SECTOR DE LA TÉCNICA Acuicultura. El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de biomasa rica en luteína de la microalga Muriellopsis, para su utilización como pigmento de origen biológico en alimentación animal (pollos, peces, etc.). Asimismo, la luteína obtenida mediante el presente procedimiento puede ser utilizada como componente de alimentos funcionales para humanos en la prevención y tratamiento de diversas patologías, tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y degenerativas asociadas a la edad (cataratas, degeneración macular, etc.), así como en cosmética.

ESTADO DE LA TÉCNICA Para el cultivo de microalgas a gran escala se han diseñado y empleado distintos sistemas abiertos al aire, que incluyen estanques de varios tipos. El cultivo de microalgas en sistema abierto combina características típicas de cultivos agrícolas (uso extensivo del terreno, agua y nutrientes, así como dependencia de clima y la radiación solar) con otros propios de procesos industriales para el cultivo de microorganismos, tales como posibilidad de operación en continuo, con suministro de nutrientes a concentración óptima y control de los parámetros más importantes del proceso.

La generación de products de interés comercial (pigmentos, antioxidantes, vitaminas, ácidos grasos, etc.) constituye un aspecto central de la biotecnología de microalgas. Pocos son los sistemas establecidos industrialmente para la obtención de compuestos de microalgas, entre los que destacan carotenoides, ficobiliproteínas, lípidos o polisacáridos, provenientes de muy pocas estirpes de microalgas, tales como Spirulina, Chlorella, Dunaliella, Haematococcus o Porphyridium. Entre estos compuestos con interés comercial sobresalen los carotenoides, que pueden presentarse en cantidades sustanciales en las células de determinadas microalgas, organismos que representan una fuente biológica idónea y casi exclusiva de algunos de estos pigmentos. Los

carotenoides son pigmentos isoprenoides liposolubles, con papel accesorio en la fotosíntesis, cuya coloración varía de amarillo al rojo. Los dos grupos generales de carotenoides son xantofilas y carotenos, que se diferencian entre sí porque sólo los primeros contienen oxígeno.

Las cada vez más restrictivas regulaciones del uso de colorantes sintéticos en la industria alimentaria han estimulado la investigación y desarrollo en la producción y empleo de pigmentos de origen biológico como aditivo en alimentos, así como en cosmética. La acuicultura, una de las áreas de mayor desarrollo actual en el campo de la producción alimentaria, demanda también cantidades crecientes de carotenoides. Por otra parte, ensayos clínicos están poniendo de manifiesto propiedades beneficiosas de algunos carotenoides en la prevención y tratamiento de diversas enfermedades, tales como cáncer, las cardiovasculares y las degenerativas asociadas a la edad, como cataratas o degeneración macular.

De entre los más de 600 carotenoides conocidos, sólo unos pocos tienen uso comercial. Su empleo como colorante natural en alimentación se extiende a una gran variedad de productos, como mantequilla, margarina, quesos y otros derivados lácteos, bebidas refrescantes, pasta, etc. Algunas xantofilas, como astaxantina o luteína se emplean también como aditivos en piensos para incrementar la pigmentación de mariscos, salmónidos y otros peces, así como la de pollos y yemas de huevo.

A diferencia de caso de ßcaroteno a partir de Dunaliella, no se ha autentificado todavía la operación de sistemas comerciales de producción de alguna xantofila de interés basado en microalgas en condiciones de cultivo abierto al exterior. Sin embargo, su gran interés determina que se estén dedicando considerables esfuerzos a este fin. La mayoría de los intentos giran alrededor de la estirpe Haematococcus oluvialis, perteneciente al orden Volvocales, que puede presentar niveles de astaxantina de hasta el 2% del peso seco. En lo referente a microalgas productoras de otras xantofilas de interés, tal como es la luteína, la información disponible es sumamente escasa.

A este respecto, cabe señalar que el alga Muriellopsis tiene niveles considerables de luteína, disponiéndose de información sobre aspectos fisiológicos y bioquímicos de esta microalga, y de su cultivo en condiciones

controladas de laboratorio y en reactores cerrados (Del Campo et al. J.

Biotechnol. (2000) 76, 51-59 y (2001) 85,289-295), aunque hasta ahora se desconocía su comportamiento en cultivo en sistema abierto a la intemperie.

Por último, existen patentes relacionadas con la producción del carotenoide ß- caroteno en sistemas de cultivo abierto empleando el alga Dunaliella (JP57159484, IL54881, CN1044200, entre otras).

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de células de Muriellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo a la intemperie en estanques abiertos con agitación y que comprende las etapas de : a) introducción en los estanques de una suspensión celular de Muriellopsis con una densidad comprendida entre 1 y 4 x 106 células ml-1. b) circulación de la suspensión celular por el estanque a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s-1 durante un periodo comprendido preferentemente entre 1 y 30 días, pudiendo prolongarse dicho periodo más de 30 días, sin control de temperatura y sometido a la irradiancia solar habitual de la zona. c) crecimiento de las células y mantenimiento del cultivo en régimen semicontinuo, recogiendo la biomasa de Muriellopsis contenida en los estanques, retirando parte del volumen de la suspensión celular y reemplazándolo por medio de cultivo libre de células para alcanzar una densidad celular mínima de 4 x 106 celulas ml~1.

El sistema de cultivo se encuentra a la intemperie, la fuente de iluminación es la luz solar, la temperatura no se controla en ningún momento de proceso, y el valor de pH de cultivo esta comprendido entre 6, 5 y 10. La suspensión celular circula a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s~, mediante impulsión por rueda giratoria provista de paletas. La suspensión celular se mantiene a una profundidad comprendida entre 5 y 20 cm, y preferentemente a 10 cm.

El contenido en luteína de la biomasa producida por el presente procedimiento esta comprendido entre el 0,4 y el 1 % del peso seco.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de biomasa del alga Muriellopsis rica en luteína, mediante su cultivo a la intemperie en sistemas abiertos de estanques poco profundos, con control de agitación, densidad celular, profundidad y pH del proceso, y que comprende las etapas de : a) introducción en los estanques de una suspensión de células de Muriellopsis en medio de cultivo, con una densidad comprendida entre 1 y 4 x 106 células ml-', siendo la altura de la columna líquida entre 5 y 20 cm, y preferentemente de 10cm. b) agitación mediante una rueda giratoria provista de paletas que giran a una velocidad suficiente para provocar la circulación de la suspensión celular por el estanque a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s-1, durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días, siendo también posible prolongar el cultivo más de 30 días, sin control de temperatura, siendo la fuente de iluminación la radiación solar habitual de la zona. c) recogida de la biomasa de Muriellopsis contenida en los estanques, retirando parte del volumen de la suspensión celular y reemplazándolo por medio de cultivo libre de células para alcanzar una densidad celular mínima de 4 x 106 células moi-', ya que el proceso se realiza en régimen semicontinuo.

Esta microalga tiene la capacidad de crecer en un amplio margen de pH, siendo capaz de desarrollarse a valores de pH comprendidos entre 6,5 y 10.

Durante el proceso, el pH se mantiene próximo a su valor prefijado mediante la inyección de 02 a través de un tubo poroso, situado en el fondo del estanque, que suministra el gas en pequeñas burbujas que difunden en el medio líquido.

El caudal de 02 suministrado se regula con medidores de flujo y su suministro puede controlarse mediante la operación de una electroválvula conectada a un sistema detector de un parámetro de interés, tal. como la irradiancia solar o el pH. El contenido en luteína de la biomasa producida por la presente invención esta comprendido entre el 0,4 y el 1 % del peso seco.

EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.

Elementos de los estanques Los cultivos de Muriellopsis sp. se llevan a cabo a la intemperie en estanques abiertos de 3 m2 de superficie, dotados de un sistema de agitación compuesto por una rueda giratoria con tres paletas en ángulo de 120°, impulsada por un motor eléctrico, para provocar la mezcla continua de la suspensión celular. Este sistema permite obtener una velocidad lineal del fluido de 0,30 m s-1 cuando las paletas giran a 10 rpm y de 0,55 m s-1 cuando giran a 20 rpm. Los estanques son de forma oblonga, siendo sus extremos curvos y desprovistos de aristas, y están construidos con poliéster reforzado con fibra de vidrio (PRFV), siendo sus dimensiones de 2,8 m de longitud máxima, 1,2 m de anchura máxima y 0,3 m de altura, estando divididos transversalmente en dos mitades (canales) por un tabique longitudinal de 1,6 m, que deja espacios libres de unos 0,6 m a cada uno de los extremos. La rueda giratoria con las tres paletas está situada en uno de los canales del estanque, con su eje cercano a uno de los extremos, teniendo las paletas el máximo ancho posible respecto a la sección del canal, llegando asimismo hasta el fondo del estanque, siendo estas condiciones relevantes para su consideración en el diseño de estanques de mayor dimensión.

Condiciones óptimas para el cultivo de Muriellopsis No se conocen experiencias previas del cultivo de Muriellopsis al exterior en estanques abiertos. Por ello, se ha verificado el crecimiento de la microalga y se han definido las condiciones óptimas para su cultivo en el sistema que aquí se presenta, considerando diversas variables, tales como densidad celular, velocidad de circulación, profundidad y pH para los valores de temperatura e irradiancia ambientales de la zona.

La influencia de los factores antes mencionados (densidad celular, profundidad, velocidad de circulación y pH) se han ensayado en distintas épocas del año. Se han conseguido valores de productividad de biomasa y luteína del orden de 12 y 0,07 g m' día'\ respectivamente, durante la primavera con una irradiancia

solar media de alrededor de 10 MJ m~2 día'\ Estos valores se han obtenido para una profundidad de la suspensión celular de 10 cm, manteniendo una densidad de población mínima de 4 x 106 células ml~1 y un valor de pH en torno a 8, con una velocidad de flujo de la suspensión de 0,45 m s-1. A valores inferiores de velocidad de flujo y más elevados de profundidad o densidad celular, disminuía la productividad, tanto de biomasa como de luteína.

Las células de Muriellopsis obtenidas en estas condiciones poseen luteína como carotenoide mayoritario, que representa al menos el 65% del total de carotenoides, entre los que también se encuentran ß-caroteno y violaxantina, aunque en inferior proporción.

El trabajo se ha desarrollado utilizando la microalga Muriellopsis proveniente de la marisma de Empordá.