L'entrée de la cellule dans le processus de la division cellulaire est régulée par un ensemble de kinases et de phosphatases utiles pour synchroniser les différentes phases du cycle cellulaire et permettre la réorganisation de l'architecture cellulaire.

Les kinases dépendantes des cyclines (CDKs) jouent un rôle majeur dans ce contrôle et déjà plusieurs inhibiteurs de cette famille de kinases sont identifiés. Un de ces composés (flavopiridol) est déjà en Phase II clinique (Senderowicz et Sausville, J. Natl.

Cancer Inst. (2000), 92,376-387).

Ces CDKs sont activées par une déphosphorylation effectuée par les phosphatases Cdc25, sur des résidus tyrosine et thréonine. Dans les cellules humaines, les protéines Cdc25 sont codées par une famille : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C (Cans et coll., Medicine Sciences (1998), 3,269-274).

Quelques inhibiteurs de Cdc25 sont identifiés, mais ils possèdent seulement une faible activité (cf. Baratte, B., Meijer, L., Galaktionov, K., et Beach, D., Anticancer Res.

(1992), 12,873-880 ; Rice, R. L. et coll., Biochemistry (1997), 36,15965-15974 ; et Ham, S. W., Park, J., Lee, S. J., Kim, W., Kang, K., et Choi, K. H., Bioorg. Med. Chem.

Lett. (1998), 8,2507-2510).

Cdc25B2 est une protéine tyrosine phosphatase proche de la phosphatase Cdc25B (appelée maintenant Cdc25Bl). Elle a été identifiée dans une banque d'ADN codant de lymphome de Burkitt. Cdc25B2 diffère de Cdc25B 1 par une insertion de 14 acides aminés et une délétion de 41 acides aminés en amont du domaine catalytique. Cdc25B 1 et Cdc25B2 sont des variants d'épissage d'un mme gne. Un troisième variant, Cdc25B3, portant les deux séquences de 14 et 41 acides aminés, a été identifié à partir

de la mme banque (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14,2485-2495). Les trois variants sont détectés dans les primocultures et les lignées cellulaires. L'analyse des variants montre que Cdc25B2 est plus faiblement exprimé que Cdc25B3 dans l'ensemble des lignées testées mais que 1'expression des deux variants augmente durant la phase G2 et la mitose (Forrest et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1999), 260, 510-515). Hernandez et coll. rapportent que Cdc25A et-B2 mais pas Cdc25Bl,-B3 et -C, sont sur-exprimés dans un grand nombre de lymphomes (35% et 39%) (Hernandez et coll., Int. J. Cancer (2000), 89 (2), 148-52). Les lymphocytes normaux expriment les messagers de Cdc25B 1 et-B3 et très faiblement ceux de Cdc 25A,-B2 et-C.

La surexpression des trois Cdc25B variants dans la levure montre que Cdc25B2 semble plus active que B1 ou B3 (B2>B3>B1). L'épissage alternatif de Cdc25B peut donc jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire.

La phosphatase Cdc25C est par ailleurs elle mme régulée par phosphorylation sur la sérine-216 par d'autres enzymes Cdsl ou Chkl et se lie à des membres très conservés de la famille des protéines 14-3-3 (Zeng, Y. et coll., Nature (1998), 395,507-510).

La recherche d'inhibiteurs plus efficaces des phosphatases passe par la nécessité d'avoir une protéine qui conserve son activité phosphatase, en quantité non limitante pour autoriser des criblages à grande échelle.

L'étude d'une protéine nécessite de grandes quantités de cette dernière pour satisfaire à toutes les caractéristiques qui peuvent tre analysées notamment dans les domaines tels que la biophysique (taille, séquence, structure...), de la biochimie (activité, stabilité, régulation...) ou de la pharmacologie (activateurs, inhibiteurs,...).

La production et la purification de cette protéine en grande quantité se heurte à plusieurs obstacles qui peuvent tre : -expression absente ou trop faible de la protéine ; -expression d'une protéine tronquée ; -obtention d'une protéine sans activité ; -perte de l'activité biologique de la protéine durant la ; -rendement de purification très faible ; -perte de l'activité biologique de la protéine durant la ; -perte de la source de production.

Seul le succès à chacune de ces étapes permet finalement de produire à long terme une protéine biologiquement active en quantité illimitée. Face à de telles exigences, la

purification de nombreuses protéines reste un processus très délicat voire mme impossible dans certains cas.

Cependant, de nombreux efforts sont faits pour développer de nouvelles stratégies de production et de purification telles que : -culture de cellules (animales ou végétales) à grande échelle ; -culture de microorganismes (bactéries, levures) à grande échelle ; -immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique à partir d'un mélange de protéines ; -chromatographie d'affinité, à l'aide d'un ligand spécifique (effecteurs, répresseurs, activateurs) ; -électrophorèse bidimensionnelle, en fonction de la masse moléculaire et du point isoélectrique de la protéine ; -électrophorèse capillaire ; -enrichissement par précipitation différentielle avec différents ; -etc.

Par ailleurs, de nouveaux systèmes essaient maintenant de combiner la production et la purification des protéines. Ces systèmes permettent une expression souvent inductible de la production d'une protéine recombinante fusionnée avec une protéine permettant une chromatographie d'affinité (appelée tag). Cette dernière partie peut tre éliminée par l'addition d'une protéase qui reconnaît spécifiquement l'endroit de la fusion (Sheibani, N., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29,77-90). Le nombre de systèmes proposés augmentent mais le succès de ces différentes approches reste très variable en fonction des protéines à purifier. La conformation et la solubilité des protéines restent des paramètres impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A. D., West, S. M. et Chaudhuri, J. B., Mol. Biotechnol. (1996), 6,53-64 ; Kelley, R. F. et Winkler, M. E., Genet. Eng. (N. Y., 1990), 12,1-19).

Les protéines Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C pourraient tre fusionnées avec des systèmes aussi variés que : 1. Le résidu de six histidines reconnu par l'anticorps anti-motif six histidine (Katsafanas, G. C. et Moss, B., Virology (1999), 258,469-479) ; 2. Le résidu de neuf acides aminés de Hemagglutinine d'Influenza reconnu par l'anticorps 3F10 (Robert, I. et Quirin-Stricker, C., J. Mol. Neurosci. (1998), 11,243-251) ;

3. Le résidu de 11 acides aminés du virus de stomatite vésiculaire reconnu par l'anticorps P5D4 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1997), 94, 13329-13334) ; 4. Le résidu de 6 acides aminés de la protéine de capside du virus bovin papilloma (AU1) reconnu par l'anticorps anti-AUl (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. (1997), 94,13329-13334) ; 5. Le résidu de 12 acides aminés de la chaîne lourde de la protéine C reconnu par l'anticorps HPC4 (Rezaie, A. R., et coll., Protein Expr. Purif (1992), 3,453-460) ; 6. La protéine C-myc reconnue par l'anticorps 9E10 (Bae, S. H., et coll., J. Biol. Chem.

(1999), 274,14624-14631) ; 7. La protéine bta galactosidase affine pour l'amino-phényl- P-D-thiogalactopyranoside (Germino, J. et Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

(1984), 81,4692-4696) ; 8. La protéine gluthation S-transférase reconnue par l'anticorps anti-GST (Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18,153-159) ; 9. La biotin-carboxylase carrier affine pour l'avidine (Germino, F. J. et Moskowitz, N. K., Methods Enzymol. (1999), 303,422-450) ; 10. La protéine interne affine pour la chitine (voir Chong, S., et coll., Gene (1997), 192, 271-281 ; Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18,153-159) ; 11. La protéine liant le maltose affine pour l'amylose (Ahaded, A., et coll., Prep.

Biochem. Biotechnol. (1999), 29,163-176).

Pour autant, rien ne permet de prédire si l'opération sera effectivement couronnée de succès.

La demanderesse vient cependant de mettre au point une méthode qui permet l'obtention des enzymes Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C humaines sous une forme active et en quantité illimitée. La présente invention facilite d'une part la recherche et l'étude des activités physiologiques ou/et physio-pathologiques de cette protéine et d'autre part facilite la recherche d'agents modulateurs de ces activités.

L'invention permet d'obtenir une protéine humaine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C recombinée avec la protéine liant le maltose (MBP) qui conserve son activité phosphatase sans nécessiter la séparation avec la partie MBP, prévenant ainsi toute contamination avec des protéases. Le haut niveau du taux d'expression de la protéine après induction permet un rendement de purification excellent et la préparation en quantité illimitée de l'enzyme.

L'invention a donc tout d'abord pour objet une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.

La présente invention concerne en particulier une protéine choisie parmi les protéines suivantes : -une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25Bl humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 12 (représentée plus loin) ; -une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 13 (représentée plus loin) ; -une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 14 (représentée plus loin) ; ou -une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 1 (représentée plus loin).

Elle a également pour objet l'ADN codant pour lesdites protéines de fusion, ainsi que l'ADN complémentaire à 1'ADN codant pour lesdites protéine de fusion.

L'invention a de plus pour objet la souche bactérienne JM 109 transfectée : -par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B 1 ; -par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B2 ; -par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B3 ; ou -par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25C.

L'invention concerne de plus un procédé de préparation desdites protéines de fusion, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : -culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence

SEQ. ID n° 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5, dans un milieu LB additionné d'ampicilline ; -induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout ; -lyse des bactéries ; -purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.

L'invention concerne enfin une application de ladite protéine de fusion à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes successives suivantes : -ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par le procédé de préparation décrit précédemment et d'un composé présumé tre un modulateur de la protéine Cdc25B 1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C ; -détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.

La détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite peut tre réalisée, par exemple, par mesure de la densité optique de la solution, de l'absorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm, ou bien encore par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.

A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la mme signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De mme, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence.

PARTIE EXPERIMENTALE A/Proteine de fusion MBP-Cd 1-Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25C.

1.1-Principe du système utilisé.

Le système utilisé (New England Biolabs #800-pMAL protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intért, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose- Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.

1.2-Origine de 1'ADNc de Cdc25C L'ADN codant pour la phosphatase Cdc25C humaine correspond au numéro d'accession 4502706.

A partir de ce plasmide, l'ADN codant pour Cdc25C a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces C-XBAI SENS et C-XBAI ANTI-SENS (de séquences SEQ. ID. noS 3 et 4 respectivement) et introduit dans le vecteur pCDNA3-HA au site XbaI pour donner le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C.

L'insert Cdc25C/XbaI a été, à ce stade, séquence dans son intégralité.

L'amorce C-XBAI SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 3 représentée ci-après : 5'-GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC-3' L'amorce C-XBAI ANTI-SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 4 représentée ci-après : 5'-GGCTCTGA GTTGCGC CGG-3'

1.3-Construction du vecteur pMAL-Hs Cdc25C Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par XbaI, l'insert Cdc25C/XbaI (1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMAL-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site XbaI, pour donner le vecteur pMAL-Hs Cdc25C (de séquence SEQ. ID n° 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).

La séquence SEQ. ID. n° 2 de la protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XBAI est la suivante : TCTAGAATGT CTACGGAACT CTTCTCATCC ACAAGAGAGG AAGGAAGCTC TGGCTCAGGA CCCAGTTTTA GGTCTAATCA AAGGAAAATG TTAAACCTGC TCCTGGAGAG AGACACTTCC TTTACCGTCT GTCCAGATGT CCCTAGAACT CCAGTGGGCA AATTTCTTGG TGATTCTGCA AACCTAAGCA TTTTGTCTGG AGGAACCCCA AAATGTTGCC TCGATCTTTC GAATCTTAGC AGTGGGGAGA TAACTGCCAC TCAGCTTACC ACTTCTGCAG ACCTTGATGA AACTGGTCAC CTGGATTCTT CAGGACTTCA GGAAGTGCAT TTAGCTGGGA TGAATCATGA CCAGCACCTA ATGAAATGTA GCCCAGCACA GCTTCTTTGT AGCACTCCGA ATGGTTTGGA CCGTGGCCAT AGAAAGAGAG ATGCAATGTG TAGTTCATCT GCAAATAAAG AAAATGACAA TGGAAACTTG GTGGACAGTG AAATGAAATA TTTGGGCAGT CCCATTACTA CTGTTCCAAA ATTGGATAAA AATCCAAACC TAGGAGAAGA CCAGGCAGAA GAGATTTCAG ATGAATTAAT GGAGTTTTCC CTGAAAGATC AAGAAGCAAA GGTGAGCAGA AGTGGCCTAT ATCGCTCCCC GTCGATGCCA GAGAACTTGA ACAGGCCAAG ACTGAAGCAG GTGGAAAAAT TCAAGGACAA CACAATACCA GATAAAGTTA AAAAAAAGTA TTTTTCTGGC CAAGGAAAGC TCAGGAAGGG CTTATGTTTA AAGAAGACAG TCTCTCTGTG TGACATTACT ATCACTCAGA TGCTGGAGGA AGATTCTAAC CAGGGGCACC TGATTGGTGA TTTTTCCAAG GTATGTGCGC TGCCAACCGT GTCAGGGAAA CACCAAGATC TGAAGTATGT CAACCCAGAA ACAGTGGCTG CCTTACTGTC GGGGAAGTTC CAGGGTCTGA TTGAGAAGTT TTATGTCATT GATTGTCGCT ATCCATATGA GTATCTGGGA GGACACATCC AGGGAGCCTT AAACTTATAT AGTCAGGAAG AACTGTTTAA CTTCTTTCTG AAGAAGCCCA TCGTCCCTTT GGACACCCAG AAGAGhATAA TCATCGTGTT CCACTGTGAA TTCTCCTCAG AGAGGGGCCC CCGAATGTGC CGCTGTCTGC GTGAAGAGGA CAGGTCTCTG AACCAGTATC CTGCATTGTA CTACCCAGAG CTATATATCC TTAAAGGCGG CTACAGAGAC TTCTTTCCAG AATATATGGA ACTGTGTGAA CCACAGAGCT ACTGCCCTAT GCATCATCAG GACCACAAGA CTGAGTTGCT GAGGTGTCGA AGCCAGAGCA AAGTGCAGGA AGGGGAGCGG CAGCTGCGGG AGCAGATTGC CCTTCTGGTG AAGGACATGA GCCCATGATA ACATTCCAGC CACTGGCTGC TAACATCTAG A

(les sites XBAI sont soulignés en continu, le cadre de lecture ouverte (ou ORF pour Open Reading Frame) de Cdc25C est souligné en pointillé) 1.4-Création de la souche JM109/pMAL-Hs Cdc25C Le vecteur pMAL-Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d'Escherichia coli (E. coli) JM109 (Stratagène #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie.

L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et immunodétection avec un anticorps anti-Cdc25C.

Finalement, F ADN plasmidique isolé de ce clone a été séquence dans la région correspondant à Cdc25C pour vérifier l'absence de mutations ou de modifications de la séquence qui auraient pu tre générées au cours des processus de sous-clonage et/ou de transformation de l'ADN.

La séquence suivante (désignée par SEQ. ID. n° 5) a été obtenue pour la souche JM109/pMAL-Hs Cdc25C : CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA

CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGACTGCACG GTGCACCAAT GCTTCTGGCG TCAGGCAGCC ATCGGAAGCT GTGGTATGGC TGTGCAGGTC GTAAATCACT GCATAATTCG TGTCGCTCAA GGCGCACTCC CGTTCTGGAT AATGTTTTTT GCGCCGACAT CATAACGGTT CTGGCAAATA TTCTGAAATG AGCTGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCCAGT CCGTTTAGGT GTTTTCACGA GCACTTCACC AACAAGGACC ATAGATTATG AAAATCGAAG AAGGTAAACT GGTAATCTGG <BR> <BR> ATTAACGGCG ATAAAGGCTA TAACGGTCTC GCTGAAGTCG GTAAGAAATT CGAGAAAGAT<BR> ACCGGAATTA AAGTCACCGT TGAGCATCCG GATAAACTGG AAGAGAAATT CCCACAGGTT GCGGCAACTG GCGATGGCCC TGACATTATC TTCTGGGCAC ACGACCGCTT TGGTGGCTAC <BR> <BR> GCTCAATCTG GCCTGTTGGC TGAAATCACC CCGGACAAAG CGTTCCAGGA CAAGCTGTAT<BR> CCGTTTACCT GGGATGCCGT ACGTTACAAC GGCAAGCTGA TTGCTTACCC GATCGCTGTT<BR> GAAGCGTTAT CGCTGATTTA TAACAAAGAT CTGCTGCCGA ACCCGCCAAA AACCTGGGAA GAGATCCCGG CGCTGGATAA AGAACTGAAA GCGAAAGGTA AGAGCGCGCT GATGTTCAAC CTGCAAGAAC CGTACTTCAC CTGGCCGCTG ATTGCTGCTG ACGGGGGTTA TGCGTTCAAG <BR> <BR> TATGAAAACG GCAAGTACGA CATTAAAGAC GTGGGCGTGG ATAACGCTGG CGCGAAAGCG<BR> GGTCTGACCT TCCTGGTTGA CCTGATTAAA AACAAACACA TGAATGCAGA CACCGATTAC TCCATCGCAG AAGCTGCCTT TAATAAAGGC GAAACAGCGA TGACCATCAA CGGCCCGTGG <BR> <BR> GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT GCCGACCTTC<BR> AAGGGTCAAC CATCCAAACC GTTCGTTGGC GTGCTGAGCG CAGGTATTAA CGCCGCCAGT<BR> CCGAACAAAG AGCTGGCAAA AGAGTTCCTC GAAAACTATC TGCTGACTGA TGAAGGTCTG<BR> GAAGCGGTTA ATAAAGACAA ACCGCTGGGT GCCGTAGCGC TGAAGTCTTA CGAGGAAGAG<BR> TTGGCGAAAG ATCCACGTAT TGCCGCCACC ATGGAAAACG CCCAGAAAGG TGAAATCATG<BR> CCGAACATCC CGCAGATGTC CGCTTTCTGG TATGCCGTGC GTACTGCGGT GATCAACGCC<BR> GCCAGCGGTC GTCAGACTGT CGATGAAGCC CTGAAAGACG CGCAGACTAA TTCGAGCTCG AACAACAACA ACAATAACAA TAACAACAAC CTCGGGATCG AGGGAAGGAT TTCAGAATTC <BR> <BR> GGATCCTCTA GAATGTCTAC GGAACTCTTC TCATCCACAA GAGAGGAAGG AAGCTCTGGC<BR> TCAGGACCCA GTTTTAGGTC TAATCAAAGG AAAATGTTAA ACCTGCTCCT GGAGAGAGAC<BR> ACTTCCTTTA CCGTCTGTCC AGATGTCCCT AGAACTCCAG TGGGCAAATT TCTTGGTGAT<BR> TCTGCAAACC TAAGCATTTT GTCTGGAGGA ACCCCAAAAT GTTGCCTCGA TCTTTCGAAT<BR> CTTAGCAGTG GGGAGATAAC TGCCACTCAG CTTACCACTT CTGCAGACCT TGATGAAACT GGTCACCTGG ATTCTTCAGG ACTTCAGGAA GTGCATTTAG CTGGGATGAA TCATGACCAG <BR> <BR> CACCTAATGA AATGTAGCCC AGCACAGCTT CTTTGTAGCA CTCCGAATGG TTTGGACCGT<BR> GGCCATAGAA AGAGAGATGC AATGTGTAGT TCATCTGCAA ATAAAGAAAA TGACAATGGA<BR> AACTTGGTGG ACAGTGAAAT GAAATATTTG GGCAGTCCCA TTACTACTGT TCCAAAATTG<BR> GATAAAAATC CAAACCTAGG AGAAGACCAG GCAGAAGAGA TTTCAGATGA ATTAATGGAG<BR> TTTTCCCTGA AAGATCAAGA AGCAAAGGTG AGCAGAAGTG GCCTATATCG CTCCCCGTCG

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GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTACCCCG GTTGATAATC AGAAAAGCCC CAAAAACAGG AAGATTGTAT <BR> <BR> AAGCAAATAT TTAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGCCCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA <BR> <BR> ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CAAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC <BR> <BR> CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC <BR> <BR> GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTAA AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC <BR> <BR> GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA <BR> <BR> CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT TTTGTGATGC <BR> <BR> TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAGAG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATACACT CCGCTATCGC TACGTGACTG GGTCATGGCT GCGCCCCGAC <BR> <BR> ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG GCAGCTGCGG TAAAGCTCAT CAGCGTGGTC GTGCAGCGAT TCACAGATGT CTGCCTGTTC ATCCGCGTCC AGCTCGTTGA GTTTCTCCAG AAGCGTTAAT GTCTGGCTTC TGATAAAGCG GGCCATGTTA AGGGCGGTTT TTTCCTGTTT GGTCACTTGA TGCCTCCGTG TAAGGGGGAA TTTCTGTTCA TGGGGGTAAT GATACCGATG AAACGAGAGA GGATGCTCAC <BR> <BR> GATACGGGTT ACTGATGATG AACATGCCCG GTTACTGGAA CGTTGTGAGG GTAAACAACT GGCGGTATGG ATGCGGCGGG ACCAGAGAAA AATCACTCAG GGTCAATGCC AGCGCTTCGT TAATACAGAT GTAGGTGTTC CACAGGGTAG CCAGCAGCAT CCTGCGATGC AGATCCGGAA CATAATGGTG CAGGGCGCTG ACTTCCGCGT TTCCAGACTT TACGAAACAC GGAAACCGAA

GACCATTCAT GTTGTTGCTC AGGTCGCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG CTCGCGTATC GGTGATTCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CTAGCCGGGT CCTCAACGAC AGGAGCACGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GACCCAACGC TGCCCGAAAT T (les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé, la séquence de la protéine liant le maltose (MBP) est soulignée par une double ligne continue et la séquence en gras correspond à la région de l'ADN plasmidique isolé à partir de la souche JM 109 et séquencée).

Ce clone peut tre conservé à-80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration finale 25%) ou"stock glycérol". Cette souche sera utilisée pour toutes les étapes de production ultérieures.

2-Production et purification de la protéine recombinante MBP-Cdc25C : NB : sauf indication contraire, tous les réactifs chimiques proviennent de SIGMA-ALDRICH.

2.1-Culture bactérienne et induction d'expression de la protéine de fusion 50 ml de milieu LB + ampicilline 100 pg/ml (LB amp.) sont inoculés avec 100 1 de stock glycérol du clone JM109/pMAL-Cdc25C et cultivés 14 à 16 heures à 37 °C sous agitation (180 à 220 rpm). Cette pré-culture est ensuite diluée cinquante fois (20 ml par litre de milieu) dans un milieu LB amp. + 2 g/1 de glucose et cultivée à 37 °C/180 rpm pour atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 0,55 et 0,60. La synthèse de la protéine de fusion est alors induite par ajout IPTG (0,3 mM) à 37 °C pendant 3 heures. Les bactéries sont récoltées par centrifugation, lavées une fois dans 40 ml de PBS froid par litre de culture, et le culot bactérien est ensuite congelé dans l'azote liquide et conservé à-80 °C.

L'induction est analysée immédiatement par dépôt de 2,5.107 cellules, prélevées avant et après induction, sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des protéines au bleu de Coomassie (Figure 1, lignes 1 et 2 respectivement).

2.2-Lyse et extraction.

Un culot bactérien correspondant à 1 litre de culture induite est décongelé dans la glace, re-suspendu dans 35 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 7,4,250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 pg/ml lysozyme, 1 J. g/ml leupeptine, 2 pLg/ml aprotinine, 1 mM PMSF) et incubé 45 min dans la glace. La suspension bactérienne est ensuite sonique (4 cycles de 1 min en mode discontinu 50%, alternés avec 1 min de pause), puis centrifugée pendant 35 min. à 110 000 g. Le surnageant ou extrait soluble est conservé pour la purification de la protéine MBP-Cdc25C (Figure 1, ligne 3).

2.3-Purification par affinité sur résine d'amylose-agarose.

Pour un extrait soluble correspondant à 1 litre de culture bactérienne induite, 2 ml de résine d'amylose-agarose (New England Biolabs #800-21) sont déposés sur une colonne chromatographique HR 5/10 (Pharmacia) et lavés par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 1 ug/ml leupeptine ; 2 pg/ml aprotinine). L'extrait soluble est passé sur la colonne d'affinité à un débit de 0,15 ml/min ; 1'eluat (c'est-à-dire la fraction non retenue sur l'amylose-agarose) est récolté pour analyse (Figure 1, ligne 4). La colonne est lavée par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne. Un échantillon de la matrice d'affinité après passage de 1'extrait soluble peut tre éventuellement analysé (Figure 1, ligne 5).

L'élution de la protéine de la matrice d'affinité est effectuée avec un tampon maltose (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 10 mM maltose). 20 fractions d'élution de 0,5 ml sont recueillies. Pour chaque fraction, la concentration protéique totale est évaluée par un essai de type Bradford et la fraction est analysée par dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1, ligne 6). Les fractions dans lesquelles la protéine de fusion MBP-Cdc25C complète représente au moins 90 % des protéines totales sont rassemblées pour former un lot dont l'activité est ensuite testée. Les lots sont conservés à-80°C.

Le séquençage de l'insert compris entre les sites XbaI donne le résultat : ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC

ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAGG ATTTCAGAAT TCGGATCCTC TAGAATGTCT ACGGAACTCT TCTCATCCAC AAGAGAGGAA GGAAGCTCTG GCTCAGGACC CAGTTTTAGG TCTAATCAAA GGAAAATGTT AAACCTGCTC CTGGAGAGAG ACACTTCCTT TACCGTCTGT CCAGATGTCC CTAGAACTCC AGTGGGCAAA TTTCTTGGTG ATTCTGCAAA CCTAAGCATT TTGTCTGGAG GAACCCCAAA ATGTTGCCTC GATCTTTCGA ATCTTAGCAG TGGGGAGATA ACTGCCACTC AGCTTACCAC TTCTGCAGAC CTTGATGAAA CTGGTCACCT GGATTCTTCA GGACTTCAGG <BR> <BR> AAGTGCATTT AGCTGGGATG AATCATGACC AGCACCTAAT GAAATGTAGC CCAGCACAGC TTCTTTGTAG CACTCCGAAT GGTTTGGACC GTGGCCATAG AAAGAGAGAT GCAATGTGTA GTTCATCTGC AAATAAAGAA AATGACAATG GAAACTTGGT GGACAGTGAA ATGAAATATT TGGGCAGTCC CATTACTACT GTTCCAAAAT TGGATAAAAA TCCAAACCTA GGAGAAGACC AGGCAGAAGA GATTTCAGAT GAATTAATGG AGTTTTCCCT GAAAGATCAA GAAGCAAAGG TGAGCAGAAG TGGCCTATAT CGCTCCCCGT CGATGCCAGA GAACTTGAAC AGGCCAAGAC TGAAGCAGGT GGAAAAATTC AAGGACAACA CAATACCAGA TAAAGTTAAA AAAAAGTATT TTTCTGGCCA AGGAAAGCTC AGGAAGGGCT TATGTTTAAA GAAGACAGTC TCTCTGTGTG <BR> <BR> ACATTACTAT CACTCAGATG CTGGAGGAAG ATTCTAACCA GGGGCACCTG ATTGGTGATT TTTCCAAGGT ATGTGCGCTG CCAACCGTGT CAGGGAAACA CCAAGATCTG AAGTATGTCA <BR> <BR> ACCCAGAAAC AGTGGCTGCC TTACTGTCGG GGAAGTTCCA GGGTCTGATT GAGAAGTTTT ATGTCATTGA TTGTCGCTAT CCATATGAGT ATCTGGGAGG ACACATCCAG GGAGCCTTAA ACTTATATAG TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTCTGAA GAAGCCCATC GTCCCTTTGG ACACCCAGAA GAGAATAATC ATCGTGTTCC ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGCCCCC <BR> <BR> GAATGTGCCGCTGTCTGCGT GAAGAGGACA GGTCTCTGAA CCAGTATCCT GCATTGTACT ACCCAGAGCT ATATATCCTT AAAGGCGGCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA TATATGGAAC <BR> <BR> TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA

GGTGTCGAAG CCAGAGCAAA GTGCAGGAAG GGGAGCGGCA GCTGCGGGAG CAGATTGCCC TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGATAAC ATTCCAGCCA CTGGCTGCTA ACATCTAGA (les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé et la séquence en italique correspond à l'ORF de la protéine liant le maltose (MBP)) La séquence de la protéine de fusion MBP-Cdc25C obtenue correspond donc à la séquence SEQ. ID n° 1 représentée ci-dessous : ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAGG ATTTCAGAAT TCGGATCCTC TAGAATGTCT ACGGAACTCT TCTCATCCAC AAGAGAGGAA GGAAGCTCTG GCTCAGGACC CAGTTTTAGG TCTAATCAAA GGAAAATGTT AAACCTGCTC CTGGAGAGAG ACACTTCCTT TACCGTCTGT CCAGATGTCC CTAGAACTCC AGTGGGCAAA TTTCTTGGTG ATTCTGCAAA CCTAAGCATT TTGTCTGGAG GAACCCCAAA ATGTTGCCTC GATCTTTCGA ATCTTAGCAG TGGGGAGATA ACTGCCACTC AGCTTACCAC TTCTGCAGAC CTTGATGAAA CTGGTCACCT GGATTCTTCA GGACTTCAGG AAGTGCATTT AGCTGGGATG AATCATGACC AGCACCTAAT GAAATGTAGC CCAGCACAGC TTCTTTGTAG CACTCCGAAT GGTTTGGACC GTGGCCATAG AAAGAGAGAT GCAATGTGTA GTTCATCTGC AAATAAAGAA AATGACAATG GAAACTTGGT GGACAGTGAA ATGAAATATT TGGGCAGTCC CATTACTACT GTTCCAAAAT TGGATAAAAA TCCAAACCTA GGAGAAGACC

AGGCAGAAGA GATTTCAGAT GAATTAATGG AGTTTTCCCT GAAAGATCAA GAAGCAAAGG TGAGCAGAAG TGGCCTATAT CGCTCCCCGT CGATGCCAGA GAACTTGAAC AGGCCAAGAC <BR> <BR> TGAAGCAGGT GGAAAAATTC AAGGACAACA CAATACCAGA TAAAGTTAAA AAAAAGTATT TTTCTGGCCA AGGAAAGCTC AGGAAGGGCT TATGTTTAAA GAAGACAGTC TCTCTGTGTG ACATTACTAT CACTCAGATG CTGGAGGAAG ATTCTAACCA GGGGCACCTG ATTGGTGATT TTTCCAAGGT ATGTGCGCTG CCAACCGTGT CAGGGAAACA CCAAGATCTG AAGTATGTCA ACCCAGAAAC AGTGGCTGCC TTACTGTCGG GGAAGTTCCA GGGTCTGATT GAGAAGTTTT ATGTCATTGA TTGTCGCTAT CCATATGAGT ATCTGGGAGG ACACATCCAG GGAGCCTTAA ACTTATATAG TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTCTGAA GAAGCCCATC GTCCCTTTGG ACACCCAGAA GAGAATAATC ATCGTGTTCC ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGCCCCC GAATGTGCCG CTGTCTGCGT GAAGAGGACA GGTCTCTGAA CCAGTATCCT GCATTGTACT ACCCAGAGCT ATATATCCTT AAAGGCGGCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA TATATGGAAC TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA GGTGTCGAAG CCAGAGCAAA GTGCAGGAAG GGGAGCGGCA GCTGCGGGAG CAGATTGCCC TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGA 3-Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C : L'activité phosphatase de la. protéine MBP-Cdc25C est évaluée par un essai de déphosphorylation du phosphate de 3-O-méthylfluorescéine (OMFP) avec détermination de l'absorbance à 477 nm (DO 477 nm) du produit de la réaction (OMF).

La protéine MBP-Cdc25C, conservée dans le tampon d'élution (le mme que celui décrit au paragraphe 2.3), est diluée à la concentration de 20 nM dans le tampon de réaction phosphatase (50 mM Tris-HCl pH 8,2 ; 50 mM NaCl ; 1 mM DTT ; 20% glycérol), à température ambiante, dans un volume réactionnel total de 1 ml. La réaction est initiée par l'ajout d'une solution 0,3 mM de OMFP (préparée extemporanément à partir d'une solution stock 7,5 mM dans du DMSO 100% (Sigma #M2629)) et se déroule à 25 °C dans une cuve pour spectrophotométrie à usage unique en polystyrène (Fisher Scientific #A12-103-056). La DO 477 nm est mesurée après 90 min. La référence pour la mesure d'absorbance est constituée par le tampon de réaction contenant 0,3 mM d'OMFP, sans protéine MBP-Cdc25C, au temps to de la réaction. Un exemple représentatif des résultats d'une telle détermination d'activité est illustré par la Figure 2.

B/Protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et<BR> MBP-Cdc25B3 :<BR> 1-Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 1.1-Principe du système utilisé.

Le système utilisé (New England Biolabs #800-pMAL protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intért, ici la protéine Cdc25B humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose- Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.

1.2-Origine de 1'ADNc de Cdc25B L'ADN codant pour les trois variants d'épissage de la phosphatase CDC25B humaine correspond aux numéros d'accession : M81934 et Z68092.

1.3-Construction des vecteurs pMAL-Hs Cdc25B Les différences entre les ADN des 3 variants de Cdc25B concernent deux exons codant des domaines de 14 et 42 acides aminés localisés dans la région régulatrice de la molécule (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14,2485-2490) et n'affectant pas ses régions 5'et 3'. La stratégie de clonage utilisée pour ces trois variants est donc identique.

Les ADNc de Cdc25B sous la forme d'inserts NdeI (Klenow)/BamHl ont été introduits dans le vecteur pMAL-C2X (New England Biolabs, #800-76) au site EcoRl (Klenow)/BamHl pour donner respectivement les vecteurs pMAL-Hs Cdc25B1, pMAL-Hs Cdc25B2 et pMAL-Hs Cdc25B3. Ces vecteurs permettent la production des protéines de fusion MBP-Cdc25B1 (962 acides aminés), MPB-Cdc25B2 (933 acides aminés) et MBP-Cdc25B3 (974 acides aminés) à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).

La séquence SEQ. ID. n° 6 de la protéine Hs Cdc25B1 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante : CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCCGCAGC CGCCTGACGC ACCTATCCCT GTCTCGACGG GCATCCGAAT CCTCCCTGTC GTCTGAATCC TCCGAATCTT CTGATGCAGG TCTCTGCATG GATTCCCCCA GCCCTATGGA CCCCCACATG GCGGAGCAGA CGTTTGAACA GGCCATCCAG GCAGCCAGCC GGATCATTCG AAACGAGCAG TTTGCCATCA GACGCTTCCA GTCTATGCCG GTGAGGCTGC TGGGCCACAG CCCCGTGCTT CGGAACATCA CCAACTCCCA GGCGCCCGAC GGCCGGAGGA AGAGCGAGGC GGGCAGTGGA GCTGCCAGCA GCTCTGGGGA AGACAAGGAG AATGATGGAT TTGTCTTCAA GATGCCATGG AAGCCCACAC ATCCCAGCTC CACCCATGCT CTGGCAGAGT GGGCCAGCCG CAGGGAAGCC TTTGCCCAGA GACCCAGCTC GGCCCCCGAC CTGATGTGTC TCAGTCCTGA CCGGAAGATG GAAGTGGAGG AGCTCAGCCC CCTGGCCCTA GGTCGCTTCT CTCTGACCCC TGCAGAGGGG GATACTGAGG AAGATGATGG ATTTGTGGAC ATCCTAGAGA GTGACTTAAA GGATGATGAT GCAGTTCCCC CAGGCATGGA GAGTCTCATT AGTGCCCCAC TGGTCAAGAC CTTGGAAAAG GAAGAGGAAA AGGACCTCGT CATGTACAGC AAGTGCCAGC GGCTCTTCCG CTCTCCGTCC ATGCCCTGCA GCGTGATCCG GCCCATCCTC AAGAGGCTGG AGCGGCCCCA GGACAGGGAC ACGCCCGTGC AGAATAAGCG GAGGCGGAGC GTGACCCCTC CTGAGGAGCA GCAGGAGGCT GAGGAACCTA AAGCCCGCGT CCTCCGCTCA AAATCACTGT GTCACGATGA GATCGAGAAC CTCCTGGACA GTGACCACCG AGAGCTGATT GGAGATTACT CTAAGGCCTT CCTCCTACAG ACAGTAGACG GAAAGCACCA AGACCTCAAG TACATCTCAC CAGAAACGAT GGTGGCCCTA TTGACGGGCA AGTTCAGCAA CATCGTGGAT AAGTTTGTGA TTGTAGACTG CAGATACCCC TATGAATATG AAGGCGGGCA CATCAAGACT GCGGTGAACT TGCCCCTGGA ACGCGACGCC GAGAGCTTCC TACTGAAGAG CCCCATCGCG CCCTGTAGCC TGGACAAGAG AGTCATCCTC ATTTTCCACT GTGAATTCTC ATCTGAGCGT GGGCCCCGCA TGTGCCGTTT CATCAGGGAA CGAGACCGTG CTGTCAACGA CTACCCCAGC CTCTACTACC CTGAGATGTA TATCCTGAAA GGCGGCTACA AGGAGTTCTT CCCTCAGCAC CCGAACTTCT GTGAACCCCA GGACTACCGG CCCATGAACC ACGAGGCCTT CAAGGATGAG CTAAAGACCT TCCGCCTCAA GACTCGCAGC TGGGCTGGGG AGCGGAGCCG GCGGGAGCTC TGTAGCCGGC TGCAGGACCA GTGAGGGGCC TGCGCCAGTC CTGCTACCTC CCTTGCCTTT CGAGGCCTGA AGCCAGCTGC CCTATGGGCC TGCCGGGCTG AGGGCCTGCT GGAGGCCTCA GGTGCTGTCC ATGGGAAAGA TGGTGTGGTG TCCTGCCTGT CTGCCCCAGC CCAGATTCCC CTGTGTCATC CCATCATTTT CCATATCCTG GTGCCCCCCA CCCCTGGAAG AGCCCAGTCT GTTGAGTTAG TTAAGTTGGG TTAATACCAG CTTAAAGGCA GTATTTTGTG TCCTCCAGGA GCTTCTTGTT TCCTTGTTAG GGTTAACCCT TCATCTTCCT GTGTCCTGAA ACGCTCCTTT GTGTGTGTGT CAGCTGAGGA TCC

(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 7 de la protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante : <BR> <BR> CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC CGCAGCCGCA GCCGCCTGAC GCACCTATCC CTGTCTCGAC GGGCATCCGA ATCCTCCCTG TCGTCTGAAT CCTCCGAATC TTCTGATGCA GGTCTCTGCA TGGATTCCCC CAGCCCTATG GACCCCCACA TGGCGGAGCA GACGTTTGAA CAGGCCATCC AGGCAGCCAG CCGGATCATT CGAAACGAGC AGTTTGCCAT CAGACGCTTC CAGTCTATGC CGGATGGATT TGTCTTCAAG ATGCCATGGA AGCCCACACA TCCCAGCTCC ACCCATGCTC TGGCAGAGTG GGCCAGCCGC AGGGAAGCCT TTGCCCAGAG ACCCAGCTCG GCCCCCGACC TGATGTGTCT CAGTCCTGAC CGGAAGATGG AAGTGGAGGA GCTCAGCCCC CTGGCCCTAG GTCGCTTCTC TCTGACCCCT GCAGAGGGGG ATACTGAGGA AGATGATGGA TTTGTGGACA TCCTAGAGAG TGACTTAAAG GATGATGATG CAGTTCCCCC AGGCATGGAG AGTCTCATTA GTGCCCCACT GGTCAAGACC TTGGAAAAGG AAGAGGAAAA GGACCTCGTC ATGTACAGCA AGTGCCAGCG GCTCTTCCGC TCTCCGTCCA TGCCCTGCAG CGTGATCCGG CCCATCCTCA AGAGGCTGGA GCGGCCCCAG GACAGGGACA CGCCCGTGCA GAATAAGCGG AGGCGGAGCG TGACCCCTCC TGAGGAGCAG CAGGAGGCTG AGGAACCTAA AGCCCGCGTC CTCCGCTCAA AATCACTGTG TCACGATGAG ATCGAGAACC TCCTGGACAG TGACCACCGA GAGCTGATTG GAGATTACTC TAAGGCCTTC CTCCTACAGA CAGTAGACGG AAAGCACCAA GACCTCAAGT ACATCTCACC AGAAACGATG GTGGCCCTAT TGACGGGCAA GTTCAGCAAC ATCGTGGATA AGTTTGTGAT TGTAGACTGC AGATACCCCT ATGAATATGA AGGCGGGCAC ATCAAGACTG CGGTGAACTT GCCCCTGGAA CGCGACGCCG AGAGCTTCCT ACTGAAGAGC CCCATCGCGC CCTGTAGCCT GGACAAGAGA GTCATCCTCA TTTTCCACTG TGAATTCTCA TCTGAGCGTG GGCCCCGCAT GTGCCGTTTC ATCAGGGAAC GAGACCGTGC TGTCAACGAC TACCCCAGCC TCTACTACCC TGAGATGTAT ATCCTGAAAG GCGGCTACAA GGAGTTCTTC CCTCAGCACC CGAACTTCTG TGAACCCCAG GACTACCGGC CCATGAACCA CGAGGCCTTC AAGGATGAGC TAAAGACCTT CCGCCTCAAG ACTCGCAGCT GGGCTGGGGA GCGGAGCCGG CGGGAGCTCT GTAGCCGGCT GCAGGACCAG TGAGGGGCCT GCGCCAGTCC TGCTACCTCC CTTGCCTTTC GAGGCCTGAA GCCAGCTGCC <BR> <BR> CTATGGGCCT GCCGGGCTGA GGGCCTGCTG GAGGCCTCAG GTGCTGTCCA TGGGAAAGAT GGTGTGGTGT CCTGCCTGTC TGCCCCAGCC CAGATTCCCC TGTGTCATCC CATCATTTTC CATATCCTGG TGCCCCCCAC CCCTGGAAGA GCCCAGTCTG TTGAGTTAGT TAAGTTGGGT <BR> <BR> TAATACCAGC TTAAAGGCAG TATTTTGTGT CCTCCAGGAG CTTCTTGTTT CCTTGTTAGG<BR> GTTAACCCTT CATCTTCCTG TGTCCTGAAA CGCTCCTTTG TGTGTGTGTC AGCTGAGGAT CC

(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 8 de la protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamH1 est la suivante : <BR> <BR> CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC CGCAGCCGCA GCCGCCTGAC GCACCTATCC CTGTCTCGAC GGGCATCCGA ATCCTCCCTG TCGTCTGAAT CCTCCGAATC TTCTGATGCA GGTCTCTGCA TGGATTCCCC CAGCCCTATG GACCCCCACA TGGCGGAGCA GACGTTTGAA CAGGCCATCC AGGCAGCCAG CCGGATCATT CGAAACGAGC AGTTTGCCAT CAGACGCTTC CAGTCTATGC CGGTGAGGCT GCTGGGCCAC AGCCCCGTGC TTCGGAACAT CACCAACTCC CAGGCGCCCG ACGGCCGGAG GAAGAGCGAG GCGGGCAGTG GAGCTGCCAG CAGCTCTGGG GAAGACAAGG AGAATGATGG ATTTGTCTTC AAGATGCCAT GGAAGCCCAC ACATCCCAGC TCCACCCATG CTCTGGCAGA GTGGGCCAGC CGCAGGGAAG CCTTTGCCCA GAGACCCAGC TCGGCCCCCG ACCTGATGTG TCTCAGTCCT GACCGGAAGA TGGAAGTGGA GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT CTCTCTGACC CCTGCAGAGG GGGATACTGA GGAAGATGAT GGATTTGTGG ACATCCTAGA GAGTGACTTA AAGGATGATG ATGCAGTTCC CCCAGGCATG GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG ACCTTGGAAA AGGAAGAGGA AAAGGACCTC GTCATGTACA GCAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGCTCTCCGT CCATGCCCTG CAGCGTGATC CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACCGGCCCATGAACCACGAGGCCTTCAAGGATGAGCTAAAGACCTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGAGGGG CCTGCGCCAG TCCTGCTACC TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT

AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC (les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) 1.4-Création des souches JM109/pMAL-Cdc25B1, B2 et B3 Les vecteurs pMAL-Cdc25B1-3 ont chacun été introduits dans la souche d'Escherichia coli JM109 (Stratagene #200271). Les colonies ont été sélectionnées sur la base de leur capacité à produire une protéine de fusion après culture en présence d'IPTG. L'identité des protéines a été vérifiée par immunodétection avec des anticorps polyclonaux dirigés contre Cdc25B.

Les ADN plasmidiques isolés de ces trois clones ont été séquences dans la région correspondant à Cdc25B. Les séquences suivantes ont été obtenues (la partie doublement soulignée correspond à 1'ORF de MBP et la partie soulignée en pointillés à l'ORF de Cdc25B1, Cdc25B2 ou Cdc25B3) : SEQ. ID n ° 9 (pMAL-HsCdc25BI) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC

AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC <BR> <BR> CTCCCGGGCCTCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCCGC AGCCGCCTGA CGCACCTATC CCTGTCTCGA CGGGCATCCG AATCCTCCCT GTCGTCTGAA TCCTCCGAAT CTTCTGATGC AGGTCTCTGC ATGGATTCCC CCAGCCCTAT GGACCCCCAC ATGGCGGAGC AGACGTTTGA ACAGGCCATC CAGGCAGCCA GCCGGATCAT TCGAAACGAG CAGTTTGCCA TCAGACGCTT CCAGTCTATG CCGGTGAGGC TGCTGGGCCA CAGCCCCGTG CTTCGGAACA TCACCAACTC CCAGGCGCCC GACGGCCGGA GGAAGAGCGA GGCGGGCAGT GGAGCTGCCA GCAGCTCTGG GGAAGACAAG GAGAATGATG GATTTGTCTT CAAGATGCCA TGGAAGCCCA CACATCCCAG CTCCACCCAT GCTCTGGCAG AGTGGGCCAG CCGCAGGGAA <BR> <BR> GCCTTTGCCC AGAGACCCAG CTCGGCCCCC GACCTGATGT GTCTCAGTCC TGACCGGAAG ATGGAAGTGG AGGAGCTCAG CCCCCTGGCC CTAGGTCGCT TCTCTCTGAC CCCTGCAGAG GGGGATACTG AGGAAGATGA TGGATTTGTG GACATCCTAG AGAGTGACTT AAAGGATGAT GATGCAGTTC CCCCAGGCAT GGAGAGTCTC ATTAGTGCCC CACTGGTCAA GACCTTGGAA <BR> <BR> AAGGAAGAGG AAAAGGACCT CGTCATGTAC AGCAAGTGCC AGCGGCTCTT CCGCTCTCCG TCCATGCCCT GCAGCGTGAT CCGGCCCATC CTCAAGAGGC TGGAGCGGCC CCAGGACAGG GACACGCCCG TGCAGAATAA GCGGAGGCGG AGCGTGACCC CTCCTGAGGA GCAGCAGGAG GCTGAGGAAC CTAAAGCCCG CGTCCTCCGC TCAAAATCAC TGTGTCACGA TGAGATCGAG AACCTCCTGG ACAGTGACCA CCGAGAGCTG ATTGGAGATT ACTCTAAGGC CTTCCTCCTA CAGACAGTAG ACGGAAAGCA CCAAGACCTC AAGTACATCT CACCAGAAAC GATGGTGGCC CTATTGACGG GCAAGTTCAG CAACATCGTG GATAAGTTTG TGATTGTAGA CTGCAGATAC CCCTATGAAT ATGAAGGCGG GCACATCAAG ACTGCGGTGA ACTTGCCCCT GGAACGCGAC GCCGAGAGCT TCCTACTGAA GAGCCCCATC GCGCCCTGTA GCCTGGACAA GAGAGTCATC CTCATTTTCC ACTGTGAATT CTCATCTGAG CGTGGGCCCC GCATGTGCCG TTTCATCAGG GAACGAGACC GTGCTGTCAA CGACTACCCC AGCCTCTACT ACCCTGAGAT GTATATCCTG AAAGGCGGCT ACAAGGAGTT CTTCCCTCAG CACCCGAACT TCTGTGAACC CCAGGACTAC CGGCCCATGA ACCACGAGGC CTTCAAGGAT GAGCTAAAGA CCTTCCGCCT CAAGACTCGC <BR> <BR> AGCTGGGCTG GGGAGCGGAG CCGGCGGGAG CTCTGTAGCC GGCTGCAGGA CCAGTGAGGG GCCTGCGCCA GTCCTGCTAC CTCCCTTGCC TTTCGAGGCC TGAAGCCAGC TGCCCTATGG GCCTGCCGGG CTGAGGGCCT GCTGGAGGCC TCAGGTGCTG TCCATGGGAA AGATGGTGTG GTGTCCTGCC TGTCTGCCCC AGCCCAGATT CCCCTGTGTC ATCCCATCAT TTTCCATATC CTGGTGCCCC CCACCCCTGG AAGAGCCCAG TCTGTTGAGT TAGTTAAGTT GGGTTAATAC CAGCTTAAAG GCAGTATTTT GTGTCCTCCA GGAGCTTCTT GTTTCCTTGT TAGGGTTAAC CCTTCATCTT CCTGTGTCCT GAAACGCTCC TTTGTGTGTG TGTCAGCTGA GGATCC

SEQ. ID n° 10 (pMAL-HsCdc25B2) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCTCGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCTGCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC TTCCAGTCTA TGCCGGATGG ATTTGTCTTC AAGATGCCAT GGAAGCCCAC ACATCCCAGC TCCACCCATG CTCTGGCAGA GTGGGCCAGC CGCAGGGAAG CCTTTGCCCA GAGACCCAGC TCGGCCCCCG ACCTGATGTG TCTCAGTCCT TGGAAGTGGA GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT CTCTCTGACC CCTGCAGAGG GGGATACTGA GGAAGATGAT GGATTTGTGG ACATCCTAGA GAGTGACTTA AAGGATGATG ATGCAGTTCC CCCAGGCATG GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG ACCTTGGAAA AGGAAGAGGA AAAGGACCTC GTCATGTACAGCAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGCTCTCCGT CCATGCCCTG CAGCGTGATC<BR> CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG

CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC <BR> <BR> GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGAGGGG CCTGCGCCAG TCCTGCTACC TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC SEQ. ID n° ll (pMAL-HsCdc25B3) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC

TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC <BR> <BR> CTCCCGGGCCTCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCT GCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC <BR> <BR> TTCCAGTCTA TGCCGGTGAG GCTGCTGGGC CACAGCCCCG TGCTTCGGAA CATCACCAAC TCCCAGGCGC CCGACGGCCG GAGGAAGAGC GAGGCGGGCA GTGGAGCTGC CAGCAGCTCT GGGGAAGACA AGGAGAATGA TGGATTTGTC TTCAAGATGC CATGGAAGCC CACACATCCC AGCTCCACCC ATGCTCTGGC AGAGTGGGCC AGCCGCAGGG AAGCCTTTGC CCAGAGACCC AGCTCGGCCC CCGACCTGAT GTGTCTCAGT CCTGACCGGA AGATGGAAGT GGAGGAGCTC AGCCCCCTGG CCCTAGGTCG CTTCTCTCTG ACCCCTGCAG AGGGGGATAC TGAGGAAGAT GATGGATTTG TGGACATCCT AGAGAGTGAC TTAAAGGATG ATGATGCAGT TCCCCCAGGC ATGGAGAGTC TCATTAGTGC CCCACTGGTC AAGACCTTGG AAAAGGAAGA GGAAAAGGAC CTCGTCATGT ACAGCAAGTG CCAGCGGCTC TTCCGCTCTC CGTCCATGCC CTGCAGCGTG ATCCGGCCCA TCCTCAAGAG GCTGGAGCGG CCCCAGGACA GGGACACGCC CGTGCAGAAT AAGCGGAGGC GGAGCGTGAC CCCTCCTGAG GAGCAGCAGG AGGCTGAGGA ACCTAAAGCC CGCGTCCTCC GCTCAAAATC ACTGTGTCAC GATGAGATCG AGAACCTCCT GGACAGTGAC CACCGAGAGC TGATTGGAGA TTACTCTAAG GCCTTCCTCC TACAGACAGT AGACGGAAAG CACCAAGACC TCAAGTACAT CTCACCAGAA ACGATGGTGG CCCTATTGAC GGGCAAGTTC AGCAACATCG TGGATAAGTT TGTGATTGTA GACTGCAGAT ACCCCTATGA ATATGAAGGC GGGCACATCA AGACTGCGGT GAACTTGCCC ACGCCGAGAG CTTCCTACTG AAGAGCCCCA TCGCGCCCTG TAGCCTGGAC AAGAGAGTCA TCCTCATTTT CCACTGTGAA TTCTCATCTG AGCGTGGGCC CCGCATGTGC CGTTTCATCA GGGAACGAGA CCGTGCTGTC AACGACTACC CCAGCCTCTA CTACCCTGAG ATGTATATCC TGAAAGGCGG CTACAAGGAG TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG <BR> <BR> GCCTTCAAGG ATGAGCTAAA GACCTTCCGC CTCAAGACTC GCAGCTGGGC TGGGGAGCGG AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGAG GGGCCTGCGC CAGTCCTGCT ACCTCCCTTG CCTTTCGAGG CCTGAAGCCA GCTGCCCTAT GGGCCTGCCG GGCTGAGGGC CTGCTGGAGG CCTCAGGTGC TGTCCATGGG AAAGATGGTG TGGTGTCCTG CCTGTCTGCC CCAGCCCAGA TTCCCCTGTG TCATCCCATC ATTTTCCATA TCCTGGTGCC CCCCACCCCT GGAAGAGCCC AGTCTGTTGA GTTAGTTAAG TTGGGTTAAT ACCAGCTTAA AGGCAGTATT TTGTGTCCTC CAGGAGCTTC TTGTTTCCTT GTTAGGGTTA ACCCTTCATC TTCCTGTGTC CTGAAACGCT CCTTTGTGTG TGTGTCAGCT GAGGATCC

Ces clones sont conservés à-80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration finale 25%). Ces souches sont ensuite utilisées pour toutes les étapes de production ultérieures.

2-Production et purification des protéines recombinantes MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 : Les protéines recombinantes MBP-Cdc25B1, B2 et B3 sont produites exactement comme cela est décrit pour MBP-Cdc25C.

Les séquences SEQ. ID n° 12, SEQ. ID n° 13 et SEQ. ID n° 14 sont obtenues respectivement pour les protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 : SEQ. ID n ° 12 (MBP-Cdc25Bl) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC<BR> CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT

TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCCGC AGCCGCCTGA CGCACCTATC CCTGTCTCGA CGGGCATCCG AATCCTCCCT GTCGTCTGAA <BR> <BR> TCCTCCGAAT CTTCTGATGC AGGTCTCTGC ATGGATTCCC CCAGCCCTAT GGACCCCCAC ATGGCGGAGC AGACGTTTGA ACAGGCCATC CAGGCAGCCA GCCGGATCAT TCGAAACGAG CAGTTTGCCA TCAGACGCTT CCAGTCTATG CCGGTGAGGC TGCTGGGCCA CAGCCCCGTG CTTCGGAACA TCACCAACTC CCAGGCGCCC GACGGCCGGA GGAAGAGCGA GGCGGGCAGT GGAGCTGCCA GCAGCTCTGG GGAAGACAAG GAGAATGATG GATTTGTCTT CAAGATGCCA TGGAAGCCCA CACATCCCAG CTCCACCCAT GCTCTGGCAG AGTGGGCCAG CCGCAGGGAA GCCTTTGCCC AGAGACCCAG CTCGGCCCCC GACCTGATGT GTCTCAGTCC TGACCGGAAG ATGGAAGTGG AGGAGCTCAG CCCCCTGGCC CTAGGTCGCT TCTCTCTGAC CCCTGCAGAG GGGGATACTG AGGAAGATGA TGGATTTGTG GACATCCTAG AGAGTGACTT AAAGGATGAT GATGCAGTTC CCCCAGGCAT GGAGAGTCTC ATTAGTGCCC CACTGGTCAA GACCTTGGAA AAGGAAGAGG AAAAGGACCT CGTCATGTAC AGCAAGTGCC AGCGGCTCTT CCGCTCTCCG TCCATGCCCT GCAGCGTGAT CCGGCCCATC CTCAAGAGGC TGGAGCGGCC CCAGGACAGG GACACGCCCG TGCAGAATAA GCGGAGGCGG AGCGTGACCC CTCCTGAGGA GCAGCAGGAG GCTGAGGAAC CTAAAGCCCG CGTCCTCCGC TGTGTCACGA TGAGATCGAG <BR> <BR> AACCTCCTGG ACAGTGACCA CCGAGAGCTG ATTGGAGATT ACTCTAAGGC CTTCCTCCTA CAGACAGTAG ACGGAAAGCA CCAAGACCTC AAGTACATCT CACCAGAAAC GATGGTGGCC CTATTGACGG GCAAGTTCAG CAACATCGTG GATAAGTTTG TGATTGTAGA CTGCAGATAC CCCTATGAAT ATGAAGGCGG GCACATCAAG ACTGCGGTGA ACTTGCCCCT GGAACGCGAC GCCGAGAGCT TCCTACTGAA GAGCCCCATC GCGCCCTGTA GCCTGGACAA GAGAGTCATC CTCATTTTCC ACTGTGAATT CTCATCTGAG CGTGGGCCCC GCATGTGCCG TTTCATCAGG GAACGAGACC GTGCTGTCAA CGACTACCCC AGCCTCTACT ACCCTGAGAT GTATATCCTG <BR> <BR> AAAGGCGGCT ACAAGGAGTT CTTCCCTCAG CACCCGAACT TCTGTGAACC CCAGGACTAC CGGCCCATGA ACCACGAGGC CTTCAAGGAT GAGCTAAAGA CCTTCCGCCT CAAGACTCGC AGCTGGGCTG GGGAGCGGAG CCGGCGGGAG CTCTGTAGCC GGCTGCAGGA CCAGTGA SEQ. ID n° 13 (MBP-Cdc25B2) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA

GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC <BR> <BR> GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC<BR> CTCCCGGGCCTCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCT GCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC TTCCAGTCTA TGCCGGATGG ATTTGTCTTC AAGATGCCAT GGAAGCCCAC ACATCCCAGC TCCACCCATG CTCTGGCAGA GTGGGCCAGC CGCAGGGAAG CCTTTGCCCA GAGACCCAGC TCGGCCCCCG ACCTGATGTG TCTCAGTCCT GACCGGAAGA TGGAAGTGGA GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT CTCTCTGACC CCTGCAGAGG GGGATACTGA GGAAGATGAT GGATTTGTGG ACATCCTAGA GAGTGACTTA AAGGATGATG ATGCAGTTCC CCCAGGCATG GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG ACCTTGGAAA AGGAAGAGGA AAAGGACCTC GTCATGTACA GCAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGCTCTCCGT CCATGCCCTG CAGCGTGATC CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG <BR> <BR> CACATCAAGACTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC <BR> <BR> TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC CGGCGGGAGCTCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGA

SEQ. ID n° 14 (MBP-Cdc25B3) : ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCT GCATGGATTC : CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC TTCCAGTCTATGCCGGTGAG GCTGCTGGGC CACAGCCCCG TGCTTCGGAA CATCACCAAC TCCCAGGCGC CCGACGGCCG GAGGAAGAGC GAGGCGGGCA GTGGAGCTGC CAGCAGCTCT GGGGAAGACAAGGAGAATGA TGGATTTGTC TTCAAGATGC CATGGAAGCC CACACATCCC AGCTCCACCC ATGCTCTGGC AGAGTGGGCC AGCCGCAGGG AAGCCTTTGC CCAGAGACCC AGCTCGGCCC CCGACCTGAT GTGTCTCAGT CCTGACCGGA AGATGGAAGT GGAGGAGCTC AGCCCCCTGG CCCTAGGTCG CTTCTCTCTG ACCCCTGCAG AGGGGGATAC TGAGGAAGAT GATGGATTTG TGGACATCCT AGAGAGTGAC TTAAAGGATG ATGATGCAGT TCCCCCAGGC ATGGAGAGTC TCATTAGTGC CCCACTGGTC AAGACCTTGG AAAAGGAAGA GGAAAAGGAC CTCGTCATGTACAGCAAGTG CCAGCGGCTC TTCCGCTCTC CGTCCATGCC CTGCAGCGTG

ATCCGGCCCA TCCTCAAGAG GCTGGAGCGG CCCCAGGACA GGGACACGCC CGTGCAGAAT AAGCGGAGGC GGAGCGTGAC CCCTCCTGAG GAGCAGCAGG AGGCTGAGGA ACCTAAAGCC CGCGTCCTCC GCTCAAAATC ACTGTGTCAC GATGAGATCG AGAACCTCCT GGACAGTGAC CACCGAGAGC TGATTGGAGA TTACTCTAAG GCCTTCCTCC TACAGACAGT AGACGGAAAG CACCAAGACC TCAAGTACAT CTCACCAGAA ACGATGGTGG CCCTATTGAC GGGCAAGTTC AGCAACATCG TGGATAAGTT TGTGATTGTA GACTGCAGAT ACCCCTATGA ATATGAAGGC GGGCACATCA AGACTGCGGT GAACTTGCCC CTGGAACGCG ACGCCGAGAG CTTCCTACTG AAGAGCCCCA TCGCGCCCTG TAGCCTGGAC AAGAGAGTCA TCCTCATTTT CCACTGTGAA TTCTCATCTG AGCGTGGGCC CCGCATGTGC CGTTTCATCA GGGAACGAGA CCGTGCTGTC AACGACTACC CCAGCCTCTA CTACCCTGAG ATGTATATCC TGAAAGGCGG CTACAAGGAG TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG GCCTTCAAGG ATGAGCTAAA GACCTTCCGC CTCAAGACTC GCAGCTGGGC TGGGGAGCGG AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGA 3-Détermination de l'activité des protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 : Les activités des protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 sont mesurées dans les mmes conditions que celles décrites pour la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les résultats obtenus sont reportés en figure 3.

LEGENDE DES FIGURES La figure 1 (FIG. 1) représente la chromatographie d'analyse relative à l'induction d'expression de la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les lignes 1 et 2 de la figure 1 correspondent respectivement à l'extrait total de JM109/pMAL-Cdc25C avec ou sans ajout d'IPTG. La ligne 3 correspond à 1'extrait soluble. Les lignes 4 et 5 correspondent respectivement aux fractions non retenue et retenue sur amylose-agarose. Enfin, la ligne 6 de la figure 1 correspond à la fraction d'élution n° 12 qui ne contient pratiquement que la protéine de fusion.

La figure 2 (FIG. 2) représente les résultats de la mesure de l'activité de la protéine recombinante MBP-Cdc25C (un"+"signifiant que de la ménadione a été ajoutée à l'échantillon, un"-"que l'échantillon n'a pas été traité par de la ménadione).

La figure 3 (FIG. 3) représente les résultats de la mesure de l'activité des protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3. La réaction est réalisée avec 300 ng d'enzyme par essai. La MBP à la mme concentration est utilisée dans le contrôle. Les valeurs de fluorescence mesurées permettent le calcul des pentes : 0,0025 Afluo/sec pour le contrôle, 0,0361 Afluo/sec pour Cdc25Bl, 0,0350 Afluo/sec pour Cdc25B2 et 0,0372 Afluo/sec pour Cdc25B3.