L'invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait à' Anethum graveolens aqueux enrichi en petits ARN (acides ribonucléiques ) d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides (nt) ainsi que les extraits obtenus par le procédé et les compositions cosmétiques comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmétiques .

La famille des Apiacées (Apiaceae) , appelées aussi Ombellifères, est constituée de plantes dicotylédones et comprend près de 3 000 espèces réparties en 420 genres surtout présentes dans les régions tempérées du monde. Cette famille inclut aussi des herbes comme le persil, la coriandre, le fenouil. Anethum graveolens, fait partie de la famille des Apiaceae. Son nom d'espèce admet plusieurs synonymes tels que Anethum sowa, Peucedanum graveolens et Peucedanum sowa (Janeen et al ; The Herb Society of America 's Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009) . L'aneth odorant (Anethum graveolens) est largement répandue dans le monde et est une espèce très riche en différentes familles de molécules telles que des huiles essentielles, des acides gras, des protéines, des carbohydrates, de la furanocoumarine, des polyphénols, des minéraux et encore beaucoup d'autres molécules biologiquement actives. Elle est notamment très utilisée en médecine traditionnelle. Le nom de l'aneth dérive d'un mot grec «aneeson» ou « aneeton» et signifie « forte odeur ». Cette plante a une histoire longue et ancienne dans de nombreux pays comme une herbe culinaire et médicinale. Son utilisation est commune en médecine ayurvédique (médecines traditionnelles de l'Inde), principalement pour lutter contre l' inconfort abdominal et l'indigestion) (Jana et Shekhawat Shekhawat GS . Phytochemical Analysis and Antibacterial Screening of in vivo and invitro Extracts of Indian Médicinal Herb: Anethum graveolens. Res. J. Med. Plant. 2010a; 4 (4 ): 206-212. 2010; Janeen et al., The Herb Society of America 's Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio : The Herb Society of America, 2009). En France et dans plusieurs autres pays de l'Europe de l'ouest cette plante fait partie de nombreuses préparations médicinales traditionnelles pour ses propriétés digestives et fortifiantes qui subsistent encore aujourd'hui. La littérature scientifique décrit notamment des effets antimicrobien, anti-inflammatoire, analgésique, une protection des muqueuses respiratoires et des effets comme relaxant musculaire.

De nombreux extraits de graines d'aneth sont décrits dans la littérature en partie pour l'utilisation de ses huiles essentielles, en revanche peu d'études ont été réalisées sur des extraits issus des parties aériennes de l'aneth. De plus la plupart des extractions décrites d'aneth sont effectuées avec des solvant organiques de type apolaire et peu sont issus d'extraction avec un solvant polaire comme l'eau. De plus très peu de ces extraits sont revendiqués pour une utilisation cosmétique .

Malgré les différents produits cosmétiques anti-âge sur le marché pour le traitement de la peau, il reste un besoin de compositions cosmétiques efficaces appliquées topiquement qui présentent des effets anti-âges pour la peau et les cheveux en utilisant des ingrédients naturels comme agent actif.

Les produits dits « non naturels » et synthétisés chimiquement peuvent être perçus comme dangereux pour l'environnement ainsi que pour les personnes. En revanche, les produits naturels sont perçus comme supérieurs aux produits synthétisés chimiquement. De nombreux produits naturels extraits de plantes ou d'herbes sont connus pour contenir des agents antioxydants / radicaux libres qui peuvent neutraliser les effets des dégâts des radicaux libres telles que les polyphénols. L'aneth est une plante très riche en composés phénoliques et d'autres familles de molécules reconnues pour leurs effets bénéfiques sur la peau. En particulier, le procédé d'extraction décrit dans l'invention permet d'enrichir l'extrait final avec des ARN de petit poids moléculaire .

Les protocoles d'extraction des acides ribonucléiques (ARN ARN de petit poids moléculaire) classiquement décrits sont adaptés aux pratiques de laboratoire, et donc réalisés à petite échelle. Ils utilisent des solvants qui ne sont pas considérés comme des solvants cosmétiques (Zumbo, P. 2014 "Phenol- chloroform Extraction", 2014) . De plus, ces protocoles d'extraction et purification ne permettent d'obtenir que la fraction d'acides nucléiques purifiée. Cette fraction d'acides nucléiques ARN ou ADN ou petits ARN est dépourvue de tout autre molécule d'intérêt telle que les métabolites secondaires, vitamines, sucres, peptides, etc. qui peuvent avoir des effets bénéfiques pour la peau et présentent donc un intérêt cosmétique.

L'invention a pour premier objet un procédé d'obtention d'un extrait aqueux à' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir d'une matière végétale comprenant les étapes suivantes :

a) Solubilisation des parties aériennes d'aneth avec de l'eau ;

b) auquel on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) , le pH du mélange étant compris entre 10,5 et 11 ;

c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;

d) on purifie le mélange obtenu en séparant la matière soluble de celle qui est insoluble c) de manière à récupérer un extrait brut aqueux ; et

e) on réalise au moins une filtration de l'extrait brut aqueux pour obtenir l'extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides dont le pH est contrôlé et si nécessaire réajusté à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5. De plus, l'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux des parties aériennes d' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et dépourvu d'ADN, obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en poids du poids total de l'extrait, de 5 à 30 g/kg d'extrait sec, 0,5 à 10 g/kg de fragments protéiques, 0,5 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 50 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.

L' invention permet également de préparer une composition comprenant, en tant qu'agent actif anti-âge, un extrait selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable.

L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, au regard de la figure 1 annexée :

- la Figure 1 est un graphique résultant d'une analyse au

Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu selon l'exemple 1 ;

la Figure 2 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu après une étape de précipitation des petits ARN selon l'exemple 2 ;

la Figure 3 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu par extraction conventionnelle selon l'exemple 3 ;

Description de l'invention :

L' invention concerne un procédé mis en œuvre pour l'obtention d'un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir des parties aériennes séchées ou fraîches d'aneth.

Par « parties aériennes » on entend les feuilles, tiges et fleurs de l'aneth.

Les graines ne sont pas comprises dans les « parties aériennes » au sens de l'invention.

Dans le cours de la description les termes « aneth » et

« Anethum graveolens » seront utilisées indifféremment, avec la même signification.

Par « petits ARN » ou « ARN de petit poids moléculaire », on entend des ARN (acides ribonucléiques ) non codants de petit poids moléculaire, d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides, tels que tous types de petits ARN non messager, simple et/ou double brins, par exemple les micro-ARN, les ARN interférents , les introns, les petits ARN nucléaires ou encore tout fragment d' ARN.

Dans une première étape a) du procédé selon l'invention, on met en présence la matière végétale soit les parties aériennes broyées séchées d'aneth avec de l'eau, préférentiellement dans un rapport matière végétale / eau de 4 à 20% en poids/poids, plus préférentiellement dans un rapport de 5 à 10%, par exemple dans un rapport de 5,7 ou 10 en poids/poids.

L'eau utilisée est une eau distillée, déminéralisée ou encore une eau riche en sels minéraux et/ou oligo-éléments, préférentiellement une eau distillée.

De préférence les parties aériennes de l'aneth sont sous forme sèche.

Préférentiellement, la matière végétale est broyée avant d'être mise en présence d'eau dans l'étape a) . Le broyage est une action mécanique qui permet une meilleure extraction. Le broyage mécanique, suivi d'une lyse alcaline en présence d'EDTA favorise la complète déstructuration de la membrane cellulaire et notamment de la membrane nucléaire. On ajoute ensuite dans une étape b) de l'EDTA tétrasodique dans le mélange obtenu en a) . Le pH à cette étape est basique et doit être ajusté, si nécessaire, à une valeur comprise entre 10,5 et 11 par l'ajout de soude (NaOH) . Lors de l'étape b) il est essentiel de maintenir le pH basique entre 10,5 et 11. En effet, ce niveau de pH, associé à l'action de l'EDTA, provoque la déstructuration de la membrane cellulaire, y compris la membrane nucléaire, la lyse des cellules et la dénaturation de l'ADN (les 2 brins de la double hélice sont séparés) . Le contrôle du pH lors de l'étape b) montre que celui-ci reste basique et se stabilise entre 9 et 11.

La concentration en EDTA tétrasodique est préférentiellement comprise entre 2 et 15mM, et plus préférentiellement de 10 mM

Cette concentration est choisie pour optimiser le rendement d'extraction des ARN de petit poids moléculaire dans l'extrait final. L'EDTA tétrasodique va fragiliser, déstructurer les membranes pecto-cellulosiques des cellules végétales en séquestrant par complexation les ions divalents tels que les ions calcium qui forment des ponts ioniques entre les molécules de pectines entourant les microfibrilles de cellulose. Ceci a pour conséquence de favoriser la libération du contenu cellulaire au cours de l'extraction. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.

L'étape de traitement par l'EDTA dure préférentiellement au moins lh, à une température comprise entre 20 et 80 °C. Pendant cette étape, le mélange obtenu en a) est avantageusement mis sous agitation.

Dans une étape c) , on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8.

Par exemple, on ajuste le pH par ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou encore n'importe quel acide pouvant réguler le pH qui soit compatible avec une utilisation cosmétique tel que l'acide citrique ou lactique.

Cette étape d'acidification provoque la renaturation brutale de l'ADN (réappariement des brins du duplex) . Néanmoins l'ADN chromosomique, très long, ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. Au contraire, les petits ARN, beaucoup plus courts, restent en solution. L'ADN et les petits ARN sont ainsi séparés en deux phases distinctes ; une phase solide contenant entre autres l'ADN chromosomique, et une phase liquide contenant, entre autres, les petits ARN.

Dans une étape d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale et récupérer un extrait brut aqueux. Toute méthode connue par l'homme du métier pourra être utilisé. Préférentiellement le mélange obtenu en c) est centrifugé à faible vitesse, par exemple pendant au moins 10 min à 4000 g, de manière à sédimenter la matière végétale résiduelle dans le culot et récupérer un extrait brut aqueux dans le surnageant.

Dans une étape d) on contrôle le pH et on le réajuste à une valeur comprise entre 6 et 8. Préférentiellement le pH est réajusté à une valeur comprise entre 6 et 6,5, encore plus préférentiellement à 6,5. Le pH est réajusté par l'ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou de soude (NaOH) .

En effet, un pH inférieur à 6 peut entraîner la précipitation des acides nucléiques en général, donc celle des ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides .

L'étape d'ajustement du pH à l'étape d) du procédé selon l'invention est une étape indispensable à l'extraction optimale des ARN de petit poids moléculaire.

Avantageusement le réajustement du pH de l'étape d) est précédé par au moins une filtration de l'extrait brut aqueux obtenu en d) . Préférentiellement des filtrations successives seront réalisées en abaissant le seuil de filtration de 50 à 20 μπι jusqu'à 0,4 ; 0,3 ; 0,2 ou 0,1 μπι. L'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux d' aneth enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides de l'invention obtenu par le procédé décrit ci-dessus.

Cet extrait ne contient pas d'ADN (acide désoxyribonucléique) .

Un tel extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides comprend, avant dilution, en poids du poids total de l'extrait, 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,2 à 3 g/kg d'acides aminés, 100 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait ainsi obtenu est considéré comme concentré. Il peut être ensuite dilué dans un solvant physiologiquement acceptable pour un usage cosmétique, de telle sorte que la concentration de l'extrait est alors ajustée à un poids en extrait sec particulier d'intérêt.

A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs de solvants physiologiquement acceptables, on peut citer l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol ainsi que sa version naturelle appelée Zemea® issue du maïs, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.

Préférentiellement, l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention est dilué dans un solvant tel que 30% de glycérol et de l'eau, et comprend en poids du poids total de l'extrait. L'extrait obtenu par le procédé selon l'invention comprend en outre de 5-15 g/kg d'extrait sec, de 50 à 1000 mg/kg de polyphénols 0,5-10 g/kg de fragments protéiques, 0,5-10 g/kg de sucres, de 0,1 à 1 g/kg d'acides aminés et 10-100 mg/kg de petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.

A titre illustratif, des exemples préférés de mode de réalisation du procédé selon l'invention sont décrits ci- dessous.

Exemple 1 : Préparation d'un extrait d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN

Un extrait aqueux enrichi en ARN de petit poids moléculaire (d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides) est obtenu à partir d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae.

Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth sous forme de poudre sont placés dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique. Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en

ARN de petit poids moléculaire.

Le mélange est ensuite chauffé 2h à 55°C sous agitation. Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.

A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.

Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration stérilisante à 0,2 ym.

Exemple 2 : Caractérisation de l'extrait d' aneth de l'exemple 1 D'une manière générale, on obtient un extrait aqueux d' aneth de couleur vert clair titrant de 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 300 à 750 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.

Néanmoins, pour des parties aériennes d' aneth de l'espèce Anethum graveolens, les extraits obtenus peuvent présenter une variabilité importante en fonction de facteurs tels que le lieu de récolte, l'année de récolte, la saison, les conditions climatiques, etc.

Dans l'extraction de l'exemple 1, on a obtenu un extrait aqueux titrant 12 g/kg d'extrait de poids sec.

L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 2,55 g/kg de fragments protéiques, 3 g/kg de sucres, 340 g/kg d'acides aminés, 650 mg/kg de composés phénoliques et 50 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol. Après dilution l'extrait présente une concentration de 1,7 g/kg de fragments protéiques, 2 g/kg de sucres, 240 g/kg d'acides aminés, 455 mg/kg de composés phénoliques et 35 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.

Méthodes utilisées dans le dosage de spectrophotométrie pour déterminer la quantité de composés différents dans l'extrait d' aneth :

La teneur totale en protéines de l'extrait d' aneth a été déterminée par un dosage de protéines de Lowry (Lowry et al, 1951) . L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. La teneur en protéines est déterminée à l'aide d'une courbe standard de BSA.

La teneur en acides aminés de l'extrait a été déterminée à partir d'un protocole publié par Moore et al (1948), la teneur en acides aminés libre de l'extrait a été évaluée par la formation d'un complexe coloré, suite à la rupture des fonctions aminé et carboxylique par le Réactif ninhydrine. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. La teneur totale en acide aminées est déterminée par rapport à un pool d'acide aminés comme standard.

La teneur totale en sucres de l'extrait a été déterminée par une adaptation du dosage décrit par Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des substances apparentées", Anal. Chem., 1956, 28 (3 ) , 350- 356) . Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en réagissant avec du phénol pour former un complexe coloré. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucre est déterminée à l'aide d'une courbe standard de glucose. La teneur en polyphénols de l'extrait a été déterminée à l'aide du dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., Analyse des phénols totaux et d'autres substrats d'oxydation et antioxydants au moyen du réactif folin-ciocalteu, 1999, 299: 152) . Les composés de type polyphénols dans l'échantillon réagissent avec le réactif Folin-Ciocalteu, l'oxydation du réactif donne une couleur bleue. L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. Le contenu a été exprimé en équivalents d'acide gallique à l'aide d'une courbe standard d'acide gallique.

La quantification des ARN de bas poids moléculaires au moyen d'un Bioanalyseur® (Agilent) qui permet de réaliser des électrophorèses miniaturisées grâce à des puces électroniques spécifiques de l'analyse des acides nucléiques telle que celle des ARN de petit poids moléculaire. Il permet de déterminer la taille et la concentration contenues dans un extrait à partir de quelques microlitres. Le résultat se présente sous forme d'un graphique avec une unité arbitraire de fluorescence en ordonnée (FU) et en abscisse le nombre de nucléotides (nt) . Un marqueur interne est ajouté à chaque analyse (pic à 25 nt sur la figure 1), et sert de contrôle interne pour valider le bon déroulement de l'analyse. Exemple 3 : Etude de l'influence du pH final dans la préparation d'extraits d' aneth (Anethum graveolens) afin d'obtenir un extrait d' aneth dépourvu de petits ARN

Le procédé d'extraction est réalisé dans les mêmes conditions opératoires que l' exemple 1, pour enrichir un extrait en ARN de petit poids moléculaire, hormis l'étape finale d'ajustement du pH.

Ce procédé d'extraction est réalisé avec une étape de traitement par EDTA tétrasodique, mais avec un ajustement final de l'extrait à un pH acide compris entre 4 et 4,5 au lieu d'un pH compris entre 6 et 8.

Ceci entraine la précipitation des ARN de petit poids moléculaire, résultats confirmés par l'analyse au Bioanalyseur® qui donne une concentration nulle en ARN de petit poids moléculaire (tel qu'illustré à la Figure 2) .

Exemple 4 : Réalisation d'un extrait conventionnel obtenu par macération d' aneth (Anethum graveolens. Mise en évidence du rôle d'une étape de traitement par EDTA pour la mise en œuyre d'un procédé d'extraction de petits ARN.

Dans le but de mettre en évidence le rôle d'une étape de traitement par EDTA lors de l'extraction des ARN de petit poids moléculaire, un extrait d' aneth (Anethum graveolens) a également été obtenu, en modifiant certaines étapes essentielles du procédé selon l'invention, ne permettant pas d'enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.

Dans une première étape, 5% d' aneth sont broyés puis de l'eau est ajoutée, soit 50 g d'aneth dans 950 g d'eau distillée.

Le pH est mesuré et est de 5,5, le mélange est mis sous agitation pendant lh à 55°C.

Ensuite, l'extrait est centrifugé 10 min à 4000 g pour ôter la matière solide. Des filtrations séquentielles sont alors réalisées sur des filtres de porosité décroissante de taille comprise entre 50 et 20 ym puis jusqu'à une porosité de 0,4 à 0,3 ym.

On obtient alors un extrait aqueux de couleur vert clair titrant à 13 g/kg d'extrait de poids sec, contenant 3,3 g/kg de fragments protéiques, 2,2 g/kg de sucres, 380 mg/kg d'acides aminés, et 410 mg/kg de composés phénoliques.

L'extrait est alors dilué pour être à 8 g/Kg en poids sec, par seul ajout d'eau.

L'analyse physico-chimique montre qu'après dilution l'extrait végétal présente une concentration en fragments protéiques de 2,8 g/kg, et en sucres de 1,7 g/kg, en acides aminés de 240 mg/kg, et en composés phénoliques de 280 mg/kg. Dans ces conditions d'extraction dite conventionnelle (absence de traitement par EDTA) , l'analyse au Bioanalyseur® indique que la concentration en ARN de petit poids moléculaire est nulle pour cet extrait (tel qu'illustré à la Figure 3) . Ce résultat confirme qu'un extrait obtenu à partir d'un procédé d'extraction en l'absence de traitement par EDTA (à pH basique) ne contient pas d'ARN de petit poids moléculaire. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour obtenir un extrait riche en ARN de petit poids moléculaire selon l'invention.

Selon un autre aspect de l'invention, les extraits aqueux enrichis en petits ARN obtenus selon l'invention sont avantageusement utilisés dans la préparation de compositions cosmétiques comprenant, à titre d'agent actif, un tel extrait de petits ARN selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable .

Par quantité efficace, on désigne la quantité minimum d'extrait selon l'invention qui est nécessaire pour obtenir l'activité de l'extrait, en particulier cosmétique et plus particulièrement pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou pour l'amélioration de l'hydratation de la peau, sans que cette quantité soit toxique.

Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est utilisé, de préférence dilué dans un solvant cosmétique, à un poids sec compris entre 5 à 15 g/kg.

Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est présent dans la composition à une concentration de 0,1 à 5 %en poids par rapport au poids total de la composition.

Un milieu physiologiquement acceptable désigne un véhicule adapté pour une mise en contact avec les couches externes de la peau ou des muqueuses, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire ou réaction d'intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable.

La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.

Préférentiellement , les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, sans risque d' inconfort lors de leur application et couvrent toutes les formes cosmétiques adaptées.

Par application topique, on désigne le fait d'appliquer ou d'étaler l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention, et plus particulièrement une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse.

« Peau » désigne la peau du visage, notamment le contour des yeux et la bouche, le nez, le front, le cou, les mains, mais aussi la peau de l'ensemble du corps.

Les compositions pour la mise en œuvre de l'invention pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydro-alcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile- dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.

Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir également l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol.

A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20% du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80% en poids et de préférence de 5 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre nanocapsule ou microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.

Avantageusement, la composition selon l'invention peut comprendre, outre l'agent actif selon l'invention, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention. Selon l'invention, cet agent actif est défini comme un « agent actif additionnel ».

Par exemple, le ou les agents actifs additionnels peuvent être choisis parmi : les agents anti-âge, raffermissants, éclaircissants, hydratants, drainants, favorisant la microcirculation, exfoliants, desquamants, stimulant la matrice extracellulaire, activant le métabolisme énergétique, antibactériens, antifongiques, apaisants, anti-radicalaires , anti-UV, anti-acné, anti-inflammatoires, anesthésiques , procurant une sensation de chaleur, procurant une sensation de fraîcheur, amincissants.

De tels agents actifs additionnels peuvent être choisis dans les groupes comprenant :

- la vitamine A et notamment l'acide rétinoïque, le rétinol, le rétinol proprionate, le rétinol palmitate ;

- la vitamine B3 et plus particulièrement le niacinamide, le nicotinate de tocophérol ;

- la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, le panthénol ;

- la vitamine C, notamment l'acide ascorbique, l'ascorbyl glucoside, l'ascorbyl tétrapalmitate, magnésium et sodium ascorbyl phosphate ;

- les vitamines E, F, H, K, PP, le coenzyme Q10 ;

- les inhibiteurs de métalloprotéinase, ou un activateur des TIMP ;

- la DHEA, ses précurseurs et dérivés ;

les acides aminés tels que l'arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, méthionine et ses dérivés, composés acides aminés N-acylés ;

- les peptides naturels ou de synthèse, incluant les di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés lipophiles, isomères et complexés avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (par exemple cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres) . A titre d'exemples, on peut citer les peptides commercialement connus sous le nom de MATRIXYL ^® , ARGIRELINE ^® , CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™, COLLAXYL ™ (brevet FR2827170, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 01™ (brevet FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02™ (brevet FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide™ (brevet FR2846883, ASHLAND®) ou encore le peptide de synthèse de séquence Arg-Gly-Ser-NH ₂ , commercialisé sous le nom ATPeptide™ par ASHLAND® ;

- l'extrait d' Artémia salina, commercialisé sous le nom

GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®) ;

- les extraits peptidiques végétaux tels que les extraits de lin (Lipigénine™, brevet FR2956818, ASHLAND®), les extraits de soja, d'épeautre, de vigne, de colza, de lin, de riz, de maïs, de pois ;

- les extraits de levures, par exemple le Dynagen™, (brevet FR2951946, ASHLAND®) ou 1 ' Actopontine™ (brevet FR2944526, ASHLAND®) ;

- l'acide déhydroacétique (DHA) ;

- les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle ;

- l'acide salicylique et ses dérivés, les alpha- et bêta- hydroxyacides , les silanols ;

- les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acetyl galactosamine ;

- les extraits de polyphénols, isoflavones, flavonoïdes, tels que les extraits de raisin, les extraits de pin, les extraits d'olive ; - les lipides tels que les céramides ou les phospholipides, les huiles d'origine animale, telles que le squalène ou le squalane ; les huiles végétales, telles que l'huile d'amande douce, de coprah, de ricin, de jojoba, d'olive, de colza, d'arachide, de tournesol, de germes de blé, de germes de maïs, de soja, de coton, de luzerne, de pavot, de potiron, d'onagre, de millet, d'orge, de seigle, de carthame, de passiflore, de noisette, de palme, de noyau d'abricot, d'avocat, de calendula ; les huiles végétales éthoxylées, le beurre de karité ;

- tous écrans UV et filtres solaires ;

- l'AMP cyclique et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase , l'extrait de Centella asiatica, 1 ' asiaticoside et l'acide asiatique, les méthyls xanthines, la théine, la caféine et ses dérivés, la théophylline, la théobromine, la forskoline, l'esculine et l' esculoside, les inhibiteurs d'ACE, le peptide Val-Trp, 1 ' inhibiteurs du neuropeptide Y, 1 ' enkephaline , l'extrait de Ginkgo biloba, l'extrait de dioscorea, la rutine, l'extrait de yerba mate, l'extrait de guarana, les oligosaccharides , les polysaccharides , la carnitine, l'extrait de lierre, l'extrait de fucus, l'extrait hydrolysé de Prunella vulgaris, l'extrait hydrolysé de Celosia cristata, l'extrait d' Anogeissus leiocarpus, l'extrait de feuilles de Manihot utilissima, la palmitoylcarnitine, la carnosine, la taurine, l'extrait de sureau, les extraits d'algue tel que l'extrait de Palmaria Palmata.

A titre d'illustration, il est mentionné ci-après des exemples de formulations d'une composition cosmétique contenant un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu selon l'invention : Exemple 5 : Baume pour le contour des yeux

Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w

Procédé de préparation:

1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal jusqu'à ce qu'elle soit claire ;

2. A 25°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser pendant 10 minutes jusqu'à homogénéité ;

3. A 25°C, préparer la phase C dans un bêcher à part, mélanger jusqu'à homogénéité. Saupoudrer dans la phase D et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;

4. A 25°C, ajouter la phase C + D dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;

5. À 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;

6. A 25°C, Prémélanger la phase F, l'ajouter dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;

7. Arrêter à 25°C. La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème nacré violet, avec un pH compris entre 5,70 et 6,20 et une viscosité (D0) de 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25°C) .

Exemple 6 : Crème riche

Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w

Phase A

Eau purifiée Aqua Qsp 100

Optiphen™ Plus Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol 1, 50 preservative (and) Sorbic Acid

Phase B

Stabileze™ QM polymer PVM/MA Decadiene Crosspolymer 0,15

Phase C

Glyceryl Stéarate (and) Behenyl Alcohol

(and) Palmitic Acid (and) Stearic Acid

ProLipid™ 141 lamellar gel (and) Lecithin (and) Lauryl Alcohol (and) 5, 00

Myristyl Alcohol (and) Cetyl Alcohol

Ceraphyl™ 494 ester Isocetyl Stéarate 4, 00

Ceraphyl™ SLK ester Isodecyl Neopentanoate 4, 00

DC 580 Wax Stearoxytrimethylsilane (and) Stearyl 2, 00

Alcohol

Emulsynt™ GDL ester Glyceryl Dilaurate 3, 00

Phase D

Gransil DM-5 Dimethicone (and) Polysilicone-11 3, 00

Phase E

Hydroxyde de sodium Sodium Hydroxide 0, 04

Eau purifiée Aqua 0, 50

Phase F

PF Bois Précieux Parfum/Fragrance 0, 30

CI 77491 (Iron oxides) (and) Isopropyl

Titanium Triisostearate (and) Bis-

Unipure* Red LC 381 ADT-C Hydroxyethoxypropyl Dimethicone (and) 0, 03

PEG-2-Soyamine (and) Isophorone

Diisocyanate

Phase G

Extrait selon l'exemple 1 Water/Aqua (and) Glycerin (and) 3, 00

Peucedanum Graveolens (Dill) extract

Ronaflair Balance Gold CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 0, 30

(and) Tin Oxide

Covabead Velvet 10 Polymethyl Methacrylate 1, 00

Ronaflair Balance Red CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 1,20

(and) Tin Oxide

Phase H

Eau purifiée Aqua 15,00

Natrosol™ Plus 330 CS Cetyl Hydroxyethylcellulose 0, 50 Procédé de préparation:

1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal et commencer à chauffer à 75-80°C ;

2. A 30°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser tout en chauffant ;

3. Dans un bêcher à part, préparer la phase C, chauffer à 75- 80°C jusqu'à homogénéité ;

4. A 75°C, ajouter la phase C dans le récipient principal et homogénéiser pendant 10 minutes ;

5. Laisser refroidir la température et ajouter la phase D à 65°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;

6. Prémélanger la phase E avant de l'ajouter dans le récipient principal ;

7. Ajouter la phase E à 60°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;

8. A 35°C, prémélanger la phase F avant de l'ajouter et de bien mélanger ;

9. Prémélanger la phase G avant de l'ajouter dans le récipient principal ;

10. Ajouter la phase G à 35°C. Bien mélanger pour homogénéiser ;

11. Dans un bêcher à part, préparer la phase H: saupoudrer Natrosol™ dans l'eau à température ambiante et homogénéiser tout en chauffant à 60°C ;

12. Ajouter la phase H à 30°C. Bien mélanger pour homogénéiser ; 13. Arrêter à 25°C.

La composition se présente ainsi sous forme d'une crème beurre rose, avec un pH compris entre 4,90 et 5,40 et une viscosité (D0) de 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT/Spindle D/5 RPM/1 minute/25°C) .

Exemple 7: Sérum visage

Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w

Phase A

Eau purifiée Aqua Qsp 100 Propylène Glycol Propylène Glycol 35, 10

SD Alcohol 40B Absolute Alcohol 10, 00

Butylène Glycol Butylène Glycol 5,00

EDTA disodique Disodium EDTA 0,10

Phase B

Flexithix™ polymer PVP 2,00

Phase C

Gomme xanthane Xanthan Gum 0,25

Phase D

Sodium Polyacrylate (and) Hydrogenated

Rapithix™ A-60 polymer 1,00

Polydecene (and) Trideceth-6

Rokonsal™/LiquaPar™ MEP Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and)

0,70 préservâtive Ethylparaben (and) Propylparaben

Phase E

Extrait selon l'exemple 1 Water/Aqua (and) Glycerin (and) 5,00

Peucedanum Graveolens (Dil) extract

Phase F

Cyclopentasiloxane Cyclopentasiloxane 6,00

DM 350 Dimethicone 3,00

Dimethicone (and) Cyclopentasiloxane

Gransil* DMCM-5 1,50

(and) Polysilicone-11

Vinyl Dimethicone/Methicone

KSP* 100 1,00

Silsesquioxane Crosspolymer

Phase G

Unicert* Yellow 08006-J Water/Aqua (and) CI 15985 (Yellow 6) 0, 60

Procédé de préparation :

1. Dans un bêcher à température ambiante, peser les ingrédients de la phase A et mélanger. Saupoudrer la phase B et homogénéiser ;

2. A température ambiante, saupoudrer dans la phase C et continuer à homogénéiser l'ensemble ;

3. A température ambiante, ajouter la phase D à la phase ABC et continuer à homogénéiser ;

4. A température ambiante, ajouter la phase E et homogénéiser ;

5. A température ambiante, ajouter la phase F et homogénéiser l'ensemble ;

6. A température ambiante, ajouter la phase G et mélanger jusqu'à homogénéité ;

7. Arrêter à 25°C. La composition se présente ainsi sous forme d'un gel lisse, translucide, jaune crème, avec un pH compris entre 6,30 et 7,10 et une viscosité (DO) de 10000 - 15000 cps (Brookfield RVT/Spindle B/5 RPM/1 minute/25°C) .

Exemple 8 : Masque anti-âge

Procédé de préparation:

1. A 25°C, homogénéiser la phase A dans le récipient principal ; 2. A 25°C, saupoudrer dans la phase B et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;

3. A 25°C, ajouter la phase C et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;

4. Prémélanger la phase D dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal à 25°C ; 5. A 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et bien mélanger ;

6. Prémélanger la phase F et l'ajouter lentement. Bien mélanger bien jusqu'à homogénéité ;

7. Prémélanger la phase G dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal jusqu'à homogénéité ;

8. Arrêter à 25°C.

La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème avec des effets vert scintillant, avec un pH compris entre 5,30 et 5, 80 et une viscosité (D0) de 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25°C) .

Exemple 9 : Sérum

Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w

Procédé de préparation :

1. Ajouter de l'eau dans le récipient principal et de commencer le mélange avec une pale d'hélice hi-lo ;

2. Ajouter le reste des ingrédients, un après l'autre tout en mélangeant entre chaque addition. La composition se présente ainsi sous forme d'un sérum lisse, semi-opaque, avec un pH compris entre 5,75 et 6,25 et une viscosité (DO) de 1,100 - 1,400 cps (Brookfield RVT/spindle 3/20 rpm/25° C/l minute) .

Les compositions cosmétiques décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou améliorer l'hydratation cutanée.

On entend par « améliorer l'aspect de la peau » que le grain de la peau apparaît plus fin, la luminosité plus intense et le teint plus homogène.

Par « signes du vieillissement cutané » on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, les crevasses, les poches sous les yeux, les cernes, le flétrissement, la perte d'élasticité, de fermeté et/ou de tonus de la peau, mais également toutes modifications internes de la peau qui ne se traduisent pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement de la peau, ou toutes dégradations internes de la peau consécutives à des stress environnementaux tels que la pollution et les rayonnements UV.

On entend par « amélioration de l'hydratation cutanée », toutes améliorations des modifications de l'aspect extérieur de la peau dues à la déshydratation comme, par exemple, la sécheresse, les tiraillements et l' inconfort.