王剑英 (中国广东省深圳市南山高新区中区高新中一道生物孵化器大楼2-112室, Guangdong 7, 518037, CN)
CHEN, Jian (Room 2-112, Bio-incubator Building 2Gaoxinzhong One Road, New Technology Garden District, Nansha, Shenzhen Guangdong 7, 518037, CN)
陈健 (中国广东省深圳市南山高新区中区高新中一道生物孵化器大楼2-112室, Guangdong 7, 518037, CN)
深圳市绿微康生物工程有限公司 (中国广东省深圳市南山高新区中区高新中一道生物孵化器大楼2-112室王剑英, Guangdong 7, 518037, CN)
WANG, Jianying (Room 2-112, Bio-incubator Building 2Gaoxinzhong One Road, New Technology Garden District., Nansha, Shenzhen Guangdong 7, 518037, CN)
王剑英 (中国广东省深圳市南山高新区中区高新中一道生物孵化器大楼2-112室, Guangdong 7, 518037, CN)
CHEN, Jian (Room 2-112, Bio-incubator Building 2Gaoxinzhong One Road, New Technology Garden District, Nansha, Shenzhen Guangdong 7, 518037, CN)
| 1、 一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法， 其特征在于： 所述的方法包括如 下的步骤： 1) 获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上， 获得潮霉素抗性的重组质 粒; 2) 分别扩增青霉的脂肪酶基因（PEL )、 构巢曲霉的强启动子 3-磷酸甘油醛 脱氢酶启动子 （PgpdA )和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子 （Tt rpC ), 得 到有强启动子驱动的 PEL基因表达盒； 3) 将该 PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中， 获得了含潮霉素 筛选标记的 PEL基因超表达载体； 4) 将含潮霉素筛选标记的 PEL基因超表达载体转化工程农杆菌， 利用农杆 菌介导转化法将 PEL基因表达盒转化到青霉菌株中， 获得高表达脂肪酶 的青霉基因工程菌。 2、 根据权利要求 1所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法， 其特征在于： 所述的青霉菌为扩展青霉。 3、 根据权利要求 1所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法， 其特征在于： 所述的目标质粒为下列之一： pCAMBIA1 300、 pCAMBIA2300、 pCAMBIA3300或 pHB。 4、 利用权利要求 1 获得的高效表达脂肪酶菌株制备脂肪酶的方法， 其特 征在于： 所述的方法是将所述的青霉基因工程均以 5-20%接重量，接种到发酵培 养基， 在 25-35 °C、 200-300rpm条件下， 发酵 2天后， 经分离纯化得到所述的 脂肪酶。 5、 权利要求 4所述的脂肪酶在预防非酒精性脂肪肝中的应用。 6、 根据权利要求 5 所述的脂肪酶在预防非酒精性脂肪肝中的应用， 其特 征在于： 所述的应用包括通过药学上可以接受的载体， 将所述的脂肪酶与载体 结合， 通过可以接受的途径进入人体， 能够有效促进人体血液中胆固醇和甘油 三脂的分解， 达到预防非酒精性肝病的效果。 |
技术领域
本发明申请涉及高效表达扩展青霉脂肪酶的质 粒及其构建方法以及获得的脂肪 酶在预防非酒精性脂肪肝中的应用， 属于生物工程技术领域。
背景技术
近年来脂肪酶（Lipase EC )在工业应用方面取得了^艮大进展， 碱性脂肪酶具有 对底物水解效率高、 反应温和、 无毒、 能在一定条件下水解脂肪作用等优点， 已经在 洗涤剂、 造纸、 制革、 食品、 纺织及轻工业等领域得到广泛的应用， 并已经成为全世 界酶制剂市场上重要的品种。
通过对大量的微生物菌种进行选育，现在已经 获得了一种产碱性脂肪酶能力较强 的扩展青霉（P. expansium) 菌株， 并经过多年的诱变育种和发酵工艺改进， 其产脂 肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传 统的菌株育种方法主要依靠随机的理化 诱变， 目标不明确， 费时费力而且收效不明显， 目前通过这些方法来提高该菌株产脂 肪酶的能力已经非常有限、潜力小。 而采用基因工程的方法来获得高表达脂肪酶的 青 霉基于工程菌是能够解决上述问题的较好方法 。
脂肪性肝病包括酒精性脂肪性肝病和非酒精性 脂肪性肝病两大类，酒精性脂肪性 肝病是由于长期大量饮酒导致的肝组织学改变 ， 是以肝细胞脂肪变性为主的疾病。 非 酒精性脂肪肝 ( nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD )是一种无过量饮酒史， 由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细 胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临 床病理综合征。其病理变化随病程的进展而表 现有单纯性脂肪肝、高脂血症、高血压， 并被认为是代谢综合征在肝脏的一种病理表现 ， 是一种与胰岛素抵抗（ IR)和遗传易 感性密切相关的代谢应激性肝损伤， 疾病谱包括单纯性脂肪肝（NAFL)、 脂肪性肝炎 (NASH )及其相关肝硬化和肝细胞癌。 NASH最常见的症状是肥胖，最早被称为 "脂肪肝肝炎（fatty liver hepatitis )", 后改为 NASH。 根据所采用的肥胖定义， NASH病人有肥胖者占 40% ~ 100% , 另外， 2型糖尿病、 高血糖或糖耐量异常占 20% ~ 75% , 高脂血症占 20% ~ 81 %。
非酒精性脂肪肝的发病机制尚不了解， 脂质过氧化和氧化应激可能是其原因。 由 于缺乏长期、 前瞻性组织学随访研究， 故对其自然病史了解很少， 现有资料提示， 多 数 NASH为良性疾病， 但某些病人可发生肝硬化、 肝衰竭或肝细胞癌。 NASH尚无确实 有效的治疗方法， 但是建议肥胖病人减肥。 小范围研究证明， 几种药物似乎有一定疗 效， 但有待大样本临床随机试验加以证实， NASH引起的终末期肝病可考虑做肝移植。
高胆固醇血症和高脂血症是目前广泛存在于现 代人的一种综合病征，并且有逐渐 年轻化的趋势， 它也是高血压、 冠心病和糖尿病的重要的危险因素。 目前， 在临床上 缺乏针对高胆固醇血症和高脂血症的有效的治 疗手段和药物，常用药物的治疗效果也 不理想。
发明内容
本发明申请即是针对目前扩展青霉（P. expansium) 菌株表达脂肪酶的效率不高 的缺陷，提供一种构建高效表达脂肪酶质粒的 方法， 所述的质粒通过转化基因工程青 霉菌， 能够获得高表达的脂肪酶。
本发明申请的另一个目的是提供所述改型扩展 青霉脂肪酶在预防非酒精性脂肪 肝中的应用。
具体来说， 本发明申请提供一种获得高效表达脂肪酶菌株 的方法， 其特征在于： 所述的方法包括如下的步骤：
1. 获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上， 获得潮霉素抗性的重组质粒；
2. 分别扩增青霉的脂肪酶基因 （PEL)、 构巢曲霉的强启动子 3-磷酸甘油酸脱氢 酶启动子（PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止 子（TtrpC), 得到有强启动 子驱动的 PEL基因表达盒；
3. 将该 PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中 ， 获得了含潮霉素筛选 标记的 PEL基因超表达载体；
4. 将含潮霉素筛选标记的 PEL基因超表达载体转化工程农杆菌， 利用农杆菌介 导转化法将 PEL基因表达盒转化到青霉菌株中， 获得高表达脂肪酶的青霉基 因工程菌。
其中所述的青霉菌为扩展青霉。
所述的目标质粒为下列之一：
pCAMBIA1300、 pCAMBIA2300、 pCAMBIA3300或 pHB。
本发明申请还涉及将所述的青霉基因工程菌应 用于制备脂肪酶。
具体来说， 所述的制备方法是将所述的青霉基因工程均以 5-20%接重量， 接种 到发酵培养基， 在 25-35°C、 200-300rpm条件下， 发酵 2天后， 经分离纯化得到所述 的脂肪酶。
通常， 是将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬 液接入种子培养基在 25_35°C、 200_300rpm条件下培养 24小时后， 以 5%_20%接种量转入发酵培养基， 在 25-35°C、 150-300rpm条件下发酵 2天后， 经分离纯化得到所述的脂肪酶。
本发明中所用到的培养基如下：
PDA培养基（g/L): 马铃薯， 200; 蔗糖， 20; 琼脂， 15; PH自然；
MM培养基： IMK2HPO4-KH2PO4 (PH7.0) 10mL, M-N(MgS0 4 ·7Η 2 030g/L,NaCl 15g/L) 20mL， 1% CaCl 2 · 2H 2 0 lmL, 20% 葡萄糖 lOmL, 0.01%FeS0 4 lOmL, Spore element (ZnS0 4 · 7H 2 0 lOOmg/L, CuS0 4 · 5H 2 0 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnS0 4 · H 2 0 lOOmg/L, Na2Mo0 4 · 2H 2 0 lOOmg/L) 5mL， 20% NH4NO3 2.5mL, 无菌水 941.5mL; IM培养基： 1· 25MK- buffer (ΡΗ4.9) 10mL, M-N(MgS0 4 ·7Η 2 030g/L, NaCl 15g/L)
20mL， 1% CaCl 2 · 2H 2 0 lmL, 20% 葡萄糖 lOmL, 0.01%FeS0 4 lOmL, Spore element
(ZnS0 4 · 7H 2 0 lOOmg/L, CuS0 4 · 5H 2 0 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnS0 4 · H 2 0 lOOmg/L,
Na2Mo0 4 · 2H 2 0 lOOmg/L) 5mL， 20% NH4NO3 2.5mL, 50%甘油 10mL， 1M MES (PH5.5) 40mL， lOOmM AS (乙酰丁香酮） 2mL， 无菌水 898.7mL;
CM培养基： 加一半 IM培养基的葡萄糖量， 外加 1.5%琼脂， 其它成份同 IM培养 基；
种子培养基（％)： 黄豆饼粉 4, 玉米淀粉 0.8, Na NO30.3, Na 2 HP0 4 0.2, K 2 S0 4 0.25, MgS0 4 0.03, FeS0 4 0.003;
发酵培养基（％)： 黄豆饼粉 6, 玉米淀粉 1, NaN0 3 0.4, Na 2 HP0 4 0.2, K 2 S0 4 0.3, MgS0 4 0.035, FeS0 4 0.02, CaC0 3 0.5, Na 2 C0 3 0.02。
本发明申请的再一个目的是提供所获得的脂肪 酶在预防非酒精性脂肪肝中的应 用。
具体来说， 所述的应用包括通过药学上可以接受的载体， 将所述的脂肪酶与载 体结合，通过可以接受的途径进入人体， 能够有效促进人体血液中胆固醇和甘油三脂 的分解， 达到预防非酒精性肝病的效果。
附图说明
附图为超表达载体 PCHAMBIA2302:： PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明申请所述的能够 高效表达脂肪酶的质粒的构建方 法以及将得到的质粒转化基因工程青霉菌得到 高表达的脂肪酶， 进行进一步描述， 目 的是为了公众更好的理解本发明的技术内容， 而不是对所述技术内容的限制，事实上， 在本发明精神实质内， 对本发明申请所述方法的改进， 目标质粒和限制性内切酶的替 换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动 即可获得的，因此都在本发明申请所要 求保护的技术方案之内。
实施例一、 超表达载体的构建
采用如下的步骤：
( 1 ) 利用限制性内切酶 Sac I , Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒 PV2+上酶切 出来， 片段经凝胶回收， 克隆到 pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上， 获 得具有潮霉素抗性的重组质粒 PCHAMBIA2302 ;潮霉素表达盒也可来自其它 含该序列的任何 DNA或者直接合成， 用于构建 PEL基因超表达载体的质粒 除 pCAMBIA2300外， 还可用能在丝状真菌中表达的质粒如 pCAMBIA1 300、 PCAMBIA3300等 pCAMBIA系列载体和 pHB载体；
( 2 ) 根据扩展青霉菌 Ρ· / δ ' 的脂肪酶基因 PEL ( AF330635 )的序列设计 引物 （正向引物： TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下划线的序列为 限制性酶 Spe l切点； 反向引物： TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下 划线的序列为限制性酶 Not I切点）， 利用 PCR技术扩增全基因序列， PCR 反应条件为： 95 °C 5min; 95 °C 30s, 56 °C 30 s, 72 °C 90s, 35个循环； 72 °C l Omin;
( 3 ) 根据质粒 pPAN7- 1 (Punt et a l . 1987 Gene 56: 117-124)的序列设计引物（正 向引物： GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA , 下划线的序 列 为 限 制 性 酶 Not I 切 点 ； 反 向 引 物 ： GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC , 下划线的序列为限制性酶 Pme I 切点；)，利用 PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子 Tt rpC , PCR反应条件为： 95 °C 5min; 95 °C 30 s, 56 °C 30s, 72 °C 60s, 35个循环； 72 °C l Omin; (4) 取 （ 2 ) 和 （ 3 ) 的反应液各 1 μ L 作为模板， 以 （ TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT ) 作 为 正 向 引 物 ； 以 ( GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC )作为反向引物， 进行 PCR扩增， PCR 的反应条件为： 95°C 5min; 95 °C 30s, 56 °C 30s, 72 °C 150s, 35 个循环； 72°C 10min o 反应结束后， 将 PCR扩增产物进行凝胶柱回收， 并 克隆到 PMD-18-T:载体， 获得中间载体 PMD-18-T:： PEL-TtrpC;
( 5 ) 才艮据质粒 pPAN7- 1 (Punt et al.1987 Gene 56: 117-124的序列设计引物（正 向引物： GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶 Not I 切点； 反向引物： GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的 序列为限制性酶 Pme I切点）利用 PCR技术扩增强启动子 PgpdA。 PCR反 应条件为： 95°C 5min; 95 °C 30s, 56 °C 30s, 72 °C 150s, 35个循环； 72 °C 10min。 利用限制性内切酶 Sal I 和 Spe I 将 PgpdA 克隆到载体 PMD-18-T:： PEL-TtrpC 的 相 应 位 点 ， 获 得 中 间 载 体 PMD-18-T:： PgpdA-PEL-TtrpC;
( 6 ) 利用限制内切酶 Sal I和 Pme I对载体 PMD-18-T:： PgpdA-PEL-TtrpC进行 消化，回收表达盒 PgpdA_PEL_TtrpC,然后克隆至 pCHAMBIA2302相应位点， 获得最终载体 PCHAMBIA2302:： PgpdA-PEL-TtrpC, 整个的构建过程如图 1 所示；
(7) 对含有最终载体 pCHAMBIA2302:： PgpdA_PEL_TtrpC 的菌进行扩大培养， 并抽提质粒， 利用冻融法转化工程农杆菌 EHA105, 随机挑选 6株转化子， 以 （ TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT ) 作 为 正向 引 物 ； 以 ( TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC ) 作为反向 引 物， 以载体 PMD-18-T:： PEL-TtrpC为阳性对照， 空 EHA105为阴性对照， 对这 6株菌进 行 PCR鉴定， 结果显示这 6株菌均为阳性。
实施例二、 青霉基因工程菌的获得
所述青霉基因工程菌的活动包括如下的步骤：
( 1 ) 挑取分离纯化后的野生型青霉接种于 PDA平板上，于 28°C培养 20天左右， 用无菌水洗下成熟孢子；
(2) 将实例一中含终载体 CHAMBIA2302:： PgpdA-PEL-TtrpC 的工程农杆菌 EHA105接种于含有链霉素、 卡那霉素（均为 100 μ g/ml )的 LB液体培养基 中 28°C, 200rpm过夜培养， 用含有链霉素和卡那霉素 （均为 100 μ g/ml ) 的 MM培养基重新活化， 28 °C, 220rpm培养 48 小时。 吸取适量的培养物 5000rpm离心去上清， 并用 IM液体培养基洗涤， 最后用 IM液体培养基稀 释至 OD600=0.15, 然后在 28°C, 220rpm 的条件下培养 6-8 小时， 至 OD600=0.5-0.6;
( 3) 将第 （ 1 ) 步得到的新鲜孢子配制成 1 X 10 7 个 /mL浓度的悬浮液， 随后取 上述孢子悬液与步骤（2) 中的工程农杆菌等体积混合， 取 200 均匀涂 布到铺有玻璃纸的 IM固体培养基（含 AS 200 μ § )之上， 28°C共培养 60h, 然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素 （lQQ g/mL 转化选择抗生素）、 头 孢菌素（ 500 μ g/mL, 抑制农杆菌生长抗生素）的 PDA培养基上 28°C培养 2 天， 揭下玻璃纸， 在 28°C条件下培养 1-3天， 将抗潮霉素的转化子挑出接 种到二筛培养基上， 如稳定传代， 即是所述的青霉基因工程菌， 如此获得 了 30株青霉基因工程菌。 随机挑选 5株转化子进行扩大培养， 并分别抽提 基因组 DNA, 以 ( TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT )作为正向引物； 以 （ GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC ) 作为反向引物， 以载体 PMD-18-T:： PEL-TtrpC为阳性对照， 野生型青霉基因组 DNA为阴性对照， 对这 5株菌进行 PCR鉴定， 结果显示这 5株菌均为阳性。
匪培养基的成分如下所述：
1M K 2 HP0-KH 2 P0 4 (PH7.0) lOmL, M-N ( MgS0 4 . 7H 2 030g/L, NaCl 15g/L) 20mL， 1% CaCl 2 · 2H 2 0 ImL, 20% 葡萄糖 lOmL, 0.01%FeS0 4 lOmL, Spore element (ZnS0 4 · 7H 2 0 lOOmg/L, CuS0 4 · 5H 2 0 lOOmg/L, H 3 B0 3 lOOmg/L, MnS0 4 · H 2 0 lOOmg/L, Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 lOOmg/L) 5mL， 20% NH 4 N0 3 2.5mL, 无菌水 941.5mL。
IM培养基的成分如下所述：
1M K— buffer (ΡΗ4.9) lOmL, M-N ( MgS0 4 .7H 2 0 30g/L, NaCl 15g/L) 20mL， 1% CaCl 2 · 2H 2 0 ImL, 20% 葡萄糖 lOmL, 0.01%FeS0 4 lOmL, Spore element (ZnS0 4 · 7H 2 0 lOOmg/L, CuS0 4 · 5H 2 0 lOOmg/L, H 3 B0 3 lOOmg/L, MnS0 4 · H 2 0 lOOmg/L, Na 2 Mo0 4 · 2H 2 0 lOOmg/L) 5mL， 20%丽 4 N0 3 2.5mL， 50%甘油 10mL， IM MES (PH5.5) 40mL， lOOmMAS (乙 酰丁香酮） 2mL， 无菌水 898.7mL
CM培养基： 加一半 IM培养基的葡萄糖量， 外加 1.5%琼脂， 其它成份同 IM培养 基。
PDA培养基（g/L): 马铃薯， 200; 蔗糖， 20; 琼脂， 15; PH自然。
实施例三、 所述脂肪酶防治大鼠非酒精性脂肪肝实验研究
一、 试验材料
1. 受试药物及试剂
脂肪酶（ZFM)受试药， 0.4g/粒， 每瓶 40粒， 每人每次 3 ~4粒， 一日 3次， 由中 国医药工业科研开发促进会提供， 批号： 081223。 成人（以 60Kg体重计算） 日用药 量为 4800mg, 即人每日每千克体重用量为 80mg/kg。 实验时先用适量吐温研磨， 再用 0.5%的羧甲基纤维素钠 （CMC)按设计浓度配制。
阳性药： 易善复（多婦磷脂酰胆碱胶嚢）， 228mg/粒， 2粒 /次， 3次 /d, 24粒 / 盒。 塞诺菲安万特（北京）制药有限公司， 批号： D8139, 国药准字： H20059010。 实 验时先用适量吐温研磨， 再用 0.5%的羧甲基纤维素钠 （CMC)按设计浓度配制。
胆固醇（分析纯级），成都科龙化工试剂厂， 批号： 20071229; 吐温 -80(化学纯）， 成都科龙化工试剂厂，批号： 20050402;胆酸钠（ Sodium Taurochlate ),上海 Solarbio, 批号： 20060826; 丙硫氧嘧啶片， 50mg/片 X100片 /瓶， 上海复星朝晖药业有限公司， 批号： 071105, 国药准字 H31021082, 1， 2丙二醇（分析纯）， 天津市大茂化学试剂厂， 批号： 20051128; 羧甲基纤维素钠， 上海三浦化工有限公司， 批号： 20010911。
2. 实验分组及剂量设计
剂量分组见表 1
表 1大鼠脂肪肝试验剂量与分组
~^ ~~ 剂 量 给 药 给药体积 约等效于成人临
(mg/kg) 途径 （ml/kg) 床剂量倍数 空白组 一一 灌胃 10 —一 模型组 一一 灌胃 10 —一
ZFM剂量组 500 灌胃 10 1倍 易善复组 125 灌胃 10 1倍 注： 因提供的 ZFM试验药按照给药周期不免设置三个剂量组， 仅能设置一个剂量。
3. 实验动物及场地
SD大鼠， 雌雄各半， 体质量 230-250g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司 提换；
实验场地： 成都地奥制药集团有限公司新药部药理实验室 。
4. 主 器
LD2-5医用离心机， 北京医用离心机厂； SHA-C恒温振荡器， 常州国化电器有限 公司； TMS-1024 i 全自动生化分析仪， 日本国东京医疗公司； BP221 型电子天平， SARTOR丽。
5. 统计方法
用 SPSS11. 5统计软件进行统计分析。 以 （X士 s )表示结果的数据用单因数方差 分析进行组间比较， 肝病理组间差异的显著性检验运用非参数检验 分析方法。
二、 实验方法及结果
1. 实验方法
取 SD大鼠， 体重 230 ~ 250g, 64只， 雌雄各半， 随机分为 4组， 每组动物 16 只。 将大鼠适应性饲养 3天后， 每天上午各组大鼠分别按表 1设计剂量给药， 空白组 给予相应的 CMC混悬液；下午除空白组外，其余各组大鼠分 别灌胃给予高脂乳液（20% 猪油、 8%胆固醇、 1. 2%胆酸钠和 0. 6%丙硫氧嘧啶） lml/ 100g。 于第 4周后末次给药 后禁食 16小时（不禁水）， 眼眶取血， 离心并分离血清， 动态测定给药 4周后的血清 生化指标。
于第 6周后末次给药后禁食 16小时（不禁水）， 称取大鼠体重， 股动脉取血， 离心并分离血清， _30 °C低温保存， 待测血清中的生化指标； 另摘取肝脏并称重， 观 察大体外观后， 每只大鼠在相同部位切下 2g肝组织置于预冷的生理盐水中制成 10% 肝匀浆， 4 °C静置 48h后， 10000r/min, 离心 20min, 取上清液， 用全自动生化仪测 定肝组织内甘油三酯的含量； 另取肝左叶 1块放于 10%中性福尔马林溶液， 待作肝组 织病理学检查（固定后， 石蜡包埋， 切片作 HE染色）。
2. 实验结果
2. 1 常舰察
实验期间空白组动物活动、 饮食正常、 皮毛光亮整洁、 体重持续增长， 其余各 组在灌胃给予高脂乳液两周后逐渐出现不同程 度的精神萎靡、 活动减少、体重增加緩 慢、 无力、 蜷缩、 饮食减少、 皮毛凌乱、 萎黄等。
2.2体重 f脏器系数测定
结果提示， 灌胃给予高脂乳液一定周期后， 模型对照组体重增加緩慢， 和空白 对照组比较有显著性差异（ **P<0.01 ), ZFM剂量组和易善复组在给药前 4周均有抵 抗大鼠体重增加緩慢的作用趋势， 但无统计学意义。
另脂肪肝模型大鼠的肝脏指数较空白组明显升 高 （**P<0.01 ); ZFM剂量组和易 善复组均有降低脂肪肝模型大鼠的肝脏器系数 的作用趋势， 但无意义。 结果见表 2 表 2 脂肪酶对大鼠脂肪肝体重及肝脏器系数的影响 （X士 S )
体 重 肝脏器系数 组 别 剂量 (肝重 /体重 *100) 给药前 给药 1周 给药 4周 给药 6周 空白对照组 —— 193±18 207 ±46 258 ± 57** 283 ± 57** 3· 0 ± 0· 17** 模型对照组 —— 196±16 201 ± 36 218士 32 230 ± 36 3.32 ± 0· 19
ZFM剂量组 500mg/kg 193 ±18 205士 35 234士 32 232士 30 3.29士 0· 19 易善复组 125mg/kg 199 ±17 212士 35 231 ±22 228士 32 3.30 ±0· 23
注： 和模型组比较， *P<0.05, **p<o.
2.3血清中 ALT、 AST的含量动态测定 结果见表 3
表 3 脂肪酶对大鼠脂肪肝血清中 ALT、 AST的含量的影响 （X±S )
ALT (U/L) AST (U/L) 组 别 剂量 动物 （只）
给药 4周 给药 6周 给药 4周 给药周 空白对照组 —— 16 34· 8 ±7.6** 38.9 ±13.4** 130 ±19 150 ±16 模型对照组 —— 16 65· 4 ±10· 6 65.1 ±13.1 139 ±19 102 ±17 ZFM剂量组 500mg/kg 16 56.0 ± 13.4* 54.8 ± 13.4 137 ± 1斗 9斗 ±20 易善复组 125mg/kg 16 54· 4 ±7· 6* 52· 9 ± 17· 1: 141士 18 98 ± 10 注： 和模型组比较， *P<0.05, **p<0.01.
ALT主要存在于肝细胞浆内， 肝内该酶的活性比血清高 100倍， 是最敏感的肝功 能检测指标之一。 AST在心肌中含量最高， 肝脏为第二位， AST主要分布肝细胞的线 粒体中， 在发生肝损伤时， 其漏出量较 ALT低。
当急性肝炎和慢性肝炎和轻型，虽有肝细胞的 损伤，肝细胞的线粒体仍保持完整， 故释放入血的只有存在于肝细胞浆内的 ALT, 故 ALT升高明显； 重型肝炎和慢性肝炎 的中型和重型， 肝细胞的线粒体也遭到了严重的破坏， AST从线粒体和胞浆内释出， SAT也明显升高。
结果提示， 在给予高脂乳液 4周， 6周后， 脂肪肝模型大鼠血清中 ALT的活性明 显较空白组明显升高 （ **P<0.01 ); 与模型对照组相比， ZFM剂量组及易善复组均能 明显降低模型大鼠 ALT活性（ *P<0.05 ), 表明 ZFM具有一定的降酶作用。
但脂肪肝模型大鼠血清中 AST未明显升高，原因可能为我们通过高脂乳液 造成的 非酒精性脂肪肝模型， 该模型程度较轻， 肝细胞的线粒体末遭到严重的破坏。
2.4 肝脏肉眼大体外观变化情况
空白组肝脏肉目艮观察呈鲜红色， 边缘锐利， 表面光滑。 脂肪肝模型对照组肉眼见 肝脏体积增大， 边缘变钝， 颜色呈奶黄色， 切面油腻状， 有明显脂肪颗粒， 提示病变 基础是肝细胞脂肪积聚； ZFM给药组织和易善复组肝脏肉眼观察有部分肝 脏呈鲜红色。
2.5 肝组织内甘油三酯的含量 结果见表 4
表 4 脂肪酶对脂肪肝大鼠肝组织内 TG的影响 （ X士 S ) 组别 剂量 动物 （只） 肝组织内甘油三酯
( mmol/L ) 空白对照组 —— 16 1.03 ± 0.31** 模型对照组 —— 15 1.87 ± 0.29
ZFM剂量组 500mg/kg 16 1· 42 ± 0.32** 易善复组 125mg/kg 15 1.63 ± 0.30 注： 和模型组比较， *P<0.05, **p<0.01. 脂肪肝主是甘油三酯大量堆积于肝脏所致的一 种病理改变， 因此测定肝组织中甘 油三酯的含量尤为重要， 结果表示， 非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞内甘油三酯含量明 显 升高， 与空白组比较， 差异有高度显著性（**P<0.01 ), ZFM 剂量组及易善复组， 均 能显著降低大鼠肝组织内甘油三酯的含量（ *P<0.05 ),表明 ZFM有一定的降低大鼠肝 脂肪变性的作用。 2.6 肝组织病理学分析 (HE 染色， 100 X )
表 5 肝组织病理损伤判断标准
病理组织学改变 分 级 评分值 无肝细胞变性， 无 - 0
水肿变性
(炎细胞浸润 肝细胞肿胀， 体积增大， 细胞间尚有界限， 轻度损伤 + 1 窦扩张充血） 胞浆淡染。 细胞明显肿胀， 细胞间界限不清， 胞浆淡染。 中度损伤 ++ 2 气球样变， 细胞膨大如气球， 胞浆变得较为 重度损伤 +++ 3 透明。 表示正常 无 - 0 脂肪变性
肝细胞内的脂肪空泡较小， 且散在。 轻度损伤 + 1 肝细胞内的脂肪空泡变大， 范围较宽。 中度损伤 ++ 2 脂肪空泡融合为大空泡， 将细胞核挤向胞膜 重度损伤 +++ 3 下， 状似脂肪细胞。 坏死 表示没有坏死 无 - 0 点状坏死， 肝小叶内可有散在的肝细胞坏死， 轻度损伤 + 1 每个坏死灶仅累及单个或几个肝细胞。 碎小片状坏死， 肝细胞呈灶状坏死， 崩解。 中度损伤 ++ 2 有大片溶解灶性坏死。 重度损伤 +++ 3 纤维化组织增生 没有增生 无 - 0 仅有纤维细胞及少许纤维组织增生， 正常肝 轻度损伤 + 1 小叶结构隐约可见。
有明显的纤维组织增生， 正常肝小叶结构不 中度损伤 ++ 2 明显， 但尚未形成明显假小叶。
有大量组织增生， 将细胞围成小块呈小岛状, , 重度损伤 -++ 3 表 6 肝病理分级结果（表中数为例数） 组别 水肿变性 脂肪变性 坏死 纤维化
0 + ++ +++ 0 + ++ +++ 0 + ++ +++ 0 + ++ +++ 空白组 15 1 0 0 13 3 0 0 15 1 0 0 16 0 0 0 模型组 13 2 0 0 0 2 8 5 12 3 0 0 15 0 0 0
ZFM & 14 2 0 0 3 6 5 2 12 3 1 0 16 0 0 0 易善复组
脂肪酶对脂肪肝大鼠肝脏病理的影响
剂 量 水肿变性 脂肪变性 肝细胞坏死 纤维化组织增生组 别
( mg/kg ) (平均记分值） （平均记分值） （平均记分值） （平均记分值） 空白对照组 0. 063 0. 19 0. 06 模型对照组 0. 133 2. 20 0. 2 ZFM剂量组 500 0.125 1.38* 0.31 0 易善复组 125 0.067 1.33* 0.13 0 注： 与模型组比较： *P<0.05, **p<0.01
由表 6表 7可知， 模型组与空白对照组比较， 出现了肝细胞的脂肪变性， 经非参 数检验， 具有极显著性差异（**P<0.01 ), 表明造模成功； 与模型组比较， 脂肪酶剂 量组及易善复组均可显著降低肝脂肪变性程度 （ *P<0.05 ),表明脂肪酶具有一定的降 低脂肪肝大鼠脂肪变性的作用。
本次实验研究旨在通过高脂乳液灌胃大鼠， 造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型， 考查该试验药对大鼠非酒精单纯性脂肪肝的防 治作用， 实验结果表明，模型对照组与 空白对照组比较， 肝脏器系数、 ALT活性、 肝组织甘油三酯含量均显著升高， 同时肝 病理也显示出现了一定的脂肪变性，按照专业 委员会的诊断标准， 该模型属于非酒精 单纯性脂肪肝模型； 脂肪酶剂量组和模型对照组比较， 可显著降低 ALT活性及肝组织 甘油三酯含量， 同时也可减轻肝脂肪变性的程度。
Next Patent: METHOD AND APPARATUS FOR IMPROVED INTRA PREDICTION MODE CODING