NANOESTRUTURADOS LIPÍDICO CATIÔNICO ANFIFÍLICO E POLIMÉRICO CATIÔNICO ANFIFÍLICO, COMPOSTOS NANOESTRUTURADOS OBTIDOS E SEUS USOS

Campo da invenção:

[001 ] A presente invenção se insere no campo de aplicação da ciência médica, mais especificamente, no setor de produção de

medicamentos e de cosméticos, uma vez que se refere a um processo de obtenção de um composto nanoparticulado lipídico ou polimérico catiônico anfifílico para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos ou

cosméticos em que a característica catiônica seja desejável,

preferencialmente produtos oftálmicos.

Fundamentos da invenção:

[002] Os produtos oftálmicos convencionais, em especial os colírios, apresentam reduzida biodisponibilidade, portanto, baixa eficácia terapêutica. Essa característica indesejável deve-se aos mecanismos de proteção do olho (ato reflexo de piscar e de lacrimejar) que expulsam qualquer material estranho da superfície do olho.

[003] Além disso, o material instilado pode ser drenado via dueto nasolacrimal podendo provocar efeito sistémico indesejável. Outra possibilidade de efeito sistémico indesejável é a absorção do material via conjuntiva, estrutura altamente vascularizada.

[004] Adicionalmente, a córnea e o filme lacrimal também constituem barreira natural contribuindo para a redução da eficácia terapêutica dos colírios no combate a doenças oculares, no segmento anterior e posterior do olho. Dessa forma, o paciente deve instilar o colírio várias vezes ao dia, dificultando sua adesão ao tratamento.

[005] Entretanto, o filme lacrimal também apresenta característica particular que pode ser utilizada para melhorar o tempo de residência do colírio no olho e, dessa forma, elevar a eficácia terapêutica desse produto. Em sua composição, essa estrutura apresenta mucina, proteína glicolisada contendo ácido siálico, que apresenta carga negativa em pH neutro.

[006] Assim, o desenvolvimento de colírios com característica catiônica (ou positiva) tem como objetivo aumentar sua eficácia terapêutica.

[007] Desse modo, uma vez que os produtos oftálmicos existentes no estado da técnica apresentam baixa eficácia terapêutica, a presente invenção propõe um composto nanoparticulado lipídico ou polimérico catiônico anfifílico.

[008] Com isso, os referidos compostos nanoestruturados catiônico anfifílico têm como objetivo a obtenção de produtos oftálmicos inovadores que apresentam maior eficácia e segurança ao paciente, uma vez que o tamanho médio das partículas, em escala nanométrica, e a interação desses compostos com o ácido siálico (carregado

negativamente) das glicoproteínas altamente O-glicosiladas (mucinas), permitirão maior tempo de residência do composto na superfície do olho, permitindo o tratamento do segmento anterior e posterior do olho.

[009] Além disso, essa nanoestrutura pode ser utilizada para o desenvolvimento de outros produtos, farmacêuticos ou cosméticos, em que a característica catiônica seja desejável.

[010] A título de exemplo, o presente composto pode ser utilizado para o desenvolvimento de medicamentos para doenças negligenciadas. No caso da leishmaniose, o parasita infecta os macrófagos e dessa forma, o composto nanoestruturado com carga positiva pode ser internalizado para essa célula, liberar o fármaco e eliminar o parasita.

Estado da técnica:

[01 1 ] Alguns documentos do estado da técnica descrevem um composto nanoparticulado associado às substâncias ativas.

[012] O documento "Evaluation of cationic polymer-coated nanocapsules as ocular drug carriers" de Calvo et a\. (1997) descreve uma nanoestrutura que apresenta apenas o fármaco lipofílico e o revestimento empregando quitosana. Diferentemente da presente invenção, não apresenta na mesma nanoestrutura a associação de outro fármaco. Além disso, a simples adição de um fármaco hidrofílico catiônico, na nanoestrutura revestida com quitosana não resulta na presente invenção, uma vez que o documento relata uma nanoestrutura com potencial zeta igual a + 37 mV, após o revestimento. Assim, a adição de um fármaco hidrofílico catiônico, também positivo, não permite sua associação à nanoestrutura relatada nesse documento, uma vez que a força elétrica entre duas cargas com o mesmo sinal é repulsiva.

[013] Já o documento US2015290092 descreve nanopartículas contendo íons mono, di ou trivalentes, as quais possuem um núcleo funcional, compreendendo fármaco, contendo uma ou várias camadas poliméricas, subsequentes e de opostas cargas para uso em odontologia. No entanto, diferentemente, a presente invenção propõe nanopartículas lipídicas ou poliméricas catiônicas anfifílicas que não contêm íons de qualquer natureza associada à nanoestrutura para o desenvolvimento de produtos oftálmicos com característica catiônica.

[014] O documento BRPI0904083 descreve um processo de obtenção de nanovesículas anfifílicas catiônicas para aplicação em suspensões oftálmicas no tratamento de infecções oculares. Todavia, diferentemente da presente invenção, o polímero e o fármaco hidrofílico são simplesmente misturados e adicionados à nanoestrutura. Tal procedimento resulta em elevada variabilidade nas características de potencial zeta da nanoestrutura revelando baixa reprodutibilidade do método.

[015] O documento US2013189368 apresenta o mesmo problema técnico, onde a nanoestrutura é obtida em uma única etapa

compreendendo a combinação simultânea da fase oleosa e da fase aquosa.

[016] Para solucionar o problema técnico apresentado, a presente invenção propõe um processo que possui etapas adicionais que permitem o controle da quantidade de fármaco hidrofílico associado à

nanopartícula, assim como, a quantidade de quitosana, sendo portanto, possível cationizar a nanopartícula de forma controlada. Além disso, através desse processo, é possível associar à nanoestrutura, pelo menos dois fármacos, sendo um hidrofílico e outro hidrofóbico, podendo ainda adicionar outros fármacos hidrofílicos.

[017] A classe dos fármacos hidrofílicos, de natureza catiônica incluem uma série de substâncias peptídicas catiônicas, peptídicas catiônicas com ação antimicrobiana tais como vancomicina.

[018] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve um processo de obtenção de um composto nanoparticulado lipídico ou polimérico catiônico anfifílico para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos ou cosméticos em que a característica catiônica seja desejável, tal como proposto pela presente invenção.

Breve descrição da invenção:

[019] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de compostos nanoestruturados lipídico catiônico anfifílico e polimérico catiônico anfifílico capaz de compreender pelo menos dois fármacos, um hidrofóbico e outro hidrofílico, associados a uma fase oleosa e aquosa, e revestidos por quitosana. O referido processo compreende quatro etapas, as quais permitem o controle de obtenção das nanoestruturas. Assim, é possível cationizar a nanopartícula de forma controlada: controle do potencial zeta, controle da quantidade da substância catiônica (SC), e controle da quantidade do fármaco ou substância ativa. Desse modo, a presente invenção também refere-se aos compostos obtidos, assim como seu uso para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos ou

cosméticos em que a característica catiônica seja desejável,

preferencialmente produtos oftálmicos.

Breve descrição das figuras:

[020] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[021 ] A Figura 1 representa graficamente a análise de regressão linear simples do potencial zeta (mV) versus concentração de sulfato de polimixina B (UI/mL).

[022] A Figura 2 representa graficamente a análise de regressão linear simples do diâmetro hidrodinâmico médio versus concentração de sulfato de polimixina B (UI/mL) para os CLN-Dexa+Poli-Prot.

[023] A Figura 3 A-E representa graficamente a regressão linear do diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) versus (a) concentração de sulfato de polimixina B (SP UI/mL); e (B-E) resíduos de DHM, em que (B) é o gráfico de probabilidade normal, (C) versus ajustados, (D) histograma, e (E) versus ordem.

[024] A Figura 4 A-E representa graficamente a regressão linear do potencial zeta (PZ) versus (a) concentração de sulfato de polimixina B (SP UI/mL); e (B-E) resíduos de DHM, em que (B) é o gráfico de probabilidade normal, (C) versus ajustados, (D) histograma, e (E) versus ordem.

[025] A Figura 5 A-F representa graficamente a análise de variância (ANOVA): diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) das VP- Dexa+Poli (concentrações de sulfato de polimixina: 2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL) após revestimento empregando 0,15% (p/v) de Protasan®, os quais (a) são as médias e intervalo de confiança; (b) o teste de Tukey e, (C-F) são os resíduos, em que (C) é o gráfico de probabilidade normal, (D) versus ajustados, (E) histograma, e (F) versus ordem.

[026] A Figura 6 A-F representa graficamente a análise de variância (ANOVA) do potencial zeta (PZ) das VP-Dexa+Poli

(concentrações de sulfato de polimixina: 2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL) após revestimento empregando 0, 15% (p/v) de Protasan®, os quais (a) são as médias e intervalo de confiança; (b) o teste de Tukey e, (C-F) são os resíduos, em que (C) é o gráfico de probabilidade normal, (D) versus ajustados, (E) histograma, e (F) versus ordem. Descrição detalhada da invenção:

[027] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de compostos nanoestruturados lipídico catiônico anfifílico e polimérico catiônico anfifílico.

[028] O referido processo compreende as etapas de:

a) Preparar os carreadores lipídicos compreendendo um lipídio líquido ou dois ou mais lipídios líquidos, ou compreendendo um lipídio sólido ou dois ou mais lipídios sólidos, ou mistura de lipídio líquido e um lipídio sólido ou mistura de dois ou mais lipídios líquidos e lipídios sólidos, compreendendo pelo menos um fármaco ou substância ativa hidrofóbico ou lipofílico;

b) Preparar a solução contendo pelo menos um fármaco ou substância catiônica (SC);

c) Incorporar a SC na formulação obtida na etapa "a"; e d) Revestir a formulação obtida na etapa "c" com quitosana de baixo peso molecular (50000-400000 g/mol) e elevado grau de

desacetilação (> 80%).

[029] O referido fármaco ou substância ativa é selecionado dos grupos que consistem em substâncias ativas hidrofóbicas ou lipofílicas, tais como imunossupressores (ciclosporina); prostaglandinas, tais como latanoprosta, bimatoprosta e travoprosta; antioxidantes, tais como carotenoides, α-, β-, γ-, δ- tocoferol e a-, β-, γ-, δ-tocotrienol, ácido retinóico, retinol e seus ésteres, ubiquinol, ubiquinona, glutationa em sua forma reduzida, flavonoides, ácido lipoico e componentes ativos de origem biotecnológica, tais como etanercept, pegaptanib, ranibizumab e bevacizumab; e fármacos do grupo dos colinérgicos tais como pilocarpina, ezerina e neostigmina; e anti-inflamatório não esferoidal e esferoidal, preferencialmente acetato de dexametasona.

[030] A referida substância catiônica (SC) é selecionada do grupo que consiste em fármacos hidrofílicos, peptídios catiônicos, tais como sulfato de polimixina B, vancomicina, gramicidina, bacitracina e outros peptídeos antimicrobianos catiônicos; e cloreto de benzalcônio e demais amônios quaternários, preferencialmente sulfato de polimixina B.

[031 ] Na etapa "a", a preparação dos carreadores lipídicos é obtida através do aquecimento da fase oleosa e da fase aquosa, separadamente, a uma temperatura que varia de 55 a 90 °C,

preferencialmente 85 °C, sob agitação que varia de 100 a 500 rpm, preferencialmente 300 rpm até completa dissolução e dispersão dos fármacos ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica, respectivamente.

[032] A fase oleosa compreende de 0,0001 a 10%,

preferencialmente 0, 10% do fármaco ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica associada a lipídios, em que os lipídios são selecionados dos grupos que consistem em lipídio líquido (óleo) na concentração de 1 a 20% ou mistura de lipídios líquidos na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 10; e lipídio sólido na concentração de 1 a 20% ou uma mistura de lipídios sólidos na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 100; ou uma mistura de lipídios líquido e sólido na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 100 da formulação total de carreadores lipídicos.

[033] Os lipídios líquidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico. E os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos saturados, tais como palmitato de cetila.

[034] Já a fase aquosa compreende pelo menos um tensoativo não iônico, tais como polissorbato 80, fosfolipídios de soja ou ovo, poloxâmero 188, poloxâmero 407 e TPGS (d-alfa tocoferil polietilenoglicol 1000), Kolliphor ELP (ricinoleato de macrogolglicerilo - óleo de rícino polioxil 35), Kolliphor HS 15 (hidroxiestearato de polioxilo 15) diluídos em água ultrapura. Alternativamente, pode conter um tensoativo aniônico, tal como o dodecil sulfato de sódio.

[035] Preferencialmente, a fase aquosa compreende de 0,05 a 10%, mais preferencialmente 2,5% de poloxâmero 188 e poloxâmero 407; de 0,05 a 10%, mais preferencialmente 1 ,5% de polissorbato 80; de 0,001 a 10%, mais preferencialmente 0,5% de dodecil sulfato de sódio; e qsp 100% de água ultrapura da formulação total de carreadores lipídicos.

[036] Posteriormente, a fase aquosa é dispersa na fase oleosa sob agitação mecânica que varia de 1000 a 25000 rpm, preferencialmente 8000 rpm por um período de tempo que varia de 1 a 10 min,

preferencialmente 5 minutos, de modo a formar uma pré-emulsão, a qual é submetida à homogeneização empregando-se 1 a 6 ciclos sucessivos, preferencialmente 3 ciclos, à pressão que varia de 200 a 1000 bar, preferencialmente 600 bar.

[037] Após o preparo dos carreadores lipídicos, na etapa "b", a solução catiônica, contendo os fármacos hidrofílicos, (SC) é diluída ou não em recipiente adequado com água ultrapura em proporção que varia de 1 :1 a 1 :5, preferencialmente 1 :2 de modo que seja obtida concentração que varia de 50.000 a 1 .000.000 UI/mL da substância catiônica.

[038] Na etapa "c" é realizada a incorporação da substância peptídica catiônica na concentração de 5 a 25.000 UI/mL,

preferencialmente 6000 UI/mL de SC obtido na etapa "b" nos carreadores lipídicos obtidos na etapa "a" diluídas ou não em água purificada na proporção que varia de 1 : 1 a 1 : 10 preferencialmente 1 :5. Essa

incorporação é realizada lentamente, preferencialmente por gotejamento, e sob agitação que varia de 50 a 300 rpm, preferencialmente 100 rpm, por um período tempo que varia de 0,5 a 6 horas, preferencialmente 2 horas.

[039] Desse modo, é formado na etapa "c" um composto nanoparticulado lipídico compreendendo um fármaco ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica incorporado com pelo menos uma substância catiônica. Vale ressaltar que, nessa etapa, o revestimento é controlado de forma a produzir partículas com potencial zeta, em módulo, menor, porém ainda negativo que varia de -30 a -1 mV, dependendo da concentração da(s) substância(s) catiônica(s) (exemplo: sulfato de polimixina B e vancomicina) que se deseja associar às nanopartículas. Esse controle é realizado por meio da concentração da substância catiônica utilizada (exemplo: 1 a 1 .000000 UI/mL).

[040] Assim, na etapa "d", 0,001 % a 10%, preferencialmente 0,2% de dispersão de quitosana a 2,0% (p/p) em água ultrapura são

adicionados no composto obtido na etapa "c", lentamente,

preferencialmente por meio de gotejamento sob agitação que varia de 50 a 500 rpm, preferencialmente 100 rpm. Após a adição da dispersão, o período de agitação prossegue durante um período de tempo que varia de 0,5 a 8 horas, preferencialmente 2 horas e as preparações obtidas são mantidas em temperatura ambiente ou sob refrigeração que varia de 1 a 10 °C, preferencialmente 5 °C. Assim, na etapa "d", o revestimento é controlado de forma a produzir partículas com potencial zeta entre +5 e +65 mV.

[041 ] Desse modo, as preparações obtidas na etapa "d" compreendem de 0,001 a 10%, preferencialmente 0,2% (p/v%) de quitosana, obtendo assim, um composto nanoestruturado lipídico catiônico anfifílico com partículas de diâmetro hidrodinâmico médio na faixa sub-micron, com diâmetro médio entre 100 e 600 nm,

preferencialmente 200 nm, com potencial zeta positivo.

[042] Em uma modalidade alternativa, o presente processo refere- se à obtenção de um composto nanoestruturado polimérico catiônico anfifílico, em que para tal, a etapa "a" consiste em preparar vesículas poliméricas compreendendo um lipídio líquido ou dois ou mais lipídios líquidos, ou mistura líquida de lipídio líquido e um lipídio sólido, ou mistura líquida de dois ou mais lipídios líquidos e lipídios sólidos, compreendendo pelo menos um fármaco ou substância ativa hidrofóbico ou lipofílico.

[043] Desse modo, para a obtenção das vesículas

compreendendo o fármaco ou substância hidrofóbica ou lipofílica, é utilizado o método de precipitação de polímero pré-formado que consiste na adição da fase orgânica compreendendo o polímero, um ou mais lipídios, o solvente orgânico, o tensoativo não iônico e o fármaco lipofílico a uma temperatura abaixo de 60 °C, preferencialmente 45 °C, sob agitação entre 50 e 300 rpm, preferencialmente a 100 rpm, por tempo necessário para a completa solubilização do polímero, entre 15 e 45 minutos, sobre a fase aquosa. Posteriormente, a eliminação do solvente e parte da água é efetuada empregando evaporador rotatório e o volume da suspensão é ajustado com adição de água purificada.

[044] A referida fase aquosa compreende de 0, 1 a 10% de pelo menos um tensoativo não iônico, tais como span 20, span 40, span 60, span 80 (ésteres de sorbitano) polissorbato 80, poloxâmero 188 e TPGS (d-alfa tocoferil polietilenoglicol 1000), Kolliphor ELP (ricinoleato de macrogolglicerilo - óleo de rícino polioxil 35), Kolliphor HS 15

(hidroxiestearato de polioxilo 15) diluídos em água purificada.

[045] Já a fase orgânica compreende de 0,0001 a 10%, preferencialmente 0, 10% do fármaco ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica associada a lipídios, em que os lipídios são selecionados dos grupos que consistem em lipídio líquido (óleo) na concentração de 1 a 20% ou mistura de lipídios líquidos na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 10, ou uma mistura líquida de lipídios líquido e sólido na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 100; de 0,01 a 20% de polímeros selecionados do grupo que consiste em poliácido lático, co-polímeros derivados dos ácidos láctico e glicólico, polianidridos alifáticos, polímero derivado das lactonas, preferencialmente poli(s-caprolactona); de 5 a 50% de solvente orgânico selecionado do grupo que consiste em acetona, etanol e metanol, preferencialmente acetona; de 0,0001 a 10% de fármaco ou substância hidrofóbica ou lipofílica; e de 0,5 a 10% de ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico e de 0,5 a 10% de tensoativo não iônico, da formulação total de vesículas poliméricas.

[046] Os lipídios líquidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico. E os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos saturados, tais como palmitato de cetila. Os tensoativos são selecionados entre os não iónicos tais como span 20, span 40, span 60 e span 80 (ésteres de sorbitano).

[047] Assim, é formado na etapa "c" um composto nanoparticulado polimérico compreendendo um fármaco ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica incorporado com pelo menos uma substância catiônica. E na etapa "d" é obtido um composto nanoestruturado polimérico catiônico anfifílico com partículas de diâmetro hidrodinâmico médio na faixa sub- micron com potencial zeta positivo.

[048] Portanto, adicionalmente, a presente invenção refere-se ao composto nanoestruturado lipídico catiônico anfifílico obtido conforme processo aqui descrito, o qual compreende pelo menos dois fármacos, um hidrofóbico e outro hidrofílico, associados a:

de 0,5 a 20% de fase oleosa;

de 80 a 99,5% de fase aquosa; e

de 0,001 a 10%, preferencialmente 0,2% de quitosana.

[049] O referido fármaco hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste em substâncias ativas hidrofóbicas ou lipofílicas, tais como imunossupressores (ciclosporina), prostaglandinas (latanoprosta, bimatoprosta e travoprosta), anti-inflamatório não esferoidal e esferoidal, preferencialmente acetato de dexametasona; e antioxidantes tais como carotenoides, α-, β-, γ-, δ- tocoferol e a-, β-, γ-, δ-tocotrienol, ácido retinóico, retinol e seus ésteres, ubiquinol, ubiquinona, glutationa em sua forma reduzida, flavonoides, ácido lipoico e componentes ativos de origem biotecnológica tais como etanercept, pegaptanib, ranibizumab e bevacizumab; e fármacos do grupo dos colinérgicos tais como pilocarpina, ezerina e neostigmina.

[050] O referido fármaco hidrofílico é selecionado do grupo que consiste em substâncias catiônicas hidrofílicas, peptídios catiônicos, peptídios catiônicos antimicrobianos tais como sulfato de polimixina B, vancomicina, gramicidina, bacitracina; outros peptídeos antimicrobianos catiônicos; e cloreto de benzalcônio, preferencialmente sulfato de polimixina B. [051 ] A fase oleosa compreende de 0,0001 a 10%,

preferencialmente 0, 10% do fármaco hidrofóbico solubilizado em lipídios, em que os lipídios são selecionados dos grupos que consistem em um lipídio líquido na concentração de 0,1 a 20% ou uma mistura de lipídios líquidos na proporção que varia de 0,001 : 1 a 1 : 10; e lipídio sólido na concentração de 1 a 20% ou uma mistura de lipídios sólidos na proporção que varia de 0,01 :1 a 1 :100; ou uma mistura de lipídios líquido e sólido na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 :100 da formulação total de carreadores lipídicos.

[052] Os lipídios líquidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico. E os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos saturados, tais como palmitato de cetila.

[053] Já a fase aquosa compreende de 0,05 a 10% de pelo menos um tensoativo não iônico, tais como polissorbato 80, fosfolipídios de soja ou ovo, poloxâmero 188, poloxâmero 407, TPGS (d-alfa tocoferil polietilenoglicol 1000), Kolliphor ELP (ricinoleato de macrogolglicerilo - óleo de rícino polioxil 35) e Kolliphor HS 15 (hidroxiestearato de polioxilo 15) diluídos em água ultrapura. Alternativamente, pode conter de 0,001 a 10% de tensoativo aniônico, tal como o dodecil sulfato de sódio.

Preferencialmente, a fase aquosa compreende 2,5% de poloxâmero 188 e poloxâmero 407, 1 ,5% de polissorbato 80, 0,5% de dodecil sulfato de sódio, e qsp 100% de água ultrapura da formulação total de carreadores lipídicos.

[054] Ainda, o composto nanoestruturado lipídico catiônico anfifílico possui potencial zeta que varia de +5 a +65 mV,

preferencialmente +20 mV; e diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) que varia de 100 a 600 nm, preferencialmente 200 nm.

[055] Além disso, a presente invenção refere-se também ao composto nanoestruturado polimérico catiônico anfifílico obtido conforme modalidade alternativa do presente processo, o qual compreende pelo menos dois fármacos, um hidrofóbico e outro hidrofílico, associados a: de 0,5 a 20% de fase orgânica (sem o solvente orgânico que será evaporado);

de 80 a 99,5% de fase aquosa; e

de 0,001 a 10%, preferencialmente 0,2% de quitosana;

[056] O referido fármaco hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste em substâncias ativas hidrofóbicas ou lipofílicas, tais como imunossupressores (ciclosporina), prostaglandinas (latanoprosta, bimatoprosta e travoprosta), anti-inflamatório não esferoidal e esferoidal, preferencialmente acetato de dexametasona; antioxidantes tais como carotenoides, α-, β-, γ-, δ- tocoferol e a-, β-, γ-, δ-tocotrienol, ácido retinóico, retinol e seus ésteres, ubiquinol, ubiquinona, glutationa em sua forma reduzida, flavonoides, ácido lipoico e componentes ativos de origem biotecnológica tais como etanercept, pegaptanib, ranibizumab e bevacizumab; e fármacos do grupo dos colinérgicos tais como pilocarpina, ezerina e neostigmina.

[057] O referido fármaco hidrofílico é selecionado do grupo que consiste em substâncias catiônicas hidrofílicas, peptídios catiônicos, peptídios catiônicos antimicrobianos tais como sulfato de polimixina B, vancomicina, gramicidina, bacitracina; outros peptídeos antimicrobianos catiônicos; e cloreto de benzalcônio, preferencialmente sulfato de polimixina B.

[058] A fase orgânica compreende de 0,0001 a 10%,

preferencialmente 0, 10% do fármaco ou substância ativa hidrofóbica ou lipofílica associada a lipídios, em que os lipídios são selecionados dos grupos que consistem em lipídio líquido (óleo) na concentração de 1 a 20% ou mistura de lipídios líquidos na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 10, ou uma mistura líquida de lipídios líquido e sólido na proporção que varia de 0,01 : 1 a 1 : 100; de 0,01 a 20% de polímero selecionado do grupo que consistem em poliácido lático, co-polímeros derivados dos ácidos láctico e glicólico, polianidridos alifáticos, polímero derivado das lactonas, preferencialmente poli(s-caprolactona; de 0,01 a 10% de tensoativos não- iônicos, tais como monoestearato de sorbitan; de 0,5 a 10% de ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico; de 0,0001 a 5% de fármaco hidrofílico; e de 5 a 30% de solvente orgânico selecionado do grupo que consiste em acetona, etanol e metanol, preferencialmente acetona.

[059] Os lipídios líquidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos insaturados, tais como triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico. E os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em ácidos graxos saturados, tais como palmitato de cetila.

[060] Já a fase aquosa compreende de 0, 1 a 10% de pelo menos um tensoativo não iônico, tais como polissorbato 80, poloxâmero 188 e TPGS (d-alfa tocoferil polietilenoglicol 1000), Kolliphor ELP (ricinoleato de macrogolglicerilo - óleo de rícino polioxil 35), Kolliphor HS 15

(hidroxiestearato de polioxilo 15) diluídos em água purificada.

[061 ] Ainda, o composto nanoestruturado polimérico catiônico anfifílico possui potencial zeta que varia de +15 a +55 mV,

preferencialmente +30 mV; e diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) que varia de 150 a 950 nm, preferencialmente 300 nm.

[062] Portanto, adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso dos referidos compostos nanoestruturados lipídico catiônico anfifílico e polimérico catiônico anfifílico como carreador de pelo menos dois fármacos, um hidrofílico e outro hidrofóbico, para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos ou cosméticos em que a característica catiônica seja desejável, preferencialmente produtos oftálmicos.

[063] Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada para o desenvolvimento de medicamentos para doenças negligenciadas.

[064] Para melhor compreensão da invenção, a presente invenção é explicada em mais detalhes pelos exemplos a seguir, porém não é limitada pelos referidos exemplos.

Exemplos da invenção: - Carreadores lipídicos nanoestruturados compreendendo acetato de dexametasona, polimixina B e revestidos por cloreto de guitosana (CLN-Dexa-Poli-Prot):

- Preparação dos carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN):

[065] Quantidade igual a 100,0g de carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) foi obtida primeiramente, através da transferência de exatos 6,0g de palmitato de cetila (ácido graxo saturado); 4,0 g de triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico (ácido graxo

insaturado); e 0,25 g de lecitina de soja, para um béquer de 150 ml_. A mistura (Fase Oleosa) foi aquecida até 85 °C, empregando-se agitador magnético, a 300 rpm, até completa dissolução.

[066] Para outro béquer de 150 ml_, foram transferidos 2,5 g de Pluronic ^® F68 e 1 ,5 g de Tween 80 ^® e 85,8g de água ultrapura Milli-Q ^® (Fase Aquosa). Esta solução também foi aquecida até 85 °C e

homogeneizada em agitador, a 300 rpm, até completa dispersão dos tensoativos.

[067] A fase aquosa foi dispersa na fase lipídica, sob agitação mecânica (8000 rpm), utilizando-se agitador, por 5 minutos, de modo a formar pré-emulsão, a qual foi submetida à homogeneização à alta pressão, empregando-se quatro ciclos sucessivos a 600 bar.

Tabela 1 - Fórmula do carreador lipídico nanoestruturado (CLN-Dexa) contendo tensoativo aniônico (dodecil sulfato de sódio):

Componentes % (P/P)

Triésteres de glicerol dos ácidos cáprico

4,00 e caprílico (ácido graxo insaturado)

Fase

Palmitato de cetila (ácido graxo

Oleosa 6,00

saturado)

Lecitina de soja 0,25

Acetato de dexametasona 0, 10

Fase Tween 80 ^® 1 ,50 aquosa Pluronic ^® F68 2,50

Dodecil sulfato de sódio 0,50

Água ultrapura Milli-Q ^® q.s.p. 100

Tabela 2 - Fórmula do carreador lipfdico nanoestruturado (CLN-Dexa) contendo tensoativos não-iônicos (tween ^® 80 e pluronic f68 ^® ).

Componentes % (P/P)

Triésteres de glicerol dos ácidos cáprico

Fase 4,00

e caprílico

Oleosa

Palmitato de cetila 6,00

Acetato de dexametasona 0, 10

Tween 80 ^® 1 ,50

Fase

Pluronic ^® F68 2,50 aquosa

Água ultrapura Milli-Q ^® q.s.p. 100

- Preparo das soluções de sulfato de polimixina B:

[068] Posteriormente, foram preparadas três soluções-estoque de sulfato de polimixina B, por meio da transferência de 123,37mg, 92,52mg e 61 ,68mg (potência do sulfato de polimixina B: 8106 Ul/mg) para balões volumétricos de 10,0 mL, sendo o volume completado com água ultrapura Milli-Q ^® . Desta maneira, foram obtidas concentrações finais,

respectivamente, iguais a 100.000 UI/mL (Solução A), 75.000 UI/mL (Solução B) e 50.000 UI/mL (Solução C).

- Preparação dos CLN-Dexa+Poli:

[069] A matriz de ensaios para a incorporação de sulfato de polimixina B em carreadores lipídicos nanoestruturados contendo acetato de dexametasona são apresentados na Tabela 1 . As variáveis

independentes foram concentração de sulfato de polimixina B (três níveis: 5.000, 7.500 e 1 .0000 UI/mL) e tempo de incubação, em horas, dos CLN- Dexa na solução de sulfato de polimixina B (três níveis: 4, 6 e 8 horas). Tabela 3 - Matriz de ensaios para a incorporação do sulfato de polimixina

B nos CLN-Dexa. Concentração do

Preparação sulfato de polimixina Tempo (horas)

B (UI/mL)

1 7.500 6

2 5.000 8

3 10.000 8

4 1 1 .000 6

5 5.000 4

6 10.000 4

7 7.500 6

9 7.500 3h 10min

10 7.500 8h 50min

12 4.000 6

13 0 0

[070] Primeiramente, foi efetuada a diluição 1 :5 dos CLN-Dexa preparados anteriormente, em água ultrapura MilliQ®.

[071 ] Alíquota igual a 9ml_ dos CLN-Dexa foi transferida para béqueres de 25 mL. Para as preparações de números 1 , 7, 9 e 10, foi utilizado volume de 1 ,0 mL da solução B. Da mesma maneira, para as preparações 2 e 5, utilizou-se 1 ,0 mL da solução C. Para a obtenção das preparações 3 e 6, foi transferido o volume de 1 ,0 mL da solução A.

[072] A solução A também foi utilizada para a preparação 4, porém foi utilizado volume de 1 , 1 mL, em 8,9 mL, do CLN-Dexa.

Finalmente, a preparação 12 foi obtida pela adição de 0,8 mL da Solução C em 9,2 mL do CLN-Dexa.

[073] A adição das soluções A, B e C foi efetuada por

gotejamento, com agitação empregando-se barra magnética e agitador magnético a 200 rpm. Após a adição das soluções, o período de agitação prosseguiu conforme descrito na Tabela 1 .

- Revestimento dos CLN-Dexa+Poli empregando cloreto de guitosana: [074] Em alíquotas de 9,0ml_ de todas as preparações obtidas foram adicionadas de 1 ,0 mL de dispersão de Protasan UP CL 1 14 ^® (cloreto de quitosana) a 2,0% (p/p) em água ultrapura MilliQ ^® , com a obtenção de volume final de 10,0 mL, por meio de gotejamento e agitação empregando-se barra magnética e agitador magnético a 200 rpm.

[075] Após a adição da dispersão, o período de agitação prosseguiu durante 2 horas e as preparações foram mantidas em geladeira (5 °C). A concentração final de Protasan UP CL 1 14 ^® nas preparações foi de 0,2% (p/v). As preparações assim obtidas foram denominadas de CLN-Dexa+Poli-Prot.

[076] As avaliações do diâmetro hidrodinâmico médio (nm) dos CLN-Dexa+Poli+Prot foram realizadas imediatamente após a preparação e após, 7, 14, 21 , 28, 35, 42, 49 e 56 dias.

[077] A análise dos efeitos principais para os valores do diâmetro hidrodinâmico médio (nm) das partículas e CLN-Dexa-Poli-Prot, bem como a análise de regressão da concentração de sulfato de polimixina B em função do potencial zeta foi efetuada por meio do software Minitab® 16 (variável y, os valores do diâmetro médio, e variável x, a concentração de sulfato de polimixina B).

Determinação do Potencial Zeta das CLN-Dexa-Poli-Prot:

[078] Após a incorporação do sulfato de polimixina B ao CLN- Dexa, o potencial zeta foi alterado de -18,6 mV (CLN-Dexa) para -2,00 mV (10.000 UI/mL) (Tabela 4). Tal resultado demonstrou a incorporação do tensoativo catiônico (sulfato de polimixina B) ao carreador. A relação entre a concentração do sulfato de polimixina B e o potencial zeta resultou em regressão linear simples (Figura 1 ).

Tabela 4 - Composto nanoestruturado lipfdico anfifflico: diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), Potencial Zeta (mV) e índice de

Polidispersividade.

Semanas

Formulação

1 ^o 2 ^o 3 ^o 40 220,2 ± 224,5 ± 218,7 ± 220,0 ±

DHM (nm)

2,150 1,539 1,002 2,205

-4,37 ± -4,93 ± -4,46 ± -6,63 ±

25LP PZ (mV)

0,159 0,186 0,173 0,191

0,135 ± 0,098 ± 0,151 ± 0,120 ±

IP

0,038 0,024 0,003 0,027

219,3 ± 220,4 ± 222,0 ± 218,7 ±

DHM (nm)

3,101 3,534 2,747 0,6658

-3,78 ± -2,96 ± -3,24 ± -4,75 ±

50LP PZ (mV)

0,237 0,0493 0,181 0,212

0,114 ± 0,143 ± 0,123 ± 0,117 ±

IP

0,058 0,017 0,028 0,021

219,8 ± 223,4 ± 219,6 ± 220,1 ±

DHM (nm)

5,163 4,631 2,364 4,258

-2,03 ± -2,37 ± -3,03 ± -3,75 ±

75LP PZ (mV)

0,213 0,457 0,0802 0,229

0,125 ± 0,135 ± 0,118 ± 0,143 ±

IP

0,046 0,008 0,017 0,020

221 ,4 ± 223,9 ± 218,5 ± 218,7 ±

DHM (nm)

2,762 1,750 2,312 1,852

-2,00 ± -1,94 ± -2,19 ± -2,80 ±

100LP PZ (mV)

0,260 0,275 0,254 0,342

0,127 ± 0,140 ± 0,129 ± 0,127 ±

IP

0,019 0,016 0,019 0,014

223,2 ± 225,8 ± 224,5 ± 225,2 ±

DHM (nm)

4,060 1,680 1,270 2,684

-18,6 ± -16,0 ± -15,7 ± -15,5 ±

Branca PZ (mV)

0,265 0,945 0,950 0,503

0,136 ± 0,137 ± 0,129 ± 0,135 ±

IP

0,010 0,027 0,007 0,045 LP: composto nanoestruturado lipídico contendo acetato de dexametasona e polimixina B nas concentrações 25, 50, 75 e 100 (2.500 UI/mL; 5.000 UI/mL; 7.500 UI/mL e 10.000 UI/mL)

[079] O CLN-Dexa+Poli apresentou carga negativa na faixa de concentração utilizada do agente antimicrobiano (2.500 a 10.000 UI/mL). Tal comportamento possibilitou o revestimento do carreador (CLN- Dexa+Poli) empregando polímero catiônico (0, 15% p/p).

[080] Assim, a Tabela 4 apresenta os resultados dos carreadores lipídicos nanoestruturados contendo acetato de dexametasona (CLN- Dexa), preparados após incorporação de sulfato de polimixina B empregando concentrações de 2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL (Tabela 4).

[081 ] A incorporação do agente antimicrobiano (Sulfato de

Polimixina), que apresenta característica tensoativa (tensoativo catiônico,) foi confirmada por meio da análise de regressão simples (Figura 1 ). Assim como o sulfato de polimixina B, outros tensoativos catiônicos podem ser utilizados tal como o cloreto de benzalcônio. Após a incorporação do sulfato de polimixina B ao CLN-Dexa, o potencial zeta foi alterado de - 18,6 mV (CLN-Dexa) para -2,00 mV (10.000 UI/mL) (Tabela 4). Tal resultado demonstrou a incorporação do tensoativo catiônico (sulfato de polimixina B) ao carreador.

[082] Dessa forma, foi possível a obtenção, por meio de interação eletrostática entre o CLN-Dexa+Poli negativo e o cloreto de quitosana (Protasan®). Os valores de potencial zeta após o revestimento estão apresentados na Tabela 5. Esses valores foram de aproximadamente +20 mV e não apresentaram diferenças significativas quando utilizadas diferentes concentrações de sulfato de polimixina B (2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL) (Tabelas 6 e 7).

Tabela 5 - Composto nanoestruturado lipídico catiônico anfifílico: diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), Potencial Zeta (PZ) e índice de Polidispersividade (IP): 0, 15 %(p/p) de cloreto de quitosana. 0, 127 ± 0, 138 ± 0, 146 ± 0,085 ±

IP

0,040 0,015 0,015 0,008

LP: composto nanoestruturado lipídico contend o acetato de dexametasona e polimixina B nas concentrações 25, 50, 75 e 100 (2.500 UI/mL; 5.000 UI/mL; 7.500 UI/mL e 10.000 UI/mL) e 0, 15% (p/p) de

Protasan SR.

Tabela 6 - Média e desvio-padrão (DP) do potencial zeta (mV) dos CLN-

Dexa+Poli-Prot: 0, 15 %(p/p) de cloreto de quitosana.

Tabela 7 - Análise de variância para o potencial zeta (mV) dos CLN- Dexa+Poli+Prot preparados com 2.500 UI/mL (25LP), 5.000 UI/mL (50LP), 7.500 UI/mL (75LP) e 10.000 (UI/mL) (100LP): 0, 15 %(p/p) de cloreto de quitosana.

- Determinação do Diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) das CLN- Dexa-Poli-Prot:

[083] Com relação ao diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), foi observada aumento dessa característica após a incorporação

empregando o sulfato de polimixina B (Tabela 8). Na etapa de

revestimento com protasan®, o DHM foi dependente da concentração de sulfato de polimixina conforme pode ser observado na Tabela 9 e Figura 2. Tabela 8 - Diâmetro hidrodinâmico médio (nm) dos CLN-Dexa e CLN-Dexa+Poli empregando 1.000, 2.000, 3.000,

4.000, 7.500 e 10.000 UI/mL por período de 56 dias mantidos sob refrigeração (5 °C).

Tabela 9 - Diâmetro hidrodinâmico médio (nm) dos CLN-Dexa-Prot e CLN-Dexa+Poli-Prot empregando 1.000, 2.000,

3.000, 4.000, 7.500 e 10.000 UI/mL por período de 56 dias mantidos sob refrigeração (5 °C).

[084] Além disso, a eficiência de encapsulação do acetato de dexametasona no CLN foi maior que 90% (p/v) conforme Tabela 10.

Tabela 10 - Quantidade de acetato de dexametasona encapsulado e livre e eficiência de encapsulação nos CLN-DEXA:

- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) das CLN- Dexa-Poli-Prot:

[085] Foram utilizadas duas microplacas contendo 96 alvéolos, divididos em oito colunas e doze fileiras. Foi utilizado o meio de cultura antibiótico n° 10, o qual foi esterilizado empregando-se vapor de água saturado sob pressão a 121 °C, por 15 minutos, em autoclave vertical.

[086] Transferiu-se alíquota de 192 μΙ_ do meio para todos os alvéolos da primeira coluna e 100 μί aos demais. Foram adicionados 8 μΙ_ do padrão de sulfato de polimixina B, das amostras de CLN-Dexa+Poli (CNL-Dexa+5.000, CLN-Dexa+7.500, CLN-Dexa+10.000), das amostras ultrafiltradas (UF-CLN-Dexa+5.000, UF-CLN-Dexa+7.500 e UF-CLN- Dexa+10.000) e dos CLN-Dexa ao primeiro alvéolo de cada fileira, perfazendo total de 200 μΙ_.

[087] Em seguida, foram transferidos 100 μΙ_ para o alvéolo seguinte de cada fileira e assim sucessivamente, de modo a se obterem diluições seriadas na relação 1 :2. Alíquota de 100 μΙ_ foi desprezada do último alvéolo. As concentrações do padrão de sulfato de polimixina B e as concentrações de CLN-Dexa+Poli foram de 4 UI/mL a 0,002 UI/mL. As concentrações dos ultrafiltrados foram estimadas a partir do padrão de sulfato de polimixina B e foram utilizadas tal qual obtidas (sem diluição). [088] O controle negativo foi efetuado com a adição de 200 μΙ_ do meio de cultura não inoculado em uma fileira da microplaca; o controle positivo do meio foi obtido pela transferência de 100 μΙ_ do meio de cultura não inoculado e 100 μί do meio inoculado para o alvéolo. A incubação foi em estufa a 37 ±0,5 °C, por período de 24 horas. Para a leitura dos resultados, após esse período, adicionaram-se 50 μΙ_ da solução de cloreto de trifenil tetrazólio, com incubação durante 2 horas em estufa a 37 ±0,5 °C. A leitura das placas foi efetuada visualmente, com a observação do aparecimento da coloração avermelhada indicando crescimento microbiano.

[089] As concentrações do sulfato de polimixina B nas amostras (5.000 UI/mL, 7.500 UI/mL e 10.000 UI/mL) foram estimadas a partir do CMI obtido para o padrão de sulfato de polimixina B.

[090] Os valores do CMI foram calculados com base na

concentração do último alvéolo, sem crescimento microbiano, multiplicada pelo fator de diluição.

[091 ] Desse modo, com referência à atividade antimicrobiana, os CLN-Dexa+Poli-Prot apresentaram eficácia aproximadamente 2 vezes maior quando comparado ao sulfato de polimixina livre conforme Tabela 1 1 .

Tabela 11 - Concentração Mínima Inibitória (CMI) do Sulfato de Polimixina B e dos CLN-Dexa+Poli -Prot diluídos em tampão fosfato 10% (p/v) pH 6,0 e em água ultra pura Milli Q® frente a Bordetella bronchiseptica ATCC 4617.

- Vesículas poliméricas nanoestruturadas compreendendo acetato de dexametasona, polimixina B e revestidas por cloreto de guitosana ( VP-Dexa-Poli-Prot):

- Preparo das vesículas poliméricas contendo acetato de dexametasona:

[092] Para a obtenção das vesículas contendo dexametasona foi utilizado o método de precipitação de polímero pré-formado que consiste na adição, sob agitação, da fase orgânica contendo o ácido poli- ΡοΝ(ε- caprolactona) (PCL), a acetona, a dexametasona e a mistura de triglicerídeos dos ácidos cáprico/caprílico, sobre fase aquosa contendo polissorbato 80 (Tabela 12). A eliminação do solvente e parte da água foi efetuada empregando evaporador rotatório e o volume da suspensão foi ajustado em balão volumétrico.

Tabela 12 - Fórmula de vesículas poliméricas contendo acetato de dexametasona:

FASE ORGÂNICA

Volume (ml_)

Componente

10 50 100

Peso (g)

Poli(s-caprolactona) 0, 1000 0,5000 1 ,0000

Monoestearato de sorbitan (span 60) 0,0770 0,3850 0,7770

Triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e

0,3333 1 ,6665 3,3333 caprílico (Myglyol ^® )

Acetato de dexametasona 0,0100 0,0500 0, 1000

Acetona P.A. (ml_) 27,0 135,0 270,0

FASE AQUOSA

Volume (ml_)

Componente

10 50 100

Peso (g)

Polissorbato 80 0,0770 0,3850 0,7770 Agua purificada (mL) 53,0 265,0 530,0

- Preparo das soluções de sulfato de polimixina B:

[093] Foram preparadas três soluções-estoque de sulfato de polimixina B, por meio da transferência de 123,37 mg, 92,52 mg e 61 ,68 mg (potência do sulfato de polimixina B: 8106 Ul/mg) para balões volumétricos de 10,0 mL, sendo o volume completado com água ultrapura Milli-Q®. Desta maneira, foram obtidas concentrações finais,

respectivamente, iguais a 100.000 UI/mL (Solução A), 75.000 UI/mL (Solução B) e 50.000 UI/mL (Solução C).

- Incorporação do sulfato de polimixina B nas VP-Dexa:

[094] Foi efetuada a diluição 1 :5 das VP-Dexa preparados conforme item A, em água ultrapura MilliQ®. Alíquota de 1 mL das soluções A, B e C foram adicionadas a 9 mL das VP-Dexa diluídas resultando nas concentrações finais de sulfato de polimixina B de 10.000, 7.500 e 5.000 UI/mL respectivamente. Alíquota de 0,5 mL da solução C foi adicionada à 9 mL das VP-Dexa resultando nas concentrações final de 2.500 UI/mL

[095] A adição das soluções A, B e C foi efetuada por

gotejamento, com agitação empregando-se barra magnética e agitador magnético RTC IKA® a 200 rpm. Após a adição das soluções, o período de agitação prosseguiu por período de 60 minutos.

- Revestimento das vp-dexa+poli empregando Protasan UP CL

114 ^® :

[096] Em alíquotas de 9,0mL de todas as preparações obtidas conforme descritas anteriormente foram adicionadas de 1 ,0 mL de dispersão de Protasan UP CL 1 14® (cloreto de quitosana) a 1 ,5% (p/p) em água ultrapura MilliQ®, com a obtenção de volume final de 10,0 mL, por meio de gotejamento e agitação empregando-se barra magnética e agitador magnético RTC IKA® a 200 rpm. Após a adição da dispersão, o período de agitação prosseguiu por 30 minutos e as preparações foram mantidas em geladeira (5 °C). A concentração final de Protasan UP CL 1 14® nas preparações foi de 0,15% (p/v). As preparações assim obtidas foram denominadas de VP-Dexa+Poli-Prot.

[097] A análise dos efeitos principais para os valores do diâmetro hidrodinâmico médio (nm) das VP-Dexa-Poli-Prot, bem como a análise de regressão da concentração de sulfato de polimixina B em função do potencial zeta foi efetuada por meio do software Minitab ^® 16 (variável y, os valores do diâmetro médio, e variável x, a concentração de sulfato de polimixina B).

- Determinação do diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) e do índice de polidispersividade (IP):

[098] O diâmetro hidrodinâmico médio das partículas (DHM) e o índice de polidispersividade (IP) das vesículas poliméricas contendo acetato de dexametasona (VP-Dexa) foram determinados por

espalhamento de luz dinâmica, diluindo-se as amostras das suspensões, na razão de 1 :800, em água Milli-Q ^® , recém-preparadas, e observando- se, à luz espalhada, em ângulo de 90°. A distribuição do tamanho das partículas, o índice de polidispersividade e o potencial zeta foram

determinados empregando-se equipamento Zetasizer Nano ZS90.

[099] A Tabela 13 apresenta os DHM, IP e PZ das VP-Dexa+Poli empregando diferentes concentrações de sulfato de polimixina B (2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL) após revestimento empregando 0, 15% (p/v) de Protasan® (VP-Dexa+Poli+Prot).

Tabela 13 - Diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), índice de polidispersividade (IP) e Potencial zeta (PZ) das VP-Dexa+Poli revestidas com Protasan® (quitosana).

Semanas

Formulações 1 2 3 4

DHM(n 658,0± 6,3 689,5±38,0 705,4±22, 1 623,9±29,

VP-Dexa+Poli m) +22,2± 1 ,0 +24,9±1 ,7 +24, 1 ±0,7 6

25P PZ (mV) 0,420± 0,1 8 0,390±0,02 +24,0±0,4 IP 0,427±0, 12 0

0,313±0,0 6

685, 1 ±

DHM(n 617,7±29,6 720,8±52,3 27,4

781 ,4±53,6

VP-Dexa+Poli m) +24,2±2,2 +22,3±0,6 +27,0±

+23,0 ±1 ,4

50P PZ (mV) 9 5 1 ,37

0,408±0,06

IP 0,438±0,14 0,648±0,09 0,318±

0,04

727,4±

DHM(n 953,4±54,3 812,7±26,4 23,9

830, 1 ±22,2

VP-Dexa+Poli m) +22,4±0,6 +21 ,8±0,5 +23,7±

+23,6± 2,0

75P PZ(mV) 8 7 1 ,27

0,530±0,07

IP 0,665±0,08 0,323±0,02 0,454±

0,06

740,7±

DHM(n 6,15

992,4±44,3 789,0±1 1 ,5 776, 1 ±30,8

VP-Dexa+Poli m) +21 , 7±

+23,4± 2,4 +23,5± 2,5 +25, 1 ± 2,6

100P PZ (mV) 0,32

0,630±0,15 0,681 ±0, 17 0,393±0,07

IP 0,409±

0,07

[100] As Figuras 3 e 4 apresentam a regressão linear entre o DHM e a concentração de sulfato de polimixina B e entre o potencial zeta e a concentração de sulfato de polimixina B das VP-Dexa+Poli,

respectivamente.

[101 ] Os resultados revelaram que o diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) foi dependente da concentração de sulfato de polimixina B empregada (2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL). Essa relação

apresentou função linear, na faixa de trabalho, com R ² ajustado igual a 86,5%. Dessa forma, quanto maior a concentração de sulfato de

polimixina B, maior foi o DHM observado sendo 339,8 nm para a menor concentração (2.500 UI/mL de sulfato de polimixina B) e 445, 8nm (10.000 UI/mL de sulfato de polimixina B). Os valores de DHM mostram-se estáveis por período de 4 semanas sob refrigeração.

[102] Resultado similar foi observado para o potencial zeta (PZ). Da mesma maneira, foi observada relação linear entre essa característica elétrica e a concentração de polimixina B. Essa relação apresentou R ² ajustado igual a 89,9% sendo que o maior valor de PZ foi observado após o revestimento das vesículas poliméricas contendo acetato de

dexametasona (VP-Dexa) empregando a maior concentração de sulfato de polimixina B (10.000 UI/mL). Assim, os valores de PZ foram alterados de -37 mV (sem adição de sulfato de polimixina B) para -19 mV (após adição de 10.000 UI/mL de sulfato de polimixina B).

[103] Já as Figuras 4 e 5 apresentam a análise de variância para o DHM e PZ das VP-Dexa+Poli+Prot, respectivamente empregando 0, 15% (p/v) de Protasan®.

[104] Com referência ao revestimento das VP-Dexa+Poli com quitosana (Protasan®), não foram observadas diferenças significativas no DHM e no PZ das VP-Dexa+Poli+Prot empregando diferentes

concentrações de sulfato de polimixina B (2.500, 5.000, 7.500 e 10.000 UI/mL) (Figuras 5 e 6). Assim, pode-se inferir que essas características são dependentes da concentração da quitosana utilizada no revestimento das VP-Dexa+Poli. Assim, os valores de DHM das VP-Dexa+Poli, que variaram entre 339,8 a 445,8 nm, para as diferentes concentrações de sulfato de polimixina B (Tabela 13), após o revestimento empregando Protasan ^® , apresentaram valores de DHM entre 623,9 e 740,7 nm (DHM não significativamente diferentes).

[105] A análise de pH revelou valor entre 4,5 e 6,5, para as formulações antes e após o revestimento empregando sulfato de polimixina B e Protasan ^® . A eficiência de encapsulação do acetato de dexametasona foi de 97,2% (p/v).

[106] Portanto, a partir dos testes realizados, a presente invenção disponibiliza compostos nanoestruturados lipídico ou polimérico compreendendo fármacos hidrofílico e hidrofóbico, portanto com característica anfifílica, e catiônica devido ao cloreto de quitosana.

[107] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.