Bioblock). Ainsi, les CSM sont amplifiées en culture monocouche jusqu'à cinq passages (P5) minimum en présence de milieu a-MEM + 10% SVF.

- Induction du lignage chondrocytaire in vitro : Après 4 ou 5 passages, les CSM sont ensemencées en éponge de collagène de type I à raison de 500 000 cellules par éponge. Ces dernières sont cultivées en milieu ICM (« Incomplète Chondrogenic Médium ») [milieu permettant d'induire la différenciation chondrogénique contenant du DMEM, de la dexamethasone 500 nM, de l'acide ascorbique-2-phosphate 50 g/ml, de la proline 40 pg/ml, du pyruvate de sodium 1 mM] et en condition hypoxique (<5% d'oxygène). La culture s'étend sur une période de 14 jours avec un changement de milieu tous les 3 ou 4 jours.

En vue de réduire la quantité de collagène de type I, des siRNA ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl (Qiagen) sont ajoutés par transfection au cours de l'étape de différenciation des CSMs (100 nM chaque) au jour 0 et au jour 7. Le biomatériau avec les cellules est ensuite récupéré au 14 ^ème jour de différenciation. Les protéines ou les ARN totaux sont alors extraits puis étudiés par « Western-blot » et RT-QPCR respectivement, selon les méthodes décrites pour les chondrocytes. Les cellules souches obtenues par culture monocouche sont caractérisées par immunophénotypage (CD44, CD73, CD90, CD105) et leur multipotence est validée par différenciation, en parallèle, des cellules souches en adipocytes, en ostéoblastes et en chondrocytes (résultats non montrés). Pour la définition du lignage chondrocytaire, sont associés pour la culture des facteurs chondrogéniques (TGF-βΙ et BMP-2), un biomatériau (éponge de collagène de type I), une tension d'oxygène et des ARN interférents ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl.

SiRNAs :

Les siRNA COL1A1 et contrôle sont décrits ci-dessus à l'exemple 1.

Le siRNA HTRA1 est décrit ci-dessus à l'exemple 2.

rhBMP-2 recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2') : L'ADNc codant la BMP-2 humaine (R&D Systems) est exprimé dans des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary cells »). Après clivage protéolytique du peptide signal et du propeptide, la BMP-2 recombinante mâture forme un homodïmère ou des hétérodimères avec d'autres membres de sa famille (exemple avec BMP-7), chaque monomère étant chacun constitué de 114 acides aminés. La BMP-2 a été ajoutée au milieu de culture à une concentration finale de 50 ng/ml.

TGF-βΙ f« Transformina arowth factor-BÏ) : L'ADNc codant le TGF-βΙ est exprimé dans des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary œlls »). Le TGF-βΙ a été ajouté au milieu de culture à une concentration finale de 10 ng/ml.

Éponges de collagènes de type I (SYMATESE Biomatériaux, Chaponost, France) : elles sont caractérisées par un diamètre de 5 mm et une épaisseur de 2 mm. Elles présentent une structure tridimensionnelle adéquate à la culture 3D. Les réseaux de fibres de collagène I forment des pores dont le diamètre moyen est de 150 pm. Ce biomatériau est d'origine bovine, et avec ses fibres de collagène I réticulées, il est biologiquement inactif et biodégradable.

Culture cellulaire : après 5 passages et une fois à confluence, les CSM ont été décollées par un mélange trypsine-EDTA (0,25% trypsine/1 mM EDTA, Fisher Bioblock Scientific) puis centrifugées. Après centrifugation, elles sont ensemencées à raison de 500 000 cellules par éponge de collagène et mis à sécher pendant une heure à 37°C pour permettre l'adhérence à l'éponge de collagène. Pour finir, les cellules souches ont été placées en hypoxie (<5%), en présence ou non de 50 ng/ml de rhBMP-2 et de 10 ng/ml de TGF-βΙ dans du milieu ICM puis sont cultivées pendant une période de 14 jours. Parallèlement, des copeaux de cartilage ont été préparés à partir de chondrocytes articulaires humains (CAH) qui ont été prélevés sur des zones de cartilage sain (région non portante de cartilage au niveau d'une articulation saine).

Les chondrocytes isolés à l'issue de la digestion ont subi une extraction d'ARN totaux ou protéique et employés dans les expériences de RT-PCR en temps réel et de «Western-blot», les chondrocytes issus de cartilage sain étant employés comme témoins.

Transfection des siRNAs par lINTERFERin®:

Les siRNA (siRNA contrôle, siRNA COL1A1, siRNA HTRAJ ont été incorporés dans les cellules souches en employant lINTERFERin ^® comme agent de transfection. (Polyplus transfection™).

« Western-blot » : Les cellules ensemencées dans les éponges de collagène de type I ont été rincées au PBS IX (« Phosphate Buffered Saline », Fisher Bioblock Scientific) et lysées à raison de 100 μΙ de tampon RIPA (« Radioimmunoprecipitation assay buffer ») par éponge, puis ont ensuite été agitées (vortex) toutes les 10 minutes pendant une heure. L'extraction protéique s'est poursuivie en retirant chaque éponge et en les pressant une à une afin de récupérer le maximum de protéines. Le surnageant contenant les extraits cytoplasmiques a enfin été prélevé après une centrifugation de 30 minutes à 14000 g. La concentration en protéines de nos échantillons a été déterminée par la méthode de Bradford. 20 pg de chaque échantillon a été mis en contact avec un tampon de dénaturation (2,5 ml de glycérol 100%; 2 ml de SDS 10%; 1 ml de bleu de bromophénol 1%; 600 μΙ de Tris-HCI 1M pH 6,8; 0,5 ml de β-mercaptoéthanol) et chauffés à 95°C pendant 5 minutes. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) a été effectuée. Les protéines du gel ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinylidène DiFluoride, illipore) par un électro-transfert de 1 h 30. La membrane ayant été au préalable activée par trois bains successifs : méthanol 100% (1 min), eau distillée (deux fois 1 min) et tampon de transfert IX (15 min). A la fin du transfert, la membrane a été lavée par du « Tris Buffered Saline-Tween » (TBS-T). Le blocage des sites non spécifiques de la membrane a été réalisé par une incubation dans du TBS-T contenant 10% de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante et sous agitation. La membrane a ensuite été lavée par du TBS-T puis incubée pendant 15 h à 4°C en présence de l'anticorps primaire (Ac I ^aira ) dirigé contre la protéine d'intérêt (Collagène de type II, l/2000 ^ème , Novotec, Collagène de type I, l/3000 ^ème , Novotec, HtrAl, l/2000 ^ème , Millipore, réf. AB15852), Collagène de type X (l/1000 ^ème , Sigma, C7974-ZML), Collagène de type III (l/1000 ^ème + 5% de lait écrémé, Santa Cruz Biotechnology sc-28888) et GAPDH (Glyceraldéhyde 3 Phosphate Déshydrogénase), l/2000 ^ème , Santa Cruz Biotechnology). Le lendemain, une série de rinçages de la membrane a été effectuée avec du TBS-T, puis celle-ci a été incubée en présence de l'anticorps secondaire (Ac IF ^ire , anti-lapin, l/6000 ^ème , Tebu-Bio ou Ac II ^aire , anti-souris, l/6000 ^ème ) 1 h à température ambiante. Les protéines ont enfin été révélées à l'aide d'un kit de détection (« Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate », PIERCE).

RT-PCR temps réel : Les cellules ont été lysées avec du TRIzol Reagent ^® ,

Invitrogen. 1 pg d'ARN total a été traité par 1 μΙ de désoxyribonucléase I (DNase I, Invitrogen) pendant 15 min à 25°C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 1 μ! d'EDTA 0,5 mM, puis suivie par une incubation de 10 min à 65°C. Les échantillons digérés par la DNase ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc. La réaction a été réalisée en présence d'un mélange composé de 5 μΙ du tampon de la transcriptase inverse 10X, de 1 μΙ de la transcriptase inverse « Moloney Murine Leukemia virus » à 200 unités/μΙ (MMLV, Fisher Bioblock Scientific), de 1 μΙ d'oligodT, de 2 μΙ d'un mélange des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 μΜ au final, Fisher Bioblock Scientific) et de 1 μΙ de RNAse-out (40 U/μΙ, Invitrogen). Le volume a été complété à 15 μΙ avec de l'eau traitée par le DEPC (dî-éthyl-pyro- carbonate). La réaction de transcription inverse s'est faite pendant une période de 1 h à 37°C, précédée d'un cycle de chauffage de 10 min à 25°C. Après la transcription inverse, les échantillons d'ADNc obtenus ont été dilués au l/100 ^ème puis utilisés dans des expériences de PCR en temps réel. Pour ce faire, l'amplification du gène étudié a été réalisée en triplicate dans des plaques de 96 puits, selon les instructions de l'appareil « ABI Prism 7000 SDS » (Applied Biosystems). Les échantillons ont été amplifiés à l'aide d'un mélange SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) et à l'aide des amorces tel que décrit dans les Tableaux 1 (COLIAI, COL2A1 et RPL13) et 2 (COL9A1, COL11A1, Agrécanne, HTRA1 et COL2B) ci-dessus et dans le Tableau 3 ci-dessous. Les taux d'ARNm des gènes COLIAI, COL2A1, C0L3A1, COL9A1, COL11A1, COL10A1, HTRA1, Agrécanne, Sox9, HIF-Ι α, HIF-2a, COL2A, COL2B, ïntégrine-βΐ, Ostéocalcine et Cbfa-1 ont été estimés après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13. Tableau 3

Analyses statistiques : Pour les RT-PC , les résultats sont représentés sous forme d'histogrammes d'une expérience représentative et représentent la moyenne de trois mesures ± SD. La significativîté des valeurs a été évaluée grâce à un test t de Student (*p<0,05 ; **p<0,01 ; ***p<0,001) RESULTATS

Effets des siRNA COL1A1 et/ou HtrAl sur l'induction du lignage chondrocytaire de cellules souches mésenchymateuses issues de moelle osseuse

Des cellules souches mésenchymateuses humaines issues de moelle osseuse ont été cultivées dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge en présence de siRNA COL1A1 et/ou HtrAl (100 nM, entre les jours 0 et 3 jours puis 100 nM entre 7 et 10 jours). Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (<5% 0 ₂ ) en présence de BMP-2 (50 ng/ml) et de TGF-βΙ (10 ng/ml) pendant 14 jours. Les taux moyens d'ARNm des gènes COL1A1, C0L2A1, HtrAl, Agrécanne, COL10A1, COL3A1 ont été estimés par RT-PCR en temps réel après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13 (UA: Unité Arbitraire). Les résultats sont regroupés sur les Figures 9A à 9F. Les ratio des taux d'ARNm COL2A1/COL1A1 et Agrécanne/COLIAI permettant de définir l'index de différenciation des cultures de chondrocytes ont également été mesurés dans les différentes conditions expérimentales et sont représentés sur les Figures 9G et 9H. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés.

Effets des siRNA COL1A1 et/ou HtrAl sur les taux protéiques des collagènes de types I, II, III, X et HtrAl.

Des cellules souches mésenchymateuses humaines issues de moelle osseuse ont été cultivées dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge en présence de siRNA ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl (100 nM, entre les jours 0 et 3 jours puis 100 nM entre 7 et 10 jours). Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (<5% 0 ₂ ) en présence de BMP-2 (50 ng/ml) et de TGF-βΙ (10 ng/ml) pendant 14 jours. Des extraits protéiques totaux isolés à partir des éponges colonisées par les cellules ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE en vue d'une analyse par « Western-Blot » avec des anticorps anti-collagène I, II, III, X, anti-HtrAl et anti-GAPDH. Les résultats sont regroupés sur la Figure 10 qui correspond à un « Western-Blot » représentatif. Profil phénotypique des cellules différenciées après induction du lignage chondrocytaire en hypoxie sous l'effet des siRNA COL1A1 et HtrAl.

Des cellules souches mésenchymateuses humaines issues de moelle osseuse ont été cultivées dans des éponges de collagène de type I à raison de 500 000 cellules / éponge en présence de siRNA ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl (5, 25, 50 4

et 100 nM, entre les jours 0 et 3 jours). Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (3% 0 ₂ ) en présence de BMP-2 (50 ng/ml) et de TGF-βΙ (10 ng/ml pendant 14 jours. Les taux moyens d'ARNm de 16 gènes COL1A1, COL2A1, COL2A1-2A, COL2A1-2B, HtrAl, Agrécanne, COL10A1, COL3A1, COL9A1, COL11A1, SOX9, HIF-lalpha, HIF-2alp a, Intégrine-βΐ, Cbfal et ostéocalcine ont été estimés par RT-PCR en temps réel après normalisation vis-à-vis du gène de référence RPL13 (UA: Unité Arbitraire) et permettent d'établir le profil phénotypique des cellules représenté sur la Figure 11. Le profil phénotypique est également établi pour des chondrocytes isolés à partir de cartilage sain.

Des études préliminaires ont montré que la BMP-2 seule n'était pas capable d'induire la synthèse, par les cellules souches cultivées en éponge de collagène en condition hypoxique, des marqueurs phénotypiques des chondrocytes. Le lignage chondrocytaire n'est donc pas engagé dans ces conditions alors que ces mêmes conditions stabilisent le phénotype des cellules différenciées que sont les chondrocytes.

Par contre, l'addition d'une autre cytokine, le TGF-βΙ, à la combinaison [BMP- 2+éponge+hypoxie] induit la différenciation des CSM en chondrocytes, comme l'attestent les résultats de la Figure 9. Cependant, les cellules après 14 jours de culture synthétisent toujours du collagène de type I, d'où l'utilisation de l'interférence par l'ARN ciblant le collagène de type I et/ou HtrAl, pour stabiliser le phénotype chondrocytaire.

Plus précisément, la combinaison [BMP-2+TGF-pi+éponge+hypoxie] induit une très forte expression du gène du collagène de type II et dans une moindre mesure celle du gène de l 'agrécanne (Figure 9A et 9D). Néanmoins, le taux élevé de messager du collagène de type I associé à ces conditions expérimentales est très significativement réduit en présence de siRNA COL1A1 ou de siRNA COL1A1 + HtrAl (Figure 9B). Cependant, l'utilisation de siRNA COL1A1 seul réduit les taux de messagers de l'agrécanne (Figure 9D) alors que celle du siRNA HtrAl , au-delà de l'inhibition des taux de messagers HtrAl (Figure 9C), est associée à une augmentation des messagers de l'agrécanne (Figure 9D) et n'a pas d'impact sur l'expression du collagène de type I. L'utilisation combinée des siRNA COL1A1 et HtrAl permet ainsi une forte expression des messagers du collagène de type II, de l'agrécanne tout en réduisant les taux des messagers du collagène de type I, dont la valeur est inférieure à celle retrouvée dans le cartilage sain. L'index de 35 FR2011/052198

différenciation avec les deux siRNA, évalué par le ratio collagène de type II / collagène de type I (Figure 9G), est donc amélioré pour atteindre celui des chondrocytes issus de cartilage sain. Cet index de différenciation est également conforté par le ratio agrécanne / collagène de type I qui est le plus significativement augmenté par la combinaison [B P-2+TGF- l+éponge+hypoxie] + siRNA COLIAI et HtrAl. Dans ces mêmes conditions, l'expression du collagène de type III est contenue au niveau des messagers (Figure 9F) et n'est que peu perceptible au niveau protéique (Figure 10). De plus, l'expression du collagène de type X, bien qu'augmentée au niveau des messagers (Figure 9E), n'est que peu perceptible au niveau protéique (Figure 10). En ce qui concerne le collagène de type II, sont observés en « Western-blot » des taux protéiques plus élevés que dans le cartilage sain pour la forme de 220 kDa, largement augmentés mais plus faibles que dans le cartilage sain, pour la forme mature de 135 KDa. Enfin, l'interférence par l'ARN utilisant les deux siRNA COLIAI et HtrAl empêche quasiment la synthèse protéique de collagène de type I (Figure 10).

Ces résultats montrent que les cellules souches se sont bien engagées dans le lignage chondrocytaire acquérant avec les conditions expérimentales un index de différenciation comparable à celui des chondrocytes issus de cartilage sain.

L'analyse des gènes a été élargie pour atteindre 16 gènes définissant le profil phénotypique chondrocytaire à atteindre par les cellules souches dans leur lignage chondrocytaire.

Ce profil phénotypique chondrocytaire est établi sur la base de 3 grandes familles de gènes : i : les gènes caractéristiques des chondrocytes articulaires ; ii : les gènes caractéristiques des chondrocytes hypertrophiques ; iii : les gènes caractéristiques des chondrocytes arthrosiques.

Chondrocytes Chondrocytes Chondrocytes articulaires hypertrophiques voire arthrosiques

ostéoblastes

COL2A1, COL2A1-2A* COL10A1, Ostéoca/cine, COLIAI, COL3A1, HtrAl COL2A1-2B**, COL9A1, Cbfal, HIF-2a

COL11A1, Agrécanne,

Intégrine-βΐ, SOX9, HIF- la

*Chondrocytes arl :iculaires immatures et **ma tures Le profil phénotypique obtenu à partir de chondrocytes issus de cartilage sain (Figure 11) se caractérise par / ^' - une forte expression des messagers des constituants majeurs de la matrice du cartilage : Agrécanne, COL2A1, COL11A1, COL9A1 et des activateurs de la signalisation de la synthèse des constituants matriciels spécifiques: intégrine-βΐ, HIF-Ια, SOX9. ih une faible expression/expression basale des messagers des molécules caractéristiques des chondrocytes arthrosiques : COL1A1, COL3A1 et HtrAl et iih une faible expression/expression basale des messagers des molécules caractéristiques des chondrocytes hypertrophiques (à l'exception de COL10AÏ).

Plus précisément, les constituants majeurs du cartilage hyalin, agrécanne et collagène de type II, se distribuent sur une couronne/échelle allant de 100 à 100 000 alors que les constituants du cartilage arthrosique fibrocartilagineux que sont COL1A1 et COL3A1 sont sur la couronne/échelle 1 à 10 tout comme les marqueurs des chondrocytes hypertrophiques à l'exception du collagène de type X qui se situe entre 10 et 100. Pour les cellules obtenues avec la combinaison [B P-2+TGF- βΐ+éponge+hypoxie] + siRNA COL1A1 et HtrAl, le profil est superposable avec une distribution des différents constituants très proche de celle observée avec le cartilage sain. Si l'on compare ce dernier profil avec celui des cellules cultivées en absence de B P-2, de TGF-βΙ et de siRNA COLlAl/HtrAl, on observe une réelle différence correspondant à l'acquisition du phénotype chondrocytaire recherché par les cellules souches avec la combinaison [BMP-2+TGF-pi+éponge+hypoxie] + siRNA COL1A1 et HtrAl, au regard également du profil du cartilage sain.

Ces résultats, où sont appréhendés l'index de différenciation par les ratio COL2A1/COL1A1 et Agrécanne/COLIAI conforté par l'étude des taux protéiques, et en parallèle, le profil phénotypique chondrocytaire, montrent que les cellules souches de moelle osseuse acquièrent un phénotype chondrocytaire et que les cellules au terme de la culture (14 jours) avec la combinaison [BMP-2+TGF- βΐ+éponge+hypoxie] + siRNA COL1A1 et HtrAl, synthétisent une matrice extrêmement qualitative, de type cartilage hyalin.

L'ensemble des résultats obtenus témoigne d'une importante diminution du collagène de type I, tant au niveau de ses taux moyens d'ARNm qu'au niveau protéique. De plus, ils démontrent que l'interférence à l'ARNm constitue une approche efficace pour diminuer la production de cet isotype collagénique atypique du cartilage articulaire sain qui est induit lorsque le cartilage articulaire devient arthrosique. Nos résultats montrent également une augmentation du ratio collagene de type Il/type I, et des ratios des taux d'ARNm C0L2A1/C0L1A1, COL9A1/COL1A1, COL11A1/COL1A1, Agrécanne/COLIAI, etc. reflétant une nette amélioration de l'état de différenciation des chondrocytes.

Le procédé selon l'invention permet donc d'induire l'augmentation des marqueurs spécifiques du cartilage et la diminution des marqueurs non spécifiques, ce qui conduit à une forte augmentation de l'index de différenciation des chondrocytes cultivés in vitro.