CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se relaciona con el área de la biotecnología. En particular, la invención ser refiere a un método para la producción de antioxidantes desde microalgas. Preferentemente, la invención se refiere a la producción de biomasa con alto contenido de luteína y bajo contenido en metales a partir de la microalga Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B de fecha 2 de Octubre de 2017 y su uso en la preparación de alimento animal o de consumo humano.

ANTECEDENTES

Una tendencia mundial tiene relación con la producción orgánica y la sustitución de químicos, colorantes, antibióticos, etc. en los procesos productivos. En este sentido, las microalgas presentan un buen potencial para diversas aplicaciones biotecnológicas, con una alta variedad de aplicaciones dado la vasta gama de productos naturales que generan.

Las microalgas han sido postuladas a través de los años como fuente potencial de diversos compuestos útiles para el ser humano, desde alimentos hasta químicos y biocombustibles. Sin embargo, su obtención actualmente no es tan económica, por lo que su viabilidad está dada por precio mínimo del producto objetivo a producir en relación a sus costos de producción. En este contexto la producción de antioxidantes presenta una buena oportunidad dado el crecimiento de su mercado y los precios atractivos, que en conjunto permitirían sustentar una operación a partir de microalgas.

En esta línea, la luteína que puede ser obtenida de la microalga Muriellopsis sp., ha sido catalogada como una de las 10 sustancias "sanas" recomendadas por la FDA norteamericana, por sus beneficiosos efectos terapéuticos en la prevención y tratamiento de enfermedades degenerativas, en particular, la degeneración macular, cataratas y arterioesclerosis. Muriellopsis sp. es una microalga verde unicelular que tiene la capacidad de producir grandes cantidades de luteína (entre 0 ,5 y 1 % del peso seco).

Por otra parte, en los últimos años, el acelerado aumento de la población, su envejecimiento y las enfermedades asociadas son una preocupación creciente en el mundo actual. En consecuencia, es necesario proveer la demanda nutricional a través de la búsqueda de fuentes alternativas de alimentos que sean fáciles de cultivar, rentables y en forma continua. Al respecto, los estudios relacionados a las aplicaciones del cultivo de microalgas han aumentado considerablemente, ya sea para la industria de la acuicultura como para la producción de compuesto con alto valor comercial, entre los cuales podemos encontrar a los ácidos grasos poliinsaturados y los pigmentos carotenoides. Estos pigmentos han sido utilizados para su inclusión en dietas de peces y como complemento alimenticio en dietas para humanos.

US20070196893A1 divulga un proceso para obtener luteína de un alga verde, específicamente de Chlorella sorokiniana (No. Acceso CCAP 21 1 -32, depositado en Culture Collection of Algae And Protozoa, Reino Unido), la que produce al menos alrededor del 90% en peso del total de carotenoides cuando se cultiva en sales de ácido acético 20 a 60 mM y se radia con luz a alrededor de 200 a 1 .500 μ/(Εηι ² 5 ¹ ) para luego es cosechada para obtener desde la cosecha, la luteína. Antes o después de la cosecha se puede agregar adicionalmente un antioxidante, por ejemplo, alfa tocoferol. También, se divulga un método para preparar un producto enriquecido en luteína que comprende cultivar la microalga Chiorella sorokiniana en sales de ácido acético 20 a 60 mM y se radia con luz a alrededor de 200 a 1 .500 μ/(Εηι ² 5 ¹ ) y cosechar para formar una suspensión concentrada, y opcional y adicionalmente, romper las celular de la suspensión concentrada y secarlas para obtener luteína o el producto enriquecido en luteína. El alga es cultivada a una temperatura entre alrededor de 20 a alrededor de 40°C y se puede conducir bajo condiciones de estrés de irradiación de luz, estrés químico, de sales, temperatura o estrés oxidativo. El producto tiene una proporción luteína/zeaxantina mayor que 5 y una proporción clorofila A/luteína menor que 10. Se obtiene así una alta producción de luteína desde el alga verde. La luteína y los productos enriquecidos en luteína son adecuados para ser usados como suplementos dietéticos y/o aditivos alimentarios o materia prima cosmética o farmacéutica.

US20150225322A1 divulga preparar una composición enriquecida en luteína a partir de biomasa microalgal al preparar un lisado celular de dicha biomasa y concentrarla a un contenido de materia seca mayor que 15% en peso, tratar el lisado con un solvente polar y obtener una resina oleosa que contiene luteína y lípidos, extraer la resina oleosa con un solvente no polar en forma de un fluido supercrítico de C0 ₂ a una presión de 25 MPa a 40 MPa y a una temperatura de 35°C a 90°C para obtener una fracción lipídica no polar que contiene triglicéridos y una fracción insoluble enriquecida en luteína, y recuperar dicha fracción insoluble. El solvente polar se selecciona de metanol, etanol, n-propanol e isopropanol, butanol e isobutanol, esteres y cetonas, solos o en combinación. La microalga pertenece a la familia Chiorella. La fracción enriquecida en luteína es útil en composiciones farmacéuticas, suplementos alimenticios y comida. CN102094061 B enseña un método para acumular luteína en microalgas al preparar un cultivo heterotrofico que puede ser inducido por luz después de la dilución del cultivo, y opcionalmente cosechar las algas para separar y extraer la luteína, se usa una solución de alginato diluida de las algas heterotróficas con una densidad celular de 0,1 -10 g/litro. El cultivo no contiene carbono orgánico y se realiza a pH 4,0-9,0. La microalga puede ser seleccionada de Chlorella pyrenoidosa, Chlorella vulgaris y Chlorella ellipsoidea. El cultivo se induce por luz y comprende una solución diluida de la microalga. La temperatura de cultivo está entre 5-50°C y se cultiva con luz continua o intermitente, con intensidad de 0,1 -150klx por un periodo de 1 a 150 horas. El método además comprende extraer por separación y extracción, los pigmentos del alga incluyendo luteína, después de mezclar polvo seco del alga o la sustancia bioactiva. De esta forma, enseña un método que permite acumular rápidamente luteína en un cultivo heterotrofico de microalgas inducido por luz, y con ello, y ofrece un método que puede ser industrializable.

EP1808483 además de describir como obtener una luteína más biodisponible al romper las células colectadas y secarlas para obtener luteína o una composición enriquecida en luteína, usando perlas donde la suspensión de masa se desintegran agua en presencia de un antioxidante apropiado para prevenir la oxidación de la luteína. Después de secar, se obtiene un producto en polvo de las partículas de tamaño tipo pequeño, que puede ser usado directamente en aplicaciones alimenticias para consumo humano o en mezcla con otros ingredientes para un alimento acuícola. La luteína puede ser concentrada por extracción con solventes no polares o solventes supercríticos de modo de formular suplementos alimenticios o productos farmacéuticos. En consecuencia, el problema técnico de la presente invención es proporcionar un método alternativo para producción de biomasa con alto contenido de luteína y bajo contenido en metales a partir de la microalga Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B, y su uso en la preparación de alimento animal o de consumo humano.

La publicación "Lutein production by Muriellopsis sp. in an outdoor tubular photobioreactor de Journal of Biotechnology", Volumen 85, No.3, del 23 Febrero 2001 , páginas 289-295, es un estudio de la tasa de dilución, mezclando y ciclos solares diarios de producción de luteína y biomasa del alga verde unicelular Muriellopsis sp. en un fotobioreactor tubular exterior. Los mayores valores de productividad para luteína fueron alrededor de 180 mg/m ² por día y biomasa alrededor de 40 g base seca/m ² por día. La tasa de dilución óptima varió desde el valor más bajo de 0,06/h al valor más alto de 0,09/h. Valores similares para eficiencia fotosintética alrededor de 4% fueron registrados, confirmando la optimización de las condiciones de cultivo. El ciclo solar diario mostró un rápido incremento del contenido de luteína de Muriellopsis sp. en respuesta a la irradianza durante las primeras horas del día, con un contenido máximo de luteína de alrededor de 6 mg/g en peso seco a mediodía. Un aumento en el crecimiento celular se confirma luego de alcanzado el máximo de la proporción luteína clorofila, lo que sugeriría que la luteína participa en proteger a la célula del fotodaño.

Carotenoid content of chlorophycean microalgae: factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp. (Chlorophyta), J Biotechnol. 2000 Enero 7; 76(1 ):51 -9, estudia el perfil de carotenoides de 15 cepas de la microalga. Luteína, beta-caroteno y violaxantina se presentaron en todas las cepas, siendo la luteína en general la más abundante. Cantaxantina y astaxantina solo se encontró en algunas cepas. Chiorella fusca SAG 21 1 -8b, Chlorococcum citriforme SAG 62.80, Muriellopsis sp., Neospongiococcum gelatinosum SAG B 64.80 y Chlorella zofingiensis CCAP 21 1 /14 mostraron altos niveles de luteína. Chlorella zofingiensis CCAP 21 1 /14 mostraba además altos niveles de astaxantina. Muriellopsis sp. mostró un contenido alto de luteína hasta 35 mg/litro de cultivo, una alta tasa de crecimiento hasta 0,17-0,23/h y una densidad celular de hasta 8 x 10 ¹⁰ células/litro de cultivo. Los niveles de luteína están en el rango de aquellos reportados para astaxantina en Haematococcus y de beta-caroteno en Dunaliella, microalga de reconocido interés para producir carotenoides. El contenido de luteína de Muriellopsis sp. se incrementó durante la fase exponencial de crecimiento con el alto valor registrado en la fase estacionaria temprana. Los niveles máximos de luteína en cultivos Muriellopsis sp. Fueron registrado en 20-40 mM NaN0 ₃ , 2-100 mM NaCI, 460 micromol de foton/m ² s\ pH 6,5 y 28°C, condiciones que en general fueron también óptimas para el crecimiento celular. Las condiciones limitantes del crecimiento son valores de pH de 6 o 9 y una temperatura de 33 ^e C, estimularon también la carotenogenesis en Muriellopsis sp. Es estudio demuestra que la cepa representa una fuente potencial de luteína, un carotenoide de interés comercial de aplicación en acuicultura y avícola como también para la prevención del cáncer y enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Outdoor cultivation of lutein-rich cells of Muriellopsis sp. in open ponds. Applied Microbiology and Biotechnology. Enero 2007, Volumen 73, No.6, páginas 1259-1266, estudia el crecimiento de la microalga en el exterior en estanques abiertos agitados y su capacidad de acumular carotenoides. Concluye que el crecimiento celular en sistema abiertos tuvieron luteína libre como el principal carotenoide, también hubo presencia de violaxantina, β-caroteno y neoxantina. El contenido de luteína de la biomasa seca se encuentra en el rango de 0,4 a 0,6% dependiendo de las condiciones de crecimiento y entorno. Además, la biomasa de Muriellopsis sp. tuvo un alto contenido de proteínas y lípidos con alrededor de la mitad de ácidos grasos del tipo poliinsaturados con casi el 30% de ácido α-linolenico. El efecto de los parámetros determinantes en la realización del cultivo en estanques abiertos para mantener cultivos productivos bajo un sistema semicontinuo y el rendimiento de biomasa y luteína no fue superior a aquella obtenida en fotobioreactores tubulares cerrados y alcanzó valores de productividad de 20 g de biomasa seca que contienen alrededor de 100 mg luteína/m ² dia ¹ en verano. Entonces el estudio confirma la posibilidad del cultivo exterior de Muriellopsis sp. en piscinas abiertas para producir luteína. Luego, la presente invención proporciona un sistema de cultivo estable en agua de mar de la microalga Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B, que permite producir biomasa con alto contenido de luteína y bajo contenido en metales a partir de la microalga Muriellopsis sp., y su uso en la preparación de alimento animal o de consumo humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención usa una cepa dulceacuícola endémica del desierto de Atacama. Esta cepa es Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B de fecha 2 de Octubre de 2017, la cual tiene potencial como fuente natural de pigmentos carotenoides específicamente luteína, en donde las concentraciones obtenidas están en el rango de 0,3% al 0,6% en peso seco. Estos valores representan entre 10 a 20 veces más que los obtenidos de la actual fuente de este pigmento, los pétalos de la flor Tagetes erecta nombre común Caléndula, de la cual se ha reportado una producción de 0,03% de luteína.

Se cultivó la cepa Muriellopsis sp. (MCH-35, BEAJDA 0063B) en agua de mar con el medio UMA5. Se realizaron análisis de laboratorio para el contenido proximal (cenizas, proteínas, lípidos, luteína) de varias biomasas obtenidas en distintos lotes. Los resultados para el contenido de cenizas estuvieron en el rango de 7,15% y 1 1 ,88% con un valor promedio entre todas las muestras de 10,06%. El contenido de proteína estuvo en el rango de 8,70 a 12,09 con un promedio de 10,31 . El contenido de carbohidratos estuvo en el rango de 65,00% a 74,25% con un valor promedio de 68,37%. El contenido de lípidos estuvo en el rango de 8,95% a 13,48% con un valor promedio de 1 1 ,26%. La humedad estuvo en el rango de 17,58% a 31 ,52% con un valor promedio de 25,93%. El porcentaje de luteína estuvo en el rango de 0,37% a 0,66% con un valor promedio de 0,54%. La determinación de la clorofila a, b y carotenoides totales se realizó como un promedio de 4 batch o lotes, de 7 días de duración obteniéndose un valor en el rango de 0,06%; 0,10% y 0,09%, respectivamente. El contenido promedio de porcentaje de luteína de 4 batch de 7 días de duración fue de 0,53%. Según los resultados obtenidos se puede afirmar que la microalga Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B, cultivada en raceway de 14 m ³ durante 7 días al aire libre permite producir biomasa con una alta capacidad antioxidante, contenido de polifenoles y luteína, mostrando potencial para su uso en producto agroalimentario con buenos contenidos nutricionales y propiedades antioxidantes.

El valor de referencia es 0,55% de luteína, se obtiene de la cepa Scenesdemus almeriensis desde la cual se obtiene los mayores porcentajes de este carotenoide. Actualmente, una fuente común para obtener luteína por extracción son las flores de Tagetes erecta (clavel chino o Marigold), de las que se obtiene 0,03% (Sánchez et al., 2008). Por lo que la presente invención es un método prometedor para el cultivo Muriellopsis sp. con fines de producir biomasa con alto contenido en luteína y bajo contenido en metales que tiene buenas propiedades antioxidantes y útil para preparar alimento animal o de consumo humano.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

ME35 y ME35 cultivadas en medio F/2 y UMA5, datos obtenidos al día 1 , 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17 y 21 en modo batch o por lote, cultivos realizados en botellones de 20 litros.

Figura 2. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MEO y MEO cultivadas en medio F/2 y UMA5, datos obtenidos al día 1 , 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17 y 21 en modo batch o por lote, cultivos realizados en botellones de 20 litros.

Figura 3. Porcentaje de cenizas, proteína, lípidos y luteína en cultivos de la cepa

Muriellopsis sp., MCH35, ME35, MCH0 (BEA_IDA_0063B) y MCH35 (BEA_IDA_0063B) con dos medios de cultivo F/2 y UMA5, datos obtenidos a 23 días de cultivo en modo batch o por lote, cultivadas en botellones de 20 litros.

Figura 4. Porcentaje de luteína en cultivos de la cepa Muriellopsis sp., ME35, ME35,

MCH0 (BEA_IDA_0063B) y MCH35 (BEA_IDA_0063B) con dos medios de cultivo F/2 y UMA5, datos obtenidos a 23 días de cultivo en modo batch o por lote, cultivadas en botellones de 20 litros. Figura 5. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp., MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L en que quedó inoculado, el balón.

Figura 6. Productividad de biomasa en g/L-d en cultivos batch o por lotes de 13 días de la cepa Muriellopsis sp., MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 con tres concentraciones de inoculo inicial. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón, barras celestes ME35, barras verdes MCH35 (BEA_IDA_0063B).

Figura 7. Concentración de nitrógeno en mg/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón.

Figura 8. Concentración de fósforo en mg/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón.

Figura 9. Porcentaje de cenizas, proteína, lípidos y luteína en cultivos de la cepa

Muriellopsis sp., MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos a 13 días de cultivo en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón.

Figura 10. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCHO (BEA_IDA_0063B) y MEO con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón.

Figura 11. Productividad de biomasa en g/L-d en cultivos batch o por lote de 13 días de la cepa Muriellopsis sp., MCHO (BEA_IDA_0063B) y MEO con tres concentraciones de inoculo inicial. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedó inoculado el balón, barras celestes MEO, barras verdes MCHO (BEA_IDA_0063B). Figura 12. Concentración de nitrógeno en mg/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCHO (BEAJDA 0063B) y MEO con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. EL número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón. Figura 13. Concentración de fósforo en mg/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCHO (BEAJDA 0063B) y MEO con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos al día 0, 3, 6 y 13 en modo batch o por lote. El número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón. Figura 14. Porcentaje de cenizas, proteína, lípidos y luteína en cultivos de la cepa

Muriellopsis sp., MCHO (BEA_IDA_0063B) y MEO con tres concentraciones de inoculo inicial, datos obtenidos a 13 días de cultivo en modo batch o por lote. EL número dentro del paréntesis indica los g/L a los cuales quedo inoculado el balón.

Figura 15. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCHO (BEA_IDA_0063B) y MEO en sistemas de 400 litros con medio UMA5, en modo batch o por lote durante 25 días.

Figura 16. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 en sistemas de 400 litros con medio UMA5, en modo batch o por lote durante 24 días.

Figura 17. Concentración de biomasa en g/L en cultivos de la cepa Muriellopsis sp.,

MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 en sistemas de 400 litros con medio UMA5, en modo batch o por lote durante 17 días.

Figura 18. Porcentaje de cenizas, proteína, lípidos y luteína en cultivos de la cepa

Muriellopsis sp., chilena y española en agua de mar MCH35 (BEA_IDA_0063B), ME35 y agua dulce MCHO (BEA_IDA_0063B) y MEO con medio UMA5, datos obtenidos a 13 y 14 días de cultivo en modo batch o por lote, en bolsas de 400 litros.

Figura 19. Resumen de los valores obtenidos de porcentaje de luteína en cultivos de la cepa Muriellopsis sp. (BEAJDA 0063B), en los tres experimentos realizados, botellones, bolones y bolsas de 400 litros.

DESCRIPCION DETALLADA DEL INVENTO Se cultivó la cepa Muriellopsis sp. chilena, con número de acceso en el Banco Español de Algas BEA_IDA_0063B, en agua de mar (MCH-35) con el medio UMA5. Se realizaron análisis de laboratorio del contenido proximal (cenizas, proteínas, lípidos y luteína) de varios cultivos de la microalga, obtenidos en distintos lotes. Los resultados para el contenido de cenizas están en el rango de 7,15% y 1 1 ,88% con un valor promedio entre todas las muestras de 10,06%. El contenido de proteína está en el rango de 8,70% a 12,09% con un promedio de 10,31 %. El contenido de carbohidratos está en el rango de 65,00% a 74,25% con un valor promedio de 68,37%. El contenido de lípidos está en el rango de 8,95% a 13,48% con un valor promedio de 1 1 ,26%. La humedad está en el rango de 17,58% a 31 ,52% con un valor promedio de 25,93%. El contenido de luteína está en el rango de 0,37% a 0,66% con un valor promedio de 0,54%. La determinación de la clorofila a, b y carotenoides totales se realizó como un promedio de 4 batch o lotes de 7 días de duración, obteniéndose los siguientes valores: 0,06%; 0,10% y 0,09%, respectivamente. El contenido promedio del porcentaje de luteína de 4 batch o lotes de 7 días de duración fue de 0,53%. Ver tablas 3 a 7.

Según los resultados obtenidos, la microalga Muriellopsis sp., con número de acceso en el Banco Español de Algas BEA D01_1 1 , cultivada en raceway de 14 m ³ durante 7 días al aire libre en agua de mar, presenta alta capacidad antioxidante y alto contenido de polifenoles y luteína, por lo que resulta en un producto agroalimentario potencial con buenos contenidos nutricionales y propiedades antioxidantes.

El método de cultivo se llevó a cabo en una piscina tipo raceway de 14 m ³ y una muestra liofilizada fue sometida a análisis de metales pesados (arsénico, cadmio, mercurio y plomo) y además de un análisis de fibra. Al comparar los resultados del análisis con aquellos que establecen los límites máximos de contaminantes en iinnssuummooss ddeessttiinnaaddooss aa llaa aalliimmeennttaacciióónn aanniimmaall,, ppoorr eejjeemmpplloo eenn mmeettaalleess ppeessaaddooss,, eessppeeccííffiiccaammeennttee,, AArrsséénniiccoo:: 4400 ppppmm;; PPlloommoo:: 1155 ppppmm;; MMeerrccuurriioo:: 00,,33--00,,55 ppppmm yy CCaaddmmiioo:: 11 ppppmm.. LLaass mmuueessttrraass ddiieerroonn vvaalloorreess ddeebbaajjoo ddee llooss vvaalloorreess ppeerrmmiittiiddooss ppoorr llaass nnoorrmmaattiivvaass mmááss uussaaddaass,, eessttoo eess,, llooss ssiigguuiieenntteess vvaalloorreess:: AArrsséénniiccoo:: 11 ,,882233 ppppmm;; PPlloommoo:: 55 00,,22 ppppmm;; MMeerrccuurriioo:: 00,,11 11 11 ppppmm yy CCaaddmmiioo:: 00,,2200 ppppmm.. AAddeemmááss,, llaa ccaannttiiddaadd ddee ffiibbrraa ccrruuddaa pprreesseennttee eenn llaa bbiioommaassaa mmiiccrrooaallggaall ffuuee ddee 44,,4433 gg//11 OOOOgg..

EEll ccoonntteenniiddoo ddee ppoolliiffeennoolleess ttoottaalleess ((ccoommppuueessttooss ffeennóólliiccooss)) ppaarraa eell ddííaa 77 ddee ccuullttiivvoo llaa mmiiccrrooaallggaa pprreesseennttaa uunn vvaalloorr ddee 332222 mmgg EEAAGG//110000gg ddee mmuueessttrraa.. MMiieennttrraass qquuee ppaarraa eell

1100 ddííaa 1144 eell vvaalloorr eess ddee 225544 mmgg EEAAGG//110000gg mmuueessttrraa.. LLaa aaccttiivviiddaadd aannttiirraaddiiccaall ssee eevvaalluuóó ccoonn eell mmééttooddoo OORRAACC ppaarraa eell ddííaa 77 yy 1144 oobbtteenniieennddoo llooss ssiigguuiieenntteess vvaalloorreess:: 88..997744 yy 66..331166 μμηηιιοοΙΙ EETT//110000gg.. EEssttoo iinnddiiccaa qquuee aall ddííaa 77 ddee ccuullttiivvoo hhaayy uunn 3300%% mmááss ddee aaccttiivviiddaadd aannttiiooxxiiddaannttee qquuee eenn eell ddííaa 1144.. EEss iimmppoorrttaannttee mmeenncciioonnaarr qquuee eell eennssaayyoo OORRAACC ccoommpprreennddee llaa mmeeddiicciióónn ddeell aappoorrttee qquuee hhaacceenn aa llaa aaccttiivviiddaadd aannttiiooxxiiddaannttee ttaannttoo llooss

1155 ppoolliiffeennoolleess ccoommoo aaqquueellllooss ccoommppuueessttooss ddee nnaattuurraalleezzaa nnoo ppoolliiffeennóólliiccaa pprreesseenntteess eenn uunn aalliimmeennttoo ddaaddoo.. SSeeggúúnn llooss vvaalloorreess ddee OORRAACC ddee llaa bbaassee ddee ddaattooss ddee AAccttiivviiddaadd AAnnttiiooxxiiddaannttee yy CCoonntteenniiddoo ddee PPoolliiffeennoolleess TToottaalleess eenn FFrruuttaass pprrooppoorrcciioonnaaddooss ppoorr eell ssiittiioo wwwwww..ppoorrttaallaannttiiooxxiiddaanntteess..ccoomm,, llooss rreessuullttaaddooss oobbtteenniiddooss ddee 77 ddííaass ssoonn ccoommppaarraabblleess oo ssuuppeerriioorreess ppaarraa ddiivveerrssooss aannáálliissiiss ddee ffrruuttaass.. DDee uunn ttoottaall ddee 114477 ffrruuttaass rreeppoorrttaaddaass,, MMCCHH--

2200 3355 ooccuuppaarrííaa eell lluuggaarr 9999..

TTaabbllaa 11 :: VVaalloorreess ddee OORRAACC ddee llaa bbaassee ddee ddaattooss ddee AAccttiivviiddaadd AAnnttiiooxxiiddaannttee yy CCoonntteenniiddoo ddee PPoolliiffeennoolleess TToottaalleess eenn FFrruuttaass eexxttrraaccttoo ddee llaa ttaabbllaa pprrooppoorrcciioonnaaddaa ppoorr eell ssiittiioo

25

Ejemplos

Ejemplo 1 : Crecimiento de diferentes cepas en agua de mar y agua dulce

Se evaluó el comportamiento en el crecimiento de las cepas Muriellopsis sp. chilena, con número de acceso en el Banco Español de Algas BEAJDA 0063B, arbitrariamente denominada (MCH35) en agua de mar y arbitrariamente denominada en agua dulce (MCH0). También se evaluó la cepa Muriellopsis sp. española (ME35) y (MEO). Los cultivos se realizaron en dos medios de cultivo con el objetivo de determinar el comportamiento respecto del aumento de concentración de biomasa, lo que permitió confirmar el medio de cultivo a utilizar en los cultivos outdoor.

Así, se inocularon botellones de 20 litros con las cepas chilena y española, utilizando agua dulce y agua de mar, y además los siguientes dos medios de cultivo F/2 y UMA5. Los cultivos se codificaron de la siguiente forma:

Medio de Cultivo F/2

MCH35 F/2 (cultivo de cepa chilena de Muriellopsis sp. (BEA_IDA_0063B) en agua de mar y medio F/2);

MCHO F/2 (cultivo de cepa chilena de Muriellopsis sp (BEA_IDA_0063B) en agua dulce y medio F/2);

ME35 F/2 (cultivo de cepa española de Muriellopsis en agua de mar y medio F/2); MEO F/2 (cultivo de cepa española de Muriellopsis en agua dulce y medio F/2); y

Medio de Cultivo UMA5

MCH35 UMA5 (cultivo de cepa chilena de Muriellopsis sp. (BEA_IDA_0063B) en agua de mar y medio UMA5);

MCHO UMA5 (cultivo de cepa chilena de Muriellopsis sp (BEA_IDA_0063B) en agua dulce y medio UMA5);

ME35 UMA5 (cultivo de cepa española de Muriellopsis en agua de mar y medio UMA5); y

MEO UMA5 (cultivo de cepa española de Muriellopsis en agua dulce y medio UMA5). Se tomaron muestras desde los Raceway, a los días 1 , 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17 y 21 de cultivo. Al término, se deja decantar los cultivos y se recolecta el pellet de cada botellón para posteriormente centrifugar y lavar dos veces con agua potable, y entonces congelar y liofilizar. Sobre el liofilizado se realiza el análisis proximal para lípidos, proteínas, luteína, carotenoides y cenizas.

Los cultivos comenzaron con 0,03 y 0,07 g/L de microalgas (figura 1 y 2). Al día 21 de cultivo, se obtuvieron los mejores resultados en la generación de biomasa microalga en los cultivos etiquetados como MCH35 (BEA_IDA_0063B) UMA5 (fue 0,41 g/L) y MCH0 (BEA_IDA_0063B) UMA5 (fue 0,42 g/L). No se confirmó diferencias entre los cultivos MCH35 (BEA_IDA_0063B) F/2, MEO F/2, MEO UMA5, MCH0 (BEAJDA 0063B) F/2, donde los resultaros obtenidos en todos estos casos, fue: 0,31 g/L.

Ejemplo 2: Cultivo outdoor de la cepa chilena de la microalga y la cepa española de la microalga Se seleccionó ME35 UMA5 y MCH35 UMA5 para evaluar el cultivo outdoor en agua de mar. El cultivo proporcionó los siguientes resultados: 0,26 g/L y 0,41 g/L (figura 1 ). Lo anterior contrastado con los resultados en agua de mar con F/2 (0,20 g/L y 0,31 g/L (figura 2), son mejores aunque no pareciera ser significativo el incremento de los valores, entre un medio y el otro.

Se realizó otra evaluación con las mismas cepas y condiciones pero evaluando esta vez, la concentración de inoculo inicial para que sea más alta que en la evaluación anterior, y así, asegurar un crecimiento microalgal superior a 0,5 g/L, concentración mínima adecuada para la producción masiva y optimización de productividad.

En la figura 4 se muestra el consumo de fósforo , el que va disminuyendo conforme pasan los días, lo que es normal en los cultivos microalgales. En la figura 3 se observan los porcentajes de compuestos bioquímicos presentes en la biomasa de microalgas. Al cabo de 23 días de cultivo, los porcentajes de cenizas, todos son similares y varían en el rango de 2,82% a 6,72%, excepto para ME35 F/2 donde el valor porcentual de cenizas es 1 1 ,64% de cenizas.

El porcentaje de proteínas muestra una variación de 12,91 % a 44,13%, siendo superior al 30% para el caso de las cepas españolas cultivadas en agua de mar con ambos medios UMA5 y F/2, y superior al 40% en el caso de los cultivos en agua dulce con los mismos medios. La cepa chilena cultivada en ambos medios y agua dulce y agua de mar presentó valor promedio de proteínas de 13%.

El porcentaje de lípidos muestra una variación de 14,09% a 53,67%, encontrando que la cepa española en agua dulce y agua de mar cultivada con F/2 tiene un contenido de lípidos superior al 40% al igual que la cepa española en agua dulce en UMA5. Los cultivos restantes presentan un porcentaje promedio de lípidos de 15%.

El porcentaje de luteína se encuentra en el rango de 0,15% a 0,67%. Cuatro cultivos presentaron valores mayores a 0,55%. La cepa chilena cultivada en agua de mar en medio F/2 y UMA5 y la cepa española cultivada en agua dulce con medio UMA5 y agua de mar en UMA5 (figura 4). Este valor de referencia 0,55% de luteína se obtiene de Scenesdemus almeriensis, cepa de la cual se han obtenido los mayores porcentaje de este compuesto. La fuente de donde se extrae luteína hoy en día son las flores de Tagetes erecta (clavel chino o Marigold) de ellas se obtiene 0,03% (Sánchez et al., 2008). De esta forma, se confirma que los cultivos de Muriellopsis sp. en agua de mar permiten producir luteína. Ejemplo 3: Evaluación de la concentración de inoculo inicial con agua de mar y agua dulce en medio UMA5.

Se evaluó la concentración de inoculo inicial de la cepa Muriellopsis sp. chilena en agua de mar (MCH35 (BEA_IDA_0063B)) y agua dulce (MCHO (BEA_IDA_0063B)). También se evaluó la cepa Muriellopsis sp. Española en agua de mar (ME35) y agua dulce (MEO). El estudio se realizó desde cultivos de concentración conocida (MCH35 (BEA_IDA_0063B), MCHO (BEA_IDA_0063B), ME35 y MEO). Estos se agregaron a un balón de 1 litro, en los siguientes volúmenes: 167 mL, 333 mL y 500 mL, y luego, se llevaron hasta 950 mL con agua de mar y agua dulce respectivamente, definiendo los siguientes cultivos: MCH35 (BEA_IDA_0063B), MCHO (BEA_IDA_0063B), ME35 y MEO (0,2 g/L) con concentración de inoculo de 0,2 g/L; MCH35 (BEA_IDA_0063B), MCHO (BEA_IDA_0063B), ME35 y MEO (0,3 g/L) concentración de inoculo de 0,3 g/L; MCH35 (BEA_IDA_0063B), MCHO (BEA_IDA_0063B), ME35 y MEO (0,4 g/L) concentración de inoculo de 0,4 g/L. Para estos cultivos se utilizó medio de cultivo UMA5.

Se tomaron 100 mL de cada balón para realizar un análisis de peso seco y determinación de nitrato y fosfato, quedando el balón con 850 mL, y diariamente se repuso el agua de evaporación con agua potable autoclavada. Al día 3, 6 y 13 de cultivo, se tomaron 50 mL para realizar análisis de pesos seco, nitrato y fosfato. Al final del experimento se dejó decantar los cultivos y se recolectaron los pellets de todos los balones, se juntaron los triplicados de cada cultivo quedando 6 muestras, las que fueron lavadas dos veces con agua potable y centrifugadas. Posteriormente, el pellet se congeló y liofilizó para un análisis proximal de lípidos, proteínas, luteína, carotenoides y cenizas. En la figura 5 se observa el promedio y desviación estándar de la cepa ME35 al día 0 que tenían una concentración inicial de: 0,1977 g/L; 0,3310 g/L; 0,3910 g/L. La cepa MCH35 (BEA_IDA_0063B) al día 0 tiene una concentración inicial de 0,2143 g/L; 0,3380 g/L y 0,4423 g/L. El objetivo fue inocular a 0,2 g/L; 0,3 g/L y 0,4 g/L aunque los balones quedaron inoculados con un poco más de biomasa pero dentro del rango esperado. Al día 13 de cultivo se observan diferencias significativas en la cepa Muriellopsis sp. española cultivada con agua de mar al comparar los balones con concentración inicial de 0,2 g/L contra aquellos balones de concentración inicial de 0,3 g/L y 0,4 g/L. Sin embargo, no hay diferencias entre los balones con concentraciones iniciales de 0,3 g/L y 0,4 g/L. Para el caso de la cepa Muriellopsis sp. Chilena (BEAJDA 0063B) cultivada con agua de mar, se observa la misma tendencia que con la cepa española, esto es, presencia de diferencias significativas entre los cultivos con concentraciones iniciales de 0,2 g/L y aquellos con concentraciones iniciales de 0,3 g/L y 0,4 g/L. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre los cultivos con concentraciones iniciales de 0,3 y 0,4 g/L.

Los mayores valores se encontraron en ME35 (concentración inicial 0,4 g/L) alcanzando 1 ,0740 g/L, y en MCH35 (BEA_IDA_0063B, concentración inicial 0,3 g/L) alcanzando 1 ,1360 g/L

En la figura 6 se observa que en cuanto a la productividad para la cepa Española, no habría diferencias en las tres concentraciones iniciales de inoculo. En tanto, para la cepa chilena (BEAJDA 0063B) inoculada con 0,3 g/L, hay un 15% de productividad más con respecto a la concentración inicial de 0,2 g/L. La concentración de inoculo inicial no es proporcional a la producción final al día 13. Por ejemplo, al inocular 0,2 g/L de la cepa Española al día 13 de cultivo se obtienen 1 ,02 g/L. En cambio, al inocular 0,4 g/L no se obtienen 2,04 g/L sino que 1 ,07 g/L. Entonces para la cepa Española se puede utilizar en cualquiera de las tres concentraciones de inoculo. Mientras para la cepa Chilena (BEA_IDA_0063B) se puede utilizar entre 0,2 y 0,3 g/L de inoculo. Entre las dos cepas no se observan diferencias significativas siendo el promedio entre los tres cultivos de la cepa Española 0,052 g/L-d y para la cepa Chilena (BEA_IDA_0063B) 0,055 g/L-d.

El contenido de nitrato y fosfato permitió evaluar si la concentración inicial de inoculo influye en el consumo de estos dos macronutrientes, ya que, en la mayoría de la literatura disponible hay deprivación de nutrientes para inducir algún cambio en el perfil proximal de las microalgas. En la presente invención se necesita en cambio inducir la carotenogénesis.

Se demuestra así que la concentración de biomasa no está directamente relacionada con el consumo de N y P. Por ejemplo, observando la figura 1 al día 13 de cultivo para la cepa MCH35 (BEA_IDA_0063B, 0,3 g/L) y MCH35 (BEA_IDA_0063B, 0,4 g/L), ambas tienen casi la misma concentración de biomasa (ver figura 5) por lo que su consumo de N y P debiera ser muy similar pero no ocurre (ver figura 7) al día 13 de cultivo, se confirma un mayor consumo de N en la cepa MCH35 (BEAJDA 0063B, 0,4 g/L), lo que - sin adherirse a ninguna teoría, se atribuiría a la distancia que se habrían ubicado los balones respecto de la fuente de luz.

En la figura 8 se muestra el consumo de fósforo, el que conforme pasan los días va disminuyendo, lo que es normal en los cultivos microalgales.

En la figura 9 se observan los porcentajes de compuestos bioquímicos presentes en la biomasa de microalgas al cabo de 13 días de cultivo. En relación a las cenizas, todos los porcentajes son similares se encuentran en el rango de 8,21 % a 10,57%. Respecto del porcentaje de proteínas, los valores se encuentran en el rango de 44,74% a 51 ,45%. El porcentaje de lípidos se encuentra en el rango de 9,62% a 15,40%. El porcentaje de luteína se encuentra en el rango de 0,10% a 0,55%.

Según los análisis proximales de todos los cultivos, esto es, para las dos cepas en los dos tipos de agua (dulce y de mar) y las tres concentraciones de inoculo (0,2 g/L; 0,3 g/L y 0,4 g/L). Luego, el cultivo de la cepa española en agua de mar, permite generar proteína, mientras el cultivo en agua dulce, permite generar lípidos. En tanto, el cultivo con la cepa chilena (BEAJDA 0063B) en agua de mar, permite generar luteína.

La Figura 10 muestra los resultados en cultivos en agua dulce. Se observa el promedio y desviación estándar de la cepa MEO al día 0, quedando con una concentración inicial de: 0,2127 g/L; 0,2927 g/L y 0,3917g/L. En tanto la cepa MCH0 (BEA_IDA_0063B) quedó para el día 0 con una concentración inicial de 0,2407 g/L; 0,3573 g/L y 0,4083 g/L. El objetivo era inocular a 0,2; 0,3 y 0,4 g/L, los balones quedaron inoculados con un poco más de biomasa pero dentro del rango esperado.

Al día 13 de cultivo, no se observan diferencias significativas en la cepa Muriellopsis sp. española cultivada con agua dulce con una concentración inicial entre 0,2 g/L y 0,3 g/L y entre 0,3 y 0,4 g/L. Sin embargo, se observan diferencias entre los balones con concentraciones iniciales de 0,2 g/L y 0,4 g/L. En el caso de la cepa Muriellopsis sp. chilena (BEAJDA 0063B) cultivada con agua dulce, no se observan diferencias significativas en los cultivos con concentraciones iniciales entre 0,2 g/L; 0,3 g/L y 0,4 g/L. Del mismo modo, se observa bastante diferencia entre las dos cepas independientes respecto de la concentración de inoculo empleada, obteniéndose los menores valores en MEO (0,2 g/L) con 0,47 g/L y los mayores valores en el cultivo MCHO (BEA_IDA_0063B, 0,4 g/L) con 1 ,21 g/L.

En la figura 1 1 se muestra la productividad para la cepa española, y no se observan diferencias en las tres concentraciones iniciales de inoculo. Lo mismo ocurre para la cepa chilena. Por lo que el aumento o disminución del inoculo inicial no influye en el aumento o disminución de la productividad. Entre las dos cepas, si se observan notorias diferencias, siendo el promedio entre los tres cultivos de la cepa española 0,021 g/L-d y para la cepa chilena (BEA_IDA_0063B) 0,062 g/L-d.

La concentración de biomasa generada debiera estar directamente relacionada con el consumo de N y P. En la figura 12 al día 13 de cultivo para la cepa española, no presenta nitrógeno consumido por las microalgas, lo que se ve reflejado en la figura 6 la cepa española al día 13 de cultivo que presenta la mitad de la concentración de biomasa que generó la cepa chilena. Sin adherirse con ninguna teoría, esto podría deberse a la falta de nutrientes. Además en la figura 13, se observa en el día 0 que el fosfato en la cepa española es menor comparado con la cepa chilena. En todos los cultivos el consumo de fósforo va disminuyendo conforme pasan los días, lo que es normal en los cultivos microalgales.

En la figura 14 se observan los porcentajes de compuestos bioquímicos (ceniza, lípidos, proteína, luteína) presentes en la biomasa de microalgas, al cabo de 13 días de cultivo. Los porcentajes de compuestos bioquímicos son todos similares. El porcentaje de cenizas están en el rango de 7,49% a 1 1 ,94%. El porcentaje de proteínas están en el rango de 14,45% a 14,80%. El porcentaje de lípidos están en el rango de 15,46% a 39,16%. El porcentaje de luteína está en el rango de 0,13% a 0,31 %.

Ejemplo 4: Evaluación de la cepa Muriellopsis sp., española y chilena (BEAJDA 0063B), en agua de mar y en agua dulce outdoor sistemas de 400 litros.

Se evaluó la producción de biomasa con la cepa Muriellopsis sp. chilena (BEA_IDA_0063B) en agua de mar (MCH35) y en agua dulce (MCH0), y la cepa Muriellopsis sp. española en agua de mar (ME35) y en agua dulce (MEO). Para ello, se cultivaron las cepas Muriellopsis sp., chilena (BEAJDA 0063B) y española en bolsas de 400 litros con medio UMA5 en agua dulce y agua de mar. Quedando los cultivos etiquetados de las siguientes formas: MCH35 (BEA_IDA_0063B), MCH0 (BEA_IDA_0063B), ME35 y MEO. Se tomaron muestras durante 24 y 25 días para realizar la curva de crecimiento de las cepas en condiciones outdoor (sistemas de 400 litros). Se realizó determinación de peso seco y al final del experimento se dejó decantar los cultivos y se recolectaron los pellets desde los sistemas. El decantado se centrifugó y se lavó dos veces con agua potable, el pellet se congeló y liofilizó, para su posterior análisis proximal para lípidos, proteínas, luteína, carotenoides y cenizas. Se obtuvieron las curvas de crecimiento de las dos cepas (chilena (BEAJDA 0063B) y española) cultivadas en sistemas de 400 litros con medio UMA5, ver la figura 14. Recién al cabo de 15 días los cultivos alcanzan una concentración de biomasa de 0,40 y 0,29 g/L para MEO y MCH0 (BEA_IDA_0063B), respectivamente. Estos valores son valores de producción de biomasa bajos pero se cultiva la microalga para que crezca en agua de mar por la disponibilidad de ella, siempre considerando que el agua potable es más costosa que el agua de mar. Aunque la cepa proviene de cultivos de agua dulce se adapta muy bien al agua de mar, ver figura 5. La curva de crecimiento se realizó para tener la línea base de estos cultivos en su medio natural (agua dulce) y luego son llevados a sistema de piscina abierta de 14 m ³ .

En la figura 15, se presentan las curvas de crecimiento de las dos cepas cultivadas en agua de mar durante 24 días de cultivo con un inoculo inicial de 0,1 g/L. Se presenta un período de latencia de 3 días, al día 17 de cultivo , los valores son 0,46 g/L y 0,32 g/L en MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35. Al día 24, en modo batch o por lote, se alcanzan valores de 0,64 g/L y 0,44 g/L para MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35. Considerando que en términos productivos 24 días es un período de tiempo no deseado, se realizó un batch o lote adicional representado en la figura 16 con un inoculo inicial de 0,2 g/L que presentó un período de latencia de 5 días, al día 17 de cultivo alcanzó 0,55 g/L y 0,52 g/L para MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35.

También, debemos destacar que al día 12 de cultivo la cepa MCH35 (BEA_IDA_0063B) y ME35 presentan un 41 ,5 y 41 ,3% o más de biomasa; 0,53 y 0,46 g/L, respectivamente. Al ser inoculadas con 0,2 g/L de microalgas, lo que conlleva a la reducción de los días de cultivo y se puede comenzar a cosechar antes la biomasa.

En la figura 18 se muestran los valores del análisis proximal realizado a la biomasa obtenida a los días 13 y 14 de cultivo, se escogen estos días porque son los días promedios en los cuales se termina el periodo batch o por lote y comienzan las cosechas semicontinuas. Entonces se necesita confirmar la calidad de la biomasa con esos días de cultivo. El porcentaje de cenizas se encuentra entre 5,05% a 9,62%. El porcentaje de proteínas en las cepas chilena y española ambas cultivadas con agua de mar se encuentra entre 9,4% y 9,9% y el porcentaje de proteínas en las cepas cultivadas en agua dulce se encuentra entre 20,36% y 30,46%. El porcentaje de lípidos es similar en los 4 cultivos, ambas cepas en agua de mar y dulce, muestran un porcentaje de 8,42%. El porcentaje de luteína es 0,53%; 0,50%; 0,39% y 0,57%. Este es un buen porcentaje de luteína si se compara con el 0,55% de Scenedesmus almeriensis y muy por encima del 0,03% de las flores de Tagetes erecta. Las cepas MCH35 (BEA_IDA_0063B) y MCH0 (BEA_IDA_0063B) serán inoculadas en piscinas abiertas para estudiar su crecimiento, productividad y producción de luteína, ver análisis estadísticos desde las tablas 3 a la 7 proporcionada más adelante en este texto.

Por último en la figura 19, se muestra un resumen de los porcentajes de luteína de los tres experimentos en los botellones de MCH35 (BEA_IDA_0063B) UMA5 y MCH35 (BEA_IDA_0063B) F/2, los que son 0,67% y 0,52% de luteína, y a su vez se producen 0,31 g/L y 0,41 g/L de biomasa respectivamente. Lo anterior indica que se generaron 2,07 mg y 2,13 mg de luteína por litro de cultivo. Comparados entre sí estos valores, parecen tener una diferencia no importante pero en una escala masiva, por ejemplo de 15.000 litros de cultivo, se produce una diferencia de casi un gramo de luteína, lo que comercialmente es muy significativo.

Para el caso de las cepas cultivadas en los sistemas de 400 litros en la tabla 1 , se observa una producción de luteína en porcentaje, la concentración de biomasa en g/L alcanzada al final del cultivo batch o por lote y la producción de luteína en g/L. Se seleccionó MCH35 (BEAJDA 0063B) ya que muestra una mayor producción de luteína al ser cultivada en agua de mar. Se escaló a sistemas de 5 y 15 metros cúbicos. Tabla 2. Porcentaje de luteína, concentración de biomasa en g/L y producción de luteína las cepas cultivadas en los sistemas de 400 litros. Cultivo Porcentaje Biomasa Producción

de luteína g/L de luteína

ME35 0,53 0,35 1 ,86

MCH35 0,50 0,43 2,15

(BEA_IDA_0063B)

MCHO 0,39 0.29 1 ,13

(BEA_IDA_0063B)

MEO 0,57 0,39 2,22

Tabla 3. ANOVA para Proteínas

Según el análisis de varianza ANOVA en la tabla 3 el valor-P de la prueba-F es 0,0132 menor que 0,05, por lo que existen diferencias estadísticamente significativas entre la media de las proteínas, con un nivel del 95% de confianza.

Tabla 4. Contraste de rangos múltiples para los datos de proteínas

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

MCH-0 - MCH-35 _* 12,8067 8,47635

MCH-0 - ME-0 2,09 8,47635

MCH-0 - ME-35 _* 12,7067 8,47635 MCH-35 - ME-0 _* -10,7167 8,47635

MCH-35 - ME-35 -0,1 8,47635

ME-0 - ME-35 _* 10,6167 8,47635

^* indica una diferencia significativa.

Según la tabla 4 se observa que no existen diferencias estadísticamente significativas entre Muriellopsis Chilena y Española cultivadas con agua de mar (MCH-35 (BEAJDA 0063B) - ME35), tampoco existen diferencias entre Muriellopsis Chilena y Española cultivadas en agua dulce (MCH-0 (BEA_IDA_0063B)- MEO). Pero si existen diferencias entre las cepas cultivadas con agua de mar y agua dulce. Tabla 5. ANOVA para lípidos

Según el análisis de varianza ANOVA en la tabla 5 el valor-P de la razón-F es 0,5010 mayor que 0,05, por lo que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre los cultivos en lo que se refiere al contenido de lípidos, con un nivel del 95,0% de confianza.

Tabla 6. ANOVA para luteína Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Valor-P

Entre grupos 0,0577667 3 0,0192556 0,5472

Intra grupos 0,2026 8 0,025325

Total (Corr.) 0,260367 1 1

Según el análisis de varianza ANOVA en la tabla 6 el valor-P de la razón-F es 0,5472 mayor que 0,05, por lo que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre los cultivos en lo que se refiere al contenido de lípidos, con un nivel del 95,0% de confianza

Tabla 7. ANOVA para cenizas

Según el análisis de varianza ANOVA en la tabla 7 el valor-P de la razón-F es 0,3040 mayor que 0,05, por lo que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos en lo que se refiere al contenido de lípidos, con un nivel del 95,0% de confianza.