Memoria Descriptiva

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo biomédico, en particular se refiere a un método para obtener un andamio poroso inyectable, como matriz biológica, a base de biopolímeros similares, pero con diferente temperatura de fusión y el uso de dicho andamio inyectable.

Antecedentes

El reemplazo de tejidos y órganos es considerado el único tratamiento factible para muchas enfermedades críticas. En el contexto del déficit de donantes de órganos y tejidos, la creación de nuevos tejidos u órganos funcionales es un tema prioritario para la salud pública. La ingeniería de tejidos ha surgido como una tecnología ideal para este esfuerzo. La ingeniería de tejidos es un área prometedora que pretende reducir el desequilibrio en el suministro de órganos y tejidos.

La ingeniería de tejidos debe considerar muchos factores críticos, incluidos los andamios (scaffolds) y los mediadores biológicos, para imitar el entorno nativo de las células y reemplazar el tejido dañado. En este contexto, el diseño de andamios debe considerar los aspectos físicos y biológicos de los tejidos para la señalización adecuada hacia el mantenimiento celular, la diferenciación y la regeneración tisular. En el caso de los aspectos físicos, la porosidad y la rigidez se pueden modificar. En cuanto a los factores biológicos, la biocompatibilidad, la infiltración celular, la adhesión celular, la encapsulación o la unión de factores de crecimiento y la incorporación de células auxiliares se pueden explorar para mejorar el rendimiento de los biomateriales para reparar, reemplazar o inducir la regeneración de tejidos y órganos lesionados.

Los andamios son arreglos tridimensionales de biomateriales capaces de imitar la matriz extracelular (ECM) nativa y facilitar la expansión celular y/o el patrón o arreglo de diferentes tipos celulares, la deposición de matriz y la producción de tejido. En este sentido, uno de los biomateriales más prometedores son los hidrogeles. Están compuestos por una red de polímero hidrofílico capaz de absorber moléculas de agua mediante puentes de hidrógeno, interacciones polares e iónicas. Los hidrogeles pueden imitar la ECM y usarse en aplicaciones biomédicas como la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos. Dependiendo de la aplicación, los hidrogeles presentan diferentes formas de administración, como implantación, apósito, dosis oral, etc. Sin embargo, la implantación de hidrogeles preformados requiere un procedimiento invasivo que puede causar dolor, un tiempo de recuperación prolongado después de la operación y un costo elevado. Por lo tanto, los investigadores se han centrado en desarrollar hidrogeles inyectables para superar los inconvenientes de la administración de hidrogeles preformados.

Los hidrogeles inyectables serían un sistema ideal para la implantación in vivo en el sitio de destino a través de procedimientos mínimamente invasivos que pueden adaptarse a la extensión y forma completas en el sitio de la lesión. El término inyectable significa que el hidrogel se forma in situ mediante una transición solución-gel (sol-gel) después de usar un dispositivo de extrusión para implantar la solución (sol) o pre-gel en el sitio objetivo.

Hay varios requisitos en el diseño de un hidrogel inyectable para la ingeniería de tejidos. Además de la inyectabilidad adecuada, el andamio debe ser biodegradable, permitiendo una sustitución gradual del biomaterial por un ECM similar al del tejido, material que es secretado por las células (remodelación) mientras se mantienen las células en el sitio de la lesión. El andamio debe ser biocompatible y minimizar las respuestas inflamatorias graves y crónicas. Además, el andamio requiere propiedades mecánicas para soportar cargas fisiológicas y debe tener la porosidad adecuada para facilitar la migración celular y el intercambio de nutrientes y desechos.

Durante la formulación de hidrogeles inyectables, la combinación con un agente terapéutico podría mejorar la reparación de la regeneración de los tejidos objetivo. Sin embargo, los hidrogeles inyectables deben cumplir los siguientes requisitos: baja viscosidad para evitar el taponamiento de la boquilla de la jeringa durante la extrusión; la reacción de entrecruzamiento debe ser lo suficientemente rápida para lograr la transición solución-gel rápidamente, evitando la salida de materiales al tejido circundante después de la inyección y, finalmente, la transición sol-gel no debe involucrar procesos tóxicos o dañinos.

La biocompatibilidad, definida como la capacidad de un material para promover simultáneamente funciones deseables para una aplicación específica sin provocar una respuesta inflamatoria crónica y severa o dañina para las células, es un factor de diseño clave para la ingeniería de hidrogeles inyectables. El principal desafío para la biocompatibilidad in vivo de los hidrogeles inyectables es la degradación de los hidrogeles sin estímulos dañinos, reactivos tóxicos o que resulte en subproductos tóxicos. Según el tejido que se va a diseñar o la aplicación biomédica, se debe considerar una cinética deseada de degradación del hidrogel en el diseño del andamio. La degradación del material en un espacio y tiempo precisos debería reflejar la tasa de formación de tejido nuevo o la liberación controlada de moléculas bioactivas.

El efecto de la rigidez del andamio

Es bien sabido que los tejidos y órganos varían en elasticidad desde 1 kPa en el cerebro hasta 20 GPa en el hueso cortical. Por lo tanto, no sorprende que los elementos mecánicos y físicos del entorno puedan influir en el comportamiento celular, como la propagación, migración, proliferación y diferenciación celular a través de estímulos mecánicos. Por ejemplo, los andamios blandos que imitan las propiedades mecánicas del cerebro son adecuados para dirigir la diferenciación de células madre al linaje neurogénico. Por el contrario, los andamios más rígidos que imitan las propiedades mecánicas del músculo permiten que las células avancen hacia un linaje miogénico. Los andamios rígidos que imitan el colágeno de hueso son adecuados para dirigir las células al linaje osteogénico.

Diseñar un hidrogel inyectable como un sistema mecánico robusto es un desafío enorme. No solo porque pocos hidrogeles presentan rigidez en el rango de los tejidos estructurales del cuerpo, sino también porque los parámetros apropiados para la inyectabilidad se contrarrestan si el andamio o hidrogel ha sido pensado para resistir esfuerzos mecánicos una vez implantados.

ESTADO DEL ARTE PREVIO

En el estado de la técnica se encuentran diferentes soluciones al problema técnico que aborda la invención.

Los inventores, en una patente anterior WO2017216780A1, han desarrollado un andamio inyectable a base de gelatina de bajo punto de fusión que soluciona gran parte de los problemas técnicos de un andamio inyectable: la biocompatibilidad, el fácil manejo por parte del cirujano dado que a temperatura ambiente la solución tiene un comportamiento newtoniano, y la rigidez apropiada del andamio una vez polimerizado. No obstante, los inventores notaron que la regeneración de tejido con esa primera solución no era tan buena ni rápida, presumiblemente por la dificultad de las células para integrase en la estructura rígida compacta. Para solucionar este problema técnico, los inventores desarrollaron la solución protegida en esta solicitud, donde se genera un andamio poroso. Si bien el foco principal es la generación del andamio poroso in situ en el campo biomédico, este nuevo desarrollo también puede implementarse en otras aplicaciones, como la impresión 3D de andamios porosos.

Otras publicaciones han explorado la formación de andamios porosos en un molde, por ejemplo, Zoratto, Nicole, et al (Bioengineering & Translational Medicine 5.3 (2020): el0180), dispersa gelatina metacrilada (GelMA) de porcino en aceite, se entrecruza a 4°C, y se expone a luz UV en un molde. En ese caso de aplicación en biomedicina, se debería implantar el andamio poroso solo una vez formado, y por lo tanto no se adaptaría completamente a la lesión. Adicionalmente, dentro del arte previo nos encontramos con la tecnología solicitada en la patente US20140079752A1. Esta tecnología utiliza un elemento porogénico sólido que se distingue de la fase líquida inyectable en que la segunda se degrada al menos 10% más lento que la primera luego de su implantación y polimerización. En esta tecnología requiere primero la digestión del porógeno antes que se observe un poro.

La invención se distingue del arte previo y describe un nuevo método para formar un andamio poroso inyectable, útil para la reparación y regeneración de tejidos.

Figuras.

Figura 1. Representación esquemática del método de la invención.

Figura 2. Viscosidad SGelMA a diferentes concentraciones de polímero. Entre 10 a 35% (p/v) de Gelatina de salmón metacrilada (sGelMA). (n=9 tres experimentos independientes por triplicado).

Figura 3. Fuerza de inyectabilidad de sGelMA al 35 % p/v de sGelMA con diferentes concentraciones de perlas: 20, 40 y 60 % (v/v) a 25 °C. Los valores se expresan como la media ± SE (Error estándar) de tres experimentos independientes por triplicado

Figura 4. 4-A Resistencia mecánica a la compresión después de la fotopolimerización para SGelMA a diferentes concentraciones: 10%, 20%, 30% y 35% (p/v). 4-B Resistencia mecánica a la compresión tras la fotopolimerización de SGelMA al 35% con diferentes concentraciones de perlas de gelatina porcina: 0, 20%, 40% y 60% (v/v) (n=9 tres experimentos independientes por triplicado).

Figura 5. Fotografías de microscopía electrónica de barrido del andamio poroso de la invención formado in vitro con una amplificación de A) 30X, B) 50X, C) 200X y D) 500X.

Figura 6. Efecto de los extractos porosos de sGelMA sobre la actividad metabólica y la viabilidad de las células. (A) Actividad metabólica de fibroblastos 3T3 después de 24 y 48 horas de exposición con extractos de hidrogeles porosos sGelMA. (B) Viabilidad de fibroblastos 3T3 después de 24 y 48 horas de exposición con extractos de hidrogeles porosos sGelMA. (a) y (b) se normalizan al control con medio para cultivo celular. Los valores se expresan como la media ± SE de tres experimentos independientes por triplicado. Prueba de Kruskal-Wallis, * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Figura 7. Viabilidad de células encapsuladas en hidrogeles porosos sGelMA. (A) Cuantificación de células vivas frente al número total de células y (B) la actividad metabólica de las células después de 6, 24 y 48 horas en hidrogeles porosos sGelMA. Los valores se expresan como la media ± SE (al menos n=4 por condición). Prueba de Kruskal-Wallis, * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Figura 8. Inyección de hidrogeles sGelMA porosos y no porosos. (A) Representación esquemática de la inyección subcutánea de formulaciones SGelMA porosas y no porosas y entrecruzamiento in situ. La formulación porosa incluye GelMA de salmón al 35 % (p/v) combinado con perlas porcinas al 40 % (v/v). La formulación no porosa incluye GelMA de salmón al 35 % (p/v). (C) El prototipo de luz UV permite la polimerización in situ a través de una fibra óptica retráctil integrada dentro de una aguja de 18 G x 1". (D). Fotoentrecruzamiento de la formulación sGelMA utilizando la herramienta inyectable con luz UV. (E) Visualización de dos hidrogeles inyectados por vía subcutánea en la parte posterior de un ratón. (F) Constructo de hidrogel recolectada después de la inyección y el entrecruzamiento. Imágenes de microscopías electrónicas representativas de hidrogeles sGelMA porosos (G) y no porosos después de 1 día después de la implantación (H). Barra de escala: 200 pm y 10 pm. Tinción con hematoxilina-eosina de explantes porosos (I) y no vertidos (J) después de 1 día de inyección. Barra de escala: 0,1 mm. Imágenes microscópicas electrónicas representativas de sGelMA poroso (K) y no poroso hidrogeles después de 14 días después de la inyección (L). Barra de escala: 200 pm y 10 pm. Tinción con hematoxilina-eosina de explantes porosos (M) y no vertidos (N) después de 14 días de inyección. Barra de escala: 0,1 mm. Figura 9. Imprimibilidad 3D de utilizando una biotinta de GelMA de salmón con perlas de gelatina. (A) Impresión 3D de una construcción utilizando la impresora 3D modelo Fab@Home y GelMA de salmón al 35 % (p/v) con perlas de gelatina porcina (40 % v/v). (B) una construcción 3D en forma de rosquilla después de la impresión y el entrecruzamiento UV. (C) Imagen representativa de perlas visualizadas en fluorescencia roja (rodamina). Barra de escala: 200 pm. (D) Imagen representativa de una construcción 3D, que visualiza el hidrogel a granel con fluorescencia verde (BSA-FITC) y perlas con fluorescencia roja (rodamina). Barra de escala: 200 pm.

Figura 10. Viabilidad y distribución de OAC encapsuladas en G20B, G25B y G35B (el número representa la concentración de sGelMA en la biotinta o hidrogel pre-polimerizado, y la letra B representa que la biotinta posee una concentración de 40% v/v de perlas de gelatina porcina). A) muestra una gran proporción de células vivas y un cambio en la morfología de un fenotipo redondeado a uno fibroblastoide. Barra de escala = 100 pm. B) Tinción LIVE/DEAD® los días 1 y 35 después de la encapsulación. C) Cuantificación de la viabilidad celular por conteo de células vivas y muertas (cada punto representa el valor media de una sección transversal del hidrogel n= 3 donantes OACs). D) La actividad metabólica, como otra medida de viabilidad, se evaluó semanalmente mediante el ensayo Prestoblue y muestra que la reducción de rezasurina tuvo un aumento después de 2 semanas y luego se mantuvo constante con excepción de G35B. n= 3 hidrogeles por formulación, 4 donantes de OAC. Los datos se muestran como media ± SEM y se analizaron con ANOVA de 2 vías y post-test de Tukey, * p < 0,05 (a: G20B vs G25B; 0: G20B vs G35B; 4): G25B vs G35B). E) La tinción alfa-SMA a los 35 días muestra el cambio de morfología que sufren los OAC con el tiempo. Barra de escala = 100 pm. F) Circularidad de OACs en G20B, G25B y G35B después de 1 y 35 días de encapsulación (cada punto representa la media de 1 foto, n= 3 OACs donantes). G) La tinción con H&E muestra la distribución homogénea de OAC en los hidrogeles después del protocolo de diferenciación.

Descripción detallada de la invención.

La invención se refiere a un método para generar un andamio (scaffold) poroso, adaptable a la forma que se requiera, donde se provee una composición inyectable, de comportamiento newtoniano, que se adapta perfectamente a cualquier forma, por ejemplo, de una lesión a reparar, y que una vez en el lugar de destino solidifica formando un andamio poroso que actúa como soporte para células, permitiendo la regeneración de tejido.

Este método comprende proveer una composición inyectable de 2 fases, donde la composición comprende: una primera fase dispersante líquida a temperatura ambiente (6-25°C) formada por una solución de gelatina de bajo punto de fusión determinado porque tiene un contenido de prolina/hidroxiprolina del 18% o menos con respecto al contenido total de aminoácidos; la que adicionalmente está funcionalizada con grupos metacriloilo o metacrilamida, y un fotoiniciador de polimerización; y una segunda fase dispersa, sólida a temperatura ambiente (6-25°C), de microgotas o perlas (beads) de una solución de gelatina con un punto de fusión cercano a los 35°C, la que tiene un contenido de prolina/hidroxiprolina del 20% o más con respecto al contenido total de aminoácidos.

Convenientemente, la fase dispersante tiene un origen de gelatina de peces adaptados a ambientes fríos, tales como salmón o trucha y la fase dispersa corresponde a perlas de gelatina de mamífero, tal como gelatina porcina o bovina.

El fotoiniciador de polimerización es un generador de radicales libres que se activa por radiación lumínica, tal como: 2-hidroxi 4'(2-hidroxietox¡)-2- metilpropiofenona (Irgacure® 2959), o litio fenil- 2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), o cualquier compuesto equivalente, el que preferiblemente se emplea en una concentración de aproximadamente 0,01 % a 5 % (p/v).

La composición se maneja a una temperatura entre 8 a 25°C, donde la gelatina de la fase dispersante está líquida y presenta un comportamiento newtoniano, es decir se comporta como un líquido con una viscosidad estable independiente de las fuerzas ejercidas sobre la misma, inundando completamente cualquier forma del recipiente donde se vierta. Esta característica es de vital importancia y muy ventajosa en el campo de la reparación de tejido empleando andamios porosos como el de la presente invención, ya que hasta ahora estos andamios se producen fuera del tejido y se introducen ya armados, tratando de adaptarlos a la zona de destino. Esto es trabajoso y muchas veces imposible, dado la naturaleza intrínsicamente irregular de las lesiones. Esto se soluciona con la presente invención, donde en una realización el andamio se forma dentro de la misma lesión, encajando a la perfección con toda ella, permitiendo una completa cobertura de esta, facilitando así su completa regeneración en el órgano o tejido tratado.

En una realización, la composición descrita se inyecta por cualquier medio disponible, por ejemplo, una jeringa, o convenientemente por un aparato que comprenda tanto un canal de inyección de la composición como una fuente de radiación de luz. De no contar con un aparato de estas características se puede emplear una jeringa clínica común y un aparato diferente generador de una emisión luminosa. Dado que la composición tiene un comportamiento newtoniano, su aplicación es simple y no requiere de canales de acceso de grandes dimensiones para alcanzar tejidos u órganos dentro del cuerpo y que de lo contrario podría generar dolor o incomodidad post implantación.

Una vez en el lugar de destino se debe iniciar la polimerización de la fase dispersante con radiación lumínica, de acuerdo con el fotoiniciador utilizado. Para el experto en la técnica será evidente que la polimerización generada con la gelatina funcionalizada, y el fotoiniciador es de carácter completo e irreversible, por lo que se genera una red de toda la fase dispersante interrumpida por la fase dispersa. La fase dispersa, al tener un punto de fusión de entre 30 a 35°C, se comenzará a fusionar (fundir) de forma natural por la temperatura del tejido de destino, y a escurrir del andamio, dejando así un andamio poroso formado in situ, de la forma exacta de la lesión a tratar, sin espacios vacíos, ni irregularidades que puedan generar molestias.

Para desarrollar el método de la invención, los inventores iniciaron desde la ¡dea conceptual de generar una formulación que comprenda dos soluciones de gelatinas con diferentes puntos de fusión. Esta formulación permite generar un andamio poroso inyectable para rellenar o tratar tejidos dañados mediante procedimientos mínimamente invasivos, tales como inyección o artroscopia.

Una de las soluciones de gelatina (gelatina de mamífero no modificada) en forma de microperlas gelificadas (estado sólido) se combina con una solución líquida de gelatina de bajo punto de fusión, por ejemplo, de salmón, metacrilada (Gelatina de salmón metacrilada, sGelMA). La configuración sólido-líquido de esta mezcla es estable debido a su gran diferencia en el punto de fusión (32°C vs 4°C respectivamente). Por lo tanto, a temperatura ambiente (15-25 °C), las microesferas permanecen en estado sólido, mientras que sGelMA o solución dispersante permanece líquida.

Si bien se realizaron experimentos empleando gelatina de salmón, para el experto en el arte será obvio que la especie de origen de la gelatina no es lo importante, sino la condición de que dicha gelatina sea líquida a una temperatura entre 8 y 25°C, como los inventores ya han establecido en trabajos anteriores (WO2017216780 Al) que está condición se correlaciona con el porcentaje de prolina e hidroxiprolina de la gelatina, donde el contenido de prolina/hidroxiprolina del 18% o menos con respecto al contenido total de aminoácidos. Esta proporción se da naturalmente en peces como salmón, pero podría emplearse gelatina de otra especie marina que habite en aguas frías o incluso podría producirse artificialmente una gelatina que cumpla con estas características. Del mismo modo, tampoco es relevante el origen de la gelatina de mamífero empleada, sino la condición de mantener un estado sólido a temperaturas bajo 25°C y líquido a temperatura fisiológica, es decir de 35° en adelante, o convenientemente líquida sobre 30° C.

En una realización, esta composición estable de la invención se implanta en una lesión mediante inyección o artroscopia (en el caso de defectos articulares), e inmediatamente se irradia con luz UV para inducir el entrecruzamiento covalente irreversible y la transición solución-gel de la fase dispersante sGelMA. Este nuevo método facilitaría rellenar con un hidrogel la lesión o defecto que necesita ser restaurado. Posteriormente, e impulsadas por la temperatura fisiológica, las microesferas de gelatina de alto punto de fusión sufrirán una transición de sólido a líquido dejando un andamio poroso dentro de la lesión. Un esquema de la invención se puede apreciar en la figura 1.

De este modo la invención se refiere a un método para generar un andamio (scaffold) poroso como matriz biológica el que comprende las etapas de: i) proveer una composición líquida de 2 fases a una temperatura inferior a 25°C, de comportamiento newtoniano, donde la composición comprende: una primera fase dispersante líquida a temperatura ambiente formada por una gelatina de bajo punto de fusión, menor a los 15°C, determinado porque tiene un contenido de prolina/hidroxiprolina del 18% o menos con respecto al contenido total de aminoácidos; la que adicionalmente está funcionalizada con grupos metacriloil o metacrilamida; y un fotoiniciador; y una segunda fase dispersa, de microgotas o perlas (beads) en estado sólido de una solución de gelatina con un punto de fusión superior a los 25°C, determinado porque tiene un contenido de prolina/hidroxiprolina del 20% o más con respecto al contenido total de aminoácidos; ii) extruir la solución proveída en el lugar donde se formará el andamio poroso; iii) iniciar la polimerización de la fase dispersante líquida mediante aplicación de radiación lumínica; iv) elevar la temperatura a 35-40°C y permitir la fusión de las microgotas o perlas (beads) de la fase dispersa; y v) obtener un andamio poroso por gelificación de la fase dispersante y descarte por fusión y/o difusión de la fase dispersa.

Adicionalmente, la fase dispersante líquida comprende adicionalmente compuestos activos como medicamentos, factores de crecimiento y/o de migración, células, organelos, anticuerpos, péptidos, vesículas, derivados celulares, oligonucleótidos u otros.

Donde la gelatina de bajo punto de fusión de la fase dispersante está en una concentración entre el 10 y el 50 % p/v; y el grado de funcionalización con grupos metacriloil o metacrilamida del polímero de gelatina o gelatina de bajo punto de fusión de la fase dispersante, es del 30% al 100% en los residuos de lisina de la cadena de aminoácidos de dicho polímero de gelatina.

Por otra parte, las microgotas o perlas (beads) de gelatina, de la fase dispersa, tienen una concentración de entre 5% al 30% p/v de gelatina; tienen un diámetro de entre 50 a 500 pm; y se presentan a una concentración entre el 10 y 80% (v/v) dentro de la fase dispersante. En una realización preferida, la concentración de las perlas en la fase dispersante está entre 20 y 60% (v/v).

En una realización en la etapa ii) la composición se inyecta directamente en el lugar donde se requiere la formación del andamio, tejido o lesión receptora, y en la etapa iii) se polimeriza in situ. Es decir, se inyecta sobre una lesión, y dado el carácter newtoniano y baja viscosidad de la composición esta es fácilmente inyectable, se adapta y recubre completamente la lesión, y al polimerizar se forma un andamio poroso perfectamente adaptado a la forma requerida; donde la temperatura natural del tejido receptor permite la fusión de las perlas de la fase dispersa.

En otra realización en la etapa ii) la composición se extruye mediante un sistema de impresión 3D, el que incorpora un sistema de aplicación de luz UV o emisión lumínica para la polimerización de la etapa iii. En este caso la aplicación de calor para elevar la temperatura, de acuerdo con la etapa i v) puede hacerse in vitro, con una fuente externa de calor. O en una segunda modalidad de esta realización, la aplicación de calor para elevar la temperatura, etapa iv) puede realizarse naturalmente por la temperatura del tejido, al disponer el andamio, polimerizado en un sistema de impresión 3D, en una lesión o tejido receptor.

Convenientemente la gelatina de bajo punto de fusión es derivada de organismos del género Salmo u Oncorhynchus, y la gelatina sólida a temperatura ambiente es gelatina de porcino o bovino.

En una realización la invención se refiere al andamio poroso formado según el método descrito, donde dicho andamio está formado de gelatina polimerizada con mesoporos de entre 50 a 500 pm de diámetro. Opcionalmente el andamio comprende compuestos activos como medicamentos, factores de crecimiento y/o de migración, células, organelos, anticuerpos, péptidos, vesículas, derivados celulares y/o oligoucleótidos

Este andamio es útil como soporte biológico para la regeneración/generación de tejido; donde la regeneración de tejido es en una lesión de cartílago, lesión ósea, lesión ulcerosa, lesión de ligamentos, lesión de órganos, lesión de médula espinal, o lesión de tejidos blandos, o en una reconstitución de tejido de piel, tejido muscular, tejido blando, o tejido de reemplazo post quirúrgico.

En otra realización la invención se enfoca en el uso del andamio formado como una matriz biológica como soporte para células, para invasión celular. Y en otra realización la invención apunta al uso del andamio formado como matriz biológica acelular, matriz biológica como soporte mecánico, matriz biológica para componentes activos.

Respecto a la etapa de elevar la temperatura esto se podrá realizar naturalmente in situ, con la temperatura corporal del paciente o, dicho de otra forma, del tejido en que se aplica la composición. La fase dispersa por sus características de gelatina bovina o porcina podrá ser degradada por el cuerpo del paciente.

El alcance de la invención se comprenderá mejor a la luz de los siguientes ejemplos ilustrativos de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Funcionalización de gelatina de Salmon con grupos metacriloilos y metacrilamidas.

Primero, obtuvimos gelatina de salmón purificada y filtrada que luego se seca y se muele.

La gelatina de salmón triturada se disolvió hasta una concentración final deseada de entre 10 % a 35% (p/v) en PBS IX (pH 7,4) a 60 °C. Una vez disuelto por completo, mientras se agitaba aún, se añadió lentamente anhídrido metacrílico (276685, Sigma, EE. UU.) hasta una concentración final del 8 % (v/v). Diferentes niveles de funcionalización de metacriloilo y/o metacrilamida requieren diferentes concentraciones de anhídrido metacrílico. Después de 3 h de reacción, se realizó una dilución 5X en PBS IX y la gelatina reaccionada se dializó frente a agua desionizada a 40 °C durante 1 semana. Se realizaron reemplazos diarios de agua desionizada fresca para eliminar durante la diálisis todo el anhídrido metacrílico sin reaccionar. Finalmente, la mezcla dializada se filtró con papel filtro poroso de 20 pm, se liofilizó y se almacenó a -20 °C para su uso posterior.

Con este proceso se obtiene el biomaterial base, gelatina de salmón metacrilado (sGelMA), para la formulación de la solución de la fase dispersante.

Ejemplo 2. Estudio de viscosidad sGelMA a diferentes concentraciones.

En ese estudio, todas las mediciones Teológicas se tomaron con un reómetro controlado por tensión Anton-Paar MCR301 (Anton-For, Graz, Austria). Para estas mediciones de viscosidad se utilizó un plato cónico con un ángulo de 0,5° y 25 mm de diámetro.

La viscosidad se midió para soluciones de metacrilato de gelatina de salmón (sGelMA) a diferentes concentraciones de 10% a 35% (p/v) a través de barrido de flujo con una velocidad de corte entre 1 y 1000 s-1 a 25 °C. Los resultados se muestran en la Figura 2.

La viscosidad a 25°C aumentó a medida que aumentaba la concentración del polímero de gelatina. Sin embargo, el comportamiento fluídico seguía siendo newtoniano. La tabla 1 muestra la viscosidad promedio de cada concentración a 100 s-1.

Tabla 1

Ejemplo 3. Preparación de Perlas de Gelatina.

Las perlas de gelatina porcina se fabricaron mediante emulsión de agua en aceite como se describió anteriormente (Hwang et al., 2010).

Brevemente, se preparó una solución al 10 % p/v de gelatina porcina (Sigma) disolviendo 0,5 g en 5 mL de tampón fosfato salino (PBS) IX a 37 °C con agitación suave. El pH se ajustó a 7,4 con NaOH 1M. Mientras aún estaba caliente, la solución se filtró utilizando un filtro de nitrocelulosa de poro 5 pm y se sometió a un protocolo de esterilización por calor-frío.

La gelatina y el aceite mineral (Sigma) se precalentaron a 37°C antes del protocolo de emulsión. En la campana de cultivo celular, se agregaron lentamente (1 mL/min) 5 mL de la solución de gelatina a 25 mL de solución de aceite mineral suplementaria con 125 pL de Tween 20 (Sigma) bajo agitación continua a 600 rpm durante 10 minutos. Tanto el aceite mineral como el Tween 20 tenían calidad de cultivo celular para garantizar la esterilidad de las perlas. Luego, la emulsión se enfrió en un baño de hielo durante 10 min a 700 rpm y se recolectó en un tubo cónico de 50 mL que contenía PBS IX frío y se centrifugó 5 min a 200 x g.

Se eliminó el sobrenadante y las perlas se lavaron 4 veces para eliminar trazas de aceite mineral. Las perlas se mantuvieron a 4 °C en PBS IX suplementario con 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina hasta su uso posterior.

Para preparar los hidrogeles porosos, el PBS se drenó utilizando un filtro de células de 100 pm de tamaño de poro y, a continuación, las perlas se incluyeron en las formulaciones respectivas.

Ejemplo 4. Preparación de la composición de la invención. Para obtener la composición de la invención se emplearon 50 mL de una solución de sGelMA al 35% (w/v) obtenida en el ejemplo 1 y se mantuvo en agitación suave a temperatura ambiente. Sobre esta solución se vertieron las perlas (beads) formadas en el ejemplo 3, hasta la concentración deseada (20%, 40% y 60% v/v), formando una composición estable de 2 fases, una dispersante y una dispersa.

Finalmente se agrega 0,2% (w/v) de fenil-2,4,6-tr¡met¡lbenzo¡lfosfinato de litio o LAP, el que es reactivo bajo luz UV, por lo que la composición puede manejarse en condiciones normales de luminosidad de trabajo.

Ejemplo 5. Estudio de fuerza de extrusión.

Dado que la aplicación de la formulación de la invención para formar los andamios in situ debe hacerse a través de jeringas o líneas de tuberías flexibles de pequeño diámetro, y que permitan aplicar la formulación directamente sobre la lesión, se estudió la fuerza de extrusión necesaria para la aplicación de las composiciones empleadas. Para esto se usó el instrumental texturómetro, el cual estaba integrado al émbolo de una jeringa. Con esto era posible medir la fuerza necesaria para extruir las composiciones a través de una tubería de largo y ancho determinado.

Estudio de fuerza de extrusión para sGelMA a diferentes concentraciones con y sin perlas de gelatina porcina. Se estudió la fuerza necesaria para extruir la composición a través de un canal de: diámetro interno de 0,58 mm longitud 30 cm velocidad de movimiento del pistón de la jeringa: 0,2 mm/s

Se probaron diferentes concentraciones entre 10 a 35% de Gelatina de salmón funcionalizada (sGelMA). El resumen de los resultados está en la Tabla 2. La fuerza de extrusión necesaria aumentó a medida que aumentaba la concentración de polímero.

Tabla 2

A continuación, se estudió las variaciones en fuerza de extrusión de la composición sGelMA a 35% (p/v) de concentración, cuando se usan diferentes concentraciones de perlas de gelatina de porcino, a 25°C. Se evaluaron concentraciones de 20, 30 y 40% v/v de perlas de gelatina porcina en una fase dispersante de 35% (p/v) de sGelMA. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

La fuerza de extrusión requerida se redujo a medida que aumentaban las concentraciones de perlas de gelatina porcina.

Finalmente, se realizó una evaluación de inyectabi lidad para determinar la fuerza requerida para inyectar la formulación precursora en una prueba de compresión utilizando una aguja 25G (0,5 mm de diámetro). Por lo tanto, los resultados demostraron que las soluciones de sGelMA al 35 % p/v poseían valores de inyectabi lidad de 55 N. Sin embargo, se mostró una reducción notoria de la fuerza (20 N frente a 55 N) después de agregar perlas de gelatina porcina (40 % y 60 % v/v) en el hidrogel sGelMA concentrado (Figura 3).

Ejemplo 6. Resistencia mecánica a la compresión.

Para evaluar las propiedades mecánicas del andamio que se formará in situ, se polimerizaron pequeños discos (6x8 mm) de las composiciones del ejemplo 4, con una concentración de 10, 20, 30 o 35% (w/v) de sGelMA. Luego se utilizó solo la concentración de 35% (p/v) de sGelMA en la fase dispersante y se agregó la fase dispersa (perlas) a concentración de 0, 20, 40 o 60% v/v de perlas de gelatina porcina respecto de la fase dispersante. Posterior al foto-entrecruzamiento se elevó la temperatura a 37°C de modo que las perlas de gelatina porcina se disolvieron formando el andamio poroso de la invención. Los resultados se aprecian en las tablas 4 y 5.

La resistencia mecánica a la compresión después de la fotopolimerización para sGelMA a diferentes concentraciones con y sin porosidad se analizó en un TA.XTplus Texture Analyzer (Stable Micro Systems, UK) con una celda de carga de 5 kg, a una velocidad de 2 mm/s, y equipado con una sonda cilindrica de 25 cm de diámetro. La prueba determina cuánta fuerza es necesaria para romper la estructura.

Tabla 4

El nivel de rigidez aumentó a medida que aumentaba la concentración de polímero.

Tabla 5

En este estudio se observó una reducción gradual de las propiedades mecánicas a medida que aumentaba la concentración de perlas. Estos resultados también se muestran en la Figura 4. En particular, los hidrogeles con 60 % (v/v) de perlas redujeron drásticamente su resistencia mecánica, mostrando 130 kPa frente a 714 kPa para hidrogeles con 35 % (p/v) de sGelMA con y sin perlas, respectivamente. Por lo tanto, se debe considerar un balance entre la porosidad y las propiedades mecánicas deseadas en la aplicación específica.

La Figura 5 muestra el aspecto estructural de la porosidad de estos hidrogeles mediante una imagen de microscopía electrónica de barrido. Como era de esperarse el gel polimerizado es más fuerte a mayor concentración de gelatina de la fase dispersante, y su fragilidad aumenta a mayor concentración de perlas de gelatina de la fase dispersa.

Es notable que los hidrogeles con la concentración más alta de sGelMA alcanzaron 714 kPa, que está muy cerca del módulo de compresión del cartílago humano.

Ejemplo 7. Citocompatibilidad de los andamios sGelMA porosos y no porosos.

La citotoxicidad potencial de los subproductos de entrecruzamiento UV y las perlas de gelatina se evaluó mediante un ensayo indirecto que emplea fibroblastos 3T3 y extractos de hidrogeles. Los extractos se obtuvieron luego de someter 1 volumen de medio de cultivo con 1 volumen de hidrogel durante 24 h a 37°C. El sobrenadante se consideró como extracto y se utilizó como medio de cultivo en los ensayos de citotoxicidad.

Los extractos de hidrogeles porosos no afectaron la actividad metabólica (Figura 6.A) o la viabilidad celular (Figura 6.B) en comparación con el 35 % de sGelMA sin poros, lo que significa que las perlas permiten un sistema eficaz de inyectabilidad/porosidad sin inducir ninguna toxicidad.

Dado que la entrega de células viables encapsuladas dentro de hidrogeles formados es una capacidad deseada para las aplicaciones de ingeniería de tejidos, se examinó la viabilidad de la encapsulation de células utilizando los hidrogeles porosos sGelMA. Se cultivaron fibroblastos 3T3 encapsulados durante 6, 24 y 48 horas y se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo LIVE/DEAD. La porosidad de los hidrogeles mejoró la actividad metabólica celular a las 24 y 48 horas posteriores a la encapsulation en hidrogeles de sGelMA al 35 % (p/v) (Figura 7.A). En este contexto, se mostró una notoria recuperación de la viabilidad en todos los hidrogeles porosos con viabilidades superiores al 70% después de 24 horas de cultivo (Figura 7.B).

Ejemplo 8. Inyección in vivo del andamio poroso sGelMA.

Se realizó una prueba de concepto in vivo de un hidrogel inyectable en las instalaciones del bioterio de Cells for Cells de acuerdo con las pautas del Comité de Bioética del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de los Andes, Santiago, Chile. Se anestesiaron ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (The Jackson Laboratory) con sevoflurano vaporizado (Baxter). Dos hidrogeles por formulación (solución de hidrogel de sGelMA al 35 % y solución de hidrogel de sGelMA al 35 % que contenía perlas al 40 % (p/v)) se inyectaron subcutáneamente (400 pl) a lo largo de cada flanco de los ratones. El foto-entrecruzamiento se realizó en la solución por inyección directa de un dispositivo personalizado que permitió la inserción de la aguja que contenía la fibra óptica UV.

Antes de la implantación subcutánea de hidrogel, se realizó una prueba de fuerza de extrusión con una aguja de 18 G x 1" (1,2 mm de diámetro) canulada a un tubo de calibre (diámetro interior: 1 mm) para emular un procedimiento artroscópico. Nuestros resultados mostraron que menos de 5 N fueron requeridos para inyectar soluciones sGelMA (Figura 8.B), siendo apropiados para procedimientos quirúrgicos in situ.

El proceso de inyecciones in situ requería dos pasos, incluida la inyección con la solución SGelMA y la posterior inserción de la aguja con luz ultravioleta para entrecruzar la solución (Figura 8.A y Figuras 8. C-D). No se identificó evidencia de sepsis, infección o dolor en los animales durante el período entre la inyección y la recolección del hidrogel.

Los ratones se mantuvieron con alimento y agua ad libitium bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h a 22±1°C. Los hidrogeles resultantes se recolectaron después de los días 1 y 14 después de la inyección, respectivamente (Figura 8.E y Figura 8.F) para el posterior procesamiento de tejidos, estudios histológicos y análisis estructurales. Los ratones fueron sacrificados mediante sobredosis intraperitoneal de xilazina y ketamina.

Las muestras de hidrogel se fijaron con formalina tamponada con fosfato neutro al 10 % (Sigma Aldrich), se deshidrataron con una concentración creciente de alcoholes y xileno y se incluyeron en parafina en un procesador de tejidos automático (STP 120 Spin Tissue Processor, Thermo Scientific™). Las muestras se cortaron en secciones de 5 pm, se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) y se observaron al microscopio óptico para caracterizar la formación de porosidad y la integridad.

La estructura porosa formada in situ se visualizó mediante microscopía electrónica (Figura 8.G y 8.K) e histología (Figura 8.1 y Figura 8.M) en comparación con hidrogeles no porosos (Figura 8.H, Figura

8 J, Figura 8.L y Figura 8.N). Sorprendentemente, después de 14 días de inyección, sGelMA poroso mostró infiltración y colonización celular indicada por la presencia de presuntos fibroblastos de ratones en las imágenes de microscopio electrónico (Figura 8.K) e histología (Figura 8.M). Por el contrario, el sGelMA no poroso no reveló infiltración celular (Figura 8.L, Figura 8.N).

Ejemplo 9. Uso del andamio sGelMA poroso inyectable en bioimpresión 3D

Imprimibilidad 3D de biotinta GelMA de salmón con perlas de gelatina porcina.

Después de probar la factibilidad de la formación de hidrogeles sGelMA porosos durante la inyección e iluminación in situ, también se evaluó el uso de GelMA de salmón con perlas de gelatina porcina como biotinta para la impresión 3D. Por lo tanto, imprimimos una estructura 3D utilizando una impresora 3D basada en extrusión, Fab@Home model 3 (Figura 9.A). Durante la deposición del material de impresión, la biotinta de sGelMA al 35 % con perlas (40 % v/v) fluyó fácilmente sin obstrucciones, lo que demuestra la viabilidad de usar esta biotinta en condiciones suaves. La construcción 3D mostró una buena fidelidad de forma de rosquilla (Figura 9.B) y la estabilidad de las perlas se mantuvo después de la impresión, como lo demuestra la microscopía confocal (Figura 9.C y Figura 9.D). Ejemplo 10. Andamios porosos inyectables que llevan condrocitos vivos.

Condrocitos derivados de pacientes con osteoartritis (OAC) fueron aislados desde la cabeza femoral de pacientes sometidos a reemplazo de cadera. Las muestras se procesaron y se sembró una suspensión celular de OAC a una densidad de 30.000 células/cm2 en una placa de cultivo celular. El medio se reemplazó 2-3 veces por semana durante el cultivo celular. Cuando los OAC alcanzaron una confluencia del 80-90 %, se separaron de la placa utilizando tripsina/EDTA al 0,5 % y se aislaron mediante centrifugación para su posterior resuspensión y experimentos. Las células solo se usaron hasta el subcultivo 2 a 3 (pasaje 2-3). Todos los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37°C y 5% de CO2.

Después del aislamiento y centrifugación de las células, estas se suspendieron en las formulaciones respectivas, incluyendo perlas, sGelMA, PBS IX y 0,2 % (p/v) de fotoiniciador LAP (Sigma). Donde sGelMA estaba a una concentración de 20%, 25% o 35% (p/v), todos con 40% (v/v) de perlas de gelatina. Se vertió un volumen de 100 pL de una suspensión de 7,5 x 10 ⁶ células/ml en moldes cilindricos de PDMS (6 mm cjs, 5 mm h) y luego se expuso a luz UV filtrada a 365 nm con una intensidad de 261 mW/cm2 (OmniCure® S2000, Excelitas Technologies, USA) a una distancia de 20 cm y durante 20 seg por lado.

Los hidrogeles celularizados se depositaron en una placa de 12 pocilios (1 hidrogel por pocilio) y 2 mL de medio de diferenciación condrogénica (DMEM suplementado con 0,2 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, 0,5 % (v/V) de albúmina de suero bovino, 1 % v/v de mezcla de insulina-transferrina selenio (ITS-X, Corning), 4 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina, 1 mM piruvato de sodio y 5 ng/ml TGF-B2) fue agregado y se cambió dos veces por semana.

Al día siguiente de la encapsulación, la tinción LIVE/DEAD® mostró una morfología y viabilidad similar entre las 3 formulaciones, donde la morfología predominante fue redondeada, lo cual era de esperar debido a que no han tenido tiempo suficiente para remodelar la matriz y adaptarse a este entorno 3D (Figura 10.B). Después de 35 días, la morfología es diferente. En G20B (20% (p/v) sGelMA, 40% (v/v) perlas) las células se diseminaron y adquirieron un fenotipo fibroblastoide, mientras que en G35B (35% (p/v) sGelMA, 40 % (v/v) de perlas), las células permanecieron en su mayoría redondeadas (Figura 10.B). Las células en G25B (25 % (p/v) de sGelMA, 40 % (v/v) de perlas) estaban entre ambos fenotipos. Cuantificamos las células vivas y muertas en el día 1 y 35 y no detectamos diferencias en el día uno, pero con una alta intra variación porque algunas regiones en los hidrogeles podrían haber recibido más estrés que otras, lo que se reflejó en las 3 condiciones. Después de 35 días, hubo una disminución significativa en la viabilidad de G35B, con más muerte celular (Figura 10.C). El número de células al final del ensayo fue similar entre las formulaciones (datos no mostrados). Otra medida de viabilidad fue la determinación de la actividad metabólica de los OAC a lo largo de las 5 semanas del ensayo, al principio (día 1) G35B comenzó más bajo que G20B y G25B pero hubo un aumento en la actividad metabólica en todas las condiciones a los 14 días, llegando a una meseta el día 35, donde G35B fue significativamente menor que las otras condiciones, ya sea por un menor número de células o por un metabolismo disminuido (Figura 10.D).

Hubo diferencias considerables entre la morfología celular de las 3 formulaciones. Para la medición del fenotipo fibroblastoide (propagación celular), los portaobjetos de hidrogel se tiñeron para alfa- actina del músculo liso (aSMA) y se determinó la circularidad celular el día 1 y el día 35. De acuerdo con las imágenes LIVE/DEAD®, los OAC G20B cambiaron su morfología, mostrando múltiples protuberancias celulares como un fibroblasto, y con una disminución en la circularidad de las células al final del experimento. Se observó un resultado similar para G25B, pero para G35B la circularidad de las células no disminuyó tanto como en el caso de las otras formulaciones, lo que sugiere una morfología similar a la de los condrocitos o una incapacidad para adaptarse y remodelar esta formulación (Figura 1O.E-F).

La distribución de OAC fue homogénea en todo el hidrogel, pero hubo diferencias considerables en la morfología de las células en las 3 condiciones, como se determinó con la tinción H&E. En G20B, los OAC tenían un aspecto principalmente fibroblastoide, formando grandes conglomerados celulares de color rosa intenso (eosinófilos) y rodeados de un halo fibroso también rosa, lo que sugiere un depósito de ECM o matriz ectracelular. En G25B se observó una distribución similar, pero con estructuras menos fibrosas, y también se detectaron OAC dentro de estructuras similares a lagunas que recuerdan al tejido cartilaginoso. En G35B, los depósitos fibrosos eran escasos y las células estaban contenidas en las mismas estructuras similares a lagunas que se acaban de describir (Figura 10.G).

Estos resultados prueban que el método de la invención y el andamio formado permiten la incorporación de células vivas, y las células sobreviven al proceso de entrecruzamiento y también son funcionales.