In frühen Teilungsstadien des Embryo kann aus jeder Zelle ein ganzer Organismus entstehen (Totipotenz). Diese Fähigkeit geht ab der Unterteilung des Embryo in Embryoblast und Trophoblast verloren. Die Embryoblastzellen werden als pluripotente em- bryonale Stammzellen bezeichnet und sind in der Lage, in jeden der verschiedenen Körper-Zelltypen zu differenzieren. Da sich aus embryonalen Stammzellen auch Keimzellen entwickeln können, gehören sie zur Keimbahn.

Prinzipiell werden die Stammzellen nach ihren Eigenschaften und nach ihrer Herkunft wie folgt unterschieden. Embryonale Stammzellen (ES) haben ihren Ursprung in der inneren Zellmasse des Embryos. Innerhalb dieser Zellmasse ist das Areal für die Urkeimzellen noch nicht determiniert, weshalb der Embryoblast per Definition Teil der Keimbahn ist. Werden solche Urkeimzel- len in adulte Tiere transplantiert, so führt dies zur Entwick- lung von typischen Teratomen, weshalb diese auch als Keimzell- teratome bezeichnet werden.

Stammzelllinien, die aus Keimzellen hervorgegangen sind (GS, premordial germ cell lines) haben ihren Ursprung in embryona- len Keimzellen. Diese wandern als Urkeimzellen aus dem Dotter- sack in die Gonadenanlage ein. Dies geschieht in der 3. und 4.

Woche der menschlichen Embryonalentwicklung. Sobald diese die Gonadenanlage erreicht haben, treten sie in eine Proliferati- onsphase ein. Dabei wird die mitotische Aktivität zu einem späteren Zeitpunkt durch geschlechtsspezifische Hemmfaktoren aus den Follikelepithelzellen des Ovars oder den Stützzellen des Hodens unterbrochen.

Darüber hinaus können sich Urkeimzellen auf dem Weg zur Ent- wicklung ruhender Oorgonien und Spermatogonien weiter mito- tisch teilen, wobei durch Differenzierung dieser Zellhaufen gutartige Teratome oder bösartige Teratokarzinome gebildet werden, aus denen pluripotente Stammzelllinien isoliert werden können. Auf diese Weise wurde beispielsweise die menschliche Stammzelllinie Terra II aus der Lungenmetastase eines mensch- lichen Seminoms isoliert (Andrews in APMIS 106,158-168, 1998).

Schließlich lassen sich auch aus experimentell induzierten Te- ratomen Stammzelllinen (TC) gewinnen. Dabei werden die Terato- me durch Injektion von embryonalen Stammzellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste in einen Empfänger-oder Experimen- taltier erzeugt. Auch derartige Teratomzellen gehen aus der Keimbahn hervor und gehören daher zu den Keimbahntumoren. In Einzelfällen sind sie jedoch auch aus einem Teratocarcinom des Hodens zu isolieren, das sich aus einer Spermatogonie entwik- kelt hat.

Des weiteren lassen sich adulte Stammzellen, z. B. aus dem Knochenmark als mesenchymale Stammzellen (MAPC, multipotent adult progenitor cells) gewinnen, wobei eine Zellsuspension des Knochenmarks eines adulten Spenders mittels sogenannter FACS (fluorescence-activated cell sorter) isoliert wird.

Schließlich lassen sich auch noch neuronale adulte Stammzellen (NAS) aus der Matrixzone des Dienzephalons adulter Spender ge- winnen.

Es sind bereits eine Vielzahl von Versuchen unternommen wor- den, mit derartigen Zellen Erkrankungen zu therapieren, wie z. B. der Ersatz von zugrundegegangenem Nervengewebe, bei- spielsweise nach einem Gehirnschlag oder einer Querschnitts- lähmung oder auch der Ersatz von Nervenzellen bei Parkinson oder Muskelzellen nach einem Herzinfarkt.

Die Gewinnung der zuvor beschriebenen Stammzellen wurde bis- lang im Wesentlichen in Tierexperimenten durchgeführt. Eine Übertragung von tierischen Zellen auf den Menschen ist jedoch zur Zeit problematisch und humane Zelllinien können zur Zeit nur aus nach dem Embryonenschutzgesetz problematischen ES- Zelllinien aus menschlichen Blastozysten gewonnen werden.

Als Quelle für derartige Zellen dienen bislang üblicherweise nicht transplantierte, befruchtete Eizellen, die in der in-vi- tro-Fertilisation übrig geblieben sind oder auch die Nabel- schnur sowie Föten von Schwangerschaftsabbrüchen. Eine weitere Quelle zu ihrer Gewinnung sind Keimbahntumore wie die bereits zuvor erwähnten Teratome. Derartige Teratome, insbesondere Te- ratome des Ovariums und der Testis, entstehen nicht nur spon- tan, sondern sind unter anderem im Tiermodell als embryonale Carcinoma oder Teratocarcinoma induzierbar. Es hat sich jedoch gezeigt, dass derartige Zellen aneuploid sind, d. h. dass in diesen Zellen einzelne Chromosome nicht in der normalen Anzahl vorhanden sind.

Teratome enthaltene Gewebe aus den drei Keimblättern Ectoderm, Mesoderm und Endoderm. Derartige Keimzellteratome sind Ge- schwülste, die aus weiblichen (Ovarialteratome) oder aus männ- lichen Keimzellen (Hodenteratome) oder auch an einer anderen Stelle aus Urkeimzellen entstehen, die sich während der Em- bryonalentwicklung nicht an dem richtigen Platz befinden. Nor- malerweise enthalten Teratome Gewebe aus den drei Keimblät- tern, das bereits mehr oder weniger ausdifferenziert ist. So wird beispielsweise die Entwicklung von Zähnen und Knochen be- schrieben, die bereits im Röntgenbild sichtbar sind. Teratome zeigen außerdem eine Neigung zu entarten, also in ein malignes Wachstum überzugehen. Ein derartig entarteter Tumor wird als Teratocarcinom bezeichnet. Teratome entstehen jedoch nicht nur in den Ovarien oder Hoden, sondern auch am Steißbein. Wegen seiner charakteristischen Lokalisation als Anlagerung am Steißbein wird diese Art als Steißbeinteratom bezeichnet.

Die Gewinnung von Stammzellen, aus Teratomen ist an sich be- kannt. So wird z. B. von G. R. Martin PNAS (1981), Vol. 78, Nr. 12, Seiten 7634-7638 beschrieben auf welche Weise sich durch Injektion von embryonalen Mauszelllinien in Mäusen Tera- tocarcinoma und Teratome entwickeln, aus denen sich wiederum pluripotente embryonale Stammzellen entwickeln lassen. Derar- tige Zellen leiten sich jedoch ebenfalls von der Keimbahn ab und zeigen außerdem, wie in dieser Druckschrift festgestellt wird, alle wesentlichen Eigenschaften von Carcinomzellen.

P. W. Andrews beschreibt in APNIS 106 : 158-168 (1998) das Auf- treten von pluripotenten humanen embryonalen Stammzelllinien in Teratocarcinoma. Dabei handelt es sich jedoch, wie aus- drücklich festgehalten wird, ebenfalls um Tumore aus Keimbahn- zellen (GCT Germ Cell Tumors).

In der WO 01/59076 wird der prä-und postmeiotische Ursprung von Teratomen beschrieben. Dabei werden die Teratome ebenfalls als chromosomal polymorph beschrieben. Als Auslöser einer Te- ratomentwicklung wird dabei die Fusion zweier reifer Oozyten oder Spermatozyten oder die Verhinderung der zweiten meioti- schen Teilung als Ursache angesehen.

Die Entwicklung von Gewebe aus embryonalen Stammzellen sowie aus pluripotenten Zellen, die sich von Keimbahnzellen ablei- ten, sind jedoch aufgrund des besonderen Schutzes der Embryo- nen ethisch sehr umstritten und aus diesem Grund in vielen Ländern zumindest derzeit verboten.

Die Erfindung hat daher zum Ziel eine Quelle für Zellen, ins- besondere Stammzellen, bereitzustellen, die ihre Eigenschaft zur Ausdifferenzierung in bestimmte Organe noch nicht voll- ständig verloren haben, d. h. pluripotent sind und die die zu- vor genannten Probleme, insbesondere ethischen und rechtlichen Probleme, nicht aufweisen und sich nicht von der Keimbahn ab- leiten.

Dieses Ziel wird durch das in den Ansprüchen definierte Ver- fahren erreicht.

Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, dass das Steiß- beinteratom kein Teratom darstellt, welches sich aus Teilen der Keimbahn entwickelt. Darüber hinaus wurde überra- schenderweise gefunden, dass-obwohl das Steißbeinteratom sehr stark ausdifferenziert ist und im Wesentlichen alle ver- schiedenen Gewebstypen enthält-es neben bereits ausdifferen- ziertem Gewebe und malignen Strukturen auch in einem Bereich von undifferenzierten embryonalen Blastem-Bezirken ein nicht bösartiges Gewebe enthält, in dem eine Vielzahl von pluripo- tenten Stammzellen vorliegen, die sich auf an sich bekannte Weise isolieren lassen. Möglichkeiten hierfür sind u. a. FACS mit Magnetic beads ; Zellkultur und selektive Anzüchtung von Stammzellen durch bestimmte Zellkulturmedien (wie bei adulten neuronalen Stammzellen aus der SVZ) ; die Zerkleinerung des Ge- webes mit einem Tissue Chopper und die darauffolgende Markie- rung und Färbung von Stammzellen mit selektiven (Vi- tal-) Farbstoffen.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise Wirbelsäulen-nahes Tumorge- webe zur Isolierung der gewünschten Stammzellen verwendet.

Ebenso denkbar wäre die Verwendung von Blastemzellen aus dem Zentrum des Tumors, die sich nicht unbedingt in unmittelbarer Nachbarschaft zum Steißbein befinden. Besonders bevorzugt wird dasjenige Gewebe verwendet, welches das Steißbein umschließt, insbesondere auch das Bein selbst enthält. Derartige Gewebe weisen etwa die Größe einer Mandarine auf. Vom Operationsort bis zur Aufbereitung des Tumors können die Gewebe bei 4°C un- ter Kühlung ohne Weiteres bis ca. 6 Stunden lang gelagert wer- den. Vorzugsweise wird das Gewebe mittels einer üblichen Nähr- lösung gelagert. Hierfür eignet sich besonders steriles HBSS, das auch bei der Gewinnung adulter SVZ-Zellen Verwendung fin- det. Zur Aufbereitung wird es mittels einem scharfen Messer, wie beispielsweise einem Skalpell, vorsichtig zerlegt und Ge- webebereiche werden vorzugsweise unter einem Mikroskop visuell entsprechend ihrer Differenzierung voneinander separiert. Al- ternativ dazu kann man von exakt definierten Gewebeteilen ei- nen Schnellschnitt herstellen und eine Seite des Schnittes dann färben, während man die andere Seite isoliert und in Kul- tur bringt, wie oben beschrieben. Das Zielgewebe besitzt eine typische Morphologie, die jener eines embryonalen Blastemgewe- bes entspricht. Unter den so erhaltenen Gewebsteilen werden vorzugsweise diejenigen weiter bearbeitet, deren Strukturen noch weitgehend undifferenziert sind. Diese darin enthaltenen Zellen werden dann mittels an sich bekannter Verfahren aus ih- rem Zellverband gelöst. Eine derartige Desintegration von Zellgewebe ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise mittels einem oder mehreren Enzymen durchführbar. Übliche hierzu ver- wendete Enzyme sind beispielsweise Kollagenase, Hyaluronidase, Pancreatin und Streptokinase.

Aus den so erhaltenen Zellen wird vorzugsweise eine Zellsus- pension hergestellt. Die in Suspension vorliegenden Zellen lassen sich dann mittels ebenfalls an sich bekannter Verfahren an einem Zellsorter, wie beispielsweise FACS oder mittels Ma- gnetic beads anhand ihrer charakteristischen Oberflächenmarker selektiv abtrennen. Die Oberflächenmarker sind für die einzel- nen Stammzellen bekannt und sind beispielsweise CEP-68 (chon- drocyte expressed protein 68) für Knorpelstammzellen (E. Steck et al. ; Biochemical Journal, Jan. 2001,169-174), Nestin für neuronale Stammzellen (H. Zulewski et al. ; Diabetis, März 2001,521-533), SSEA-1 (stage specific embryonic antigen-3), SSEA-3 und SSEA-4 für pluripotente Stammzellen (S. A. Przybor- ski ; Stem-Cells, 2001,19 (6) : 500-4, CD34 für hämatopoetische Stammzellen (H. Klaasen et al. ; Neuroscience Letters, 26. Okt.

2001,312 (3) : 180-2), p63 für Keratinozyten und Stammzellen (G.

Pellegrini et al. ; Proceedings of the National Academy of Sci- ences of the United States of America, 13. März 2001, 98 (6) : 3156-61), AC133 für hämatopoetische Stammzellen (M. Pei- chev et al. ; Blood, 1. Feb. 2001,95 (3) : 952-8, Betal Integrin für Stammzellen (U. B. Jensen et al. ; Development, Juni 1999, 126 (11) : 2409-18, AA4 für Stammzellen (vascular endothelial cells, aorta-associated hematopoietic clusters, primitive fe- tal liver hematopoietic progenitors) (0. Petrenko et al. ; Im- munity, Juni 1999,10 (6) : 691-700, AP (alkaline phosphatase) für Stammzellen (S. Nagafuchi et al. ; FEBS-Letters, 16. Juli 1999,455 (1-2) : 101-4, FGF-4 für Stammzellen (M. A. Lane et al. ; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 9.

Nov. 1999,96 (23) : 13524-9, Thy-1 für hämatopoetische Stammzel- len (B. E. Petersen et al. ; Hepatology, Feb. 1998, 27 (2) : 433- 45, TIE, TEK für hämatopoetische Stammzellen (M. Yano et al. ; Blood, 15. Juni 1997,89 (12) : 4317-26, OC. 3 (oval cell anti- gen. 3) für Gallengang-, Leberstammzellen (S. H. Sigal et al. ; Hepatology, April 1994, 19 (4) : 999-1006, CK 8 mRNA (Cytokeratin 8 mRNA) für Prostatastammzellen (X. Wang et al. ; Chinese Medi- cal Sciences Journal, Dez. 1994,9 (4) : 237-41, Bcl-2 für Haut- stammzellen (R. R. Polakowska et al. ; Developmental Dynamics, März 1994,199 (3) : 176-88, PSCA (Prostata Stem Cell Antigen) für Prostatastammzellen (Tetsuro Watabe et al. ; Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 8. Jan. 2002, 99 (1) : 401-6. Mittels diesen Zellmarkern und dagegen gerichte- ten Antikörpern ist es ohne Weiteres möglich die jeweilige Zelle selektiv aus einer Mischung, wie einer Suspension mit anderen Zellen, zu isolieren. Zwar wird vorzugsweise eine der- artige Isolierung mittels Antikörpern durchgeführt, jedoch ist es ebenfalls möglich die Isolierung durch andere spezifische Oberflächenmarker und damit bindefähigen immobilisierten Re- zeptoren durchzuführen.

Exakte histologische Untersuchungen im Rahmen der Erfindung haben nämlich gezeigt, dass sich aus Colonkrypten, die auch in Steißbeinteratomen oft enthalten sind, verschiedenste Gewebe entwickeln, wie z. B. Haare, Epithelien, Pankreas mit Insel- zellen, usw. Daher sind diese Colon-Strukturen auch Ziel einer selektiven Zellisolierung und Zellkultivierung.

Erfindungsgemäß lassen sich aus den Steißbeinteratomen Vorläu- fer-bzw. Progenitorzellen von Leber, Pankreas und Langerhan- sschen Inselzellen, von neuronalem Gewebe, von serösen sowie mucösen Drüsen, z. B. zur Gewinnung von zentroazinösen Zellen des exokrinen Pankreas oder auch Talgdrüsen mit Haaranlagen von den verschiedensten Epithelarten, wie kubischem Epithel, transitionalem bzw. Übergangsepithel, aus welchem sich ablei- tende Harnwege gewinnen lassen oder auch mehrschichtig ver- horntes sowie unverhorntes Plattenepithel, welches der Ge- winnung von Vaginalschleimhaut dient, aber auch sekretorisches Epithel, Flimmerepithel, mehrreihiges Flimmerepithel zur Her- stellung von respiratorischem Epithel, Knochen-und Knochen- markvorläuferzellen sowie skeletale als auch tracheale Knor- pelzellen und Vorläuferzellen von glatter und quergestreifter Muskulatur, hochprismatisches Schleimepithel zur Herstellung der Kolonschleimhaut isolieren. Ebenso sind die Vorläuferzel- len von dopaminergen Neuronen aus den erfindungsgemäß isolier- ten Stammzellen zu isolieren bzw. lassen sich zu diesen weiter ausdifferenzieren. Die derart erhaltenen Zellen lassen sich beispielsweise auf entsprechenden Feederzellen kultivieren.

Derartige Kultivierungsverfahren sind vielfältig und sind dem Fachmann bekannt. Prinzipiell sind die erfindungsgemäß gewon- nenen Zellen auch ohne Feederzellen kultivierbar.

Prinzipiell ist es auch möglich derartige Zellen tiefgekühlt zu konservieren. Auch derartige tiefgekühlte Konservierungen sind dem Fachmann bestens bekannt und benötigen keiner weite- ren Erläuterung. In einzelnen Fällen hat es sich als zweckmä- ßig erwiesen, besondere Nährmedien zu verwenden. Derartige Me- dien sind vom Fachmann anhand einfacher Versuche zu ermitteln.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen pluripoten- ten Stammzellen sind insbesondere für die Gewinnung von Er- satzgewebe und Ersatzorganen geeignet. Es sind beispielsweise aus Zellen mit dem Marker CEP 68 Knorpelstammzellen und damit skeletale und tracheale Knorpelzellen und Gewebe herstellbar ; aus Nestin-positiven Zellen sind neurale Stammzellen sowie Nervengewebe aller Art, insbesondere dopaminerge Nervenzellen sowie anderes Nervengewebe des Gehirns und motorische sowie sensorische Nerven herstellbar. Aus Zellen mit den Ober- flächenmarkern CD 34, Thy-1, TIE, TEK sind hämatopoetische Stammzellen und damit Zellen des blutbildenden Systems her- stellbar, aus Zellen mit dem Marker AA4 sind insbesondere en- dotheliale Zellen, Aorta-assoziierte hämatopoetische Blasto- zellen, hämatopoetische primitive fötale Leberprogenitorzellen und daraus gebildetes Gewebe herstellbar, aus OC. 3-Marker- positiven Stammzellen sind Gallengang-und Leberzellen her- stellbar und aus Bcl-2-markierten Zellen lassen sich Haut- stammzellen und entsprechendes Hautgewebe gewinnen. PSCA und CK8mRNA-positive Zellen sind Vorläuferzellen der Prostata.

Weitere generelle übergeordnete Marker für Stammzellen sind AP und FGF-4 sowie für pluripotente Stammzellen die entsprechen- den stufenspezifischen embryonalen Antigene 1, 3 und 4 (SSEA- 1, SSEA-3 und SSEA-4). Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Zellen zur Erzeugung von Organen und Körperteilen, wie Blut- zellen, insbesondere Erythrozyten, insbesondere Leukozyten, Lymphozyten, Thrombozyten, etc., Blut-und Lymphgefäße, wie z. B. Arterien und Venen, Leber sowie extrakorporale Leberer- satzvorrichtungen, Nieren sowie künstliche extrakorporale Nie- renzellen-enthaltende Dialysevorrichtungen, Muskelgewebe, ins- besondere Herzmuskel sowie motorische Muskulatur, haarbilden- des Gewebe, dopaminerge Neuronen, insbesondere zur Therapie der Parkinsonkrankheit, Langerhans'sche Zellen zur Behandlung von Diabetes, Darmwände speziell des Kolons, Pankreas und Gal- le sowie Gallengänge, Vagina, Knochen, Knochenmark, Nervenge- webe, Lungen-und Bronchial-/Trachealgewebe, Oesophagus, Haut sowie Knorpel, insbesondere Gelenkknorpel, Prostata-, Testis- und Ovarialgewebe. Erfindungsgemäß wurde auch gefunden, dass solche Stammzellen auch aus gesundem wirbelsäulennahen Gewebe, insbesondere des Steißbeins isolierbar sind.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Zellen sind jedoch auch beson- ders geeignet um den Einfluss neuer Medikamente sowie von Um- weltgiften und Umweltbedingungen auf die Embryonalentwicklung zu untersuchen. Auf diese Weise ist es möglich auf eine Viel- zahl von Tierversuchen zu verzichten. Darüber hinaus sind Aus- sagen an menschlichen Zellen häufig aussagekräftiger als Er- gebnisse, die an Tieren gewonnen werden.