PRODUKTIONSPROZESSES

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung betrifft das Gebiet der biopharmazeutischen Prozessentwicklung mit eukaryotischen Zellen, welche rekombinantes Protein von Interesse produzieren. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methode zur Optimierung der Prozessführung welche den Einsatz eines Na ₂ C0 ₃ und NaHC0 ₃ freien bzw. reduzierten Mediums in Kombination mit einer pC0 ₂ -Regelung umfasst.

HINTERGRUND

Die biopharmazeutischen Prozessentwicklung steht vor der Herausforderung, immer höhere Titer bereitzustellen für die Produktion von therapeutischen Proteinen, insbesondere Antikörpern für klinische (Toxikologie-) Studien mit engen Zeitvorgaben oder die Marktversorgung.

Im Rahmen dieser Zeitvorgaben müssen Expressionssysteme entworfen werden, müssen stabile Produktionszellklone für die Produktion generiert und ausgewählt werden (z.B. CHO Zellen, Hybridome, BHK oder NSO Zellen), müssen skalierbare biopharmazeutische Pproduktionsprozesse entworfen werden umfassend Medienoptimierung und Prozesskontrolle. All das muss adressiert werden, damit die spezifische Produktivität (=spezifische Produktbildungsrate) und die erreichten Titer (Produktausbeute) maximiert werden um die Prozesse robust und reproduzierbar in unterschiedlich gross dimensionierten Anlagen fahren zu können. In den letzten Jahren wurden enorme Steigerungen bei Produkttiter in rekombinanten eukaryotischen Zellsystemen erreicht. So wurden beispielsweise Produktkonzentrationen von über 5g Immunoglobulin/L in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen erreicht. Fortschritte in der Molekularbiologie und der Zellbiologie umfassen genetische Zelllinienentwicklung und -Veränderungen, Medienentwicklung, und„In-Prozess" Kontrollstrategien wie Nährstoffzugabe („Feed") haben dies u.a. ermöglicht. Dennoch erreichen die Produktivitäten von eukaryotischen Zellsystemen, insbesondere Säugerzellsystemen, nicht diejenigen von prokaryotischen Zellsystemen und daher bleibt die weitere Optimierung insbesondere der Prozesskontrolle bei der Fermentation und die Optimierung des Fermentationsmediums eine ständige Herausforderung.

Eine spezielle Herausforderung ist die Kontrolle des oxidativen Stoffwechsels.

Alle Zellen produzieren im Rahmen des oxidativen Stoffwechsels C0 ₂ und benötigen HC0 ₃ ^" für eine Vielzahl gekoppelter Transportprozesse. Erhöhte C0 ₂ -Gehalte, die z.B. bei starkem Wachstum auftreten können, erniedrigen den pH- Wert, was durch erhöhten Natriumhydrogencarbonatgehalt neutralisiert werden kann. Damit ist Natriumhydrogencarbonat sowohl Puffersubstanz als auch essentieller Nahrungsbestandteil. Natriumhydrogencarbonat wird u.a. im Lehrbuch Lindl, Toni; Gstraunthaler Gerhard (2002): Zell- und Gewebekultur, 5. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, S. 93 Punkt 4.4.3 als essentieller Nahrungsbestandteil beschrieben oder auch in Ling, C. T. et. al (1968): Chemically characterized concentrated corodies for continuous cell culture (The 7C ^' s culture media), in Experimental Cell Research Nr. 52, S. 469-489.

Hydro gencarbonat spielt des Weiteren eine Rolle im Zitronensäure-Zyklus, bei der pH-Regulation des gesamten Körpers, sowieeinzelner Zellen und deren Volumen-Regulation. Die Membranen von Säugerzellen beinhalten Transportproteine für Hydrogencarbonat, um den Transmembrantransport zu erleichtern. Während C0 ₂ in der Lage ist die Lipiddoppelschicht per Diffusion zu durchdringen, ist HCO ₃ ^" geladen und durchtritt die Membran nur mit Hilfe von spezifischen Transport-Proteinen. Auf Grund der Säure-Base-Eigenschaften von CO ₂ /HCO ₃ ^" , resultiert der C0 ₂ -Ausstoß aus der Zelle in einer Alkalisierung der Zelle während HCO ₃ ^" -Ausfluss die Zelle ansäuert (Casey Joseph. R. (2006): Why bicarbonate? in Biochem. Cell Biol. Nr. 84, S. 930-939).

Zusammenfassung der Erfindung

Um das Ziel, C0 ₂ im Fermentationsprozess vollständig regulieren zu können, zu erreichen, müssen HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen z.B. stammend aus Natriumhydrogencarbonat Puffer durch eine alternative Puffersubstanz ersetzt werden. Aktuell kann, wie in folgender chemischer Gleichung gezeigt, bei der Reaktion mit Milchsäure (MS) C0 ₂ entstehen:

NaHC0 _{3 (aq)} + MS _(aq) Na-Laktat _(aq) + C0 _{2 (aq)} +H ₂ 0 (Gl. 1)

Auch die Regelung des pH- Wertes erfolgt aktuell mit Na ₂ C0 ₃ -Lösung welche, wie in Gl. 2 dargestellt, zu NaHCC>3 zerfallen kann. Das Produkt NaHCC>3 aus Gl.2 wird wiederum zum Edukt in Gl. 1.

Na ₂ C0 ₃ (a _q) + H ₂ 0 -> NaHC0 _{3 (aq} ) + OH ^" + Na ⁺ (Gl. 2)

Wie oben beschrieben, können Zellen nicht ohne HCO ₃ ^" existieren, da es obligat für wichtige Zellfunktionen ist. Es erscheint daher unmöglich, auf HCO ₃ ^" - aus der Quelle Puffersubstanz NaHCC>3 oder aus der Quelle pH-Regulationsagens Na ₂ C(VLösung, vollständig zu verzichten. Die Zellen haben jedoch noch weitere Quellen für Bicarbonat:

C0 ₂ + H ₂ 0 ±? H ₂ C0 ₃ ^ HCCV + H ⁺ (Gl. 3)

_{C()2 +} Kohlenstoff-Anhydrase ^ jj^- _{+ R+ (Q1} ^ Während Gl. 3 spontan abläuft, z.B. beim Eingasen von C0 ₂ , so ist die Reaktion von Gl. 4 noch zusätzlich durch das intrazelluläre Enzym Kohlenstoff- Anhydrase unterstützt. Die Zelle kann sich also bei Bedarf ihr Bicarbonat selbst aus H ₂ 0 (vorhanden in Zellkulturmedium) und C0 ₂ (wird eingegast oder Nebenprodukt aus Zellzyklus) synthetisieren.

Der erste Schritt auf dem Wege zur pC0 ₂ -Regelung im Fermentationssystem ist die Suche nach alternativen Puffersubstanzen für Natriumhydrogencarbonat, NaHC0 ₃ . Mit dem Standardmedium/ NaHC0 ₃ -haltigen Standardpuffer bildet sich ein Gleichgewicht zwischen C0 ₂ (gas) und C0 ₂ (aq) aus, welches den pH- Wert der Zellkultur beeinflusst.

Die neue, alternative Puffersubstanz, muss bei vollständigen oder teilweisen Ersatz von HC0 ₃ ^" bzw. C0 ₃ ^2" Ionen z.B. stammend aus Natriumhydrogencarbonat eine gute Pufferwirkung zeigen und darf sich nicht negativ auf die Zellkultur auswirken. Auch müssen die Performance und die Produktbildung (Titer) mindestens auf gleich hohem Niveau bleiben. Es könnte z.B. der Fall auftreten, dass die neue Puffersubstanz zwar ein gutes Pufferverhalten zeigt, jedoch toxisch auf die Zelle wirkt oder das extrazellulär sezernierte Produkt schädigt. Ferner könnten unerwünschte Reaktionen mit den weiteren Bestandteilen des Zellkulturmediums auftreten und z.B. die Vitalitätsraten absinken. Eine gesunkene Vitalität bedeutet mehr tote Zellen in der Kultur, welche schädigende Zellinhalte wie z.B. Proteasen an die Fermentationsbrühe abgeben.

Die neue Puffersubstanz sollte in zweiter Priorität kostengünstig sein, keine besonderen Anforderungen an Lagerung und Handhabung stellen und von verschiedenen Lieferanten zu beziehen sein.

Der zweite Schritt/ ein weiterer Schritt auf dem Wege zur pC0 ₂ -Regelung im Fermentationssystem ist ein optimales C0 ₂ Profil zu etablieren welches den Stoffwechsel der Zellen positiv beeinflusst indem weniger toxische Stoffwechselprodukte gebildet werden (Laktat, Ammonium) und/oder die Zugaben von Säure und Lauge zur pH Regelung minimiert. Dabei wird das optimale Profil der entsprechenden Wachstumsphase angepasst (Anwachsphase, Wachstumsphase, Absterbephase) mit dem Ziel die Anwachsphase zu verkürzen, die Wachstumsphase zu verlängern und die spezifische Produktbildungsrate während der Wachstumsphase zu erhöhen. Das gewählte C0 ₂ Profil dient somit der gezielten Steuerung des Prozesses und wird in mehrere Regelabschnitte unterteilt: Ein niedriger pC0 ₂ in der Anwachsphase (<10% tbd, bevorzugt 3-8% bzw. 3-5%, besonders bevorzugt 5% oder 3%>) begünstigt ein schnelleres Anwachsen der Zellen, ein mittlerer pC0 ₂ (<12%> tbd, bevorzugt 5-1 1%) in der Wachstumsphase begünstigt eine hohe Wachstumsrate und besseren Stoffwechsel wodurch weniger Laktat gebildet wird als bei höherem pC0 ₂ , während ein leicht erhöhter bzw. hoher pC0 ₂ (>5%>, >8%>, >15%> tbd, bevorzugt 5-10%) in der Absterbephase einer Laugezugabe entgegenwirkt und somit zu einer Erniedrigung des osmotischen Drucks und somit zur Verlängerung der Produktivitätsphase beiträgt.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Skalierbarkeit und insbesondere die Übertragbarkeit eines Prozesses über die verschiedenen Fermentervolumina hinweg. In herkömmlichen Fermentationssystemen hängt der pC0 ₂ von den verwendeten Gerätschaften (=Equipment) und dem Maßstab (=scale) ab und nimmt traditionell mit Maßstabs Vergrößerung zu. Diesem Phänomen kann nicht entgegengewirkt werden ohne gleichzeitig den Stoffwechsel der Zelle zu verändern, da in herkömmlichen Systemen der pC0 ₂ mit der Begasung und der pH Regelung gekoppelt ist. Durch Entkopplung der pC0 ₂ -Regelung von pH- und Begasungsregelung (genauer p0 ₂ -Regelung) durch das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Puffersystem in Kombination mit der pC0 ₂ - Regelung, lässt sich eine Maßstabsvergrößerung einfach und ohne grundlegende Veränderung der Fermentationscharakteristika (=Performance) durchführen, dabei werden Begasungs- (genauer p0 ₂ -), pH- und p C 0 ₂ -Regelung jeweils separat übertragen und sichern somit eine vergleichbare Zellkulturperformance in allen Fermantationsmaß Stäben.

Die vorliegende Erfindung erreicht diese Zielsetzung durch die Bereitstellung einer Methode zur Optimierung eines biopharmazeutischen Produktionsprozesses und umfasst folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C6H15N06S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C3H7Na206P x 5 H20, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C0 ₂ -bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass in der Anwachsphase ein niedriger pC0 ₂ eingestellt wird. Bevorzugt ist eine Regulierung des pC0 ₂ mit C0 ₂ und/ oder N ₂ .

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält: (i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES)

und/ oder (ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß).

Bei der geregelten Fermentation im Bioreaktor wird der pH- Wert über das Eingasen von C0 ₂ und die Zugabe von flüssiger Lauge, z.Bsp. Na ₂ C0 ₃ geregelt. Um jedoch den pH- Wert unabhängig von pC0 ₂ regeln zu können, muss das Puffersystem und dazugehörige pH-Regulierung mit Agenzien erfolgen, welche nicht C0 ₂ frei setzten. Durch die Elimination von C0 ₂ -bildendem Puffer und Säure/Base wird eine unabhängige Regelung von DO (dissolved oxygen, p0 ₂ ) und pC0 ₂ erst möglich. Zusätzlich tragen sowohl das Puffersystem als auch Säure/Base massgeblich zur Osmolalität (Osmo) bei. Das C0 ₂ unabhängige Puffersystem mit Säure/Base wurde deshalb speziell bezüglich Osmoreduktion entwickelt Die pC0 ₂ ^" Regelung trägt als zusätzliche Regelgrösse zur Optimierung von Bioprozessen bei und wird eingesetzt zur Steigerung der Prozessperformance durch Opitmierung des pC0 ₂ Profils, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Verbesserung der Skalierbarkeit.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Methode ist eine deutliche Verbesserung der spezifischen Produktbildungsrate/ spezifischen Produktivität. W e i t e rhin kann die Produktqualität, die Fermentationsdauer und der Zellstoffwechsel generell positiv beeinflusst werden. Das heißt beispielsweise, dass die Fermentationsdauer in einem Fed-Batch Verfahren verlängert werden kann bei gleichzeitig höherer Produktausbeute.

Die Implementierung einer weiteren Regelgrösse (pC0 ₂ ) ermöglicht eine bessere Prozessoptimierung. Das pH Profil, das Temperatur Profil, das Drehzahl Profil, das 0 ₂ Profil, das pC0 ₂ Profil können unabhängig voneinander optimiert werden. Die optimierten Bedingungen tragen dann massgeblich zu einer erhöhten Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit auf verschiedenen Bioprozesse und Herstellungsmassstäbe bei. Hierbei ist wichtig, dass nur eine Entkopplung dieser drei benannten Regelgrößen durch Einführung einer separaten pC0 ₂ Regelung mit neuem Puffersystem eine unabhängige Maßstabsübertragung ermöglicht, in herkömmlichen Systemen beeinflussen sich die 3 Regeigrössen gegenseitig und zwar unterschiedlich stark je nach Maßstab. Deshalb ist es in herkömmlichen Systemen nicht möglich diese 3 Regeigrössen identisch zu übertragen.

Das osmoreduzierte Säure-Base-Puffersystem führt zu einer erhöhten Zellvitalität, steigert die zellspezifische Produktivität und ermöglicht eine weitere Produktivitätssteigerung durch Verlängerung der Prozesszeit. Erfindungsgemäß bevorzugte Säuren und Laugen zur pH-Regulierung sind NaOH (Natronlauge) Essigsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzäure. Bevorzugt sind Salzsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure. Eine besonders bevorzugte Säure ist Schwefelsäure. Ein weiterer Benefit durch das neue, NaHC0 ₃ -freie Medium, ergibt sich im Bereich der Analytik: Bei einigen Versuchen in der Zellkulturtechnik ist es wichtig, die Kohlenstoffdioxid-Bildungstrate (CER) zu bestimmen. Durch Elimination der C0 ₂ Quellen Puffer, Base und Säure wird eine Kohlenstoffbilanzierung, z.Bsp. über Abgasanalytik überhaupt ermöglicht und zur Prozessoptimierung eingesetzt bzw. einsetzbar.

Die Kohlenstoffbilanzierung erfolgt über die Erfassung, z.B. über Abluftanalytik. Die neue Regelstrategie ermöglicht eine exakte Kohlenstoffbilanzierung (z.Bsp. CER) welche als Optimierungstool eingesetzt wird. Die Kohlenstoffdioxid-Bildungsrate gibt an, welche Menge an C0 ₂ die Zellen eines Liters Kulturbrühe in einer Stunde bilden. Ist man gezwungen ein Zellkulturmedium zu verwenden, welches über Bicarbonat gepuffert ist, so ergeben sich Eigenheiten in der Bestimmung der Kohlenstoffdioxid-Bildungsrate. Im physiologischen pH-Bereich herrscht beim Gesamtkarbonat ein Gleichgewicht zwischen C0 ₂ und HC0 ₃ ^~ , welches vom pH- Wert beeinflusst wird. Zur Bilanzierung wird die Gaszusammensetzung bei Zugabe und bei Abgabe aus dem Fermenter analysiert. Die Bilanzierung fällt bisher bei NaHC0 ₃ -haltigen Medien schwer, da die eigentliche Speicherwirkung der Zellkulturbrühe unbekannt ist. Das neue, HC0 ₃ ^" bzw. C0 ₃ -freie Medium, das optimal auf die Zelle abgestimmt ist, eröffnet hier neue Möglichkeiten.

Ein weiterer Benefit der Erfindung ist die Verbesserung der Reproduzierbarkeit von Bioprozessen. Dies bedeutet, dass bei wiederholten Fermentatiopnsläufen in verschiedenen Skalierungen bei kontrolliertem pC0 ₂ vergleichbare Ergebnisse bezüglich Endtiter, Zellzahl, Metabolismus etc. erzielt werden. Bei Fermentationsläufen, die nicht pC0 ₂ kontrolliert ablaufen, können diese Parameter von Fermentationslauf zu Fermentationslauf zum Teil erheblich schwanken insbesondere bei unterschiedlicher Skalierung.

BESCHREIBUNGEN DER ABBILDUNGEN

Der Aufbau des verwendeten Bioreaktors wird anhand Beispiel 3 beispielhaft beschrieben. Der Aufbau des Bioreaktors ist jedoch prinzipiell variabel, um verschiedenen Anforderungen zu entsprechen. Zum Beispiel kann auf ein Steigrohr verzichtet werden und dafür eine weitere Sonde eingebaut oder weitere/andere Lösungen mittels Schlauchpumpen automatisch zugegeben werden.

ABBILDUNG 1 VERGLEICH P02 [%] MIT VARIABLER NAHC03- KONZENTRATION

Pufferbedingungen:

Kurve 1 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + NULL NaHC0 ₃ (komplett NaHC0 ₃ -frei)

Kurve 2 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + ImM NaHC0 ₃ Kurve 3 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + 4mM NaHC0 ₃

Kurve 4 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + 8mM NaHC0 ₃ + 20mM HEPES

Kurve 5 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + 8mM NaHC0 ₃

Kurve 6 = Medium A NaHC0 ₃ -frei + 36mM NaHC0 ₃ (Kontrolle)

ABBILDUNG 2 PUFFERSCREEN

A: Pufferscreen mit hohem pC02 Profil

SF01 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (1/2)

SF02 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (2/2)

SF03 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM (1/2)

SF04 = Medium NaHC03-frei mit HEPES-Puffer 60mM (2/2)

SF05 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (1/2)

SF06 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (2/2)

SF07 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (1/2)

SF08 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (2/2)

SF09 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (1/2)

SF10 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (2/2)

SF11 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (1/2)

SF12 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (2/2)

SF13 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (1/2)

SF14 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (2/2)

SF15 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mM (1/2)

SF16 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mm (2/2)

SF17 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (1/2)

SF18 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (2/2)

SF19 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (1/2)

SF20 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (2/2)

SF21 = Medium A (Kontrolle) (1/2)

SF22 = Medium A (Kontrolle) (2/2)

SF23 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei , NaHC0 ₃ -frei) (1/2) SF24 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei, NaHC0 ₃ -frei) (2/2) SF49 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1) SF50 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1) SF51 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1) SF52 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES-Puffer 40mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF53 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

B: Pufferscreen mit niedrigem pC02 Profil

SF25 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (1/2)

SF26 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (2/2)

SF27 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM (1/2)

SF28 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM (2/2)

SF29 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (1/2)

SF30 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (2/2)

SF ₃ 1 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (1/2)

SF32 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (2/2)

SF33 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (1/2)

SF34 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (2/2)

SF35 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (1/2)

SF36 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (2/2)

SF37 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (1/2)

SF38 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (2/2)

SF39 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mM (1/2)

SF40 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mM (2/2)

SF41 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (1/2)

SF42 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (2/2)

SF43 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (1/2)

SF44 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (2/2)

SF45 = Medium A (Kontrolle) (1/2)

SF46 = Medium A (Kontrolle) (2/2)

SF47 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei, NaHC0 ₃ -frei) (1/2)

SF48 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei, NaHC0 ₃ -frei) (2/2)

SF54 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF55 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF56 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF57 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES-Puffer 40mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF58 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1) C: Pufferscreen bezüglich Titer an Tag 8 und 11

SF01 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (1/2)

SF02 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer lOOmM (2/2)

SF03 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM (1/2)

SF04 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM (2/2)

SF05 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (1/2)

SF06 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer lOOmM (2/2)

SF07 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (1/2)

SF08 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM (2/2)

SF09 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (1/2)

SF10 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 50mM (2/2)

SF11 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (1/2)

SF12 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM (2/2)

SF13 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (1/2)

SF14 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 80mM (2/2)

SF15 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mM (1/2)

SF16 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES 40mM (2/2)

SF17 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (1/2)

SF18 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base 50mM (2/2)

SF19 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (1/2)

SF20 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base lOOmM (2/2)

SF21 = Medium A (Kontrolle) (1/2)

SF22 = Medium A (Kontrolle) (2/2)

SF23 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei NaHC0 ₃ -frei) (1/2)

SF24 = Medium A Blank (=Medium A MOPS-frei NaHC0 ₃ -frei) (2/2)

SF49 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit HEPES-Puffer 60mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF50 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit MOPS-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF51 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF52 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit TES-Puffer 40mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1)

SF53 = Medium NaHC0 ₃ -frei mit Trizma-base-Puffer 50mM + NaHC0 ₃ 8mM (1/1) ABBILDUNG 3 PC0 ₂ REGELUNG

Die Abbildung 3 zeigt grafisch den Verlauf der internen pC0 ₂ Messung (Sonde mit automatischer Datenarchivierung) und des externen Messwertes am Blutgasanalyseautomat (BGA) aufgetragen über die Zeit. Die mit einem Pfeil markierte erste Kalibration (Abgleich zwischen C0 ₂ Sonde und BGA) an Tag 0 (dO) zeigt wenig Effekt, da das Regelverhalten noch zu unruhig ist. Ab der 2. Kalibration (2. Pfeil) an Tag 4 (d4) ist eine gute Übereinstimmung zwischen internem und externem Messwert zu erkennen. Achsendarstellung: pC0 ₂ -online vs pC0 ₂ -BGA

Kurve A = C0 ₂ -Messwert intern (via C0 ₂ -Sonde, Fa. Mettler Toledo)

Kurve B = C0 ₂ -Messwert extern (via BGA Rapidlap, Fa. Siemens)

ABBILDUNG 4 NORMALE LEBENDZELLZAHLKONZENTRATION (A) BZW. TITERKONZENTRATION (B)

A: Lebendzellzahlkonzentration (Vgl. pC0 ₂ -Geregeh7Ungeregelt)

A = FS 33.1 Medium B NaHC0 ₃ ^~ -frei MOPS-frei + 40mM TES (pC0 ₂ -geregelt) pH- Agens: NaOH B = FS 32.2 Medium B NaHC0 ₃ -frei MOPS-frei + 40mM TES+ 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: NaOH

C = FS 32.3 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES + 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: Na ₂ C0 ₃

B: Normierter Titer (Vgl. pC0 ₂ -Geregeh7Ungeregelt)

A = FS 33.1 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES (pC0 ₂ -geregelt) pH-Agens: NaOH B = FS 32.2 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES + 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: NaOH

C = FS 32.3 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES+ 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: Na ₂ C0 ₃

ABBILDUNG 5 VERGLEICH PUFFERSYSTEME

A: pC0 ₂ -Profil geregelt/ungeregelt

A = FS 33.1 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES (pC02-geregelt) pH-Agens: NaOH B = FS 32.2 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES + 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: NaOH

C = FS 32.3 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + 40mM TES + 8mM NaHC0 ₃ (ungeregelt) pH- Agens: Na ₂ C0 ₃

B: pC02-Profil geregelt(lx) /ungeregelt(5x) I = FS 32.2 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + TES 40mM + NaHC0 ₃ 8mM (NaOH)

II = FS 33.1 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + TES 40mM (pC02-geregelt) (NaOH)

III = FS 32.4 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + Sod-ß 25mM (NaOH)

IV = FS 32.5 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 12mM (NaOH)

V = FS 33.3 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + NaHC0 ₃ 36mM (Vergl.-Kontrolle) (NaOH)

VI = FS 33.5 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + NaHC0 ₃ 8mM (NaOH)

C: Normierter Titer

I = FS 32.2 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + TES 40mM + NaHC0 ₃ 8mM (NaOH)

II = FS 33.1 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + TES 40mM (pC02-geregelt) (NaOH)

III = FS 32.4 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + Sod-ß 25mM (NaOH)

IV = FS 32.5 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 12mM (NaOH)

V = FS 33.3 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + NaHC0 ₃ 36mM (Vergl.-Kontrolle) (NaOH)

VI = FS 33.5 Medium B , NaHC0 ₃ -frei , MOPS-frei + NaHC0 ₃ 8mM (NaOH)

Die mit TES Puffer erreichten Produkttiter bzw. Produktkonzentrationen sind auf gleichem Niveau wie diejenigen der Kontrolle.

ABBILDUNG 6 VERGLEICH PUFFERSYSTEME NORMIERTE PRODUKTKONZENTRATION Läufe 1.1 bis 1.6 in Abbildung 6 mit C0 ₂ -Regelung und NaOH 1,2M als Lauge.

1.1 = FS 33.1 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + TES 40mM

1.2 = FS 33.2 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + TES 40mM + NaHC0 ₃ 8mM

1.3 = FS 33.2 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM

1.4 = FS 33.2 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 8mM

1.5 = FS 33.2 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 12mM

1.6 = FS 33.2 Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM + NaHC0 ₃ 16mM

ABBILDUNG 7 VERGLEICH C0 ₂ -PROFILE

Läufe 3.1 bis 3.5 in Abbildung 7 mit C0 ₂ -Regelung, NaOH 1 ,2M als Lauge und mit Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM

Verschiedene C0 ₂ -Profile:

3.1 = Tag 0-3 5% C0 ₂ , Tag 3-11 3% C0 ₂

3.2 = Tag 0-2 8% C0 ₂ , Tag 2-11 6% C0 ₂

3.3 = Tag 0-4 8% C0 ₂ , Tag 4-8 10% C0 ₂ , Tag 8-11 8% C0 ₂

3.4 = Tag 0-1 8% C0 ₂ , Tag 1-2 6% C0 ₂ , Tag 2-7 8% C0 ₂ , Tag 7-11 5% C0 ₂

3.5 = Tag 0-11 3% C0 ₂ ABBILDUNG 8 SÄUREVERTRÄGLICHKEIT MIT EINSATZ DER NA-SALZE

SFl-10 mit Einsatz des Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25 mM und Zugabe verschiedener Na-Salze an Tag 3:

SF1 = Zugabe von Wasser (für Kontrolle)

SF2 = Zugabe von Wasser (für Kontrolle)

SF3 = Zugabe von Natriumchlorid (für Salzsäure)

SF4 = Zugabe von Natriumchlorid (für Salzsäure)

SF5 = Zugabe von Natriumacetat (für Essigsäure)

SF6 = Zugabe von Natriumacetat (für Essigsäure)

SF7 = Zugabe von Natriumsulfat (für Schwefelsäure)

SF8 = Zugabe von Natriumsulfat (für Schwefelsäure)

SF9 = Zugabe von Di-Natriumhydrogenphosphat (für Phosphorsäure)

SF10 = Zugabe von Di-Natriumhydrogenphosphat (für Phosphorsäure)

ABBILDUNG 9 VERGLEICH VERSCHIEDENER SÄUREN

Läufe 4.3 bis 4.5 in Abbildung 9 mit C0 ₂ -Regelung, NaOH 1,2M als Lauge, mit Medium B, NaHC0 ₃ - frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM und Zugabe verschiedener Säuren (50 mL) an Tag 3:

4.3 = Zugabe von Salzsäure 99mM

4.4 = Zugabe von Phosphorsäure 81mM

4.5 = Zugabe von Schwefelsäure 54mM

ABBILDUNG 10 VERGLEICH STANDARDPROZES S OHNE C0 ₂ -REGELUNG MIT C0 ₂ - GEREGELTEM PROZESS

4.1 = Medium B, Na ₂ C0 ₃ IM als Lauge, ohne C0 ₂ -Regelung (Standardprozess)

4.3 = Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM, NaOH 1,2M als Lauge, mit C0 ₂ -Regelung und Zugabe von Salzsäure 99mM

4.4 = Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM, NaOH 1,2M als Lauge, mit C0 ₂ -Regelung und Zugabe von Phosphorsäure 81mM

4.5 = Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM, NaOH 1,2M als Lauge, mit C0 ₂ -Regelung und Zugabe von Schwefelsäure 54mM ABBILDUNG 11 VERGLEICH C0 ₂ -PROFILE MIT MODELLZELLE 2

(A) Normierte Zellkonzentration, (B) Normierte Produktkonzentration, (C) C0 ₂ Profile

Läufe KFl bis KF5 in Abbildung 11 mit C0 ₂ -Regelung, NaOH 1,2M als Lauge und mit Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß 25mM

Verschiedene C0 ₂ -Profile:

KFl = Tag 0-11 3% C0 ₂

KF2 = Tag 0-3 7% C0 ₂ , Tag 3-11 3% C0 ₂

KF3 = Tag 0-3 11% C0 ₂ , Tag 3-11 3% C0 ₂

KF4 = Tag 0-3 7% C0 ₂ , Tag 3-7 11% C0 ₂ , Tag 7-11 7% C0 ₂

KF5 = Tag 0-3 7% C0 ₂ , Tag 3-7 11% C0 ₂ , Tag 7-11 3% C0 ₂

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Experimente zeigen beispielhaft:

Resultat 1: Die Reduzierte NaHC03 Konzentration von 12mmol/L und speziell von 8mmol/L zeigt ein vorteilhaftes, der Kontrolle ähnliches p0 ₂ Profil (Zellwachstum).

Resultat 2:

-> Identifizierung der besten Puffersubstanzen bei NaHC0 ₃ freiem Zellkulturmedium bzw. bei NaHC0 ₃ erniedrigtem (=8mmol/L) Zellkulturmedium.

-> Die besten Puffersubstanzen sind: TES (z.B. 40mmol/L) und Sod-ß (z.B. 25mmol/L)

In Abbildung 2A ist ersichtlich, dass alle Puffermedienansätze bis auf Trizma-base (SF19 und SF20) mit Konzentration I Zellwachstum zeigen. Das beste Wachstum zeigen die beiden Kontrollen (SF21 und SF22), doch ist der Unterschied zu den Puffermedienansätzen, zumindest bis d8, relativ klein. Die drei besten Puffer, rangierend bei einer Zelldichte um 45, sind Sod-ß / H; TES / K + NaHC0 ₃ / D und MOPS / F + NaHC0 ₃ / D. Trizma-base läuft in jeglicher Konzentration schlecht, der pH ist zwar stabil aber evtl. liegt eine Toxizität vor.

In Abbildung 2B ist der Maßstab von Abbildung 2A beibehalten worden. Dabei sieht man deutlich, dass die erreichten Zelldichten bei diesem C0 ₂ -Profil wesentlich geringer ausfallen. Die Kontrollen schneiden zwar auch hier am Besten ab, doch ist eine maximale Zelldichte von 20 nicht akzeptabel. Die zwei besten Pufferansätze, rangierend bei einer Zelldichte um 18, sind hier Sod-ß / H + NaHC0 ₃ / D und MOPS / F. Aus diesem Grund beschränkt sich die weitere Auswertung primär auf die Shakeflasks aus Brutschrank 1 mit dem dazugehörigen C0 ₂ -Profil.

Generell ist die Kombination mit NaHC0 ₃ / D bei den niedrigen Pufferkonzentrationen vorteilhaft. In Abbildung 2C sind die erreichten Titerkonzentrationen (normiert) aufgetragen. Bis auf wenige Ausnahmen ist ein ansteigender Titer zwischen d8 und dl 1 erkennbar. Der Zugewinn ist dabei bei den Shakeflasks SF49 bis SF52, den Medien mit der reduzierten NaHC0 ₃ -Konzentration, sogar mehr als zehnfach!

Bemerkenswert ist auch die Tatsache, dass erstmals mit einer neuen Puffersubstanz im Medium die herkömmliche Kontrolle (SF21 u. SF22) überholt wurde: SF52 mit TES / K + NaHC0 ₃ / D liefern am dl 1 mit norm. Produktkonzentration 83,6 ein sehr gutes Ergebnis.

Resultat 3

Aus den pC0 ₂ Regelungsexperimenten ist ersichtlich, dass mit einem pC0 ₂ -Sollwert von 2% eine kritische Untergrenze erreicht wird, welche im Prozess nicht sinnvoll erscheint.

Resultat 4:

Abbildung 4 A und B zur normalen Lebendzellzahlkonzentration (A) bzw. Titerkonzentration (B) zeigt, dass die zellspezifische Produktbildungsrate des geregelten Fermentationslaufes (Kurve mit Dreiecksymbol) höher ist als diejenige des vergleichbaren ungeregelten Fermentationslaufes (Kurve mit Raute). Weiterhin zeigen die Versuche aus Abbildung 4, dass die pH-Regelung mit NaOH tendenziell eine bessere Produktbildungsrate aufweist als diejenige mit Na ₂ C0 ₃ . Bei einer weiteren Optimierung des pC0 ₂ Profils wird die spezifische Produktbildungsrate weiter erhöht. Die Lebendzellzahldichte des pC0 ₂ -geregelten Laufs (FS 33.1) weicht, wie in Abbildung 4B ersichtlich um maximal 20 Einheiten voneinander ab. Ab dlO streuen auch die beiden Vergleichsläufe gering, sonst wird eine gute Übereinstimmung erzielt. Das niedrigere Niveau von FS 33.1 kann aus dem höheren pC0 ₂ -Profil resultieren und ist nicht negativ zu interpretieren. Die Vitalität (nicht gezeigt) ist bei allen Läufen auf gleichem Niveau. Die Laugenverbräuche (nicht gezeigt) sind bei allen Läufen gering. Bei FS 32.2 (höchste Lebendzellzahlkonzentration) muss gegen Ende der Fermentation (d9-dl l) erwartungsgemäß mehr Lauge zugegeben werden. Trotzdem weißt dieser Lauf am Fermentationsende mit 393 mosmol/kg die geringste Osmolalität auf (nicht gezeigt). In Abbildung 4A ist ersichtlich, dass FS 33. 1 trotz geringerer Zellzahl als FS 32.3 eine höhere Titerkonzentration aufweißt. Die Konzentration liegt im oberen Drittel der Streuung zwischen den beiden identischen Fermentationsläufen FS 32.2 und FS 32.3. Das heißt, dass der Fermentationslauf mit der pC0 ₂ - Regelung eine höhere spezifische Produktbildungsrate besitzt.

Resultat 5:

-> Optimalerweise läuft ein Fermentationslauf unter folgenden Bedingungen ab: TES-Puffer (bzw. Sod-ß Puffer) komplett ohne NaHC0 ₃ und mit pC0 ₂ Regelung. Hiermit werden die besten Endtiter erreicht.

Abbildung 5A zeigt, dass sich das pC0 ₂ Profil des geregelten Fermentationslaufes (FS33.1) deutlich von den Vergleichsfermentationen (FS32.2 und FS32.3) abhebt. FS32.2 und FS32.3 werden zum Vergleich herangezogen obwohl sie einen geringen Anteil von NaHC03 aufweisen, da aufgrund einer Kontamination ein identischer Vergleichspartner entfallen ist. Das durch die Regelung erzielte pC0 ₂ Profil hebt sich im ersten Drittel der Fermentation deutlich von den Vergleichsläufen ab und folgt der Sollvorgabe (siehe Abbildung 5B, dl-d3 pC0 ₂ = 8%, d3-d6 pC0 ₂ = 6%, d6-d8 pC0 ₂ = 2% und von d8-dl 1 pC0 ₂ = 4%) weitestgehend. Beim Erzwingen eines niedriger als normalen pC0 ₂ Wertes (Tag 6-8, d6-d8) wird Stickstoff eingegast um C0 ₂ auszutreiben. Es ist festzustellen, dass der niedrige Sollwert nie erreicht wird und ein pC0 ₂ Wert von 3.2% eine kritische Untergrenze darstellt für die Regelung. Bei der dabei erhöhten Anforderung von Stickstoff wird im Zusammenhang auch Sauerstoff ausgetrieben, welcher durch einen höheren Sauerstoffvolumenstrom ausgeglichen wird. Es kann einer kritischen Gesamtgasmenge erreicht werden, bei welcher eine unverhältnismäßig große Schaumbildung festzustellen ist.

Aus Abbildung 5B ist ersichtlich, dass sich der geregelte Fermentationslauf auch von allen anderen Vergleichsläufen überraschend deutlich abhebt. Das heißt, dass das durch die Regelung eingestellte pC0 ₂ Profil tatsächlich auf der Sollvorgabe (dl-d3 pC0 ₂ = 8%, d3-d6 pC0 ₂ = 6%, d6-d8 pC0 ₂ = 2% und von d8-dl 1 pC0 ₂ = 4%) beruht und nicht zufällig zustande kommt.

Abbildung 5C zeigt, dass die mit TES ohne NaHC0 ₃ bzw. TES mit 8mmol/L NaHC0 ₃ erreichten Titerkonzentrationen vergleichbar sind mit der Kontrolle (NaHC0 ₃ basierter Puffer mit einer Konzentration von 36mmol/L). Der Lauf mit TES ohne NaHC0 ₃ (geregelt) erreicht trotz zufällig gewählten und nicht optimierten pC0 ₂ Profil eine Endkonzentration (Titer), welche sich um lediglich 6.10% (gemessen an der Kontrolle) von der Kontrolle unterscheidet. Der Lauf mit TES plus 8mmol/L NaHC0 ₃ (ungeregelt) erreicht eine Endkonzentration (Titer), welche sich um lediglich 0.01 % (gemessen an der Kontrolle) von der Kontrolle unterscheidet. Dies zeigt vollkommen überraschend, dass NaHC0 ₃ vollständig durch TES ersetzt werden kann. Weiterhin zeigt dies, dass das Ergebnis des Laufs mit TES plus 8mmol/L NaHC0 ₃ (ungeregelt) die gleiche Endtiterkonzentration erreicht wie die Kontrolle.

Resultat 6:

Für das Erreichen einer möglichst hohen Produktkonzentration ist der Einsatz von NaHC0 ₃ im Medium überraschenderweise ni c ht erforderl i ch . D i e in Abb i l dung 6 darg e ste l lten Produktkonzentrationen beider Läufe mit Einsatz von TES (1.1 , 1.2) weisen erstaunlicherweise sowohl mit als auch ohne Einsatz von NaHC0 ₃ im Medium die gleichen Produktkonzentrationen auf. Bei den Läufen mit Einsatz von Sod-ß sind die erreichten Produktkonzentrationen ebenfalls nicht von der eingesetzten Menge an NaHC0 ₃ im Medium abhängig, da in allen Läufen (1 .3-1.6) eine ähnliche maximale Produktkonzentration an Tag 1 1 erreicht wird (siehe Abbildung 6).

I m C 0 ₂ -geregelten Fermentationsprozess ist der Einsatz von NaHC0 ₃ im M edium überraschenderweise nicht erforderlich. Ohne NaHC0 ₃ im Medium wird die C0 ₂ -Regelung im Prozess erleichtert, da durch das Medium kein C0 ₂ gebildet werden kann.

Resultat 7:

Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass ein niedriger C0 ₂ Partialdruck zu Anfang der

Fermentation ein kritischer Faktor für ein optimiertes Fermentationsergebnis ist.

Einen Fermentationsprozess mit einem hohen pC0 ₂ zu starten ist dagegen nicht von Vorteil.

Sowohl die Lebendzellkonzentrationen als auch die Produktkonzentrationen aller Läufe außer des

Laufes 3.2 mit unterschiedlichen pC0 ₂ -Profilen verlaufen ähnlich und erreichen ungefähr die gleichen

Maxima (siehe Abbildung 7A und 7B). Im Lauf 3.2 wachsen die Zellen schlechter und erreichen deshalb eine niedrigere Produktkonzentration.

Bei Betrachtung der zugehörigen pC0 ₂ -Werte in Abbildung 7C ist ein wesentlicher Unterschied des Laufes 3.2 im Vergleich zu allen anderen Läufen ersichtlich. Der pC0 ₂ an Tag 1 liegt im Lauf 3.2 über 8%). Dahingegen liegen die pC0 ₂ -Werte der anderen Läufe an Tag 1 alle unter 5%. Durch einen anfänglich hohen pC0 ₂ wird das Zellwachstum gehemmt.

Resultat 8:

Die in Abbildung 8 dargestellten Lebendzellkonzentrationen zeigen, dass das Zellwachstum durch die Zugabe von Natriumacetat (SF5 und 6) beeinträchtigt wird. Die Lebendzellzahlen steigen mit dem Einsatz von Natriumacetat nur leicht an und fallen bereits drei Tage nach Zugabe wieder ab, sodass von einer toxischen Wirkung des Natriumacetats ausgegangen werden kann. Aufgrund der nachgewiesenen Zelltoxizität wird die Essigsäure nicht als bevorzugte S äure für die pH-Regelung im Fermentationsprozess eingesetzt.

Alle anderen Salze zeigen keine toxischen Wirkungen auf das Zellwachstum und können zum Test im Fermentationsprozess eingesetzt werden. Bevorzugt werden Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure.

Resultat 9:

Durch die Zugabe von Salzsäure (4.3), Schwefelsäure (4.4) und Phosphorsäure (4.5) werden im Fermentationsprozess gleiche Produktkonzentrationen erreicht wie Abbildung 9B zeigt.

Bei Betrachtung der Lebendzellkonzentrationen dieser Ansätze (siehe Abbildung 9A) fällt auf, dass im Lauf 4.3 mit Zugabe von Salzsäure eine niedrigere Zellzahl als in den anderen Läufen erreicht wird. Da die Produktkonzentration jedoch genauso hoch ist wie in allen anderen Läufen, ist die Produktivität der Zellen durch Zugabe der Salzsäure höher.

Im Lauf 4.4 mit Zugabe von Schwefelsäure entsteht ab Tag 7 weniger Laktat als in den anderen Läufen wie Abbildung 9C zeigt. Da Laktat ab einer gewissen Konzentration toxisch auf die Zellen wirkt, ist eine niedrige Laktatkonzentration im Prozess von Vorteil.

Sowohl die Schwefelsäure als auch die Salzsäure sind im Fermentationsprozess von Vorteil. Die Schwefelsäure sorgt für eine geringe Laktatproduktion und die Salzsäure sorgt für eine hohe Produktivität der Zellen.

Resultat 10:

Beim Vergleich des Standardprozesses (4.1 ) mit den C0 ₂ -geregelten Prozessen mit Einsatz verschiedener Säuren (4.3 - 4.5) ergeben sich in allen Läufen ähnliche Produktkonzentrationen (siehe Abbildung 10). Im Lauf 4.5 mit Zugabe von Phosphorsäure wird annähernd die gleiche maximale Produktkonzentration erreicht wie im Lauf 4.1 (Standardprozess).

Der C0 ₂ . geregelte Prozess bringt im Vergleich zum Standardprozess keine Nachteile im Bezug auf die Produktkonzentration mit sich. Bei weiteren Optimierungen des C0 ₂ -geregelten Prozesses kann die Produktkonzentration im Vergleich zum Standardprozess sogar gesteigert werden. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse eine vergleichbare Performance bezüglich Zellwachstum und Produktivität und sogar bessere Performance durch niedrigere Laktatbildung wenn die getesteten Säuren zur pH Regelung eingestetzt werden.

Resultat 11:

Um das Ergebnis der Prozessperformance für unterschiedliche pC0 ₂ -Profile, wie in Resultat 7 beschrieben, auf eine breitere Datenbasis zu stellen, wird in Beispiel 9 ein weiterer Versuchsansatz mit unterschiedlichen pC0 ₂ -Profilen, diesmal mit einer anderen Modellzelle (CHO) durchgeführt.

Die unterschiedlichen pC0 ₂ -Profile, welche in diesem Versuchsansatz eingestellt werden, werden in Abbildung 1 IC wiedergegeben.

Wie in den Abbildungen I IA und I IB ersichtlich ist, hebt sich der Fermentationslauf KFl sowohl für das Zellwachstum als auch für den Verlauf der Produktkonzentration deutlich von der restlichen Kurvenschar ab. Dieser Fermenterlauf (KFl) wurde mit einem pC0 ₂ -Profil von Tag 0 bis Tag 11 bei 3% pC0 ₂ betrieben.

Mit diesem Versuchsansatz konnte somit bestätigt werden, dass der C0 ₂ Partialdruck zu Anfang der Fermentation (Anwachsphase, speziell Tag 0 bis 3) ein wichtiger Faktor für ein optimiertes Fermentationsergebnis darstellt.

Beispiel 9 bestätigt, dass ein gezielt geregelter niedriger C0 ₂ Partialdruck zu Anfang der Fermentation sowohl für das Zellwachstum als auch für den Verlauf der Produktkonzentration das beste Ergebnis liefert. Dies gilt auch bzw. insbesondere bei Verwendung HCO ₃ ^" bzw. C O ₃ ^2" Ionen reduzierter Kultivierungsmedien (insbesondere unter 12mmol/L bzw. bei 8mmol/L HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen) bzw. bei Verwendung komplett HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen freier Kultivierungsmedien.

DEFINITIONEN

Bevor die Erfindung nachfolgend anhand nicht-beschränkender Ausführungs-beispiele näher erläutert wird, sei darauf verwiesen, dass die Verwendung unbestimmter Artikel, beispielsweise„ein" oder „eine", sowie die bestimmter Artikel, wie „der", „die", „das" Einzahl u n d Mehrzahl des entsprechenden Begriffs einschließen, es sei denn, dass eine der beiden Formen explizit ausgeschlossen und auf eine bestimmte Form (Einzahl, Mehrzahl) verwiesen wird. So schließt der Begriff„eine Zelle" automatisch„mehrere Zellen" mit ein, es sei denn es wird explizit darauf verwiesen, dass nur eine einzige Zelle gemeint ist. Einzahl ist beispielsweise dort explizit gemeint, wo„ein" durch (1) ergänzt ist.

Unter einem „biopharmazeutischen Produktionsprozesses" versteht man die Produktion von Biomolekülen mittels eukaryotischen Zellen durch einen Fermentationsprozess. Dies umfasst insbesondere die Produktion von Proteinen wie Antikörpern in Säugerzellen wie CHO, NSO, PERC.6 Zellen.

Unter einem Biomolekül versteht man insbesondere ein Protein von Interesse bzw. ein DNA oder RNA Molekül wie beispielsweise RNAi, anti-sense RNA etc.

Die Optimierung eines biopharmazeutischen Produktionsprozesses meint die Anpassung der Medien und physikalischen Parameter im Fermentationsprozess. Diese umfassen beispielsweise pC0 ₂ , Rührerdrehzahl etc. Mit der Optimierung wird beispielsweise die Steigerung des Titers verbessert oder die Produktqualität (z.B. verändertes Glykosylierungsmuster des Proteins oder andere posttranslationale Modifikationen eines Proteins) oder die Robustheit des Prozesses (Unempfindlichkeit gegenüber kleineren Prozessschwankungen, kleine Änderung hat keine Auswirkung auf den Prozess).

Der Begriff„nicht C0 ₂ -bildende Säure und/oder Lauge" meint Säuren und Laugen, die durch chemische Reaktion kein C0 ₂ abgeben, z.Bsp. NaOH, HCl, H ₃ P0 ₄ , CH ₃ COOH, H ₂ S0 ₄ .

„Regulierung des pC0 ₂ " bedeutet, dass der C0 ₂ -Partialdruck in der Fermentationslösung auf einem Sollwert gehalten / eingestellt wird. Dies geschieht beispielsweise über Zufuhr von C0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ und/oder Luft während des Bioprozesses. In der vorliegenden Erfindung erfolgt die„Regulierung des pC0 ₂ " bevorzugt durch Begasung mit C0 ₂ und /oder N ₂ .

„Komplett HC0 ₃ ^" bzw. C0 ₃ ^2" Ionen frei" bedeutet, dass das von Tag 0 an bis zum Ende der Fermentation eingesetzte Medium HC0 ₃ ^" bzw. C0 ₃ ^2" Ionen frei ist. Es werden dem Medium von Tag 0 an bis zum Ende der Fermentation auch keine HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen über separate Zugaben („Feeds") zugeführt.

Unter einer „Fed-Batch" Fermentation / einem„Fed-Batch" Verfahren bzw. einem„Fed- Batch" Prozess versteht man einen Fermentationsprozess, welcher durch einen Zustrom an Substraten bis zum maximalen Füllstand betrieben wird. Der Begriff Fed-Batch leitet sich vom englischen fed „gefüttert" und batch„Stapel" ab. Manchmal wird statt dem Begriff Fed-Batch Verfahren auch der Begriff Zulauf- Verfahren verwendet. Der Begriff„Fed-Batch" Fermentation /„Fed-Batch" Verfahren bzw.„Fed-Batch" Prozess ist ein in der Verfahrenstechnik etablierter Begriff. Man bezeichnet damit Prozesse, die als „Stapel", das heißt nacheinander, abgearbeitet werden und durch einen Zustrom (Zufütterung) an Edukten (Ausgangsstoffe) bis zum maximalen Füllstand betrieben werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die „Fed-Batch" Fermentation / das„Fed- Batch" Verfahren bzw. der„Fed-Batch" Prozess bevorzugt in drei (3) Abschnitte unterteilt: Anwachsphase, Wachstumsphase, Absterbephase. Die Dauer einer„Fed-Batch" Fermentation ist zeitlich beschränkt. Bevorzugt beträgt die gesamte Dauer der„Fed-Batch" Fermentation / des„Fed- Batch" Verfahrens bzw. des„Fed-Batch" Prozesses 8-15 Tage, besonders bevorzugt 11 Tage.

Die „Fed-Batch" Fermentation / das„Fed-Batch" Verfahren bzw. der„Fed-Batch" Prozess unterscheidet sich von anderen Kultivierungsverfahren wie der Perfusionskultur bzw. Fermentation im Perfusionsverfahren oder der kontinuierlichen Kultivierung. Bei der Perfusionskultur wird der Inkubationsreaktor mit der Zellkultur ständig von einem Mediumfluss durchspült. Dies stellt gleich bleibende Konzentrationsverhältnisse der Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Antibiotika etc., den Abtransport von Stoffwechselendprodukten sowie Nachahmung natürlicher physiologischer und metabolischer Umgebungsbedingungen (Blutkreislauf, Diffusion und Kreislauf von Gewebeflüssigkeit) sicher.

Die„spezifische Produktivität" oder„spezifische Produktbildungsrate" einer Zelle gibt die Menge eines bestimmten Proteins an, die von einer Zelle pro Zeiteinheit produziert, d.h. bei sekretierten Proteinen ins Medium abgegeben wird. Die spezifische Produktivität berechnet sich aus dem Quotienten der Konzentration des Produktes im Medium (=Titer, bestimmt, z.B. über ELISA) und der Anzahl der über den betrachteten Zeitraum vorhandenen produzierenden Zellen, auch bezeichnet als „IVC" (Integral der Lebendzellzahl über die Zeit). Die spezifische Produktivität wird üblicherweise in ,pcd' (= pg/cell*day = Picogramm sezerniertes Protein pro Zelle und Tag) angegeben). Der Begriff „serumfrei" meint Kulturmedien wie auch Kultivierungsbedingungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Zellen in Abwesenheit von tierischem und/oder humanem Serum, vorzugsweise in Abwesenheit von jeglichen aus Serum isolierten Proteinen, vorzugsweise in Abwesenheit von nicht rekombinant gewonnenen Proteinen kultiviert werden. Folglich meint der Ausdruck„an serumfreie Bedingungen adaptierte Zellen" solche Zellen, die in Abwesenheit von tierischem oder humanem Serum bzw. Serumproteinen vermehrt werden können.

Der Begriff„proteinfrei" meint, dass das Kulturmedium keine tierischen Proteine enthält, wobei aus Bakterien, Hefen oder Pilzen isolierte Proteine nicht als tierische Proteine verstanden werden.

Der Begriff„chemisch definiert" beschreibt ein Zellkulturmedium, welches serumfrei, vorzugsweise auch proteinfrei ist, und das aus chemisch definierten Substanzen besteht. Chemisch definierte Medien bestehen somit aus einer Mischung aus vorwiegend reinen Einzelsubstanzen. Ein Beispiel für ein chemisch definiertes Medien ist beispielsweise das CD-CHO-Medium der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, US).

Der Ausdruck„eine in Suspension kultivierbare Zelle" bezieht sich auf Zellen, die an das Wachstum in flüssigen Kulturen („Suspensionskulturen") adaptiert sind und deren Fähigkeit zu Adhäsion an Gefäßoberflächen, beispielsweise an Zellkulturschalen / -Haschen eingeschränkt bzw. verloren gegangen ist. Zellen, die sowohl an serumfreies Wachstum als auch an das Wachstum in Suspension adaptiert sind, werden als„an serumfreies Medium adaptierte und nicht adhärente Zellen" bezeichnet.

Der Begriff „Gen von Interesse" oder „rekombinantes Gen von Interesse" umfasst eine Nukleotidsequenz beliebiger Länge, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Das Genprodukt oder auch„Produkt von Interesse" ist in der Regel ein Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Fragment oder Derivat davon. Es kann aber auch RNA oder antisense RNA sein. Das Gen von Interesse kann in voller Länge, in verkürzter Form, als Fusionsgen oder markiertes Gen vorliegen. Es kann sich um genomische DNA oder vorzugsweise cDNA bzw. entsprechende Fragmente oder Fusionen handeln. Das Gen von Interesse kann die native Gensequenz darstellen, mutiert oder auf sonstige Weise modifiziert sein. Derartige Modifikationen schließen Codon-Optimierungen zur Anpassung an eine bestimmte Wirtszelle und eine Humanisierung ein. Das Gen von Interesse kann z.B. für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, kernlokalisiertes, membrangebundenes oder zelloberfiächengebundenes Polypeptid kodieren.

Der Begriff„Produkt von Interesse" bezieht sich auf biopharmazeutisch bedeutsame Substanzen wie Proteine / Polypeptide, aber auch auf DNA und RNA Moleküle (wie beispielsweise siRNA, antisense RNA) und auf weitere Produkte wie z.B. Viren, virale Partikel etc.. Der Begriff „Protein von Interesse" bezieht sich auf biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassend z.B. Antikörper, Enzyme, Cytokine, Lymphokine, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente. Ein Protein / Produkt von Interesse ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt. Im Allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam bzw. von Interesse, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können. Andere Proteine von Interesse sind beispielsweise Proteine/Polypeptide, die zur Veränderung der Eigenschaften von Wirtszellen im Rahmen des sogenannten„Cell Engineering" verwendet werden, wie z.B. anti-apoptotische Proteine, Chaperone, Stoffwechselenzyme, Glykosylierungsenzyme sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt.

Der Ausdruck„Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Zudem können die Polypeptide multimerisieren und Homo- und Heteromere bilden.

Unter„rekombinanten Proteinen" versteht man Proteine, welche durch rekombinante Expression in Wirtszellen produziert werden. Solche rekombinanten Proteine werden unter höchsten Reinheitsauflagen produziert, um das Kontaminationsrisiko möglichst gering zu halten. Rekombinante Proteine werden üblicherweise in passenden Wirtszellen produziert wie z.B. Hefezellen, tierische Zellen oder prokaryotische Zellen (E. coli oder andere Bakterienstämme) indem ein Expressionsvektor wie beispielsweise ein Plasmid, Bakteriophage, nackte DNA oder ein Virus benutzt wird, um das rekombinante Protein in die Wirtszelle einzuführen.

Ein rekombinantes Protein wird von einem rekombinanten Gen kodiert und von einer rekombinanten Zelle exprimiert.

Rekombinante Proteine werden üblicherweise gereinigt als konzentrierte Protein-Lösungen oder in Pulverform kommerziell angeboten. Rekombinantes HSA ist beispielsweise von diversen kommerziellen Anbietern wie Sigma Aldrich erhältlich. Beispiele für therapeutische Proteine sind Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon (hGH) und andere Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Erythropoetin (EPO), Cytokine, beispielsweise Interleukine (IL) wie IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN)-alpha, beta, gamma, omega oder tau, Tumornekrosefaktor (TNF) wie z.B. TNF-alpha, beta oder gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Weitere Beispiele sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (single chain) Antikörper und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fe und Fc'- Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente. Die Antikörper können humanen oder nichthumanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und chimäre Antikörper kommen in Frage.

Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind F(ab')2-Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.

Durch Genklonierung können auch verkürzte Antikörperfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv- Fragmente (Fragment variable = Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv- Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv-Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv- Antikörpern sind bekannt und beschrieben.

In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimeri sierung der s cFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3- Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil strueture") wie die Leucin-Zipper-Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL-Regionen des scFv- Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia-, Tri- und Pentabodies).

Als„Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv-Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VH/VL-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur. Als„Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv-Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die CH3 -Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt IgGl, als Dimerisierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv- Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Linker-Region.

Mit „Triabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homotrimeres scFv-Derivat. Die direkte

Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.

Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi-, tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv-Fragmenten. Die

Multimerisierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere„coiled coil"- Strukturen erzielt.

Der Begriff „Antikörper-Fusion" oder„Antikörper-Fusionsprotein" bezeichnet die Fusion/Kopplung eines Proteins mit einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers. Insbesondere zählen dazu gentechnisch hergestellt Fusionsproteine, bei denen ein therapeutisches Protein an den Fc-Teil eines

Antikörpers gekoppelt wird, um auf diese Weise eine die Halbwertszeit / Stabilität des Proteins im

Serum zu erhöhen. Der Begriff umfasst auch Antikörper-Fusionen, die aus einem Peptid und einem

Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers bestehen.

Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.B. BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-Kl, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-Kl und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NSO und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/ Abkömmlinge dieser Zelllinien.

Beispiele für Hamster- und Mäusezellen, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- , Vogel- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.

Tabelle 1 : Bekannte Produktionszelllinien

Zelllinie Hinterlegungsnummer

NSO ECACC No. 85110503

Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581

BHK21 ATCC CCL-10

BHK TK ^" ECACC No. 85011423 HaK ATCC CCL-15

2254-62.2 (BHK-21 -Derivat) ATCC CRL-8544

CHO ECACC No. 8505302

CHO-Kl ATCC CCL-61

CHO-DUKX ATCC CRL-9096

(= CHO duk ^" , CHO/dhfr ^" )

CHO-DUKX Bl ATCC CRL-9010

CHO-DG44 Urlaub et al, Cell 33 [2], 405-412, 1983

CHO Pro-5 ATCC CRL-1781

Lee 13 (Stanley P. et al, 1984).

V79 ATCC CCC-93

B14AF28-G3 ATCC CCL-14

HEK 293 ATCC CRL-1573

COS-7 ATCC CRL-1651

U266 ATCC TIB-196

HuNSl ATCC CRL-8644

Per.C6 (Fallaux, F.J. et al, 1998)

CHL ECACC No. 87111906

Erfindungsgemäß sind insbesondere rekombinante Säugerzellen, vorzugsweise Nagerzellen, besonders murine Zellen wie NS0 und Hamsterzellen wie z.B. CHO- oder BHK-Zellen bevorzugt.

Wirtszellen sind bevorzugt, wenn sie etabliert, adaptiert und komplett unter serumfreien Bedingungen kultiviert werden. Besonders bevorzugt sind Wirtszellen, die zusätzlich in Medium etabliert, adaptiert und komplett kultiviert werden, welches nicht nur serumfrei ist, sondern auch noch frei von jeglichen Proteinen /Peptiden tierischen Ursprungs.

Kommerziell erhältliche Medien wie Ham ^' s F12 (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove ^' s Modified Dulbecco ^' s Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invtirogen), serumfreies CHO Medium (Sigma), und proteinfreies CHO Medium (Sigma) sind Beispiele passender Nährlösungen. Der Begriff „Produktionszelle,, oder„Produzenten-Zelle" oder „Produktionsklon" bezeichnet eine Zelle, die in einem Prozess zur Herstellung eines Proteins verwendet wird. Insbesondere gehören dazu genetisch-veränderte Zellen, die zur industriellen Produktion von recombinanten Proteinen eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Erfindung bezeichnet der Begriff vor allem genetisch-veränderte eukaryontische Wirtszellen, die ein recombinantes Protein exprimieren und zur Herstellung dieses Proteins eingesetzt werden. Darunter fallen insbesondere monoklonale Zelllinien zur Produktion von therapeutischen Proteinen.

ERFINDUNGSGEMÄSSE AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung beschreibt eine Methode zur Optimierung eines biopharmazeutischen Produktionsprozesses umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert, b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß) c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge, wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird. Die Erfindung beschreibt eine Methode zur Regulierung des pC02 umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert, b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder (ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird.

Die Erfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit von Bioprozessen mit eukaryo tischen Zellen dadurch charakterisiert, dass mindestens folgende Parameter kontrolliert werden: pC02 Profil, 02 Profil, pH-Profil, Temperaturprofil, Drehzahl und

a) wobei die Kultivierung der Zelle in einem Zellkulturmedium erfolgt, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, und

b) wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß) und

c) wobei die Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge erfolgt und

d) wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird.

Die Erfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Regulierung des pH- Wertes umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge, wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird.

rfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Steigerung des Titer / der spezifischen Produktivität umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C0 ₂ -bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird.

rfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Verbesserung der Produktqualität umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C0 ₂ -bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C 0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird. Die Erfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Verbesserung der Robustheit des Prozesses umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC03 ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C3H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C 0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird.

Die Erfindung beschreibt weiterhin eine Methode zur Herstellung eines rekombinanten Produkts von Interesse umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert,

b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC0 ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält.

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C3H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß)

c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C02-bildende Säure und/oder Lauge,

wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C02, 02, N2 und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens ist das Produkt von

Interesse ein Protein, bevorzugt ein Antikörper oder Antikörperfragment oder Fc-Fusionsprotein.

In einer bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben erfolgt eine Regulierung des pC0 ₂ durch Begasung mit C0 ₂ und/ oder N ₂ . Bevozugt erfolgt eine Regulierung des pC0 ₂ ausschließlich durch Begasung mit C0 ₂ und/ oder N ₂ .

In einer bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben enthält das Zellkulturmedium 8mmol/L HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben ist das Zellkulturmedium komplett HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen frei.

In einer bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben erfolgt die Kultivierung der Zelle im Fed-Batch Fermentationsverfahren (und z.B. nicht im Perfusionsverfahren). Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der Zelle im Fed-Batch Verfahren. Bevorzugt werden hier vom Tag 0 an bis zum Ende der Fed-Batch Fermentation/ des Fed-Batch Verfahrens keinerlei HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen im Medium zugegeben und/oder eingesetzt.

In einer spezifischen Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben beträgt die TES Konzentration zwischen lmmol/L bis 100mmol/L, 10-90, 20-80, 30-50 bzw. kleiner gleich 100mmol/L bzw. 40mmol/L. Eine höhere TES Konzentration als 100mmol/L ist wegen der steigenden Osmolalität nicht erfindungsgemäß.

In einer spezifischen Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben beträgt die Sod-ß Konzentration zwischen lmmol/L bis 100mmol/L, 5-50, 15-30 bzw. kleiner gleich 100mmol/L bzw. 25mmol/L beträgt. Eine höhere Sod-ß Konzentration als 100mmol/L ist wegen der steigenden Osmolalität nicht erfindungsgemäß.

In einer spezifischen Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben ist die Säure und/ oder Lauge gemäß Schritt c) NaOH, HCl, H ₃ PO ₄ , CH ₃ COOH oder H ₂ S0 ₄ ist, bevorzugt NaOH oder HCl.

In einer spezifischen Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben ist die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle, bevorzugt eine Nagerzelle, bevorzugt eine C HO , PER. C 6 o der N S 0 Ze lle i st . In einer spezifischen Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie soeben beschrieben ist die eukaryotische Zelle eine CHO, PER.C6 oder NS0 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Methoden wie oben beschrieben wird der pC0 ₂ in der Anwachsphase (Tag 0 bis Tag 3 bzw. Tag 1 bis 3, insbesondere an Tag 1 der Fermentation) auf einen Wert kleiner oder gleich 10% bzw. kleiner oder gleich 8% reguliert, bevorzugt wird der pC0 ₂ eingestellt auf einen Wert zwischen 2% und 8% bzw. zwischen 3% und 8% bzw. zwischen 5% und 8% bzw. zwischen 3% und 5%, besonders bevorzugt ist ein pC0 ₂ Wert von 5% bzw. 3%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das pC0 ₂ -Profil von Tag 0 bis Tag 1 1 (bzw. bis Fermentationsende) bei 3% pC0 ₂ eingestellt. Bevorzugt wird der pC0 ₂ von Tag 0 bis Tag 11 (bzw. bis Fermentationsende) auf 3% reguliert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Methode weiterhin, dass der pC02 Wert zusätzlich wie folgt reguliert wird:

i) ein mittlerer pC0 ₂ (kleiner oder gleich 12%) in der Wachstumsphase (beispielsweise Tag 3-7 oder Tag 4-8), bevorzugt 5-12% bzw. 8-12%, besonders bevorzugt 8-10% bzw. 5-11% bzw. 3-11%, ii) ein leicht erhöhter bzw. hoher pC0 ₂ (größer oder gleich 5%, 8% bzw. 15%) in der Absterbephase (Tag 7 bis 11 oder Tag 9-11 bzw. bis zum Eende der (Fed-Batch) Fermentation / bis zum Ende der Kultivierung der Zelle / ), bevorzugt 15-18%) bzw. 5-10% bzw. 15%.

Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HC0 ₃ ^~ bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0 ₆ P x 5 H ₂ 0, Sod-ß).

Die Erfindung beschreibt insbesondere ein Fed-Batch Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 0eP x 5 H ₂ 0, Sod-ß).

In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkulturmediums enthält das Zellkulturmedium 8mmol/L HCO ₃ - bzw. C0 ₃ ^2~ Ionen enthält.

In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkulturmediums ist das Zellkulturmedium komplett HCO ₃ ^" bzw. C0 ₃ ^2~ Ionen frei ist.

In einer spezifischen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Zellkulturmedium zur Fed Batch Kultivierung von Zellen. Bevorzugt

In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkulturmediums sind die kultivierten Zellen eukaryontische Zellen, insbesondere Säugerzellen, insbesondere Nagerzellen, insbesondere Hamsterzellen, insbesondere CHO Zellen. In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkulturmediums beträgt die TES Konzentration zwischen lmmol/L bis 100mmol/L, 10-90, 20-80, 30-50 bzw. kleiner gleich 100mmol/L bzw. 40mmol/L. Eine höhere TES Konzentration als 100mmol/L ist wegen der steigenden Osmolalität nicht erfindungsgemäß.

In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkulturmediums beträgt die Sod-ß Konzentration zwischen lmmol/L bis 100mmol/L, 5-50, 15-30 bzw. kleiner gleich 100mmol/L bzw. 25mmol/L beträgt. Eine höhere Sod-ß Konzentration als 100mmol/L ist wegen der steigenden Osmolalität nicht erfindungsgemäß.

Die Erfindung beschreibt weiterhin eine Fed-Batch Fermentations Ausrüstung bzw. einen Satz an Fed- Batch Fermentations Ausrüstungsteilen, auf englisch„kit", umfassend folgende Komponenten:

(a) Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. C03 ^2" Ionen enthält, bzw. welches bevorzugt komplett HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen frei ist, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgenden Pufferkomponenten enthält:

(i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß),

(b) Fed-Batch Fermenter,

(c) eukaryontische Zelle, bevorzugt eine Säugerzelle, Nagerzelle, Hamsterzelle, insbesondere bevozugt eine CHO Zelle.

Bevorzugt ist die Zelle in (c) eine rekombinante Zelle. Eine rekombinante Zelle enthält eine rekombinante (beispielsweise eine zellfremde) DNA oder RNA Sequenz, welche bevorzugt exprimiert wird und besonders bevorzugt aufgereinigt und isoliert wird. Bevorzugt exprimiert diese rekombinante Zelle ein Gen von Interesse, insbesondere ein therapeutisches Protein, bevorzugt einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Fc-Fusionsprotein.

Alle erfindungsgemäßen Methoden werden synonym als Verfahren bezeichnet. So betrifft die Erfindung beispielsweise ebenso ein Verfahren zur Regulierung des pC0 ₂ umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche ein rekombinantes Gen von Interesse enthält und ein korrespondierendes Produkt von Interesse produziert, b) Kultivierung der Zelle aus Schritt a) in einem Zellkulturmedium, welches 12mmol/L oder weniger HCO ₃ ^" bzw. CO ₃ ^2" Ionen enthält, wobei besagtes Zellkulturmedium die folgende Pufferkomponente enthält: (i) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (C _Ö H _{I S} NO _Ö S, TES) und/ oder

(ii) Sodium-ß-glycerophosphat-pentahydrat (C ₃ H ₇ Na ₂ 06P x 5 H ₂ 0, Sod-ß) c) Regulierung des pH- Wertes über eine nicht C0 ₂ -bildende Säure und/oder Lauge, wobei während des Bioprozesses eine Regulierung des pC0 ₂ mit C 0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ und/oder Luftzufuhr oder mittels der Drehzahl des Rührers durchgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform einer der erfindungsgemäßen Verfahren wie soeben beschrieben erfolgt eine Regulierung des pC0 ₂ ausschließlich durch Begasung mit C0 ₂ und/ oder N ₂ .

EXPERIMENTELLER TEIL

MATERIAL UND METHODEN

Fermentation

Die durchgeführten Experimente wurden entweder im Bioreaktor mit einem Fermentations- Volumen von 2 L (Einsaatvolumen 1 ,8 L), in 250 ml Shakeflasks (Einsaatvolumen 50 ml) oder mittels SensorDish Reader® der Firma Presens (Einsaatvolumen 1,5 ml) durchgeführt.

Versuche mit dem Bioreaktor bieten viele Vorteile wie z.B. Datenerfassung in Echtzeit und Archivierung der Prozessparameter, eine etablierte und valide Regelung der Prozessgrößen Temperatur, pH, Begasung (unterschiedliche Anteile von Gasen) und der Rührerdrehzahl. Die erhobenen Daten sind durch die kontrollierten Bedingungen reproduzierbar und können auf größere Bioreaktoren übertragen werden (Scale-up/ Skalierung). Die Ausbeuten im Bioreaktor sind im Vergleich meist höher, als bei alternativen Fermentations arten. Dies resultiert u. a. aus dem integrierten Rührwerk mit seiner turbulenten Durchmischung welches eine bessere Nährstoffversorgung und einen erhöhten Sauerstoffeintrag ermöglicht. Allerdings ist der Betrieb relativ aufwendig und zeitintensiv, da Anfangs der Aufbau und die Sterilisation der Fermentationsgerätschaften/des Equipments, während der Fermentation tägliche Betreuungsarbeiten und nach der Fermentation der Abbau und eine aufwändige Reinigung erforderlich sind. Der Betrieb ist damit sehr personal- und kostenintensiv.

Bioreaktoren werden dann zur Fermentation eingesetzt, wenn in Vorversuchen bereits gute Ergebnisse erzielt wurden und die zusätzlichen Vorteile eines Bioreaktors gefordert sind.

Für Bioreaktoren gibt es unterschiedliche Betriebsarten. Während ein Batch-Prozess primär durch ein konstantes Volumen gekennzeichnet ist, ist dieses bei einem Fed-Batch-Prozess variabel. Variabel deshalb, weil während des Fermentationsprozesses Zugaben zur Zellkulturbrühe erfolgen. Zugaben können ein kontinuierlicher Feed oder weitere Bolusgaben sein, die den Fermentationsprozess unterstützen. Bei den im Experimentteil beschriebenen Fermentationen am Bioreaktor wurden Fed-Batch-Prozesse gefahren.

Die Kultivierung von Zellen in Schüttelkolben (Shakeflask) bietet den Vorteil, dass sie mit relativ einfachen Mitteln zu bewerkstelligen ist. Man benötigt neben einem Brutschrank, einer LAF-Box (laminar flow, steriler Arbeitsbereich) und den Einweg-Kolben keine weiteren technischen Einrichtungen. Die Kolben werden unter sterilen Verhältnissen mit Zellkulturmedium und Inoculum einer definierten Konzentration befüllt und anschließend in den Brutschrank überführt. Über die Einstellungsmöglichkeiten am Brutschrank (Solltemperatur, -luftfeuchte, -Drehzahl und -C0 ₂ -Gehalt) kann Einfluss auf die Zellkultur genommen werden. Da die Schüttelkoben steril verpackt vorliegen, ist keine weitere Vorbereitung des Equipments nötig. Die Nachteile liegen jedoch auf der Hand: Es ist keine Online-Datenerfassung, keine Regelung von pH, Begasung und Feed möglich. Der Probenzug für Analytik, Feed- und Boluszugaben muss jeweils unter der LAF-Box erfolgen. Dies ist eine Quelle für Kontaminationen oder Fehler und erfordert neben einem routiniertem Handling sehr viel Zeit. Ferner unterliegt man von Seiten der Analytik her den Einschränkungen des Probenvolumens: Es werden z.B. beim Fermentationsstart 50 ml eingesät, bei jedem (meist täglichen) Probenzug zwei bis drei Milliliter entfernt. Obwohl dies teilweise durch Feed- und Bolusgaben relativiert wird, ergibt sich jedes Mal eine, im Verhältnis zum Gesamtvolumen der Kultur, große Entnahme. Generell eignen sich Versuche in ko stengünstigen S hakeflasks auf Grund ihres einfachen Handlings und ihrer guten Auswertungsmöglichkeiten gut als Vorstufe für Bioreaktorversuche.

Experimente mittels SensorDish-Reader (=SDR) vereinen teilweise die Vorteile von Bioreaktoren und Schüttelkolben. Bei diesem Verfahren wird in eine 24-Well Platte mit je nur 1,5 ml Zellsuspension pro Well eingesät und diese mit Deckel verschlossen in den Brutschrank gestellt. Auf der Unterseite jedes Wells ist ein Sensorpunkt aufgetragen. Unter der Well-Platte befindet sich der sog. Reader der diesen Sensor ausliest. Dies erlaubt die nicht invasive Messung von pH oder p0 ₂ online und in Echtzeit. Es ist keine vorhergehende Kalibration nötig, die Kalibrationsdaten werden zu Beginn anhand der aufgedruckten Batch-Nummer automatisch in die Steuerungssoftware geladen.

Die Möglichkeiten von SDR sind jedoch darauf beschränkt, den pH- Wert im Well zu messen und mittels Interpretationen des p0 ₂ -Abfalls über die Zeit hinweg, Rückschluss auf das Zellwachstum zu nehmen. Das Verfahren bietet sich an, wenn man Toxizitäten, Effekte von Einzelsubstanzen oder Grenzkonzentrationen testen will. Auch bei Versuchen, die eine Mehrfachbestimmung erfordern, ist SDR sinnvoll. Da die Probennahme entfällt und das Experiment nur eine Laufzeit von drei Tagen hat und somit auch die Feedings entfallen, ist diese Methode sehr zeitsparend und vom Handling sehr angenehm. pH-Regulation

Bei den Versuchen mit dem SensorDish-Reader und bei der Fermentation in Shakeflasks im Brutschrank wird keine aktive pH-Regulation vorgenommen.

Die pH-Regulation im Bioreaktor erfolgt bei BI regulär über die Zugabe von Na ₂ C0 _{3 (aq)} und C0 _{2 (gas)} . Die Regelung erfolgt automatisch über SimaticIT® ( s . Punkt S o ftwar e ) . B e i pHi _s t > pHsoii wird C0 _{2 (gas)} eingegast, bei pHi _st < pH _so n wird über eine geregelte Pumpe Na ₂ C0 _{3 (aq)} zudosiert bis der Sollwert, +/- definiertes Totband, wieder erreicht wird.

Im aktuellen Fall wird bei einigen Fermentationen aus beschriebenen Gründen Na ₂ C0 _{3 (aq)} gegen äquivalent wirksame Natronlauge ersetzt.

Medien

Als Basis Zellkultur-Medium wird bei allen Fermentationen ein BI proprietäres Medium als Standardmedium eingesetzt. Die Medien A und B unterscheiden sich nur durch den voreingestellten pH- Wert. Es handelt sich bei beiden Medien um serumfreie Produktionsmedien, die in der eigenen Medienherstellung just in time produziert werden.

Als Feed-Medium wird ein ebenfalls„in house" hergestelltes BI proprietäres Feed-Medium verwendet. Ein Feed-Medium enthält meist hochreines Wasser (WFI= water for injection), Glucose, Aminosäuren, Wachstumsfaktoren und biologische Extrakte aus z.B. Hefen, die für die jeweilige Zelllinie optimal sind. Das Feed-Medium wird bei den Multifermentationen mittels Pumpe kontinuierlich zugegeben, bei der Fermentationen im Shakeflask per Hand unter der LAF-Box zupipettiert.

Für die Experimente im Bioreaktor wird ein so genannter Multifermenter eingesetzt. Er besteht aus sechs baugleichen Einzelfermentern mit je zwei Litern Fermentationsvolumen, die physisch zu einer fahrbaren Einheit zusammengefügt sind. Die Ansteuerung erfolgt mit PC 's über die Software SimaticIT®. Das Grundgerüst des Fermenters bildet der 2L Glasbehälter mit Doppelmantel zur Temperierung und die Deckplatte in die die Sonden und weitere Peripherie wie z.B. Steigrohre eingeschraubt werden.

Bei der Fermentation im Bioreaktor kommen folgende Sonden, die in die Deckplatte des Bioreaktors eingeschraubt sind, zum Einsatz: Temperatursonde, p0 ₂ -Sonden, pH-Sonde, C0 ₂ -Sonde.

Für alle durchgeführten Fermentationen wird eine BI-HEX ^® -Zelle eingesetzt. BI-HEX ^® steht für Boehringer Ingelheim High Expression System. Die BI-HEX ^® -Zelle ist eine CHO Zelle, deren genetisches Konstrukt verändert/ optimiert ist, so dass ein Produkt von Interesse effektiv produziert wird. Bei Bedarf an Zellen wird eine Ampulle mit den entsprechenden CHO- Zellen vom Bereich Inoculum aufgetaut, expandiert und eine Stammhaltung angelegt, um daraus eine Expansion für eine Einsaat in den Bioreaktor oder Shakeflask zu gewährleisten. Die Zelle sezerniert einn bestimmtes Biomolekül, bevorzugt ein Protein, bevorzugt einen bestimmten Antikörper extrazellulär ins Zellkulturmedium. Dieser wird bei der Konzentrationsbestimmung des Titers nachgewiesen.

BEISPIEL 1

SDR- Versuch (Reduzierung NaHC0 ₃ -Konzentration)

Die elementare Funktion von NaHC0 ₃ für die Zelle wurde bereits beschrieben. In diesem Versuch soll gezeigt werden, wie, bzw. ob sich verringerte NaHC0 ₃ -Konzentrationen auf das Zellwachstum auswirken. Die Beurteilung erfolgt mittels Rückschluss über den Sauerstoffverbrauch (durch Zellwachstum), im Zellkulturmedium. Das Experiment wird an einem SensorDish-Reader durchgeführt.

Die Versuchsreihe wurde mit n = 4 durchgeführt, um Ausreißer zu erkennen und die allgemeine Streuung beurteilen zu können. Eingesetzt wird eine 24-well Platte OxiDish OD24. Zusätzlich zu den fünf unterschiedlichen NaHC0 ₃ -Konzentrationen wird eine Versuchsreihe mit einer bestimmten Konzentration NaHC0 ₃ und HEPES gefahren. Diese Kombination wird in der Literatur beschrieben, dort allerdings nur mit 3 % pC0 ₂ betrieben. Der aktuelle Versuch (6) wird, um eine Vergleichbarkeit zu anderen Versuchen herzustellen, mit 5 % pC0 ₂ betrieben. Weiteres siehe Experimentplan Tabelle 1. Um die Varianz so gering wie möglich zu halten, wird die Zellsuspension für eine Versuchsreihe gleicher Konzentration jeweils im Pool hergestellt, in die Wells pipettiert und anschließend jeweilig mit dem berechneten, identischen Volumen an NaHC0 ₃ -Stocklösung versehen.

Plattform: SensorDish-Reader (SDR) Zelle: CHO Laufzeit: 90 h

Medium: MEDIUM A w/o NaHC0 ₃ + Einwaage/Stocklösung Puffersubstanz

Feeding: -entfällt- T/L: 36,8°C / 70%

C0 ₂ -Profil: konstant 5 % Einsaatdichte: 0,6

Tabelle 1

NaHC0 ₃ HEPES

Normierte

mmol/L Angabe mmol/L Normierte Angabe

0 A 0 A

1 B 20 E

4 C

8 D

36

mmol (Ktr) / F Bei Versuchsreihe Nummer fünf wurde neben NaHC0 ₃ auch HEPES mittels Stocklösung zum Pool beigegeben.

Zur Auswertung wird das Diagramm in Abbildung 1 herangezogen, bei dem die p0 ₂ -Werte jedes Wells gegen die Zeit aufgetragen sind. Das Diagramm ist bereits von einem Ausreißer in Versuchsreihe vier bereinigt und basiert auf den arithmetischen Mittelwerten der 4-fachen (bei Versuchsreihe vier, 3- fachen) Wiederholung.

-> Die Reduzierte NaHC0 ₃ Konzentration von 8mmol/L zeigt ein vorteilhaftes, der Kontrolle ähnliches p0 ₂ Profil (Zellwachstum).

BEISPIEL 2

Shakeflaskversuch

Die Auswahl der Puffersysteme (zellfrei) wird nun mit Zellen betrieben. Kriterium für die Auswahl der in diesem Versuch verwendeten Puffersubstanzen ist eine akzeptable Osmolalität und gutes Pufferverhalten bei der Begasung im Schüttelinkubator.

Mit in das Versuchssetup / Experimentplan geht die Erkenntnis aus Beispiel 1 ein, dass auch mit einer auf Konzentration D (=8mmol/L) reduzierten NaHC0 ₃ ^" Konzentration gute Wachstumsraten (gefolgert aus dem Sauerstoffverbrauch) erzielt werden können.

Ziel ist die Ermittlung des, auf die Wachstumsperformance der Zelle bezogenen, besten Puffermediums als Basis für eine folgende Fermentation im Bioreaktor.

Die Herstellung erfolgt analytisch so exakt wie möglich. Die pH- Werte werden mittels BGA- Abgleich eingestellt. Geringe Pufferkonzentrationen werden durch Stocklösungen zugegeben. Nach der Herstellung erfolgt eine Sterilfiltration. Zur Absicherung werden die Versuche mit n = 2 ausgeführt. Um zwei unterschiedliche Begasungsvarianten zu realisieren, erfolgt eine Aufsplittung auf zwei unterschiedliche Brutschränke. Eine Zusammenfassung ist dem Experimentplan zu entnehmen.

Plattform: Shakeflasks im Brutschrank Zelle: CHO Laufzeit: 11 d

Medium: MEDIUM A w/o NaHC0 ₃ w/o MOPS + Einwaage/Stocklösung Puffersubstanz

Feeding: 1,5 ml / Tag T/L:37°C / 70% C0 ₂ -Profil: s. Experimentplan Einsaatdichte: 1,1

SFO MOPS / F

SFO MOPS / F

SFO Sod-ß / F Hier aufgeführt: Jeweils die geringere

SFl Sod-ß / F Konzentration der Puffersubstanz plus

SFl Sod-ß / H

SFl Sod-ß / H das vom Standard abweichende,

SFl TES / U NaHC0 ₃ -Konzentrationsoptimum

SFl TES / U

SFl TES / K (D=8mmol/L); n = 1

SFl TES / K

SFl Trizma-base / F

SFl Trizma-base / F

SFl Trizma-base / 1

SF2 Trizma-base / 1

SF2 MEDIUM A (Ktr)

SF2 MEDIUM A (Ktr)

SF2 Blank

SF2 Blank

Tabelle 2 - Experimentplan, Brutsc

Tabelle 3 - Experimentplan, Brutschrank 2

Die Analytik an dO (Tag 0) erfolgte sofort nach der Einsaat unter der LAF-Box, d.h. ohne vorherige Einwirkung der C0 ₂ -Atmosphäre des Brutschrankes.

In Abbildung 2A ist ersichtlich, dass alle Puffermedienansätze bis auf Trizma-base (SF l 9 und SF20) mit Konzentration I Zellwachstum zeigen. Das beste Wachstum zeigen die beiden Kontrollen (SF21 und SF22), doch ist der Unterschied zu den Puffermedienansätzen, zumindest bis d8, relativ klein. Die drei besten Puffer, rangierend bei einer Zelldichte um 45, sind Sod-ß / H; TES / K + NaHC0 ₃ / D und MOPS / F + NaHC0 ₃ / D. Trizma-base läuft in jeglicher Konzentration schlecht, der pH ist zwar stabil aber evtl. liegt eine Toxizität vor.

In Abbildung 2B ist der Maßstab von Abbildung 2A beibehalten worden. Dabei sieht man deutlich, dass die erreichten Zelldichten bei diesem C0 ₂ -Profil wesentlich geringer ausfallen. Die Kontrollen schneiden zwar auch hier am Besten ab, doch ist eine maximale Zelldichte von 20 nicht akzeptabel. Die zwei besten Pufferansätze, rangierend bei einer Zelldichte um 18, sind hier Sod-ß / H + NaHC0 ₃ / D und MOPS / F. Aus diesem Grund beschränkt sich die weitere Auswertung primär auf die Shakeflasks aus Brutschrank 1 mit dem dazugehörigen C0 ₂ -Profil.

Generell ist die Kombination mit NaHC0 ₃ / D bei den niedrigen Pufferkonzentrationen vorteilhaft.

Bei der vorgenommenen pC0 ₂ Messung wird festgestellt, dass das vorgegebene pC0 ₂ Profil eingehalten wird. Es ist ersichtlich, dass je später der Zeitpunkt des Probenzuges ist, desto tiefer der gemessene pC0 ₂ . Dies ist ein Resultat des mehrmaligen Öffnens des Brutschrankes.

Die Kontrollen zeigen bei Brutschrank 1 gegen Ende erneut einen Anstieg des pC0 ₂ , welcher vermutlich aus der Eigenproduktion der Zellen resultiert.

Auch der pH-Verlauf über die Dauer der Fermentation hinweg wird gemessen. Dabei sind die pH- Werte auf akzeptablem Niveau. Die Kontrollen (SF21 und SF22) liegen am Tag 2 (d2) noch über dem eigentlichen Startwert von 7,00 +/- 0,05. Dies könnte an der Abweichung vom pH-Meter gegenüber dem BGA liegen; die Kontrolle wurde direkt ohne Eingriff aus der Medienherstellung bezogen, wo der pH- Wert ohne BGA eingestellt wird. Bei den Kontrollen sinkt der pH- Wert am Ende am stärksten ab, basierend auf der Ansäuerung der Zellkultur.

In Abbildung 2C sind die erreichten Titerkonzentrationen (normiert) aufgetragen. Bis auf wenige Ausnahmen ist ein ansteigender Titer zwischen d8 und dl 1 erkennbar. Der Zugewinn ist dabei bei den Shakeflasks SF49 bis SF52, den Medien mit der reduzierten NaHC0 ₃ -Konzentration, sogar mehr als zehnfach!

Bemerkenswert ist auch die Tatsache, dass erstmals mit einer neuen Puffer Substanz im Medium die herkömmliche Kontrolle (SF21 u. SF22) überholt wurde: SF52 mit TES / K + NaHC0 ₃ / D liefern am dl 1 mit norm. Produktkonzentration 83,6 ein sehr gutes Ergebnis.

Resultat:

Identifizierung der besten Puffersubstanzen bei NaHC0 ₃ freiem Zellkulturmedium (linke Tabellenhälfte) bzw. bei NaHC0 ₃ erniedrigtem (=8mmol/L) Zellkulturmedium (rechte Tabellenhälfte).

Die besten Puffersubstanzen waren: TES und Sod-ß BEISPIEL 3 BIOREAKTOR-FERMENTATION

Versuchsaufbau pC0 ₂ Regulierung:

Zur Regelung eines Prozesses stehen unterschiedliche Reglertypen in unterschiedlichen Kombinationen zur Verfügung. Sie können folgende Regleranteile aufweisen:

1. P-Regler: Proportional-Regler. Sie finden Einsatz bei Anwendungen mit geringen Anforderungen an die Regelgenauigkeit. P-Regler weißen eine bleibende Regelabweichung auf.

2. 1-Regler: Integral-Regler. Sie finden Einsatz bei Anwendungen mit geringen Anforderungen an die Regelgeschwindigkeit, regeln aber sehr genau.

In der Praxis am häufigsten und auch bei der vorliegenden Fermentationssteuerung werden PI-Regler eingesetzt. PI-Regler kombinieren die Vorteile von P- und I-Reglern: Sie regeln zügig durch den P- Anteil und genau und ohne bleibende Regelabweichung durch den I-Anteil; die Wirkungen der Einzelregler werden addiert.

Das Regelverhalten soll im anschließenden Verlauf der Fermentation durch das Abändern der Regeleinstellungen (P-I Anteile) optimiert werden.

Der Bioreaktor enthält folgende Komponenten:

Tabelle 4 Der veränderte Bioreaktor enthält insbesondere eine integrierter C0 ₂ Sonde. Das Hardware-Setup der Experimente ist jedoch prinzipiell variabel, um verschiedenen Anforderungen zu entsprechen. Zum Beispiel kann auf ein Steigrohr verzichtet werden und dafür eine weitere Sonde eingebaut oder weitere/andere Lösungen mittels Schlauchpumpen automatisch zugegeben werden.

Bei den pC0 ₂ Messungen kann man zunächst erkennen, dass der Regler nach Sollwertänderungen lange Zeit schwingt. Ab dem Zeitpunkt der Einsaat bis zum Erreichen des Sollwertes von 8 % schwingt der Regler rund zwei Tage. Bei der Absenkung des Sollwertes von 8% auf 6% schwingt die Regelung noch 14 Stunden; nach einer In-Prozess-Kalibration ca. 12 Stunden.

Gemessen werden auch die Gas- Volumenströme, die bei der maximalen negativen Stellgröße (-45 %) des pC0 ₂ -Reglers anliegen. Trotz dieser Stellgröße wird der Sollwert von 2 % pC0 ₂ um + 0,3 % nicht erreicht. Daraus ist abzuleiten, dass mit einem pC0 ₂ -Sollwert von 2% eine kritische Untergrenze erreicht wird, welche im Prozess nicht sinnvoll erscheint. Da der eingetragene Stickstoff den Sauerstoff austreibt, muss dies mit einem erhöhten Sauerstoff-Volumenstrom ausgeglichen werden. Der sich aufsummierende Gesamtgas-Volumenstrom kann bzgl. der Schaumbildung eine kritische Größe erreichen. Deutlich wird auch, dass sich nach dem Einpendeln der Regelung auf ein höheres Niveau eine gleichmäßige C0 ₂ -Begasung einstellt.

In Abbildung 3 werden die pC0 ₂ -Online-Daten (entspricht den minütlich archivierten pC0 ₂ -Sonden Messwert) mit den extern nach Probenzug am BGA gemessenen Werten verglichen. Die erste Kalibration ist wenig erfolgreich, da danach eine konstante Differenz auftritt. Nach der zweiten Kalibration jedoch sind die darauf folgenden Messwerte übereinstimmend. Man kann daraus den Schluss ziehen, dass eine In-Prozess-Kalibration erst dann Sinn macht, wenn sich das oszillierende Regelverhalten gelegt hat. Im zweiten Viertel der Fermentation sind die externen Messwerte höher. Die Hypothese hierzu ist, dass zu diesem Zeitpunkt der Zellstoffwechsel hochaktiv ist und dabei sehr viel C0 ₂ gebildet wird. In der nicht mehr begasten Probe in der Spritze kann dann C0 ₂ bis zur Messung kummulieren.

Die Abbildung 3 zeigt somit grafisch den Verlauf der internen pC0 ₂ Messung (Sonde mit automatischer Datenarchivierung) und des externen Messwertes am Blutgasanalyseautomat. Die mit einem Pfeil markierte erste Kalibration (Abgleich zwischen C02 Sonde und BGA) an Tag 0 (dO) zeigt wenig Effekt, da das Regelverhalten noch zu unruhig ist. Ab der 2. Kalibration (2. Pfeil) an Tag 4 (d4) ist eine gute Übereinstimmung zwischen internem und externem Messwert zu erkennen.

Ein vorab durchgeführter Funktionstest ergibt, dass die Oszillation der pC0 ₂ -Regelung vom Puffersystem abhängig ist. Bei der als Test durchgeführten pC0 ₂ -Regelung in PBS-Puffer ist das Regelungssystem bereits nach nur drei Stunden stabil. Der Fermentation am Multifermenter geht erneut ein Optimierungsversuch mittels SDR voraus. In diesem Vorversuch werden, in Anlehnung an Beispiel 1, verschiedene NaHC0 ₃ -Konzentrationen in Kombination mit den Medien Sod-ß / H und TES / K getestet. Bei dem Experiment wird zusätzlich zur Beurteilung mittels p0 ₂ -Abfall eine identisch belegte Wellplatte mit pH-Sensoren durchgeführt. Die Ergebnisse dienen der Entscheidungsfindung für das aktuelle Beispiel, die aussichtsreichsten Kombinationen (TES / K + NaHC0 ₃ / D und Sod-ß / H + NaHC0 ₃ / E) werden in den Experimentplan aufgenommen. (Die Daten aus dem Vorversuch sind hier nicht gezeigt.)

Es wird in zwei Multifermenter (entspricht zwölf Einzelfermentern) mit unterschiedlichen Medienkombinationen fermentiert.

Die Durchführung und das Handling basiert auf den unter Materialien, Methoden und Arbeitschritte beschriebenen Punkten. Es folgt das Versuchssetup und der Experimentplan zur Übersicht in Tabelle 5.

Plattform: Bioreaktor/Multifermenter Zelle: CHO Laufzeit: 11 d (11 Tage)

Medium: MEDIUM B w/o NaHC0 ₃ + Einwaage/Stocklösung Puffersubstanz(en)

Feeding: Ab dx kontinuierlicher Feed T: 37,0°C Einsaatdichte: 1,7

C0 ₂ -Profil: dO bis d3: 8 % - d3 bis d6: 6 % - d6 bis d8: 2 % - d8 bis dl 1 : 4 %

Das obig gezeigte C0 ₂ -Profil gilt für den geregelten Bioreaktor FS 33.1. Bei den restlichen Fermentern wurde nach der Einsaat (dO), für eine bestimmte Zeit bei einer bestimmten Stellgröße, C0 _{2 (gas)} zugegeben um den Zellen ein Minimum an gelösten C0 ₂ anzubieten. An dl wurden weitere pC0 ₂ - Messungen durchgeführt, bei denen sich herausstellte, dass in den Kulturen im Schnitt ca. 2 bis 3 % C0 ₂ vorlagen. Im Kontext einer Zelldichtebestimmung wurde gemeinsam beschlossen, dass keine weiteren manuellen Eingriffe zur C0 ₂ -Begasung mehr notwendig sind.

Das Regelverhalten wurde erneut beobachtet. Um später eine objektive Beurteilung durchführen zu können wurden dabei keine Einstellungen geändert, oder per Hand eingegriffen. Die Analyse des Regelverhaltens soll als Basis für die getrennte (zukünftig separater positiver und negativer Stellbereich) Regelereinstellung dienen.

FS Puffersubstanz (en) / Konzentration pH-Agenzien pC0 ₂ -Management

32.1 TES / K C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO)

32.2 TES / K + NaHC0 ₃ / D C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO)

32.3 TES / K + NaHC0 ₃ / D C0 ₂ /Na ₂ C0 ₃ Definierte Anfangsbegasung (dO)

32.4 Sod-ß / H C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO)

32.5 Sod-ß / H + NaHC0 ₃ / E C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO)

32.6 TES / K C0 ₂ /NaOH Keine Zugabe von C0 ₂

33.1 TES / K C0 ₂ /NaOH Automatische Regelung

33.2 Sod-ß / H + NaHC0 ₃ / E C0 ₂ /Na ₂ C0 ₃ Definierte Anfangsbegasung (dO)

33.3 MEDIUM B (NaHC0 ₃ /F) (Vergl. -Kontrolle) C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO) 33.4 MEDIUM B (NaHC0 ₃ /F) (Kontrolle) C0 ₂ /Na ₂ C0 ₃ Definierte Anfangsbegasung (dO)

33.5 MEDIUM B (NaHC0 ₃ /D) C0 ₂ /NaOH Definierte Anfangsbegasung (dO)

33.6 MEDIUM B (NaHC0 ₃ /D) C0 ₂ /Na ₂ C0 ₃ Definierte Anfangsbegasung (dO)

Tabelle 5 Experimen

Die Fermentationssysteme (FS) 32.1, 32.6 und 33.6 fielen über den Fermentationszeitraum hinweg leider auf Grund von Kontaminationen aus. Die daraus erhobenen Daten fließen nicht, oder nur beschränkt, in die Ergebnisbetrachtungen ein.

Vergleich pC0 ₂ geregelt gegen pC0 ₂ ungeregelt

Da sowohl FS 32.1 als auch FS 32.6, welche wie der geregelte Bioreaktor FS 33.1 mit dem Zellkulturmedium TES / K betrieben werden, wegen Kontamination ausfiel kann der Unterschied nur abschätzend durch Vergleich mit FS 32.2 und FS 32.3 (beide TES / K + NaHC0 ₃ / D) verglichen werden.

Abbildung 4 A und B zur normalen Lebendzellzahlkonzentration (A) bzw. Titerkonzentration (B) zeigt, dass die zellspezifische Produktbildungsrate des geregelten Fermentationslaufes (Kurve mit Dreiecksymbol) höher ist als diejenige des vergleichbaren ungeregelten Fermentationslaufes (Kurve mit Raute).

Weiterhin zeigen die Versuche aus Abbildung 4, dass die pH-Regelung mit NaOH tendenziell eine bessere Produktbildungsrate aufweist als diejenige mit Na ₂ C0 ₃ .

Bei einer weiteren Optimierung des pC0 ₂ Profils wird die spezifische Produktbildungsrate weiter erhöht.

Die Lebendzellzahldichte des pC0 ₂ -geregelten Laufs (FS 33.1 ) weicht, wie in Abbildung 4B ersichtlich um maximal 20 Einheiten voneinander ab. Ab dlO streuen auch die beiden Vergleichsläufe gering, sonst wird ist eine gute Übereinstimmung erzielt. Das niedrigere Niveau von FS 33.1 kann aus dem höheren pC0 ₂ -Profil resultieren und ist nicht negativ zu interpretieren. Die Vitalität (nicht gezeigt) ist bei allen Läufen auf gleichem Niveau.

Die Laugenverbräuche (nicht gezeigt) sind bei allen Läufen gering. Bei FS 32.2 (höchste Lebendzellzahlkonzentration) muss gegen Ende der Fermentation (d9-dl 1) erwartungsgemäß mehr Lauge zugegeben werden. Trotzdem weißt dieser Lauf am Fermentationsende mit 393 mosmol/kg die geringste Osmolalität auf (nicht gezeigt.)

In Abbildung 4A ist ersichtlich, dass FS 33. 1 trotz geringerer Zellzahl als FS 32.3 eine höhere Titerkonzentration aufweißt. Die Konzentration liegt im oberen Drittel der Streuung zwischen den beiden identischen Fermentationsläufen FS 32.2 und FS 32.3. Das heißt, dass der Fermentationslauf mit der pC0 ₂ -Regelung eine höhere spezifische Produktbildungsrate besitzt. Vergleich Puffersysteme

Im Anschluss erfolgt der Vergleich der unterschiedlichen Puffersysteme gegeneinander.

Abbildung 5A zeigt, dass sich das pC0 ₂ Profil des geregelten Fermentationslaufes (FS33.1) deutlich von den Vergleichsfermentationen (FS32.2 und FS32.3) abhebt. FS32.2 und FS32.3 werden zum Vergleich herangezogen obwohl sie einen geringen Anteil von NaHC0 ₃ aufweisen, da aufgrund einer Kontamination ein identischer Vergleichspartner entfallen ist. Das durch die Regelung erzielte pC0 ₂ Profil hebt sich im ersten Drittel der Fermentation deutlich von den Vergleichsläufen ab und folgt der Sollvorgabe (siehe Abbildung 5B, dl-d3 pC0 ₂ = 8%, d3-d6 pC0 ₂ = 6%, d6-d8 pC0 ₂ = 2% und von d8-dl 1 pC0 ₂ = 4%) weitestgehend. Beim Erzwingen eines niedriger als normalen pC02 Wertes (Tag 6-8, d6-d8) wird Stickstoff eingegast um C0 ₂ auszutreiben. Es ist festzustellen, dass der niedrige Sollwert nie erreicht wird und ein pC0 ₂ Wert von 3.2% eine kritische Untergrenze darstellt für die Regelung. Bei der dabei erhöhten Anforderung von Stickstoff wird im Zusammenhang auch Sauerstoff ausgetrieben, welcher durch einen höheren Sauerstoffvolumenstrom ausgeglichen wird. Es kann einer kritischen Gesamtgasmenge erreicht werden, bei welcher eine unverhältnismäßig große Schaumbildung festzustellen ist.

Aus Abbildung 5B ist ersichtlich, dass sich der geregelte Fermentationslauf auch von allen anderen Vergleichsläufen überraschend deutlich abhebt. Das heißt, dass das durch die Regelung eingestellte pC0 ₂ Profil tatsächlich auf der Sollvorgabe (dl-d3 pC0 ₂ = 8%, d3-d6 pC0 ₂ = 6%, d6-d8 pC0 ₂ = 2% und von d8-dl 1 pC0 ₂ = 4%) beruht und nicht zufällig zustande kommt.

Abbildung 5C zeigt, dass die mit TES ohne NaHC0 ₃ bzw. TES mit 8mmol/L NaHC0 ₃ erreichten Titerkonzentrationen vergleichbar sind mit der Kontrolle (NaHC0 ₃ basierter Puffer mit einer Konzentration von 36mmol/L) . Der Lauf mit TES ohne NaHC0 ₃ (geregelt) erreicht trotz zufällig gewählten und nicht optimierten pC02 Profil eine Endkonzentration (Titer), welche sich um lediglich 6.10% (gemessen an der Kontrolle) von der Kontrolle unterscheidet. Der Lauf mit TES plus 8mmol/L NaHC0 ₃ (ungeregelt) erreicht eine Endkonzentration (Titer), welche sich um lediglich 0.01% (gemessen an der Kontrolle) von der Kontrolle unterscheidet. Dies zeigt vollkommen überraschend, dass NaHC0 ₃ vollständig durch TES ersetzt werden kann. Weiterhin zeigt dies, dass das Ergebnis des Laufs mit TES plus 8mmol/L NaHC0 ₃ (ungeregelt) die gleiche Endtiterkonzentration erreicht wie die Kontrolle.

Optimalerweise läuft ein Fermentationslauf unter folgenden Bedingungen ab: TES-Puffer komplett ohne NaHC0 ₃ und mit pC0 ₂ Regelung. Hiermit werden die besten Endtiter erreicht. BEISPIEL 4 FERMENTATION VERIFIZIERUNG PUFFERSYSTEM

In sechs C0 ₂ -geregelten Bioreaktoren werden die Puffersysteme TES und Sod-ß mit unterschiedlich hohen Konzentrationen an NaHC0 ₃ eingesetzt, um die optimale Konzentration an NaHC0 ₃ im Medium zu bestimmen. Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Plattform: Bioreaktor / Multifermenter

Verfahren: Fed Batch

Zelle: CHO

Einsaatdichte: 3x10 ⁵ vc/mL

Startvolumen: 1,8 L

Laufzeit: 11 Tage

Medium: Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Einwaage/Stocklösung Puffersubstanz(en) Feeding: Feed I kontinuierlich ab Tag 2

Temperatur: 37°C

p0 ₂ : 60 %

Drehzahl: 160 Upm

pH: Tag 0-3 6,95 ± 0,15, Tag 3-11 6,80 ± 0,15

pH-Regelung: NaOH (1 ,2M) (kein C0 ₂ )

pC0 ₂ : Tag 0-3 5%, Tag 3-11 3%

Die eingesetzten Puffersysteme mit unterschiedlich hohen Konzentrationen an NaHC0 ₃ sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6 Experimentplan mit eingesetzten Puffersystemen und NaHC0 ₃ -Konzentrationen.

Die in Abbildung 6 dargestellten normierten Produktkonzentrationen weisen bei Einsatz der gleichen Puffersubstanz keine Unterschiede im Hinblick auf die eingesetzte NaHC0 ₃ -Konzentration auf. Mit Einsatz von TES (1.1, 1.2) ergeben sich durch unterschiedlich hohe NaHC0 ₃ -Konzentrationen gleiche Produktkonzentrationen. Auch in den restlichen Fermentationen mit Einsatz von Sod-ß (1.3, 1.4, 1.5, 1.6) und verschiedenen Konzentrationen an NaHC0 ₃ bestätigt sich die Aussage, dass die Produktivität der Zellen unabhängig von der eingesetzten NaHC0 ₃ -Konzentration im Medium ist. Aus diesem Grund ist es möglich Zellen ohne den Einsatz von NaHC0 ₃ zu kultivieren.

BEISPIEL 5 FERMENTATION VERGLEICH C0 ₂ -PROFILE

In fünf C0 ₂ -geregelten Bioreaktoren werden über die Kultivierungsdauer hinweg verschiedene C0 ₂ - Sollwerte vorgegeben, um das optimale C0 ₂ -Profil für einen Fermentationsprozess zu finden.

Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Plattform: Bioreaktor / Multifermenter

Verfahren: Fed Batch

Zelle: CHO

Einsaatdichte: 3x10 ⁵ vc/mL

Startvolumen: 1,8 L

Laufzeit: 11 Tage

Medium: Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß (25mM)

Feeding: Feed I kontinuierlich ab Tag 2

Temperatur: 37°C

p0 ₂ : 60 %

Drehzahl: 160 Upm

pH: Tag 0-3 6,95 ± 0,15, Tag 3-11 6,80 ± 0,15

pH-Regelung: NaOH (1 ,2M) (kein C0 ₂ )

Die unterschiedlichen C0 ₂ -Profile der sechs Fermentationsprozesse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7 Experimentplan mit verschiedenen C0 ₂ -Profilen.

Da an Tag 0 versäumt wurde am Nachmittag erneut eine Probe für eine C0 ₂ -Korrektur zu entnehmen, stimmen die vorgegebenen C0 ₂ -Werte (siehe Tabelle 6) von Tag 0 bis 1 nicht mit den gemessen Werten überein wie in Abbildung 7C ersichtlich ist. Sowohl die normierten Lebendzellkonzentrationen als auch Produktkonzentrationen der einzelnen Prozesse mit unterschiedlichen C0 ₂ -Profilen ähneln sich weitgehend bis auf den Lauf 3.2. In dem Prozess 3.2 ist das Wachstum der Zellen schlechter als in allen anderen Prozessen (siehe Abbildung 7A). Durch das schlechte Wachstum der Zellen und die niedrige Zelldichte bleibt auch die Produktkonzentration in diesem Lauf niedriger als bei den anderen (siehe Abbildung 7B). Im Bezug auf das C0 ₂ -Profil des Laufes 3.2 ist in Abbildung 7C ersichtlich, dass dies der einzige Lauf ist, der an Tag 1 einen hohen pC0 ₂ (> 8%) aufweist.

Somit wird das Wachstum der Zellen durch einen anfänglich hohen pC0 ₂ negativ beeinflusst.

BEISPIEL 6 SCHÜTTELKOLBEN SÄUREVERTRÄGLICHKEIT MIT EINSATZ DER NA-SALZE In 10 250-mL-Schüttelkolben werden Zellen auf ihre Säureverträglichkeit mit Zugabe von Natriumsalzen getestet. Dabei werden die Salzlösungen so gewählt, dass sich die in einer vorhergehenden Titration ermittelten Stoffmengen der Säuren für einen pH-Shift von 7,1 nach 6,7 in 1 ,5 mL Lösung befinden. An Tag 3 werden den Schüttelkolben diese 1 ,5 mL der verschiedenen Salzlösungen zugegeben, um einen pH-Shift zu simulieren.

Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Kulturgefäß/Füllmeng: 250mL/50mL

Zelle: CHO

Medium: Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß (25mM)

Einsaatdichte: 2x10 ⁵ vc/mL

Kultivierungsdauer: 11 Tage

Kultivierungsbedingungen: Temperatur: 37°C

Relative Feuchte: 70%

Drehzahl: Tag 0-3 120 rpm, Tag 3-7 140 rpm

C0 ₂ : Tag 0-3 5%, Tag 3-11 3%

Feeding: Feed I täglich 1,5 mL

Die unterschiedlichen Zugaben in den 10 Schüttelkolben sind in Tabelle 8 dargestellt.

Schüttelkolben Zugabe

SF1

Wasser (für Kontrolle)

SF2

SF3

Natriumchlorid 23,4 g/L (für Salzsäure)

SF4

SF5 Natriumacetat 39,4 g/L (für Essigsäure) SF6

SF7

Natriumsulfat 34,1 g/L (für Schwefelsäure)

SF8

SF9

Di-Natriumhydrogenphosphat 61,7 g/L (für Phosphorsäure)

SF10

Tabelle 8

Die in Abbildung 8 dargestellten normierten Lebendzellkonzentrationen zeigen, dass die Zellen in allen Schüttelkolben außer den Schüttelkolben SF 5 und 6 mit Zugabe von Natriumacetat ähnlich wachsen. In diesen Schüttelkolben werden niedrigere Zellkonzentrationen erreicht und die Zellen sterben bereits ab Tag 7, sodass die Zugabe von Natriumacetat ein wesentlich schlechteres Wachstum zur Folge hat. Somit kann der Einsatz von Essigsäure zur pH-Regelung im Bioreaktor ausgeschlossen werden.

BEISPIEL 7 FERMENTATION VERGLEICH SÄUREN

In drei C0 ₂ -geregelten Bioreaktoren werden für einen pH-Shift von 6,95 nach 6,8 an Tag 3 verschiedene Säuren zugegeben. Dafür werden die Konzentrationen der Säurelösungen so gewählt, dass sich die notwendigen Stoffmengen, die zuvor in einer Titration ermittelt wurden, in 50 mL Lösung befinden.

Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Plattform: Bioreaktor / Multifermenter

Verfahren: Fed Batch

Zelle: CHO

Einsaatdichte: 3x10 ⁵ vc/mL

Startvolumen: 1,8 L

Laufzeit: 11 Tage

Medium: Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß (25mM)

Feeding: Feed I kontinuierlich ab Tag 2

Temperatur: 37°C

p0 ₂ : 60 %

Drehzahl: 160 Upm

pH: Tag 0-3 7,00 ± 0,05, Tag 3-11 6,80 ± 0,05

pH-Regelung: NaOH (1 ,2M) (kein C0 ₂ )

Die unterschiedlichen Zugaben der drei Fermentationsprozesse sind in Tabelle 9 dargestellt. Lauf Zugabe

4.3 Salzsäure 99mM

4.4 Schwefelsäure 54mM

4.5 Phosphorsäure 81mM

Tabelle 9 Experimentplan mit verschiedenen Zugaben.

Die normierten Zellkonzentrationen in Abbildung 9A verlaufen weitgehend ähnlich, sodass an Tag 10 die Maxima der einzelnen Läufe erreicht werden. Dabei bewegen sich die Zellkonzentrationen des Laufes 4.3 mit Zugabe von Salzsäure ständig unterhalb der anderen.

Im Hinblick auf die normierten Produktkonzentrationen (siehe Abbildung 9B) fällt jedoch auf, dass diese alle ähnlich verlaufen und somit im Lauf 4.3 mit Zugabe von S alzsäure gleiche Produktkonzentrationen erhalten werden wie in den anderen Prozessen.

Im Bezug auf die in Abbildung 9C dargestellten Laktatkonzentrationen wird deutlich, dass durch die Zugabe von Schwefelsäure (4.4) im Fermentationsprozess weniger Laktat produziert wird.

Damit ergibt sich durch die Zugabe der Salzsäure eine höhere Produktivität der Zellen und durch die Zugabe der Schwefelsäure ergeben sich niedrigere Laktatkonzentrationen im Fermentationsprozess.

BEISPIEL 8 VERGLEICH STAND ARDOPROZESS MIT C0 ₂ -GEREGELTEM PROZESS

In vier Bioreaktoren wird der Standardprozess mit dem herkömmlichen Medium B ohne C0 ₂ -Regelung und mit Einsatz von Na ₂ C0 ₃ zur pH-Regelung mit dem C0 ₂ -geregelten Prozess mit dem Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß (25mM) und Einsatz von NaOH und verschiedener Säuren für die pH-Regelung verglichen.

Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Plattform: Bioreaktor / Multifermenter

Verfahren: Fed Batch

Zelle: CHO

Einsaatdichte: 3x10 ⁵ vc/mL

Startvolumen: 1,8 L

Laufzeit: 11 Tage

Feeding: Feed I kontinuierlich ab Tag 2

Temperatur: 37°C

p0 ₂ : 60 %

Drehzahl: 160 Upm

pH: Tag 0-3 7,00 ± 0,05, Tag 3-11 6,80 ± 0,05 Die unterschiedlichen Zugaben der drei Fermentationsprozesse sind in Tabelle 10 dargestellt.

Tabelle 10 Experimentplan mit verschiedenen Zugaben.

Die in Abbildung 10 dargestellten normierten Produktkonzentrationen der Läufe 4.1 und 4.3 - 4.5 verlaufen sehr ähnlich. Dabei werden im Standardprozess (4.1) und im Lauf 4.5 mit Zugabe von Phosphorsäure annähernd gleiche Produktkonzentrationen erreicht, sodass der C0 ₂ -geregelte Prozess keine Nachteile in Hinsicht auf die Produktivität oder die zu erreichende Produktkonzentration mit sich bringt.

BEISPIEL 9 VERGLEICH C0 ₂ PROFILE MIT MODELLZELLE 2

In fünf Bioreaktoren wird der C0 ₂ -geregelte Prozess mit dem Medium B, NaHC0 ₃ -frei, MOPS-frei + Sod-ß (25mM) und Einsatz von NaOH für verschiedene pC0 ₂ -Profile verglichen. Die Regelung des pC0 ₂ geschieht aktiv durch Begasung mit N ₂ und C0 ₂ , was durch die Entkoppelung der pH-Regelung möglich ist.

Im Folgenden wird das Versuchssetup dargestellt:

Plattform: Bioreaktor / Multifermenter

Verfahren: Fed Batch

Zelle: CHO

Einsaatdichte: 3x10 ⁵ vc/mL

Startvolumen: 1,8 L

Laufzeit: 11 Tage

Feeding: Feed I kontinuierlich ab Tag 2

Temperatur: 37°C

p0 ₂ : 60 %

Drehzahl: 160 Upm pH: Tag 0-3 7,00 ± 0,05, Tag 3-11 6,80 ± 0,05

Die unterschiedlichen pC0 ₂ -Profile der fünf Fermentationsprozesse sind in Tabelle 11 dargestellt.

Tabelle 11 Experimentplan mit unterschiedlichen pC0 ₂ -Profilen.

Die in Abbildung I IA dargestellten normierten Lebendzellkonzentrationen zeigen ein signifikant besseres Wachstumsverhalten für den Fermentationslauf KF 1. Die Abbildung 1 1B für die normierte Produktkonzentration weist ebenfalls ein besseres Resultat für KF1 aus. Die Fermentationslaufzeit wurde für diesen Versuch in 3 Abschnitte unterteilt, für welche die Sollwerte des pC0 ₂ variiert wurden. Das besste Ergebnis wurde mit einer durchgängig niedrigen Vorgabe für den pC0 ₂ von 3%> erzielt.

ABKÜRZUNGEN

Im Folgenden werden in dieser Arbeit verwendete Abkürzungen und Symbole kurz erläutert.

BI Firma Boehringer Ingelheim GmbH & Co. KG

CHO-Zelle Chinese Hamster Ovarie - Zelle (Engl.„Zelle aus dem Eierstock des chinesischen Hamsters"). Eine seit 1960 etablierte und seither gut definierte und robuste Zelllinie die inzwischen auch in Suspension kultiviert werden kann und oft in der Pharmaproduktion Einsatz findet.

DoE Design of Experiments. Versuchsplanung zur Optimierung auf mathematisch-statistischer Grundlage. Software: Modde

Downstream Bereich der Produktisolierung und Anreicherung ab dem Zeitpunkt der

Zellernte . ( Vo lumenabnahme/ Aufkonzentration) .

Feeding (Engl.„Fütterung") Zugabe einer Lösung in die Fermentationskultur die von den Zellen zum Wachstum oder zur Proliferation benötigt wird.

FS Fermenter-Steuerplatz oder Fermentationssystem

Gl. Gleichung

GZZ Gesamtzellzahl. Konzentrationsangabe. Anzahl an Zellen pro Volumen die analysiert worden ist; beinhaltet sowohl tote als auch lebende Zellen. Meist Zelldichte in [Y Zellen xlO ⁵ / ml].

IPC In-Prozess-Kontrolle. Analytik von Parametern während ein Prozess abläuft. Kann Grundlage für Eingriffe in den laufenden Prozess sein wie z.B. Boluszugaben.

LAF-Box Laminar-Air-Flow-Box (Engl. "Mit laminarem Luftstrom durchströmte

Einrichtung). Steriler Arbeitsbereich.

LZZ Lebendzellzahl. Konzentrationsangabe. Anzahl an Zellen pro Volumen die als lebend analysiert ist. Meist Zelldichte in [Y Zellen xl 0 ⁵ / ml] Entspricht GZZ minus Anzahl toter Zellen.

MFC Massendurchflussregler (Engl. Mass Flow Controller)

MSR Messen-Steuern-Regeln; Mess- und Regeltechnik

Multifermenter Ein sog. Multifermenter ist eine Zusammenfassung aus sechs baugleichen Einzelfermentern, weiteres siehe Materialien.

NaHCCh Natriumhydrogencarbonat, auch (Natrium-) bicarbonat od. Natron (Engl.„Phosphate buffered saline"). Phosphat-gepufferte Salzlösung die isotonische Eigenschaften hat.

Unter einem Prozessformat versteht man die Festlegung der

Prozessparameter. Es enthält ebenso zeitliche Angaben als auch

Volumenströme von Feedings, Rührerdrehzahlen etc.

P steht für eine Puffersubstanz. PA steht z.B. für Puffer Substanz A. Bei

Wiederholungen des Puffers PA1, PA2, PA3 usw.

(Engl.„Maßstäbliche Vergrößerung") = Skalierung bzw. Skalierbarkeit

Maß stabs Vergrößerung einer Produktionsanlage; meist mit Hilfe von dimensionslosen Kennzahlen durchgeführt.

(Engl. Schüttelkolben). Einweg-Kolben aus Kunststoff. Der Deckel ist mit einem Gasdurchlässigen Sterilfilter versehen und wird bei Probenzug und Feeding abgeschraubt.

SensorDish Reader®

Online-Datenerfassung aus spezieller Wellplatte mit Messdots.

Nicht invasives Tool der Firma Presens, Regensburg.

Gibt die Konzentration eines Produktes, z.B. eines Proteins wie z.B. eines

Antikörpers in [mg/L] an. Nicht zu verwechseln mit dem medizinischen

Titer im eigentlichen Sinn.

Bereich der Zellkulturtechnik beginnend mit der Inokulation des Fermenters und Fermentation bis hin zur Zell-Ernte. (Volumenzunahme). Water for injection (Engl.„Wasser für Injektionszwecke") Aufgereinigtes, filtriertes, entsalztes Wasser dessen Qualität ständig überwacht wird. Ein Medium X with NaCl ist z.B. ein Medium bestehend aus allen Komponenten für Medium X -mit zusätzlicher definierter Menge NaCl. Im Bereich der Medienherstellung gängige Abkürzung für engl,„without". Ein Medium X w/o NaCl ist z.B. ein Medium bestehend aus allen Komponenten für Medium X -aber ohne NaCl.

Index In wässriger Lösung

Tag Fermentationstag. dO = Tag der Einsaat.