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Title:
METHOD FOR OBTAINING A SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD)-CONCENTRATED PROTEIN EXTRACT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/107850
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for obtaining a superoxide dismutase (SOD)-concentrated protein extract having a specific activity of at least 700 UI/mg protein, said method comprising a single step of extraction from a plant selected from any species of the Plumbaginaceae family.

Inventors:
MAGNE, Christian (17 rue Brahms, Brest, 29200, FR)
BEN HAMED, Karim (Résidence "Fell", Appartement 3 Jardins El Menzah 2Ariana, 2094, 2094, TN)
Application Number:
EP2015/081303
Publication Date:
July 07, 2016
Filing Date:
December 28, 2015
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE (3 rue des Archives, Brest, Brest, 29200, FR)
International Classes:
A61K38/44; A23C19/04; A61P9/00; A61P25/28; A61P29/00; A61P39/06; A61Q19/08
Foreign References:
FR2747044A11997-10-10
EP2722075A12014-04-23
EP0207039A11986-12-30
FR2729296A11996-07-19
FR2747044A11997-10-10
EP2747044A12014-06-25
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Attorney, Agent or Firm:
REGIMBEAU (20 rue de Chazelles, Paris Cedex 17, Paris Cedex 17, 75847, FR)
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Claims:
R E V E N D I C A T I O N S

1 . Procédé d'obtention d'un extrait protéique concentré en superoxyde dismutase (SOD) ayant une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg de protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une seule étape d'extraction protéique à partir d'une plante choisie parmi l'une quelconque des espèces de la famille des Plombaginacées.

2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la plante est choisie dans le groupe consistant en les genres Limonium et Armeria.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la plante est choisie dans le groupe consistant en les espèces Limonium latifolium, Limonium normannicum, Limonium vulgare, Limonium tunetanum , Limonium densiflorum, Limonium pruinosum, Limonium delicatulum, Limonium spathulatum, Limonium boitardii et Armeria maritima.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'extraction est réalisée à partir des parties aériennes de la plante, de préférence à partir des feuilles.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la seule étape d'extraction comprend la récupération d'une phase liquide après la mise en contact d'un solvant avec ladite plante, ledit solvant étant de préférence un solvant aqueux.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'extraction est réalisée en absence de solvants organiques choisis dans le groupe comprenant les alcools, les solvants aromatiques, les solvants carbonylés, les esters, les nitriles, les solvants halogénés et les solvants éther-oxydes.

7. Extrait protéique de plante concentré en SOD ayant une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg de protéines, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.

8. Extrait protéique selon la revendication 7 comprenant de l'ordre de 50000 à 200000 Ul/g, de préférence de l'ordre de 100000 à 150000 Ul/g d'extrait sec, ou, en poids, environ 1 à 4%, de préférence 2 à 3% de superoxyde dismutase dans l'extrait sec.

9. Composition cosmétique ou pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait selon la revendication 7 ou 8 et un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, respectivement.

10. Composition alimentaire ou nutraceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait protéique selon la revendication 7 ou 8 et un additif alimentaire ou un véhicule nutraceutiquement acceptable, respectivement.

11. Composition selon l'une quelconque des revendication 9 ou 10 comprenant de 0,1% à 20%, plus particulièrement de 0,1% à 10%, encore plus particulièrement de 0,5% à 5%, en particulier de 1 à 3% de superoxyde dismutase en poids par rapport au poids total de la composition.

12. Utilisation cosmétique d'un extrait protéique selon la revendication 7 ou 8 ou d'une composition selon la revendication 9 ou 11 en tant qu'agent cosmétique antioxydant, en particulier pour lutter contre le vieillissement de la peau et/ou des phanères et/ou la protection anti-UV.

13. Utilisation d'un extrait protéique selon la revendication 7 ou 8 ou d'une composition selon la revendication 10 ou 11 pour la préparation de fromages et/ou la conservation de produits laitiers.

14. Extrait protéique selon la revendication 7 ou 8 ou composition selon la revendication 9 ou 11 en tant que médicament.

15. Extrait protéique ou composition selon la revendication 14 pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies choisi dans le groupe comprenant : les maladies psychiatriques, de préférence la schizophrénie ;

les maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson ;

les maladies cardiovasculaires, de préférence l'infarctus du myocarde ou l'athérosclérose ;

les maladies inflammatoires, de préférence la maladie de Crohn ou l'arthrite rhumatoïde ;

les maladies chroniques, de préférence le diabète, et

les maladies cancéreuses, de préférence choisies dans le groupe comprenant le cancer de la peau, le cancer du sein, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'estomac, le cancer du foie, le cancer du côlon et le cancer des poumons.

Description:
PROCEDE D'OBTENTION D'UN EXTRAIT P ROTE I QUE CONCENTRE EN SUPEROXYDE

DISMUTASE (SOD)

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait protéique concentré en superoxyde dismutase (SOD) ainsi que l'extrait obtenu par ce procédé et son utilisation.

La présente invention concerne également une composition comprenant l'extrait obtenu par le procédé de l'invention.

Les superoxyde dismutases (SOD) sont des protéines enzymatiques qui possèdent une puissante action antioxydante contre les espèces oxygénées réactives (EOR) générées chez les organismes vivants (animaux comme végétaux) par tout type de stress environnemental ou lors du vieillissement naturel. Catalysant l'élimination des premières espèces oxygénées formées (les superoxydes) suite à la réduction de l'oxygène, les SOD constituent donc la première ligne de défense contre ces EOR, lesquelles sont fortement impliquées dans diverses maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, de Parkinson), l'athérosclérose, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et certains cancers (Campana et al. , 2004 ; Valdivia et al. , 2009).

Les SOD sont des métalloprotéines, qui renferment dans leur site actif des atomes de Cu/Zn, de Mn ou de Fe. Ces métaux jouent un rôle important dans le mécanisme d'action des SOD. Par exemple, pour la SOD Cu/Zn, le Cu 2+ est tout d'abord réduit par le radical superoxyde (0 2 " ) qui est ainsi détoxifié en oxygène. Le cuivre réduit cède ensuite un électron à une nouvelle molécule de superoxyde qui, en présence de deux protons, génère H 2 0 2 , beaucoup moins toxique que 0 2 ' " .

En raison de leur capacité anti-oxydante, les SOD sont très largement utilisées dans différents domaines :

En cosmétologie, les SOD permettent de protéger la peau et les cheveux en maintenant l'intégrité de la structure kératinique naturelle (FR 7331354).

Des expériences conduites au Centre Hospitalier Universitaire de Besançon (France) ont démontré que la supplémentation en SOD prépare la peau de l'Homme à l'exposition au soleil (Annual Congress for Dermatological Research, Brest, France, May 2005).

Dans l'Industrie pharmaceutique, des formulations médicamenteuses à base d'extraits riches en SOD (exemple orgotéine) ont été proposées pour abaisser le niveau des EOR fortement impliquées dans diverses maladies neurodégénératives ou inflammatoires. En outre, une formule végétale bioactive par voie orale, constituée d'un extrait de melon (Cucumis melo) riche en SOD (Vouldoukis et al. , 2004) couplé à une molécule de gliadine, protéine extraite du blé (Menvielle-Bourg, 2005), a été proposée : Superoxyde dismutase Gliadine (GliSODine) (FR 2729296). Ce complément alimentaire est particulièrement approprié pour lutter contre la surproduction de radicaux libres, notamment lorsque les défenses naturelles de l'organisme sont affaiblies : sujets âgés, exposition solaire, tabagisme, stress, exercice physique intense, etc. I l permet de prévenir certaines affections chroniques impliquant un stress oxydatif ou de freiner leur évolution, améliorant ainsi les conditions de vie du patient.

Dans l'industrie alimentaire, des extraits végétaux riches en SOD (exemple PROMUTASE™ 200, à base de melon) sont incorporés dans des aliments destinés aux animaux de sport comme les chevaux de course ou les pigeons voyageurs pour augmenter leur résistance aux efforts intenses. Les mêmes extraits sont incorporés à des aliments avant et au cours du transport de poissons et de crustacés d 'élevage (crevettes, alevins, truites, saumons, etc. ) afin de réduire le taux de mortalité pendant ce transport.

Pour améliorer la qualité du lait produit, des extraits riches en SOD (exemple PROMUTASE™ R) sont introduits dans l'alimentation des femelles d'élevages laitiers (vaches, chèvres, etc).

Les extraits riches en SOD entrent dans certaines formulations alimentaires pour améliorer les performances de croissance des poulets et des dindes de chair, animaux souvent confrontés à des déséquilibres digestifs mal maîtrisés. Les SOD peuvent être d 'origines très diverses: animale (par exemple bovine ou porcine), humaine (par exemple placentaire ou sanguine), microbienne (par exemple bactéries ou levures), etc.

Elles peuvent être également issues du génie génétique ou de la synthèse chimique. Plusieurs SOD sont d 'origine végétale (champignons, algues, épinards, céréales, fruits et légumes, etc. ).

Parmi les différents végétaux, une variété de melon (Cucumis melo) est riche en SOD (Vouldoukis et al. , 2004). Cette variété de melon est caractérisée par des graines résistantes qui ont un pouvoir germinatif important, ainsi que par des fruits à vieillissement ralenti (protégés des effets des radicaux libres). De ce qui précède, il apparaît clairement que le rôle des SOD dans la diminution du stress oxydatif est très important.

En outre, vue sa large utilisation dans différents domaines de l'industrie, il y a un très grand intérêt à rechercher de nouvelles sources naturelles hyperproductrices de cette protéine ayant une forte activité spécifique.

La SOD étant une protéine fragile, il est nécessaire de disposer de procédés permettant de l'obtenir en grande quantité ou mieux encore, en quantité moins importante mais avec une forte activité spécifique, sans pour autant augmenter l'utilisation de composés chimiques susceptibles d'altérer la fonctionnalité de cette protéine et de diminuer son activité spécifique.

La SOD peut être obtenue simplement par extraction protéique à partir des végétaux la comprenant en grande quantité et ayant une grande activité spécifique. Il est préférable que de tels procédés d'extraction de SOD n'impliquent pas l'utilisation d'une multitude de solvants, notamment des solvants organiques, qui nécessitent la mise en œuvre d'étapes supplémentaires de purification et dégradent une partie de la SOD.

En outre, il est à noter que, dans la majorité des cas, l'extraction de SOD à partir des végétaux se fait par des procédés d'extraction qui comprennent une étape d'enrichissement en SOD. Les procédés d'extraction de SOD connus actuellement nécessitent la réalisation de plusieurs étapes avant l'obtention d'un extrait fortement concentré en SOD ayant une forte activité spécifique. Un tel procédé est décrit par exemple dans la demande de brevet FR 2 747 044, ledit procédé comprenant outre l'étape d'extraction, une étape de purification du filtrat obtenu par extraction avec un agent de précipitation permettant d'augmenter l'activité spécifique de SOD dans l'extrait final. L'activité enzymatique de la SOD dans l'extrait après l'étape d'extraction est de 1482 Ul/g. Cet extrait est obtenu à partir de plantes céréalières, de plantes légumineuses et de plantes oléagineuses.

Ainsi, l'inconvénient principal de ces procédés en plusieurs étapes est leur coût élevé et leur durée de réalisation souvent longue. En particulier, pour obtenir une SOD ayant une activité spécifique élevée, une étape supplémentaire de purification incluant typiquement une étape de précipitation est systématiquement réalisée. Ainsi, ces procédés en plusieurs étapes sont difficilement transposables à grande échelle et nécessitent souvent l'utilisation de plusieurs réactifs chimiques, dont des solvants, lesquels doivent être éliminés de l'extrait, ce qui n'est pas toujours facilement réalisable et augmente le coût du procédé.

II existe donc un besoin de disposer de nouveaux procédés d'obtention de SOD ayant une forte activité spécifique, dont la mise en œuvre est simple et rapide et le coût est bas. Outre l'activité spécifique élevée de SOD, les extraits obtenus doivent être propres, c'est-à-dire dépourvus des réactifs chimiques qui ont été nécessairement utilisés lors du processus d'extraction, ce qui permettra d'optimiser l'utilisation de ces extraits notamment en alimentation humaine et animale. Il est également souhaitable que l'extrait obtenu par ces procédés contienne d'autres substances actives bénéfiques, naturellement présentes dans les végétaux, tels que les polyphénols qui ont des propriétés antioxydantes.

La présente invention a donc pour but de mettre en œuvre un procédé d'extraction de SOD ayant une très forte activité spécifique. Ce procédé est simple, rapide, peu coûteux ; il permet l'obtention d'un extrait dépourvu de réactifs chimiques, il contient d'autres substances naturelles ayant un effet bénéfique et il pallie ainsi les inconvénients des procédés d'extraction de SOD connus dans l'art antérieur.

Les Inventeurs ont découvert de manière surprenante que les extraits protéiques obtenus à partir des espèces d'une famille de végétaux littoraux sont tellement riches en activité SOD qu'une simple extraction aqueuse à partir de la plante broyée, sans ajout d'autres solvants (par exemple, des solvants alcooliques) et sans étapes de purification supplémentaires, est suffisante pour obtenir des extraits où l'activité spécifique de SOD est d'au moins 700 Ul/mg de protéines. Ce niveau dépasse très largement le niveau le plus élevé (126 Ul/mg) rapporté jusqu'à présent dans la littérature pour une variété de melon (Vouldoukis et al. , 2004) considérée comme référence parmi les sources naturelles de SOD.

Ainsi, les Inventeurs ont mis en œuvre un procédé simple d'extraction de SOD, dont le coût est bas et qui permet d'obtenir des extraits protéiques très actifs en SOD dépourvus de réactifs chimiques fréquemment utilisés dans les procédés d'extraction conventionnels et qui contient d'autres substances naturelles ayant un effet bénéfique, palliant ainsi les inconvénients des procédés d'extraction végétale de SOD de l'art antérieur.

Un premier objet de la présente invention concerne donc un procédé d'obtention d'un extrait protéique concentré en superoxyde dismutase (SOD) ayant une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg de protéine comprenant une seule étape d'extraction protéique à partir d'une plante choisie parmi l'une quelconque des espèces de la famille des Plombaginacées.

Au sens de la présente invention, le terme « procédé d'extraction » ou « extraction » signifie la mise en œuvre d'un ensemble d'étapes permettant d'obtenir un extrait protéique à partir d'une source, de préférence une source végétale, lesdites étapes comprenant au moins une étape de récupération d'une phase liquide après la mise en contact (dans des conditions appropriées) du solvant avec ladite source, puis une étape de purification comprenant une étape de précipitation, afin d'obtenir l'extrait protéique recherché.

Ainsi, au sens de la présente invention, l'expression « en une seule étape d'extraction » signifie qu'une seule étape est réalisée parmi les étapes citées ci-dessus, à savoir la récupération de la phase liquide après la mise en contact du solvant avec la source, de préférence la source végétale. De manière préférée, le procédé d'extraction protéique selon la présente invention ne comprend donc pas d'étapes de purification de la protéine SOD et/ou d'étapes d'enrichissement en protéine SOD.

Au sens de la présente demande, le terme « activité spécifique » désigne l'activité SOD rapportée à la quantité de protéines, c'est-à-dire l'activité des SOD dans l'extrait protéique.

Les Inventeurs ont découvert qu'en moyenne, les extraits directement obtenus (sans étapes de purification et/ou d'enrichissement) par une simple étape de mise en contact de l'eau avec des plantes broyées de la famille des Plombaginacées, famille de plantes couramment représentée en milieu littoral, possèdent une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg de protéine. En particulier, cette activité spécifique peut être d'au moins 1000 Ul/mg, plus particulièrement d'au moins 1200 Ul/mg et encore plus particulièrement d'au moins 1400 Ul/mg.

Au sens de la présente invention, l'abréviation « Ul » désigne l'unité enzymatique de SOD dans le système international. L'unité enzymatique de SOD est définie par Me Cord et Fridovitch (1969).

Particulièrement, les extraits obtenus par le procédé de la présente invention sont concentrés en SOD ayant une activité spécifique comprise entre 700 et 2000 Ul/mg de protéines, plus particulièrement entre 1000 et 1800 Ul/mg de protéines, encore plus particulièrement entre 1200 et 1600 Ul/mg de protéines et de manière encore plus particulière entre 1300 et 1500 Ul/mg de protéines.

Les Inventeurs ont réalisé des tests comparatifs (cf. exemples comparatifs) qui démontrent que d'autres espèces littorales appartenant aux familles des Apiacées, Brassicacées, Aizoacées et Chénopodiacées, présentent une activité spécifique de SOD comprise entre 20 et 400 Ul/mg, soit très inférieure à celle des espèces de la famille des Plombaginacées.

Au sens de la présente demande, le terme « activité catalytique » désigne l'activité SOD rapportée à la biomasse végétale source.

Cette activité catalytique est, chez les espèces de la famille des Plombaginacées, dans une plage comprise entre 3000 et 14000 Ul/g MS (unités d'activité/g de matière sèche), particulièrement entre 5000 et 13000 Ul/g MS et encore plus particulièrement entre 7000 et 12000 Ul/g MS.

Les Inventeurs ont réalisé également des tests comparatifs (cf. exemples comparatifs) qui démontrent que les espèces des familles Apiacées, Aizoacées, Brassicacées et Chénopodiacées présentent une activité catalytique de SOD comprise entre 120 et 1250 Ul/g MS, soit très inférieure à celle des espèces de la famille des Plombaginacées.

La famille des Plombaginacées est une famille cosmopolite de plantes dicotylédones. Les espèces de cette famille sont présentes partout, particulièrement dans des milieux salins et froids où leurs capacités d'adaptation leur confèrent un avantage sélectif.

En France, la famille des Plombaginacées est représentée par les trois genres Plumbago, Limonium et Armeria. Parmi eux, les genres Limonium et Armeria sont les plus fréquemment rencontrés de cette famille. On les trouve sur l'ensemble du littoral, de la Manche à la Méditerranée, en passant par les côtes Atlantiques.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, la plante à partir de laquelle la SOD est extraite est choisie dans le groupe consistant en les genres Limonium et Armeria.

Avantageusement, le procédé de l'invention est réalisé à partir des espèces de genres Limonium et Armeria rencontrées sur l'ensemble du littoral français, de préférence sur le littoral français Atlantique.

Le genre Armeria contient une seule espèce qui est nommée Armeria maritima.

Le genre Limonium comprend des plantes herbacées vivaces à fleurs violettes qui poussent sur les sols sableux ou pauvres du littoral Atlantique et dans les marais salants.

Les espèces du genre Armeria sont des plantes vivaces des dunes ou rochers littoraux, dont la floraison dure de juillet à septembre.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré du procédé de la présente invention, l'extraction de SOD est réalisée à partir des plantes choisies dans le groupe consistant en les espèces Limonium latifolium, Limonium normannicum, Limonium vulgare, Limonium tunetanum, Limonium densiflorum, Limonium pruinosum, Limonium delicatulum, Limonium spathulatum, Limonium boitardii, Limonium wrightii et Armeria maritima.

Toutes ces espèces sont très riches en SOD, ayant une activité spécifique très élevée qui est supérieure à celle des SOD extraites des organismes utilisés en tant que source de SOD jusqu'à présent. En outre, ces espèces ont l'avantage d'être facilement cultivables en plein champ, ce qui n'est pas habituel pour des espèces dont le milieu naturel est caractérisé par une forte salinité. De plus, les espèces de la famille des Plombaginacées sont facilement cultivables dans des conditions contrôlées (en serre), ce qui rend leur utilisation à l'échelle industrielle possible, voir même aisée, en toute saison.

Avantageusement, le procédé d'extraction de SOD est réalisé à partir de l'espèce Limonium latifolium qui est facilement cultivable ou accessible dans la région où la présente invention a été mise en œuvre.

En effet, Limonium latifolium ou lavande de mer (encore appelée statice) est une plante herbacée vivace qui pousse sur les sols sableux ou pauvres du littoral Atlantique et dans les marais salants. Cette lavande de mer possède des propriétés antioxydantes dues à ses composés phénoliques et contient des agents colorants (fleurs et racines).

L'espèce Limonium latifolium est beaucoup plus riche en activité spécifique SOD que les espèces végétales jusqu'alors exploitées dans l'industrie agroalimentaire comme sources de SOD. Ceci signifie qu'il n'est pas nécessaire de disposer d'une grande quantité de la plante pour obtenir une SOD très active enzymatiquement, d'où un coût inférieur de production d'un produit fini enrichi en SOD.

En effet, l'activité spécifique de SOD dans les extraits obtenus à partir de cette espèce dépasse 1200 unités/mg protéines, soit un niveau beaucoup plus élevé que l'activité spécifique de SOD dans l'extrait obtenu à partir du melon, espèce considérée jusqu'à présent comme la plus riche en SOD (Vouldoukis et al. , 2004).

De plus, l'espèce L. latifolium est une espèce facilement cultivable, à cycle de développement plus rapide que le melon, sans prédateur connu, d'où la possibilité de produire cette plante dans des conditions correspondant à la réglementation sur les cultures biologiques.

Enfin, étant donné que Limonium latifolium est une espèce halophyte, donc résistante au sel, et que la contrainte saline est connue pour stimuler la synthèse des composés antioxydants dont les enzymes (Jithesh et al. , 2006 ; Ben Hamed et al. , 2007, Li et al. , 2008, Hameed et al. , 2014), il est envisageable d'amplifier encore l'activité SOD dans les organes de cette plante par une culture en conditions contrôlées en présence de sel. Ainsi, il sera possible de produire celle-ci dans des conditions peu onéreuses en empêchant tout développement d'organismes nuisibles (mauvaises herbes, pathogènes, etc. ) sensibles au sel.

Les Inventeurs ont ainsi réalisé des tests complémentaires qui démontrent que l'activité SOD peut être augmentée de 10 à 20% dans les plantes de l'espèce L. latifolium cultivées en présence de sel à une concentration de 20 g/L de NaCl (soit 2/3 de la concentration du sel dans l'eau de mer).

Parmi les espèces étudiées de la famille des Plombaginacées, les inventeurs ont démontré que l'espèce Limonium latifolium présente des propriétés et des avantages particulièrement intéressants comme décrit ci-dessus. Les inventeurs ont également mis à l'évidence que d'autres espèces du genre Limonium présentent ces mêmes propriétés et avantages et peuvent ainsi être facilement cultivées dans des conditions contrôlées en présence du sel afin d'augmenter l'activité spécifique de SOD.

Selon un mode de réalisation préféré du procédé de la présente invention, l'extraction est réalisée à partir des parties aériennes de la plante, de préférence à partir des feuilles qui sont les organes les plus charnus et les plus riches en SOD.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une seule étape d'extraction consistant en la récupération d'une phase aqueuse contenant l'extrait de plante après la mise en contact de la plante broyée de la famille des Plombaginacées avec de l'eau uniquement. Particulièrement, les inventeurs ont démontré que les plantes de la famille des Plombaginacées sont tellement riches en SOD que la simple extraction aqueuse sans ajout d'autres solvants ou substances chimiques permet d'obtenir un extrait dont l'activité spécifique de SOD est d'au moins 700 Ul/mg de protéine.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, dans le procédé de la présente invention, l'extraction est réalisée en présence d'eau ou d'un tampon aqueux de type tampon phosphate, donc en l'absence de solvants organiques toxiques de type alcool (ex : l'éthanol, le méthanol, le propanol, l'isopropanol, ou encore le butanol), solvants aromatiques (ex : pyridine, toluène, chlorobenzène ou xylène), solvants carbonylés (ex : acétone, diméthyl formamide ou méthyl pyrrolidone), esters (ex : acétate d'éthyle), sulfoxydes (ex : diméthyl sulfoxyde), nitriles (ex : acétonitrile), solvant halogénés (ex : dichlorométhane, dichloroéthane, chloroforme, tétrachlorure de carbone, chlorobenzène), éther-oxydes (ex : diéthylène glycol, tétrahydrofurane, éther éthylique).

Dans certains cas, lors de l'extraction, on ajoute de la glycérine, qui joue le rôle de stabilisateur.

Selon un mode de réalisation, préalablement à l'étape d'extraction, ladite plante peut être lavée, coupée, broyée, micronisée et tamisée.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'extraction peut être réalisée à partir de la matière végétale préalablement congelée ou séchée de manière à permettre sa conservation et/ou son stockage. De préférence, le séchage de la plante est effectué par lyophilisation afin d'éviter la dégradation de l'enzyme. Un deuxième objet de la présente invention concerne un extrait protéique de plante concentré en SOD ayant une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg protéines, l'extrait étant obtenu par le procédé de l'invention tel que défini ci-dessus.

L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention possède toutes ou partie des caractéristiques dudit procédé telles que décrites ci-dessous.

En particulier, l'extrait obtenu par le procédé de l'invention est un extrait qui ne contient pas de réactifs chimiques habituellement utilisés lors de procédés d'extraction conventionnels et dont l'élimination est fréquemment liée à la diminution de la qualité de l'extrait puisqu'elle entraine la baisse de l'activité spécifique de SOD et la destruction de certaines substances présentes naturellement dans la plante et ayant un effet bénéfique.

Afin de préserver l'activité enzymatique de SOD dans l'extrait de l'invention, selon un mode de réalisation particulier, l'extrait de l'invention peut être conservé à froid, c'est-à-dire, à une température comprise entre 4° C et -30° C, de préférence entre -2° C et -30° C, plus particulièrement, entre -18° C et -27° C.

Selon un autre mode de réalisation, la conservation de l'extrait peut être effectuée par un séchage de celui-ci, de préférence un séchage par lyophilisation.

Ainsi, l'extrait de la présente invention peut comprendre d'autres substances naturellement présentes dans les espèces de la famille des Plombaginacées ayant un effet bénéfique, tel que les polyphénols qui sont connus pour leurs propriétés anti-oxydantes.

Selon un mode de réalisation particulier, l'extrait de l'invention contient majoritairement l'isoforme SOD Cu/Zn.

L'extrait de la présente invention a pour avantage d'être très riche en activité SOD ainsi qu'en d'autres substances anti-oxydantes, tels que les polyphénols, et du fait de son procédé d'obtention, de ne pas contenir ou de contenir très peu de réactifs chimiques habituellement utilisés lors de l'extraction.

L'extrait de l'invention est donc parfaitement adapté à l'utilisation en médecine et/ou en cosmétologie humaine et/ou animale.

Un troisième objet de la présente invention concerne ainsi une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant l'extrait obtenu selon le procédé de la présente invention et un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, respectivement.

On entend par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » au sens de la présente invention, toute matière appropriée à une utilisation dans un produit pharmaceutique. A titre d'exemple de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer le lactose, l'amidon éventuellement modifié, la cellulose, l'hydroxypropylméthyl cellulose, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le dextrose, le sulfate de calcium, le phosphate de calcium, le lactate de calcium, les dextrates, l'inositol, le carbonate de calcium, la glycine, la bentonite et leurs mélanges.

De préférence, les véhicules pharmaceutiquement acceptables sont choisis dans le groupe constitué des prolamines, c'est-à-dire des protéines de réserve accumulées par les plantes de la famille des Poacées comme les céréales.

La composition pharmaceutique et les médicaments selon l'invention peuvent se présenter sous différentes formes, en particulier sous une forme choisie dans le groupe consistant en les solutions injectables, les comprimés, les gélules, les dragées, les sirops, les suspensions, les solutions, les poudres, les granulés, les émulsions, les microsphères. En outre, des formes pharmaceutiques à libération prolongée telles que des gélules, ou des comprimés éventuellement enrobé pour libération prolongée seront préférées.

La composition pharmaceutique et les médicaments selon l'invention sont administrables par différentes voies. A titre d'exemples de voies d'administration utilisables pour la composition pharmaceutique et les médicaments selon l'invention on peut citer la voie orale, la voie rectale, la voie cutanée, la voie nasale, la voie sublinguale, la voie parentérale notamment intradermique, la voie sous-cutanée, la voie intramusculaire, la voie intraveineuse, la voie intra-artérielle, la voie intra-articulaire, la voie intra-pleurale et la voie intra-péritonéale.

La composition pharmaceutique et les médicaments selon l'invention peuvent être administrés en une ou plusieurs fois ou en libération continue. De manière préférée, la composition pharmaceutique ou les médicaments selon l'invention sont administrés en libération continue, telle que sous la forme d'une perfusion ou par le biais d'une forme pharmaceutique, telle qu'une gélule ou un comprimé éventuellement enrobé, à libération prolongée et/ou retardée.

Au sens de la présente invention, on entend par « véhicule cosmétiquement acceptable», un véhicule adapté pour une utilisation en contact avec des cellules humaines et animales, en particulier les cellules de l'épiderme, sans toxicité, irritation, réponse allergique et proportionné à un rapport avantage/ risque raisonnable.

La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connus et classiques dans les compositions cosmétiques et dermatologiques tels que, à titre d'exemples et de façon non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines comme la vitamine E, des filtres UV, etc. Grâce à ses connaissances en matière de cosmétique et/ou en dermatologie, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter aux compositions de l'invention et en quelles quantités en fonction des propriétés recherchées. La composition cosmétique selon l'invention peut se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie sans autre restriction galénique que l'application sur le visage et sur le corps. De façon avantageuse, les compositions selon l'invention se présentent sous la forme d'un gel, d'une crème, d'une lotion, d'une huile, d'un lait, d'un spray, etc.

Quel que soit l'objectif, on peut proposer une application quotidienne, une ou deux fois par jour, pour une durée de quelques jours à plusieurs mois.

Etant donné que l'extrait de l'invention peut être obtenu par une extraction aqueuse sans l'utilisation d'autres réactifs chimiques (alcools, solvants organiques, tampons), il est particulièrement approprié pour être utilisé en alimentation humaine et animale.

Ainsi, la présente invention concerne en outre une composition alimentaire ou nutraceutique comprenant un extrait protéique obtenu selon le procédé de l'invention et un additif alimentaire ou un véhicule nutraceutiquement acceptable, respectivement.

Les additifs alimentaires peuvent être choisis parmi tous les additifs alimentaires bien connus de l'Homme du métier, par exemple, dans le groupe comprenant des conservateurs, des colorants alimentaires, des antioxydants, des lactates, des citrates, des orthophosphates, des malates, des adipates, des alginates, des gommes, des di- et triphosphates, etc.

On entend par « composition nutraceutique » au sens de la présente invention une composition relative à un produit fabriqué à partir d'aliments et commercialisée sous forme de comprimé, de poudre ou de potion ayant un effet physiologique bénéfique contre des maladies chroniques.

On entend par « véhicule nutraceutiquement acceptable » au sens de la présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans un produit nutraceutique. A titre de véhicule nutraceutiquement acceptable, on peut citer le phosphate dicalcique, l'alginate de calcium, la carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le di oxyde de silicium, le chlorure de calcium, etc.

La composition nutraceutique selon l'invention est administrable notamment par voie orale, par exemple, sous forme de comprimés sécables ou non, pelliculés ou non, de granules, de capsules, de gélules, ou sous forme de poudres libres conditionnées de préférence en sachets unitaires, ou de poudre compressée.

Lorsque l'extrait obtenu par le procédé de l'invention est destiné à une utilisation dans une composition alimentaire et/ou nutraceutique, il est préférable de réaliser une extraction aqueuse en mettant en œuvre le procédé de l'invention et non une extraction utilisant des réactifs susceptibles de provoquer un désagrément et/ou un trouble d'ordre digestif tels que par exemple, les inhibiteurs des protéases et/ou des agents réducteurs ou fixant les phénols.

Selon un mode de réalisation, ledit extrait comprend de l'ordre de 50000 à 200000 Ul /g d'extrait sec, de préférence de l'ordre de 100000 à 1 50000 Ul/g, ou, en poids, environ 1 à 4%, de préférence 2 à 3% de superoxyde dismutase dans l'extrait sec.

On entend par « extrait sec » au sens de la présente invention, le résidu sec qui subsiste après dessiccation d'un extrait et par exemple par évaporation sous-vide à 40° C ou par lyophilisation.

En outre, la composition selon l'invention peut comprendre de 0, 1 % à 20%, plus particulièrement de 0, 1 % à 10% ou de 0,5% à 5%, en particulier de 1 à 3% de superoxyde dismutase en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 5% à 20%, particulièrement de 5% à 1 5% et plus particulièrement de 5 à 10% de superoxyde dismutase en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition alimentaire et/ou la composition nutraceutique selon l'invention peut comprendre de 0, 1 % à 5%, particulièrement de 0,5% à 3% et plus particulièrement de 1 à 2% de superoxyde dismutase en poids par rapport au poids total de la composition.

Un quatrième aspect de la présente invention concerne une utilisation cosmétique d 'un extrait protéique tel que défini selon l'invention en tant qu'agent cosmétique antioxydant, en particulier pour lutter contre le vieillissement de la peau et/ou des phanères, contre les rayons U.V. , etc.

Un cinquième aspect de l'invention concerne l'utilisation d 'un extrait protéique de SOD tel que défini ci-dessus pour la préparation de fromages et/ou la conservation de produits laitiers.

Dans la production de fromages, la SOD peut se coupler à la catalase et de cette manière inhiber efficacement l'oxydation anarchique des lipides dans les produits laitiers, permettant le stockage prolongé du lait.

Un sixième aspect de la présente invention concerne l'extrait protéique de SOD tel que défini ci-dessus en tant que médicament.

En particulier, l'invention concerne un extrait protéique de SOD selon l'invention pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies choisies dans le groupe comprenant :

les maladies psychiatriques, de préférence la schizophrénie ;

- les maladies neurodégénératives, de préférence la maladie d 'Alzheimer ou la maladie de Parkinson ; les maladies cardiovasculaires, de préférence l'infarctus du myocarde ou l'athérosclérose ;

les maladies inflammatoires, de préférence la maladie de Crohn ou l'arthrite rhumatoïde ;

- les maladies chroniques, de préférence le diabète ;

les maladies cancéreuses, de préférence choisies dans le groupe comprenant le cancer de la peau, le cancer du sein, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'estomac, le cancer du foie, le cancer du côlon et le cancer des poumons.

La présente invention est illustrée d'avantage par les exemples décrits ci-dessous.

EXEMPLES

1. Matériel et méthodes

1.1 Matériel végétal

Les espèces testées sont habituellement trouvées sur le sable dunaire, les rochers ou les marais salants le long du littoral breton.

Les espèces testées sont Limonium normannicum, L. vulgare, L. latifolium, L. tunetanum, L. densiflorum, L. pruinosum, L. delicatulum, L. spathulatum et Armeria maritima.

1.2 Conduite des cultures Des échantillons de parties aériennes de toutes ces espèces ont été prélevés en fin de printemps dans leur habitat naturel.

En outre, des plantes de l'espèce L. latifolium ont été cultivées dans les conditions contrôlées suivantes : Photopériode : 8h/16h (nuit/jour) ; Température : 14/23° C (nuit/jour) ; Humidité relative : 50-70% ; Salinité : 0, 5, 10, 20 g/L de NaCl.

L'extraction des protéines SOD est réalisée immédiatement après le prélèvement des feuilles sur les plantes mères ou après conservation de celles-ci à -80° C. Pour cela, les feuilles sont broyées dans l'eau ou un tampon phosphate 100 mM de pH 7,8 pendant 15 mn à 4° C. Après filtration ou centrifugation à 14 000 g pendant 30 mn à 4° C, le surnageant est collecté (phase liquide). La teneur en protéines solubles ainsi que les activités enzymatiques sont déterminées à partir du surnageant.

1.3 Dosage des protéines solubles

La teneur en protéines solubles est déterminée dans le surnageant de chaque extrait enzymatique selon la méthode de Bradford (1976). 1.4 Mesure des activités SOD

Les superoxyde dismutases catalysent la réaction : 2 0 2 " '(anion superoxyde) + 2 H+ - 0 2 + H 2 0 2

Le substrat des SOD est très instable et a une durée de vie très courte (10 "9 s), les méthodes de dosage sont donc très indirectes. La méthode proposée par Beauchamp et Fridovich (1969), modifiée par Scebba et al. , (1999), évalue la SOD par sa capacité à inhiber un flux d'anion superoxyde généré par la riboflavine illuminée. Les radicaux superoxyde produits par ce système réduisent le nitrobleu de tétrazolium (NBT) en bleu de formazan. Deux séries de tubes ont été préparées. Les premiers sont des témoins, maintenus à l'obscurité et contenant un mélange dans le tampon phosphate 50 mM pH 7,8 composé d'EDTA 0,1 mM, méthionine (13 mM), NBT (75 μΜ), riboflavine (2 μΜ) et l'extrait enzymatique. La deuxième série de tubes est destinée à la détermination de l'activité SOD. Ces tubes contiennent le même mélange réactionnel mais ils sont maintenus pendant 15 mn sous un éclairage de 15 W. La mesure de l'absorbance est réalisée à 560 nm. Une unité enzymatique de SOD correspond à la quantité d'extrait végétal susceptible d'induire une inhibition de 50% de la réaction de réduction du nitrobleu de tétrazolium.

L'activité catalytique de l'enzyme est alors rapportée à la masse de tissus ayant fait l'objet de l'extraction alors que l'activité spécifique, elle, est rapportée à la quantité de protéines dans l'extrait.

2. Résultats

Les résultats obtenus par les mesures de l'activité catalytique et l'activité spécifique de SOD dans les extraits obtenus à partir des plantes de la famille desPlombaginacées par le procédé de l'invention sont montrés dans le tableau 1 ci- dessous :

Activité Catalytique Activité Spécifique

Espèce

(Unité /g MS) (Unité /mg Prot).

Famille Plombaçinacées

Limonium normannicum 12709,40 1588,68 L. vu l gare 10945,94 1368,24

L. latifolium 7812,50 1228,38

L. tunetanum 8051 ,61 1006,45

L. densiflorum 8836,72 1 104,59

L. pruinosum 8027,38 1003,42

L. delicatulum 3703,70 752,78

L. spathulatum 4743,72 705,91

Armeria maritima 9280,74 1784,76

Tableau 1 : Résultats des mesures de l'activité catalytique et de l'activité spécifique des SOD chez les espèces des Plombaginacées.

Ces résultats montrent clairement que le procédé d'extraction protéique de SOD à partir des espèces des Plombaginacées, selon la présente invention, permet d'obtenir de manière simple et rapide des extraits protéiques concentrés en SOD ayant une activité spécifique d'au moins 700 Ul/mg de protéines et une activité catalytique d'au moins 3000 Ul/g de matière sèche.

EXEMPLES COMPARATIFS Dans les mêmes conditions d'extraction protéique (extraction aqueuse ou extraction dans un tampon phosphate) que celle décrites précédemment, des exemples comparatifs ont été réalisés à partir des plantes halophytes des familles Apiacées, Aizoacées, Brassicacées et Chénopodiacées.

Les résultats obtenus sont exposés dans le tableau 2 ci-dessous.

Activité Activité

Espèce Catalytique Spécifique

(Unité /g MS) (Unité /mg prot. )

Famille Plombaginacées

Limonium normannicum 12709,40 1588,68

L. vu l gare 10945,94 1368,24

L. latifolium 7812,50 1228,38

L. tunetanum 8051 ,61 1006,45

L. densiflorum 8836,72 1 104,59

L. pruinosum 8027,38 1003,42

L. delicatulum 3703,70 752,78

L. spathulatum 4743,72 705,91

Armeria maritima 9280,74 1784,76 Famille Apiacées

Crithmum maritimum 1216,55 405,52

Eryngium maritimum 687,62 172,56

Famille Brassicacées

Cakile maritima 879,31 314,04

Crambe maritima 1250 155

Famille Aizoacées

Mesembryanthemum crystallinum 160 20

Famille Chénopodiacées

Suaeda fruticosa 1 4 18

Arthrocnemum indicum 176 22

Halocnemum strobilaceum 160 20

Tableau 2 : Résultats de tests comparatifs de l'activité catalytique et de l'activité spécifique des SOD chez des espèces de différentes familles de plantes halophytes.

Ces résultats montrent clairement que l'activité catalytique et l'activité spécifique de SOD des espèces de la famille des Plombaginacées sont nettement supérieures à celles des espèces étudiées des autres familles.

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EP 2 747 044