DESCRIPCIÓN

OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el proceso de obtención de ácido indolacético

(AIA) a partir de fermentación de las cepas Klebsiella variicola, Bacillus licheniformis, Bacillus velezensis, Enterococcus faecium y Bacillus amyloliquefaciens o combinaciones de éstas en un medio con triptófano como precursor de ácido indolacético. ANTECEDENTES

En las últimas décadas se han identificado nuevas hormonas vegetales, que incluye auxinas como el ácido indol-3 -acético (AIA), ácido abscísico (ABA), brasinoesteroides (BRS), citoquininas, giberelinas, etileno, ácido jasmónico (AJ) y ácido salicílico (AS). Las auxinas, citoquininas, ABA, etileno, ácido salicílico y giberelinas pueden ser producidas también por bacterias. Estas hormonas regulan todos los aspectos de la vida vegetal, desde la formación del patrón durante el desarrollo hasta las respuestas al estrés biótico y abiótico.

El AIA es la principal auxina nativa de las plantas superiores. Este está involucrado en el crecimiento y desarrollo de las plantas, principalmente en una serie de procesos fisiológicos que incluyen el alargamiento y división celular, diferenciación de tejido, fototropismo, y en respuestas defensivas, destacando un importante rol en la formación del xilema y la raíz. En muchas especies de plantas, en los fragmentos destinados a ser esquejes o estacas, las auxinas favorecen la regeneración de raíces. Otra propiedad importante de la auxina es que el tejido donde se encuentra en concentración suficientemente alta se convierte en el punto de atracción de nutrientes. Las auxinas de tipo sintéticas se usan frecuentemente en los huertos, invernaderos y campo con el objeto de evitar la caída prematura de los frutos. Los usos de las auxinas en la esfera agrícola son muy diversos y se aplican de forma rutinaria en biofábricas, en los cultivos in vi tro de material vegetal y en las plantaciones. Algunas auxinas, como el propio ácido indolacético, son sintetizadas por algunos microorganismos como Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas, Rhyzobium, etc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El presente proceso para la producción de ácido indolacético a partir de fermentación microbiana contempla las siguientes etapas: activación de las cepas (a) en el medio de cultivo, una primera etapa de inoculación y fermentación (b) una segunda etapa de inoculación y fermentación (c) una tercera etapa de inoculación y fermentación (d), una etapa de producción de ácido indolacético (e) y posteriormente una etapa de inactivación y cuantificación de ácido indolacético (f). A continuación, se describe detalladamente cada una de las etapas:

a) Activación de las cepas.

Las cepas utilizadas en la presente invención son Klebsiella variicola, Bacillus licheniformis, Bacillus velezensis, Enterococcus faecium y Bacillus amyloliquefaciens o combinaciones de estas cepas para la producción de ácido indolacético, que son activadas en agar nutritivo por 24 h a una temperatura de entre 30 a 32°C y posteriormente en caldo nutritivo por 24 h a una temperatura de entre 30 a 32°C.

Opcionalmente la activación puede realizarse inoculando 100 pL de la cepa criopreservada en 10 mL de caldo nutritivo o medio de cultivo consiste en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y 1.5 g/L de Triptófano por 24 a 72 h a una temperatura de entre 30 a 32°C. b) Primera inoculación y fermentación de las cepas en medio de cultivo.

En esta etapa las cepas previamente activadas en la etapa a) son inoculadas en una proporción 10% de medio de cultivo con un pH de entre 7- 7.2 y son fermentadas durante 24 horas a 48 horas con una agitación entre 120 -150 rpm. En donde el medio de cultivo consiste en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y entre 2 -5 g/L de Triptófano; En la presente invención, la producción de ácido indolacético se caracteriza por ocurrir en el medio fermentado a un valor de temperatura en el rango comprendido entre 29 a 32°C, preferentemente a 30°C. c) Segunda inoculación y fermentación de la cepa en medio de cultivo.

En la segunda etapa de inoculación el medio fermentado obtenido en la etapa b) es inoculado, en un tiempo no mayor a 24 horas posteriores a su recuperación, en una proporción 1 : 10 de medio de cultivo con un pH de entre 7- 7.2 y son incubadas durante 24 a 48 horas a 30°C ± 2 y una agitación de entre 120 -150 rpm. En donde el medio de cultivo consiste en consiste en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y entre 2 -5 g/L de Triptófano. d) Tercera inoculación e incubación de la cepa en medio de cultivo.

En la tercera etapa de inoculación el medio fermentado obtenido en la etapa c) es inoculado, en un tiempo no mayor a 24 horas posteriores a su recuperación, en una proporción 1 : 10 en el medio de cultivo, descrito en las etapas b) y c), con un pH de entre 7- 7.2 y son incubadas a durante 24 a 48 horas a 30°C ±2 a una agitación de entre 120 a 150 rpm hasta alcanzar una concentración celular mínima de 1 xlO ⁶ UPC/mL. e) Etapa de producción de ácido indolacético.

El medio resultado de la etapa d) es inoculado en un tiempo no mayor a 24 horas posteriores a su recuperación en una proporción desde 1:10 hasta 1:4 de medio previamente descrito, en donde este medio de cultivo es fermentado con una agitación de 120 a 150 rpm o burbujeo a una temperatura de 30 ±2 °C durante un período de 96 a 120 horas. f) Etapa de inactivación y cuantificación.

El medio resultado de la etapa e) puede ser sometido a un proceso de inactivación de las bacterias por medio de un calentamiento mayor o igual a 80°C por un período de 20 a 60 minutos. Opcionalmente el medio de fermentación obtenido de la etapa e) puede ser inactivado por un ciclo de autoclave, es decir 15 min a 121 °C y 15 psi o por choque térmico a 80°C durante un minuto y posteriormente a -20°C durante un minuto por cinco ciclos consecutivos.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Producción de Acido indolacético con L-triptófano como inductor en Klebsiella variicola.

Reactivación de Klebsiella variicola, la cepa se encontraba en criopreservación y para reactivarla se descongeló lentamente a 4°C, posteriormente se tomó 100 pL de la cepa y se colocó en 10 mL de caldo consistente de 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y 1.5 g/L de L-Triptófano, posteriormente se incubó a30±2 °C a l50 rpm durante 24 horas.

Para la producción de ácido indolacético se realizó un cultivo de 50 mL con un inoculo del 10% a una concentración de 1 xlO ⁶ UFC/mL, el medio de cultivo consistió en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado y 5 g/L extracto de levadura, el ejemplo se realizó con diferentes tratamientos variándolas concentraciones de L-triptófano como inductor, y cada cultivo se incubó a 30±2 °C a 150 rpm por 96 h.

Tabla 1. Producción de ácido indolacético en Klebsiella variicola con diferentes concentraciones de L-triptófano.

Ejemplo 2. Producción de Acido indolacético con L-triptófano como inductor en mezcla de Klebsiella variicola y Enterococcus faecium.

Reactivación de Klebsiella variicola y Enterococcus faecium, las cepas se encontraban en criopreservación y para reactivarlas se descongelaron lentamente a 4°C, posteriormente se tomaron 100 pL de cada cepa y cada una se colocó en 10 mL de caldo consistente en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar,

0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y 1.5 g/L de

L-triptófano: se incubaron a 30 ±2°C a 150 rpm durante 24 horas. Para la producción de ácido indolacético se realizó un cultivo de 50 mL con un inoculo del 10% a una concentración de 1 xlO ⁶ UFC/mL, el medio de cultivo consistió en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado y 5 g/L extracto de levadura, el ejemplo se realizó con diferentes tratamientos de L-triptófano como inductor, y cada cultivo se incubó a 30 ± 2°C a 150 rpm por 96 h.

Tabla 2. Producción de ácido indolacético en Klebsiella variicola y Enterococcus faecium con diferentes concentraciones de L-triptófano.

Ejemplo 3. Producción de Ácido Indolacético con L-triptófano como inductor en mezcla de Klebsiella variicola , Enterococcus faecium , Bacillus licheniformis, Bacillus velezensis y Bacillus amyloliquefaciens.

Reactivación de Klebsiella variicola, Enterococcus faecium, Bacillus licheniformis, Bacillus velezensis y Bacillus amyloliquefaciens, las cepas se encontraban en criopreservación y para reactivarlas cada una fue descongelada lentamente a 4°C, posteriormente se tomó 100 pL de cada cepa y cada una se colocó en 10 mL de caldo consistente en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado, 5 g/L extracto de levadura y 1.5 g de L-triptófano: se incubaron a 30 ±2 °C a l50 rpm durante 72 horas.

Para la producción de ácido indolacético se realizó un cultivo de 50 mL tomando de cada cepa partes iguales hasta tener un inoculo del 10%, el medio de cultivo consistió en 3 g/L de fosfato monobásico de potasio, 0.6 g/L de fosfato dibásico de potasio, 0.5 g/L cloruro de sodio, 2 g/L cloruro de amonio, 0.8 g/L azúcar, 0.1 g/L sulfato de magnesio heptahidratado y 5 g/L extracto de levadura, el ejemplo se realizó con diferentes tratamientos de L-triptófano adicionado como inductor, y cada cultivo se incubó a 30±2 °C a 150 rpm por 96 h.

Tabla 3. Producción de ácido indolacético en Klebsiella variicola, Enterococcus faecium, Bacillus licheniformis , Bacillus velezensis y Bacillus amyloliquefaciens con diferentes concentraciones de L-triptófano.