Método de diagnóstico de cáncer de páncreas

La presente invención está relacionada con la medicina, y particularmente con el diagnóstico del cáncer. Específicamente se refiere a un método de

diagnóstico de cáncer de páncreas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Todavía no hay un marcador biológico fiable para la detección y el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas y en concreto del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Se emplean técnicas de imagen para el diagnóstico y la clasificación del grado o desarrollo de la enfermedad. Aunque también se emplea el Antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), este se recomienda más para el seguimiento de PDAC que para su diagnóstico. Uno de los principales problemas clínicos del cáncer de páncreas radica, precisamente, en distinguir esta enfermedad maligna de otras enfermedades pancreáticas benignas, tales como la pancreatitis crónica (CP).

El PDAC es la cuarta causa de mortalidad relacionada con cáncer en los EEUU. Los datos muestran además que este tipo de cáncer es el que menos ha mejorado en términos de supervivencia respecto de otros tipos de cáncer. El mal pronóstico de PDAC se debe principalmente a la etapa avanzada de la enfermedad en el momento del diagnóstico y a la naturaleza agresiva del tumor, que no suele responder a las terapias disponibles. El tratamiento más efectivo a fecha de hoy es la cirugía extractiva (resección), pero pocos son los candidatos (20 %) que puede beneficiarse de ello, porque generalmente cuando se detecta el cáncer ya es demasiado tarde incluso para abordarlo de esta manera.

Aunque la técnicas endoscópicas y de imagen son cada vez más precisas, no suelen ser útiles para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas. Además, los marcadores tumorales no son lo suficientemente específicos para distinguir entre formas benignas y malignas, en particular y como se decía antes, resulta especialmente difícil distinguir el cáncer de la pancreatitis crónica. Ello se debe a que varios tipos de CP son muy parecidas clínica y morfológicamente a PDAC en particular. Ello hace que se detecten bastantes falsos positivos por imagen o mediante marcadores tumorales en muestras de los pacientes.

Dos de los marcadores más estudiados en el diagnóstico de cáncer de páncreas y en particular de PDAC han sido el Antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) antes mencionado y el Antígeno carcinoembrionario (CEA). También se emplean los niveles de otras proteínas séricas solas o en combinación con CA19-9 y CEA. Actualmente el CA19-9 se propone como el marcador más ampliamente utilizado, pero como se comenta a continuación presenta serias limitaciones, que lo hacen poco útil para el diagnóstico precoz, y sólo útil para el seguimiento. La medición de CA19-9 de manera aislada permite obtener sensibilidades del 70-90% y especificidades de 68-91 %. Sin embargo, el hecho de que CA19-9 se encuentre elevado en enfermedades no malignas reduce su especificidad. Por ello, se persiguen combinaciones de marcadores que alcancen una mayor sensibilidad y especificidad.

Ejemplos de estas combinaciones se desprenden, por ejemplo, del documento de tesis doctoral titulado "Moléculas séricas relacionadas con la fisiopatología del adenocarcinoma pancreático como posibles marcadores tumorales" defendido por María José Ferri Iglesias (Fecha de defensa: 27-09-2012) y dirigida por Rosa Peracaula Miro y Rosa Núria Aleixandre Cerarols. En este documento se describen algunas combinaciones de marcadores séricos para diagnosticar de manera diferencial PDAC de CP. Algunas de las

combinaciones de marcadores propuestos incluyen la combinación de la medición de los niveles séricos de CEA, CA19-9 y de factor de crecimiento insulínico de tipo 1 (IGF-1 ). Precisamente con esta combinación se obtienen valores de sensibilidad y especificidad del 88% y 100%, respectivamente, como discriminatorios de las dos enfermedades.

Otra combinación de marcadores se desprende también del documento de Chung et al, "Clinical significance of serum levéis of immune-associated molecules, uric acid and soluble MHC class I chain-related molecules A and B, as diagnostic tumor markers for pancreatic ductal adenocarcinoma", Cáncer Science - 201 1 , Vol. NO. 102(9), pp.: 1673-9. En este documento se describe el uso de la combinación de los marcadores séricos ácido úrico, CA19-9, y las moléculas A y B relacionadas con la cadena I del complejo principal de histocompatibilidad (denominadas MICA y MICB, respectivamente), para diagnosticar diferencialmente PDAC frente a enfermedades no malignas de páncreas, entre las que se incluye CP. Se obtienen valores de sensibilidad y especificidad para la discriminación de ambas enfermedades del 94,2% y 93,3%, respectivamente. Aunque los valores de sensibilidad y especificidad son muy buenos, esta combinación conlleva el inconveniente que los marcadores MICA y MICB no son empleados de manera rutinaria en laboratorios clínicos.

De todo ello se desprende la necesidad de nuevos marcadores, combinaciones o parámetros que permitan diagnosticar el cáncer de páncreas, en particular el PDAC y distinguirlo de otras enfermedades de páncreas con gran especificidad y sensibilidad.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado combinaciones de marcadores, que permiten diagnosticar con gran sensibilidad el cáncer de páncreas a partir de la muestra aislada de un sujeto. Los marcadores se corresponden con moléculas analizadas en la rutina clínica. Estas combinaciones proporcionan además una especificidad elevada permitiendo diagnosticar de manera diferencial el cáncer de páncreas (en particular PDAC) de otras enfermedades benignas de páncreas, tal como la pancreatitis crónica. Suponiendo la combinación de marcadores ya de por sí una ventaja, los inventores proponen también un método de diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y de pancreatitis crónica (u otras enfermedades benignas de páncreas) de fácil implementación en clínica. Ello se deriva del hecho que se propone un método de diagnóstico en el que los valores de los distintos marcadores se introducen en una función para obtenerse un valor test. Este valor test se compara con un valor discriminatorio o control de referencia que permite clasificar los pacientes como sujetos con cáncer de páncreas o con enfermedades benignas de páncreas, más concretamente pacientes con PDAC o con CP.

Así, de acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer de páncreas, caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto al menos los siguientes marcadores: - Antígeno carbohidrato 19-9 (CA19.9);

- Albúmina; donde,

- si la concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es superior a un valor control de referencia y la concentración de Albúmina es inferior a un valores control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y

- si las concentración de Antígeno carbohidrato 19-9 es inferior al valor control de referencia; y/o la concentración de Albúmina es superior al valor control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.

Con el análisis conjunto simultáneo o secuencial de estos dos marcadores se obtienen, como podrá verse en los ejemplos, valores óptimos de sensibilidad y especificidad. Además, el análisis estadístico confirma valores predictivos positivos y negativos elevados y también valores del área bajo la curva (AUC) en una curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic, o

Característica Operativa del Receptor) con valores próximos a 1 .

En una realización particular, cuando se miden al menos estos dos compuestos (CA19-9 y albúmina) en la muestra del sujeto, el método está caracterizado porque el valor control de referencia de antígeno carbohidrato 19-9 es 2.9 U/ml; y el valor control de referencia de albúmina es 3.9 g/dl. Estos valores son en particular aplicables a una muestra fluida del tipo suero aislado del sujeto.

Así, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer de páncreas, caracterizado porque comprende determinar al menos los niveles de CA19-9 y albúmina; y opcionalmente calcular un valor test introduciendo los niveles detectados en la muestra aislada de un sujeto, en una función matemática. Además, con solo los niveles de estas dos moléculas o marcadores ya se pueden diferenciar los pacientes o sujetos que padecen cáncer de páncreas de aquellos que padecen una pancreatitis crónica.

En otra realización particular del método y dado que también se obtienen valores de sensibilidad y de especificidad elevados, el método

para el diagnóstico de cáncer de páncreas, está caracterizado porque comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto la

concentración de los siguientes marcadores:

- Antígeno carbohidrato 19-9;

- Antígeno carcinoembrionario;

- Factor de crecimiento insulínico tipo 1 ;

- Albúmina;

donde,

- si las concentraciones de antígeno CA 19-9 y CEA son superiores a respectivos valores control de referencia y las concentraciones de IGF-1 y de albúmina son inferiores a respectivos valores control de referencia, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y

- si las concentraciones de antígeno CA 19-9 y/o CEA son inferiores a los valores control de referencia; y/o si las concentraciones de IGF-1 y/o de albúmina son superiores a respectivos valores control de referencia, dichas concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan en una función para obtener un valor test que se compara con un valor de

discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas.

Existen diversas isoformas de albúmina humana, tomándose como consenso la isoforma 1 con número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P02768, versión 2 de la secuencia de 1 de abril de 1990 (datos públicos consultables en la versión 219 de entrada en base de datos). La forma sérica de la proteína tiene 585 aminoácidos.

El IGF-1 humano se corresponde con el número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P05019, versión 1 de la secuencia de 13 de agosto de 1987 (datos públicos consultables en la versión 185 de entrada en base de datos). La secuencia polipeptídica en suero comprende 70 aminoácidos. El CEA (antígeno carcinoembrionario) humano es una glicoproteína que se produce durante el desarrollo fetal y usualmente no es detectable en la sangre de las personas sanas adultas. CEA pertenece a la superfamilia de

inmunoglobulinas. En la presente invención se detectan de manera indistinta cualquiera de sus isoformas o grupo de isoformas expresadas en humanos. La mayoría de tests comerciales para su detección van dirigidos a la secuencia con número de acceso en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot P06731 , versión 3 de la secuencia de 1 1 de enero de 201 1 (datos públicos consultables en la versión 157 de entrada en base de datos). La secunda polipeptídica en suero tiene 651 aminoácidos y es conocida también como molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5

(CEACAM5).

Finalmente, el CA 19-9 se corresponde con el determinante carbohidrato definido como lacto-N-fucopentosa (II) sialilado, que fue detectado como banda única por el anticuerpo monoclonal de ratón CA 19-9, producido de un hibridoma derivado de células del bazo de un ratón inmunizado con la línea celular humana de cáncer colorectal SW1 1 16 (Leibovitz et al., "Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines", Cáncer Res- 1976, vol. No. 36, pp.: 4562-4569).

Con el análisis conjunto simultáneo o secuencial de estos cuatro marcadores se obtienen, como podrá verse en los ejemplos, valores óptimos de sensibilidad y especificidad. Además, el análisis estadístico confirma valores predictivos positivos y negativos elevados y también valores del área bajo la curva (AUC) en una curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic, o

Característica Operativa del Receptor) con valores próximos a 1 . Ello quiere decir que la probabilidad de escoger al azar un valor positivo (enfermo de cáncer) es mayor que la probabilidad de obtener un valor negativo (enfermo con pancreatitis u otra enfermedad benigna de páncreas). Dicho de otra forma, la probabilidad de que el diagnóstico realizado a un paciente con cáncer de páncreas sea correcto es mayor que el que se realizaría a una persona sana o con enfermedad benigna escogida al azar. La sensibilidad es el concepto que indica que el método es capaz de detectar los pacientes con cáncer de páncreas a pesar de mínimos cambios en los niveles de los marcadores respecto de un control sano o con otra enfermedad. La especificidad es el concepto que nos indica que de manera inequívoca clasificamos bien entre una cohorte de pacientes, aquellos que tienen cáncer de páncreas de aquellos que no.

Si bien los niveles de CA19-9 se vienen utilizando de manera independiente para el seguimiento de cáncer de páncreas, en esta invención se propone su uso combinado con la adición de los niveles de albúmina, o bien con la adición de los niveles de CEA, IGF-1 y de albúmina.

La albúmina, en combinación con los niveles séricos de proteína C reactiva (CRP), se ha asociado también a la prognosis de pacientes previamente diagnosticados con cáncer de páncreas. La respuesta de las proteínas inflamatorias de fase aguda supone un marcador independiente de prognosis en este tipo de cáncer una vez diagnosticado por otras vías (Falconer et al., "Acute-Phase Protein Response and Survival Duration of Patients with

Pancreatic Cáncer", Cáncer - 1995, Vol. No. 75(8), pp.:2077-2082).

Como se ha indicado antes, los niveles de IGF-1 se han descrito en

combinación con CEA y CA19-9 como posibles marcadores diagnósticos del cáncer de páncreas. Sin embargo, su sensibilidad es menor a la deseada, con lo que podrían darse bastantes falsos negativos respecto de pacientes con enfermedades benignas de páncreas y, en particular, con CP.

En una realización particular, cuando se contempla en el método determinar las concentraciones de las cuatro moléculas, el método se caracteriza porque el valor control de referencia de CA 19-9 es 64.61 Unidades por mililitro (U/ml); el valor control de referencia de CEA es 1 1 .8 nanogramos por mililitro (ng/ml), el valor control de referencia de IGF-1 es 80.7 nanogramos por mililitro (ng/ml); y el valor control de referencia de albúmina es 4.1 gramos por decilitro (g/dl). Estos valores son en particular aplicables a una muestra fluida del tipo suero aislado del sujeto.

En el método de la presente invención, los valores control de referencia de CA 19-9 y de albúmina varían en función de si se van a determinar o considerar solo las concentraciones de estas dos moléculas o bien si van a tenerse también en consideración las concentraciones de CEA y de IGF-1 en la muestra aislada del paciente. Ello quiere decir que estos valores pueden ajustarse con la finalidad de no comprometer la sensibildad y especificidad del método, en cualquiera de sus realizaciones, pero adaptándose por ejemplo al tipo de muestra, o de población, si fuera necesario y según comprenderá el experto en la materia.

Como se ha indicado antes, el método de acuerdo con la invención puede implementarse a la práctica clínica no solo porque en él se emplean

concentraciones de marcadores (o lo que es lo mismo concentraciones de moléculas o compuestos) habitualmente analizados en la rutina clínica para el diagnóstico de cánceres u otras patologías, sino también porque los inventores proponen un análisis de las concentraciones de estas dos o cuatro moléculas combinando los valores obtenidos para cada una de ellas, de tal modo que se obtiene un valor test. Dicho valor test se compara con un valor de referencia que discrimina entre enfermos de cáncer de páncreas y sujetos con

enfermedades benignas de páncreas.

Para ello, en una realización particular del método según la invención, si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas, además comprende combinar las concentraciones de CA 19-9 y de albúmina; o de CA 19-9, de CEA, de IGF- 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto en una función, para obtener el valor test que se compara con el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas. Esta realización particular permite verificar que, efectivamente, el sujeto padece cáncer a pesar de que ya se reflejaba en las concentraciones de los marcadores que estaban por encima (CEA, CA19-9) y por debajo (IGF-1 , albúmina) de los respectivos valores control de referencia.

En una realización particular, opcionalmente en combinación con cualquier aspecto o realizaciones comentadas anteriormente o a continuación, este valor test se obtiene de la siguiente fórmula (I), si se emplean los niveles de las cuatro moléculas:

Vxob(PDAC) = ₀ + β Α19-9+ p ₂ CEA + p ₃ IGFl+ PtA!bu min)

(i) donde:

Prob(PDAC) se refiere a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto como cáncer de páncreas o enfermedades benignas de páncreas;

βθ es 16,000764;

β1 es 0,099556;

β2 es 0,342634;

β3 es 0,004923;

β4 es -5,200419;

CA19-9 es la concentración en U/ml de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; CEA es la concentración en ng/ml de antígeno carcinoembrionario de la muestra aislada del sujeto; IGF1 es la concentración en ng/ml de factor de crecimiento insulínico tipo 1 de la muestra aislada del sujeto; y Album in es la concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.

En otra realización particular, opcionalmente en combinación con cualquier aspecto o realizaciones comentadas anteriormente o a continuación, si lo que se emplea para obtener el valor test son solo los niveles de CA19-9 y de albúmina, la fórmula utilizada es la siguiente fórmula (II): e (A) +P _l CA19-9+p ₂ Albu min)

Pr ob ( Pancreatic— cáncer / ) = τ- _Ω — _α „ _{Λ Λ η} » _Q — rx

V -i (β ₀ + _i CA\9-9+ iAlbu m)

(II)

donde:

Prob(Pancreatic_cancer) se refiere también a un valor de probabilidad, expresado en porcentaje, de clasificar un sujeto de padecer cáncer de páncreas o enfermedades benignas de páncreas;

βθ es 13,013;

β1 es 0,035;

β2 es -3,539; CA19-9 es la concentración en unidades por mililitro (U/ml) de antígeno carbohidrato 19-9 de la muestra aislada del sujeto; y Albumin es la

concentración de albúmina en g/dl de la muestra aislada del sujeto.

Así, si el método se lleva a cabo mediante la introducción de las

concentraciones de los cuatro marcadores en la función de fórmula (I), o de dos marcadores en la fórmula (II), si el valor test es igual o superior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas; y si el valor test es inferior al valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas, el sujeto es diagnosticado de enfermedad benigna de páncreas.

Este valor de discriminación es un porcentaje de probabilidad, que se obtiene, en una realización particular, a partir del punto de máxima sensibilidad y especificidad, calculadas por el modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial a partir de los valores (concentraciones) de los cuatro o los dos marcadores de una cohorte de referencia que comprende sujetos con cáncer de páncreas y con enfermedades benignas de páncreas. En una realización más particular todavía, el valor de discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedades benignas de páncreas es del 48.2 % cuando se emplean en la fórmula los cuatro marcadores (concentraciones de las cuatro moléculas); y del 33.5 % cuando se emplean solo los niveles de CA19-9 y de albúmina de acuerdo con la fórmula (II).

El modelo GLM permite clasificar sujetos con cáncer de páncreas con una determinada sensibilidad (del 97.9 % con los cuatro marcadores y del 96.4 % con los dos) y una determinada especificidad (del 95 % con los cuatro marcadores y del 90.9 % con los dos). El valor de discriminación óptimo es aquel en que los valores de sensibilidad y especificidad son máximos. Este valor, que se corresponde con una probabilidad expresada en porcentaje (%), es el que se emplea para la clasificación de los sujetos. A partir de los valores de los cuatro marcadores en una muestra de un sujeto test (no previamente clasificado) y aplicando el mismo modelo, si la probabilidad es mayor o igual que la del valor discriminatorio, los sujetos se clasifican como cáncer de páncreas. Si el valor es inferior al discriminatorio, los sujetos se clasifican como enfermedad benigna de páncreas, tal como CP. Lo mismo aplica si solo se dispone de al menos los niveles de CA19-9 y de albúmina, o bien si solo quieren emplearse estos niveles para hacer el diagnóstico. Con la presente invención se aporta un método de diagnóstico que aún determinándose los niveles de CA19-9, albúmina, IGF-1 y CEA, da la opción al responsable de emitir un diagnóstico de escoger entre utilizar solo los niveles de CA19-9 y albúmina, o los niveles de todos cuatro juntos, sin pérdida de sensibilidad y especificidad notorias.

Así, según el método de la invención, si en un sujeto (paciente) todas las concentraciones de los marcadores están fuera de los valores control de referencia (por encima para CEA y CA 19-9 y por debajo para IGF-1 y albúmina) la probabilidad de padecer un cáncer de páncreas estará por encima del 48.2 % y el paciente tendrá cáncer con una sensibilidad del 97.9 % y una especificidad del 95 %. Del mismo modo y también según el método de la invención, pero cuando solo se determinan o utilizan los niveles de albúmina y CA19-9, si en un sujeto (paciente) todas las concentraciones de estas moléculas están fuera de los valores control de referencia (por encima para CA 19-9 y por debajo para albúmina) la probabilidad de padecer un cáncer de páncreas estará por encima del 33.5 % y el paciente tendrá cáncer con una sensibilidad del 96.4 % y una especificidad del 90.9 %.

Por otro lado, si alguno de los cuatro, o de los dos tratándose solo de CA19-9 y albúmiba, o ninguno de los marcadores está fuera de los valores control de referencia, resulta apropiado introducir las concentraciones de CA 19-9, de CEA, de IGF-1 y de albúmina detectadas en la muestra aislada del sujeto en una de las funciones de fórmula (I) o (II), para obtener un valor test que se compara con un valor de discriminación entre cáncer de páncreas y

enfermedades benignas de páncreas. Estas funciones permiten calcular la probabilidad de padecer cáncer de páncreas, de tal modo que, si la

probabilidad calculada es menor del 48.2 % (en el caso de la fórmula (I)) el sujeto probablemente no padece de cáncer de páncreas. Mientras que, si la probabilidad calculada con la fórmula (I) es igual o superior a 48.2 %, el sujeto muy probablemente padece de cáncer de páncreas, tomándose en

consideración los datos de sensibilidad y especificidad inherentes en este cálculo mediante la fórmula (I). Paralelamente, si se emplea la fórmula (II), si la probabilidad calculada es menor del 33.5 % el sujeto probablemente no padece de cáncer de páncreas. Mientras que, si la probabilidad calculada con la fórmula (II) es igual o superior a 33.5 %, el sujeto muy probablemente padece de cáncer de páncreas, tomándose en consideración los datos de sensibilidad y especificidad inherentes en este cálculo mediante la fórmula (II).

En una realización particular del método según la invención, el cáncer de páncreas es adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC).

En otra realización particular del método, la enfermedad benigna de páncreas es pancreatitis crónica.

Aunque el método según este primer aspecto es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas respecto de enfermedades benignas de este órgano, en una realización particular es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. Así, el uso combinado de las concentraciones de estos cuatro marcadores (moléculas) permite diagnosticar con gran sensibilidad y especificidad el cáncer de páncreas, respecto de un sujeto con pancreatitis crónica, enfermedad que en numerosas ocasiones se confunde con el cáncer. Por ello, en una realización particular el método se caracteriza porque es para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. Más en particular para el diagnóstico diferencial de adenocarcinoma pancreático ductal y pancreatitis crónica.

Para la puesta en práctica del método según la invención, la muestra fluida aislada del sujeto se selecciona del grupo constituido por sangre completa, suero y plasma. De un modo preferido la muestra aislada es suero.

Precisamente, una de las ventajas del método de la invención es que los niveles de estos marcadores pueden determinarse fácilmente a partir de una muestra de suero del paciente y mediante el empleo de reactivos habituales en clínica tal como anticuerpos comerciales y reactivos colorimétricos, y

quimioluminiscentes. Con ello, se evita tener que obtener biopsias de tejidos que son invasivas y además no siempre se escogen zonas representativas del tejido en cuestión. En una realización particular, la determinación (o detección) de las

concentraciones de CA 19-9, de CEA, de IGF-1 y de albúmina se lleva a cabo usando un grupo de unión específico para cada uno de los marcadores. En una realización particular, el grupo de unión específico para la determinación de la concentración de CA 19-9, de CEA, y de IGF-1 es un anticuerpo y la

determinación se lleva a cabo mediante inmunoensayo. En una realización particular y en función del elemento o técnica que se emplea para visualizar la interacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), dicho inmunoensayo se selecciona de radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA), fluoroinmunoanálisis (FPIA), ¡nmunoquimioluminescente.

En otra reacción particular del método según el primer aspecto de la invención, el grupo de unión específico para la determinación de albúmina es un compuesto colorante aniónico y la determinación se lleva a cabo mediante un ensayo colorimétrico. En estas reacciones colorimétricas, el colorante específico forma un complejo con la molécula a detectar (en este caso la albúmina), y el complejo posee un espectro de absorbancia característico que se utiliza para su cuantificación. En una realización particular, el compuesto colorante aniónico es verde de bromocresol, que forma un complejo verde azulado con albúmina. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de albúmina. Evidentemente, otros compuestos colorantes en los que se mantenga esta propiedad que la coloración aparecida en el complejo sea proporcional a la cantidad de albúmina, pueden emplearse en el método según la invención.

Algunos de estos inmunoensayos y/o ensayos colorimétricos tienen la ventaja de que pueden llevarse a cabo en biosensores de pequeño tamaño y fácil uso que no necesitan estar ubicados en un laboratorio, ni requieren de personal especializado en química analítica. Así, el procedimiento de la invención podría ser llevado a cabo de forma rápida en el punto de asistencia, por ejemplo, se puede llevar a cabo por los asistentes sanitarios en la misma unidad

ambulatoria. Ejemplos no limitativos de biosensores de detección rápida adecuados para llevar a cabo el método de la invención son una tira

inmunocromatográfica (también conocido por "dipstick") o una tarjeta lab-on-a- chip con circuito de microfluídica e immunodetección o detección de la interacción con una segunda molécula. Otro aspecto de acuerdo con la invención se refiere, en un segundo aspecto, a un método para decidir o recomendar un régimen médico para cáncer de páncreas, dicho régimen médico seleccionado de entre tratamiento

farmacológico e intervención quirúrgica, que comprende llevar a cabo el método de diagnóstico según cualquiera de las realizaciones descritas más arriba; y donde, si el sujeto es diagnosticado de cáncer de páncreas se recomienda o decide el régimen médico indicado para el cáncer de páncreas, y si el sujeto no es diagnosticado de cáncer de páncreas pero es diagnosticado de una enfermedad benigna de páncreas, se recomienda o decide el régimen médico para esta otra enfermedad.

La invención se refiere entonces, según otro aspecto de la invención, al uso combinado de las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina; o de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina como marcador de cáncer de páncreas. Más particularmente como combinación de marcadores de adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC).

En una realización particular, estas combinaciones binaria o cuaternaria de marcadores son para uso en el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.

En la práctica, el método según la invención se lleva a cabo en kits que comprenden medios para determinar niveles (concentraciones) de proteínas y carbohidratos en una muestra aislada de un sujeto, dichos kits caracterizados porque los medios que comprenden son grupos de unión específicos de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina; y opcionalmente también de antígeno carcinoembrionario y factor de crecimiento insulínico tipo 1 . Además, en una realización particular, los kits están caracterizados porque comprenden medios para calcular un valor test que se obtiene de la combinación de los niveles de antígeno carbohidrato 19-9 y de albúmina y/o de la combinación de los niveles de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra asilada en una función matemática. Este valor test se compara con un valor de

discriminación entre cáncer de páncreas y enfermedad benigna de páncreas. Los kits comprenden en una realización particular un chip o dispositivo electrónico programable, que calcula el valor de las concentraciones de cada uno de los marcadores y opcionalmente los introduce en la función de fórmula (I) o en la función de fórmula (II) para calcular un valor de probabilidad

"Prob(PDAC)" o "Prob(Pancreatic_Cancer)", que se corresponde con el valor denominado aquí valor test.

Los medios empleados para la detección de las concentraciones de los dos (CA19-9 y albúmina) o cuatro marcadores (CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina) forman parte de un kit en una realización particular, pero también pueden formar parte de kits separados. La invención tiene también por objeto el uso de dichos medios para llevar a cabo el método de diagnóstico de cáncer de páncreas y, más en particular, el método de diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica u otras enfermedades benignas de páncreas.

El método según la invención comprende en una realización particular la etapa de recopilar y/o suministrar y/o salvar los datos de las etapas anteriores en un portador de datos. Por tanto, la invención también comprende cualquier portador de datos con los datos del diagnóstico directamente obtenidos a partir del método de diagnóstico de cáncer de páncreas de la invención.

En el sentido de la presente invención, un "portador de datos" debe entenderse como cualquier medio que comprenda información significativa para el diagnóstico de cáncer de páncreas. En particular información significativa de diagnóstico diferencial de PDAC y CP. Ejemplos de portadores de datos incluyen papel impreso con los niveles en suero de un paciente de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina, dichos niveles determinados de acuerdo con el método de la invención y correlacionados con el diagnóstico de la enfermedad. El portador de datos puede también ser cualquier entidad o dispositivo capaz de contener esta información diagnóstica. Por ejemplo, memorias electrónicas, tal como una ROM, tipo CD ROM o un semiconductor ROM, o un medio de grabado magnético, tal como un disco flexible o un disco duro. Además, el portador de datos puede ser transmisible tal como una señal eléctrica u óptica, la cual puede ser transmitida por cable óptico o eléctrico, por radio frecuencia u otros medios. Cuando los datos diagnósticos son incorporados en una señal que puede transmitirse directamente por cable u otros medios, el portador puede ser este cable mismo. Otros tipos de portadores de datos son

dispositivos USB y archivos de ordenador.

El término "diagnóstico" es bien conocido en el estado de la técnica y se refiere al procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad.

El término "muestra" se refiere a un fluido corporal del paciente (sujeto) obtenido con el propósito de llevar a cabo el diagnóstico in vitro del cáncer de páncreas, o para el diagnóstico diferencial de cáncer de páncreas y pancreatitis crónica. El sujeto es un mamífero y preferentemente un humano.

Por "marcador" o "biomarcador" debe entenderse cualquier molécula (en este caso concreto proteína o carbohidrato) que se detecta en una muestra aislada de un paciente y puede ser asociada a una señal dada. En el caso de esta invención, los marcadores son antígenos carbohidratos (CA 19-9) o proteínas, que a partir de unos valores de referencia pueden asociarse a cáncer de páncreas.

Se entiende por "valor control de referencia" un valor con el cual se compara la cantidad (concentración) de cada una de las moléculas CA 19-9, CEA, albúmina e IGF-1 , determinada según la invención para el diagnóstico del cáncer de páncreas. Se trata de un valor de cada uno de los marcadores que permite distinguir con un grado de probabilidad un sujeto con cáncer de páncreas del resto de individuos que no sufren este cáncer, incluyendo entre estos individuos, individuos sanos e individuos que padecen enfermedades benignas de páncreas, tal como la pancreatitis crónica. El valor de referencia es un valor, también denominado punto de corte o valor umbral, que permite descartar con una elevada sensibilidad que el paciente diagnosticado sufre cáncer de páncreas y en particular adenocarcinoma pancreático ductal. Este valor umbral representa una concentración de cada uno de los marcadores por encima o por debajo del cual, en función de cada caso, se asocia la muestra del sujeto con la enfermedad o no. Por ello, cuando se indica en la presente invención que la concentración de uno de los marcadores está "fuera del valor control de referencia" se hace referencia a que se superan por encima los valores asociados con mayor probabilidad a no enfermedad (no cáncer de páncreas), o bien a que no se llega a los niveles mínimos asociados con mayor probabilidad a no enfermedad (no cáncer de páncreas).

El valor de referencia dependerá de varios factores, entre los que destacan el tipo de muestra en la que se determine el marcador, el plazo de tiempo en el cual se lleve a cabo dicha determinación y, en menor medida, la técnica de determinación empleada. Esto es debido a que los niveles de los marcadores pueden variar en los diferentes fluidos del paciente, en función del tiempo trascurrido desde el inicio de la enfermedad, y en función de la técnica de determinación empleada, o incluso en función del algoritmo empleado donde se incluyen los valores detectados en una muestra test para obtener un valor derivado que da información al técnico (por ejemplo un valor de probabilidad o de corte para clasificar a los pacientes). Todo ello es bien conocido por el experto en la materia que sabe adecuar los valores a cada cómputo de circunstancias (tipo de muestra, tiempo de medición, tecnología, etc.). El valor de referencia además puede variar debido a la regulación de la práctica clínica, de tal modo que niveles que no se consideraban como patológicos en un determinado momento, pasen a serlo por decisión de las autondades sanitarias y con el objetivo de mejorar el cribado de ciertas enfermedades. Una posible forma de establecer el valor de referencia para el método de la invención en unas condiciones dadas es a partir de los puntos de corte de la curva ROC para el marcador o combinación de marcadores en esas condiciones. Una curva ROC (acrónimo del inglés Receiver Operating Characteristic, o

Característica Operativa del Receptor) es una representación gráfica de la sensibilidad frente a (1 - especificidad) para un sistema clasificador binario según se varía el umbral de discriminación. El umbral de discriminación equivale al valor de referencia del método de la invención.

El término "concentración", "nivel" o "niveles" (empleados como sinónimos) se refieren a la cantidad de cada uno de los marcadores CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina en una muestra obtenida de un sujeto. Generalmente esta cantidad se da por unidad de volumen y por ello se habla de concentraciones. Por "grupo de unión" se entiende una molécula o segmento de molécula capaz de unirse específicamente a una molécula o proteína diana (en el presente caso la molécula o proteína diana puede ser CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina).

Se entiende por "biosensor" un instrumento para la medición de parámetros biológicos o químicos. En la presente invención el parámetro a medir es cualquiera de las moléculas CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina.

Según la invención, "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo, incluyendo sin limitación un anticuerpo quimérico, recombinante, transgénico, humanizado, injertado y de una única cadena, y similares, así como cualquier proteína de fusión, sus conjugados, sus fragmentos, o sus derivados que contengan uno o más dominios que se unen selectivamente a la proteína diana o péptido. Cuando se utilizan anticuerpos completos para la presente

invención, se prefieren anticuerpos monoclonales.

Por "inmunoensayo" se entiende una técnica inmunoquímica donde se emplean complejos inmunes, es decir, los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito determinado, que puede ser el anticuerpo o el antígeno, usando para la medición una molécula como marcador que forma parte de la reacción con el complejo inmune.

El inmunoensayo es un conjunto de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio que tienen en común el usar complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un antígeno (Ag), usando para la medición una molécula como marcador que hace parte de la reacción con el complejo inmune en la prueba o ensayo químico.

Las técnicas se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos y se usan los anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio) o de sueros policlonales (obtenidos de animales), siendo más específicos los monoclonales. Su gran sensibilidad y especificidad permite la cuantificación de compuestos presentes en líquidos orgánicos en concentración reducida, del orden de nanogramos/ml o de picogramos/ml. Los "ensayos colorimétricos" se refieren a técnicas analíticas, en las cuales un compuesto colorante (que da color a una determinada longitud de onda de luz) se compleja con la molécula a detectar. El complejo "compuesto colorante- molécula a detectar" posee un espectro de absorbancia característico que se utiliza para su cuantificación. Se intenta que la intensidad del color sea directamente proporcional a la concentración de la molécula a detectar.

Por "régimen médico" debe entenderse como el conjunto de acciones o actividades que incluyen terapias farmacológicas (tal como la quimioterapia) y también intervenciones quirúrgicas terapéuticas (tal como la resección del tumor), e incluso otras decisiones clínicas que el oncólogo especialista pueda tomar, tal como la hospitalización, o el consejo de ciertos hábitos sociales y dietéticos (evitar el consumo de bebidas alcohólicas).

Por "enfermedades benignas de páncreas" debe entenderse aquellas enfermedades causadas o que afectan este órgano, pero que no se

corresponden con el cáncer de páncreas. Ejemplo de enfermedades benignas incluyen la pancreatitis aguda o crónica, que es una inflamación del páncreas, y neoplasias benignas como el cistoadenoma sérico de páncreas y el neoplasma pseudopapilar sólido.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso

"consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra en cada recuadro A a E los niveles de CA19-9 (U/ml) (FIG. 1 A), los niveles de CEA (ng/ml) (FIG. 1 B), los niveles de IGF-1 (ng/ml) (FIG. 1 C), los niveles de albúmina (g/dl) (FIG. 1 D); y los niveles de CRP (mg/dl) (FIG. 1 E), para cada muestra de paciente, dichos pacientes clasificados entre sanos (HC), pacientes con pancreatitis crónica (CP ) y con adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC). Las marcas ^* muestran que la diferencia entre grupos era significativa.

La FIG. 2 muestra una curva ROC para la discriminación de sujetos con PDAC de sujetos con CP utilizando solo los niveles séricos de CA19-9 (línea sólida) y utilizando los niveles de los cuatro marcadores CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina en combinación de acuerdo con la invención (línea discontinua).

La FIG. 3 muestra una curva ROC para la discriminación de sujetos con PDAC de sujetos con CP, utilizando los niveles de los dos marcadores CA19-9 y albúmina en combinación, de acuerdo con la invención.

EJEMPLOS

Para el análisis de la combinación de marcadores, los siguientes materiales y métodos fueron empleados.

Pacientes y muestras de suero:

El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario Dr. Josep Trueta y se obtuvo un consentimiento informado firmado de todos los participantes. Se obtuvieron de 2007 a 2012 muestras de suero de 47 pacientes de PDAC (media de edad (desviación estándar) 64.1 (10.3), 59.6 % hombres), de 20 pacientes con CP (media de edad (desviación estándar) 56.3 (1 1 .5), 80.0 % hombres): y de 15 controles sanos (HC) (media de edad

(desviación estándar) 60.9 (9.2), 26.7 % hombres). La Tabla 1 siguiente muestra las características de los pacientes.

PDAC CP HC

N 47 20 15

Mediana de edad, 64.1 56.3 60.9

años (min-max) (30-81) (42-79) (44-75)

Hombres 28 16 4

Mujeres 19 4 1 1

Mediana del IMC 25.9 23.4 25.3

(min-max) (18.1-32.8) (16.7-29.7) (19.8-32)

Estadio

enfermedad

IA 0

IB 1

NA 4

IIB 22

III 8

IV 12

Una cohorte independiente de muestras se empleó para validación. Esta cohorte comprendía 20 pacientes con PDAC (media de edad (desviación estándar) 67.2 (10.4), 45.0 % hombres) y 13 pacientes con CP (media de edad (desviación estándar) 50.9 (9.55), 76.9 % hombres). Las muestras de suero de los pacientes de cáncer se tomaron por venopunción antes de la intervención quirúrgica. Las muestras de suero de pacientes con CP y de los controles (HC) se obtuvieron cuando estos pacientes iban a los controles rutinarios de análisis en el laboratorio del hospital. El suero se recolectó mediante procedimientos estándares y fue almacenado a -80 °C hasta el momento de su análisis.

El diagnóstico de los pacientes con PDAC se derivó de un examen

histopatológico de especímenes procedentes de pancreaticoduodenoctomía. La diagnosis de CP se basó en tests de imágenes radiológicas, resonancia magnética (MRI), escáner de tomografía computarizada (CT) o métodos de ultrasonidos (transcutáneos o endoscópicos), así como la evolución clínica. Los pacientes diagnosticados de otras enfermedades malignas los últimos cinco años se excluyeron, igual que los pacientes con CP con brote agudo de la enfermedad.

Todos los parámetros fueron medidos en sistemas automáticos y con reactivos estandarizados empleados en la rutina clínica en laboratorios clínicos. El análisis del antígeno carbohidrato CA19-9 y de antígeno carcinoembrionario (CEA) se determinó mediante inmunoensayo "ECLIA"

electroquimioluminescente cuantitativo, preparado para ser usado con la plataforma E-170 de Roche Diagnostics. Para el ensayo de CA19-9 se emplea el anticuerpo monoclonal 1 16-NS 19-9 (Life technologies®). El ensayo de CEA se estandariza frente la referencia estándar 73/601 de la primera preparación de referencia internacional (1 st IRP) de la Organización Mundial de la Salud (WHO). Las características del diseño de los ensayos CA19-9 y CEA fueron, respectivamente: coeficiente de variación intraensayo (CV) 3.4 % y 1 .7 %, CV interensayo 3.9 % y 4.9 %, sensibilidad 0.6 U/ml y 0.2 ng/ml, y linealidad 1000 U/ml y 1000 ng/ml. El ensayo de la albúmina se realizó con un ensayo colorimétrico en un Cobas 71 1 (Roche Diagnostics) estandarizado frente la preparación de referencia BCR470/CRM470 (RPPHS-Reference Preparation for Proteins in Human Serum) del Instituto para la Referencia de Materiales y Medidas, con un CV intraensayo e interensayo de 0.8 % y 1 .1 %,

respectivamente; y una linealidad de 6 g/dl. La determinación cuantitativa de CRP se midió mediante el ensayo inmunoturbidimétrico en el Cobas 71 1. Este método se estandarizó frente la preparación de referencia del IRMM

BCR470/CRM470 (RPPHS); con un CV intraensayo y interensayo de 1 % y 1 .7 %, respectivamente, una sensibilidad de 0.1 g/dl y linealidad de 25 g/dl. IGF-1 se determinó utilizando el analizador Immulite 2000 con el ensayo de mareaje inmunométrico quimioluminescente enzimático de fase sólida, que se calibra con el WHO NIBSC 1 st IRR 87/518. El CV intraensayo e interensayo es del 3 % y 6 %, respectivamente. La sensibilidad y linealidad son 20 ng/ml y 1600 ng/ml. También se utilizó la nefelometría para la medición de la prealbúmina con un Immage 800 (Beckman), con una sensibilidad de 1 .17 mg/dl, un CV intraensayo del 4 % y una linealidad de hasta 1800 mg/dl.

El análisis estadístico se realizó con el paquete SPSS estadístico v. 15.0. Las características de los pacientes se compararon entre PDAC, CP y HC mediante el test U Mann-Whitney. Para el análisis univariante, PDAC se consideró estadio de enfermedad. El test del rango de correlación de Spearman fue aplicado para determinar la correlación entre dos variables. Se empleó el software estadístico R versión 1 .1 .49 para el análisis de ROC (receiver operating characteristics). Las curvas ROC se emplearon para describir el diseño de biomarcadores o el diseño de la combinación de biomarcadores como test diagnóstico. El área bajo la curva (AUC) se empleó para evaluar la utilidad de un determinado biomarcador como test diagnóstico y los niveles de corte o umbrales (para encontrar un valor de referencia). El modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial se estimó con el programaho libre de estadística R (DeLong ER, et al., "Compahng the áreas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach", Biomethcs-1988; 44:837-845). Las bibliotecas Epi y pROC, también en la plataforma R, se emplearon para la construcción y comparación,

respectivamente, del AUC de las distintas curvas ROC (Hills M, et al., "Follow- up with the Epi package". Spring 2009 [disponible en: http://cran.r- proiect.orq/web/packages/Epi/vignettes/FoHow-up.pdf, en Noviembre 30, 2013). La significación estadística se estableció a p<0.05.

Resultados:

En cuanto a las características clínicas de la población en estudio, las muestras de suero de 82 sujetos; 47 PDAC, 20 CP y 15 HC, fueron analizadas. La distribución histológica tipo TNM de los 47 pacientes con PDAC incluyó diferentes estadios (estadio IB n = 1 ; estadio NA n = 4; estadio IIB n = 22, estadio III n = 8; estadio IV n = 12) de acuerdo con la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC); y de éstos, 29 pacientes tuvieron tumores

resectables. El sistema TNM es un sistema ampliamente utilizado para el estadiaje de los tumores y ha sido aceptado por la "Union for International Cáncer Control (UICC)", y por el "American Joint Committee on Cáncer, AJCC". La edad, el sexo y el índice de masa corporal (IMC) de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Mientras que los grupos de PDAC y HC no mostraron diferencias significativas en la edad, el sexo y el IMC, el grupo CP tiende a estar formado por hombres con un menor IMC que los otros dos grupos. Esto podría explicarse por el hecho de que varias causas de esta enfermedad, como el abuso de alcohol, junto con la ingesta inadecuada o mala absorción de nutrientes causados por la pérdida de tejido pancreático exocrino, pueden contribuir a un IMC bajo.

Ensayo 1 : Análisis univariante de biomarcadores: marcadores tumorales (CA 19-9 y CEA), proteínas de fase aguda (albúmina y PCR) y IFG-1 en PDAC, CP y grupos de HC.

Los niveles séricos de cada molécula, CA 19-9, CEA, la albúmina, la CRP y el IGF-1 , se compararon entre PDAC, CP y grupos sanos (HC, de healthy control) y se muestran en los gráficos de dispersión. Los resultados pueden visualizarse en la FIG. 1 , donde para cada marcador se indican los niveles en las

ordenadas respecto de cada enfermedad o tipo de muestra (CP, PDAC y/o HC).

CA 19-9 y CEA sólo se midieron en pacientes con CP y en los grupos PDAC ya que el nivel de estos marcadores tumorales en HC están claramente por debajo de los valores de corte establecidos. Para evaluar su especificidad y

sensibilidad, se realizaron curvas ROC para todos ellos (datos no mostrados).

La concentración media de suero de CA 19-9 en PDAC era de 945 U / mi, significativamente mayor que en CP (15.1 U / mi) (p <0,001 ). Utilizando un punto de corte o valor control de referencia de 36.99 U / mi, se obtuvo una especificidad del 95% y una sensibilidad del 80.9%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.862. Los niveles séricos de CEA no mostraron diferencias significativas entre los grupos CP y PDAC.

La concentración sérica media de la CRP en PDAC fue de 1 .8 mg / di, significativamente mayor que en CP (0.4 mg / di) y en HC (0.169 mg / di) (p = 0.038, p = 0.019). Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 0.23 mg / di, la especificidad fue del 55 % y la sensibilidad de 76.6%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.661. La concentración media de suero de albúmina en PDAC era 3.4 g / di significativamente menor que en CP (4.3 g / di) y en HC (4.5 g / di) (p <0.001 y p <0.001 ,

respectivamente). Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 3.8 g / di, la especificidad fue del 95 % y la sensibilidad del 78,7%. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.870 Los niveles de IGF-1 en suero no mostraron diferencias entre HC y CP pero hubo diferencias significativas entre el grupo HC y el PDAC (p = 0.002) y el CP y los grupos PDAC (p < 0.001 ) .Utilizando un valor control de referencia (punto de corte) de 80.7 ng / mi, la especificidad fue del 100 % y la sensibilidad del 57.4 %. La curva ROC para diferenciar PDAC del CP dio un AUC de 0.839.

Para determinar si los niveles significativamente bajos de IGF-1 que se encuentran en PDAC podrían estar asociados ya sea a un estado de

malnutrición o a la resistencia a la hormona del crecimiento, se midieron los niveles de prealbumina y los niveles de Hormona de crecimiento (GH) como respectivos indicadores de los dos trastornos. También su posible correlación con los niveles de IGF-1 . Para la medición de GH se usó el mismo analizador Immulite 2000 que para IGF-1 . Los niveles de prealbumina se determinaron por nefelometría con un Immage 800 (Beckman). Aunque los niveles de

prealbumina fueron inferiores en el grupo de PDAC que en el CP y los grupos de HC, la concentración sérica media de prealbumina no mostró diferencias significativas entre PDAC (media 16.5 mg / di, SD 5.6) y CP (media 19.9 mg / di, SD 4,4 ), pero hubo diferencias significativas entre CP y HC (media de 25.5 mg / di, SD 3.84) y entre PDAC y HC. Los niveles de prealbumina y de IGF - 1 mostraron una correlación positiva (r = 0.454 , p = 0.005 ) en el grupo de PDAC pero no en el grupo CP.

En cuanto a los niveles de GH, no hubo diferencias significativas en los niveles de GH entre PDAC (media 1.69 ng / mi, 2.16) y CP (media 1 .58 ng / mL, SD 1 ,71 ) o HC (media 1 .57, SD 1.81 ) grupos. No se encontró correlación entre los niveles de GH y de IGF-1 .

En la Tabla 2 se muestran la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y el AUC de cada marcador para diferenciar PDAC de los pacientes con CP. La capacidad de los biomarcadores para discriminar PDAC de los pacientes con CP fue evaluado a partir del valor AUC. Como se muestra, no hubo ningún marcador que se comportara mejor que el CA 19-9, pero como se mencionó anteriormente, CA 19-9 no es lo

suficientemente sensible y específico para ser utilizado para el diagnóstico PDAC. Tabla 2: Parámetros diagnósticos de distintos marcadores únicos para diferenciar PDAC de CP.

Sensibilidad Especificidad

PPV ^a (%) NPV ^b (%) AUC ^C

(%) (%)

CA 19-9 80.9 95 97.4 67.9 0.862

CEA 83 40 76.5 50 0.561

Albúmina 78.7 95 97.4 65.5 0.869

PCR 76.6 55 80 50 0.654

IGF-1 57.4 100 100 50 0.839

^a PPV, valor predictivo positivo, ^b NPV, valor predictivo negativo, ^C AUC área bajo la curva ROC.

Ensayo 2. Análisis multivariante de los niveles de biomarcadores.

Con el fin de evaluar el rendimiento de la combinación de los niveles séricos de los diferentes biomarcadores, se utilizó el paquete estadístico R (programarlo libre de estadística R). La sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y el AUC de cada combinación de biomarcadores para diferenciar PDAC de los grupos de la CP fueron evaluados. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: Parámetros diagnósticos de distintas combinaciones de marcadores para diferenciar PDAC de CP.

Sensibilidad Especificidad PPV ^a NPV ^b

AUC ^C

(%) (%) (%) (%)

CA 19-9 80.9 95 97.4 67.9 0.862

CA 19-9+CEA 83 95 97.5 70.4 0.887

CA 19-9+IGF-1 83 100 100 71.4 0.946

CA 19-9+Albumin 95.7 95 97.8 90.5 0.954

CA19-9 +CRP 83 95 97.5 70.4 0.907 Sensibilidad Especificidad PPV ^a NPV ^b

AUC ^C

(%) (%) (%) (%)

CA 19-9+ IGF-1 +CEA 80.9 100 100 69 0.947

CA 19-9+ IGF-1 +Albumin 93.6 95 97.8 86.4 0.959

CA 19-9+IGF-

97.9 95 97.9 95 0.979 1+CEA+Albumin

CA 19-9+CEA+IGF-

87.2 100 100 76.9 0.954 1 +CRP

CA 19-9+CEA+IGF-1

91.5 100 100 83.3 0.979 +Albumin+CRP ^a PPV, valor predictivo positivo, ^b NPV, valor predictivo negativo, ^C AUC área bajo la curva ROC.

Tomando CA 19-9 como referencia, la mejor combinación de dos

biomarcadores era de CA 19-9 y el IGF - 1 , lo que dio un AUC de 0,946. Este valor es mucho más alto que el de CA 19-9 sólo. La adición de un nuevo biomarcador tal como los niveles de CEA mejoró ligeramente el rendimiento a 0.947. Al añadir albúmina, el AUC aumentó a 0.979. Por lo tanto, el mejor rendimiento para distinguir pacientes con PDAC de los pacientes con CP se encontró con la combinación de las concentraciones de CA 19-9 , CEA , el IGF - 1 y la albúmina, lo que dio lugar a una sensibilidad del 97,9 %, una

especificidad del 95% y una AUC de 0,979, tal como se muestra en la FIG. 2.

En esta FIG. 2 se detallan las curvas ROC para la discriminación de PDAC de CP utilizando sólo los niveles séricos de CA19-9 (línea sólida) y utilizando los niveles de los cuatro marcadores (CA19-9, CEA, IGF-1 y albúmina) en combinación de acuerdo con la invención (línea discontinua). Los valores control de referencia o punto de corte para cada marcador en la combinación fueron para CA 19-9, 64.61 U/ml; para CEA, 1 1 .8 ng/ml; para IGF-1 , 80.7 ng/ml y para albúmina 4.1 g/dL.

Tal como puede apreciarse, la mejor combinación (con mayor sensibilidad, especificidad y AUC) se corresponde con la propuesta en esta invención. Esto es, la que comprende determinar en una muestra fluida aislada de un sujeto los niveles de Antígeno carbohidrato 19-9, de Antígeno carcinoembrionario, de Factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de Albúmina.

Según se desprende además de la Tabla 3, la alta especificidad y sensibilidad lograda con esta combinación supone una gran ventaja en la diferenciación de pacientes con PDAC de los pacientes con CP. Además, esta combinación de biomarcadores conlleva la ventaja de que se puede medir fácilmente en laboratorios clínicos usando autoanalizadores que ya están disponibles en la rutina clínica, por lo que su implementación en clínica es fácil y permite un mejor diagnóstico de PDAC. Con ello, puede escogerse más rápidamente la terapia a aplicar en cada caso sin demoras de tiempo por diagnóstico erróneo y sin malversación de recursos por parte de las autoridades sanitarias al aplicarse tratamientos no necesarios en caso de tratarse de pacientes con CP en vez de PDAC.

Para poner en práctica esta combinación de biomarcadores (marcadores biológicos, en este caso proteicos y carbohidratos) en la práctica clínica, y en particular con el objetivo de predecir la probabilidad de un sujeto (paciente) de padecer cáncer de páncreas, en concreto PDAC, se estimó un modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial mediante el programarlo libre de estadística R, utilizando los datos de la cohorte de pacientes, y que tenía como variables predictoras las concentraciones de CA 19-9, CEA, de IGF-1 y de la albúmina. La estimación permitió construir una fórmula que posibilitó clasificar los pacientes con cáncer y sin cáncer, con una sensibilidad del 97,9 % y con una especificidad del 95%.

En esta fórmula (la fórmula (I) que está descrita aquí) las concentraciones de antígeno carbohidrato 19-9, de antígeno carcinoembrionario, de factor de crecimiento insulínico tipo 1 y de albúmina de la muestra aislada del sujeto se combinan para obtener un valor test que se compara con un valor de

discriminación entre cáncer de páncreas y pancreatitis crónica.

Para esta realización particular, los puntos de corte o valores control de referencia para cada marcador son: CA 19-9 64.61 U/ml; CEA 1 1 .8 ng/ml, de IGF-1 80.7 ng/ml; y 4.1 g/dl de albúmina. Con este modelo se calculó la probabilidad de diagnosticar nuevos pacientes de CP o PDAC. Para una probabilidad igual a o mayor que 48,2 % (punto con la máxima sensibilidad y especificidad) el paciente será clasificado como PDAC con una sensibilidad del 97,9 %, pero si la probabilidad es inferior a 48,2 % el paciente se clasifica como CP con una especificidad de 95 %. La probabilidad de ser clasificado como CP o PDAC para un paciente particular se calcula con sus valores de CA 19-9, de CEA, de IGF - 1 y de albúmina, usando la siguiente función o fórmula (I), donde βθ, β1 , β2, β3 y β 4 son parámetros estimados por el modelo GLM:

(β ₀ + β Α19-9+ p ₂ CEA + p ₃ IGFl+ p^Albu min)

Vxob(PDAC) = ⁶ ( ₀ + _l CA19-9+ ₂ CEA + ₃ IGFl+ _/i Albu min)

l + e

(i).

El panel de CA 19-9, CEA, IGF-1 y albúmina se validó en una cohorte independiente compuesta de 20 pacientes con PDAC y 13 pacientes con CP (los datos de estos pacientes figuran en la Tabla 4). La distribución TNM de los 20 pacientes con PDAC era: Estadio NA n=7; Estadio IIB n=9; Estadio III n=1 y Estadio IV n=3. Cada muestra de validación se diagnosticó como cáncer o CP empleándose la función (I) descrita arriba. Con este modelo, 19 de los 20 pacientes con PDAC y 12 de los 13 pacientes con CP se clasificaron

correctamente. Esto supone una sensibilidad de 95 % y una especificidad del 92 %.

Los estadios de la enfermedad se corresponden con la clasificación Tumor- Node-Metastasis (TNM) del adenocarcinoma pancreático. (Extraído de TNM classification of malignant tumours. UICC (International Union Against Cáncer)); y se detallan en la Tabla 5, más adelante.

Tabla 4: Características clínicas y patológicas de la cohorte de validación.

PDAC CP

N 20 13

Media edad, años 67.2 50.9

(min-max) (39-86) (39-72) PDAC CP

Hombres 9 10

Mujeres 1 1 3

Estadio

IA 0

IB 0

NA 7

IIB 9

III 1

IV 3

De todos estos ensayos se desprende que la nueva combinación de albúmina, CEA, CA19-9 y IGF-1 propuesta permite la obtención de valores óptimos de sensibilidad, especificidad, área bajo curva (AUC), valor predictivo positivo (PPV) y negativo (NPV), no obtenibles con otras combinaciones propuestas para este mismo tipo de cáncer. La invención supone además la ventaja adicional de facilitar un método que utiliza únicamente marcadores (moléculas) ya usados habitualmente en clínica, con la finalidad de dar un valor significativo que permite al médico diagnosticar otras enfermedades. Esta discriminación correcta se mantiene incluso cuando los valores de los distintos marcadores por separados dan diagnósticos contrarios. Por ejemplo, si los niveles de CEA indican la presencia de PDAC y, por otro lado, los niveles de IGF-1 indican lo contrario, la combinación descrita permite el diagnóstico correcto y por ende, más preciso.

Tabla 5.: Clasificación TNM

ESTADÍO T N M

ESTADÍO 0 T in situ NO M0

ESTADÍO IA T1 NO M0

ESTADÍO IB T2 NO M0

ESTADÍO NA T3 NO M0

ESTADÍO IIB T1 -3 N1 M0

ESTADÍO III T4 Cualquier N M0

ESTADÍO IV Cualquier T Cualquier N M1 T, N, M se definen según:

CLASIFICACION CARACTERISTICAS

TX Tumor primario no puede ser valorado

T0 No evidencia de tumor primario

T/s Carcinoma in situ

T1 Tumor < 2 cm limitado al páncreas

T2 Tumor > 2 cm limitado al páncreas

Tumor que se extiende más allá del páncreas pero sin afectación del

T3

tronco celíaco o la arteria superior mesentérica.

T4 Tumor que afecta a tronco celíaco o arteria superior mesentérica.

Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función del tamaño del tumor primario

CLASIFICACION CARACTERISTICAS

Nx No pueden valorarse los ganglios linfáticos regionales

NO No hay metástasis en ganglios linfáticos regionales

N1 Presencia de metástasis en ganglios linfáticos regionales

Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función de la afectación de ganglios linfáticos regionales

CLASIFICACION CARACTERISTICAS

Mx No puede valorarse si existen metástasis a distancia

M0 No hay metástasis a distancia

M1 Presencia de metástasis a distancia

Clasificación del adenocarcinoma pancreático en función de la presencia o ausencia de metástasis Ensayo 3. Análisis multivariante de los niveles de biomarcadores CA19-9 y albúmina.

Alentados por los valores prometedores de la combinación de los niveles de CA19-9 y albúmina de la Tabla 3, los inventores realizaron un nuevo ensayo en una cohorte independiente de sujetos.

En este caso se disponía de 127 pacientes, de los cuales 83 estaban diagnosticados de cáncer de páncreas (PDAC) y 44 era pacientes con pancreatitis crónica (CP).

Se analizaron igualmente los cuatro marcadores en suero de los pacientes (CA19.9, CEA, IGF-1 y albúmina). Para ello, se siguieron los mismos procedimientos de extracción de muestra por venopunción y de análisis en suero de los marcadores, tal cual indicados para el resto de ensayos. Esto es, utilizando los mismos reactivos y sistemas automáticos y cálculos estadísticos. Repitiendo el esquema del Ensayo 2, para evaluar el rendimiento de la combinación de los niveles séricos de los diferentes biomarcadores, se utilizó el paquete estadístico R (programarlo libre de estadística R).

Con la combinación de los biomarcadores CA19-9 y albúmina para diferenciar PDAC de los grupos de la CP se obtuvieron una sensibilidad del 96.4 % y una especificidad de 90.9 %, con un AUC de 0.963. El valor predictivo positivo (PPV) fue del 95.2 %; y el valor predictivo negativo del 93 %.

En la FIG. 3 se muestra la curva ROC para la discriminación de PDAC de CP utilizando los niveles de los dos marcadores (CA19-9 y albúmina) en

combinación de acuerdo con la invención. Los valores control de referencia o punto de corte para cada marcador en la combinación fueron para CA 19-9, 2.9 U/ml; y para albúmina 3.9 g/dL.

Además, para poner en práctica esta combinación binaria de biomarcadores en la práctica clínica, y en particular con el objetivo de predecir la probabilidad de un sujeto (paciente) de padecer cáncer de páncreas, en concreto PDAC, se estimó también un modelo lineal generalizado (GLM) con respuesta binomial mediante el programarlo libre de estadística R, utilizando los datos de la cohorte de pacientes, y que tenía como variables predictoras las

concentraciones de CA 19-9, y de la albúmina. La estimación permitió construir una fórmula (II) que posibilitó clasificar los pacientes con cáncer y sin cáncer, con una sensibilidad del 96.4 % y con una especificidad del 90.9 %.

Para esta realización particular, los puntos de corte o valores control de referencia para cada marcador son: CA 19-9, 2.9 U/ml; y 3.9 g/dl de albúmina. Con este modelo se calculó la probabilidad de diagnosticar nuevos pacientes de CP o PDAC. Para una probabilidad igual a o mayor que 33.5 % (punto con la máxima sensibilidad y especificidad) el paciente será clasificado como PDAC con una sensibilidad del 96.4 %, pero si la probabilidad es inferior a 33.5 % el paciente se clasifica como CP con una especificidad de 90.9 %.

La fórmula (II) es la siguiente :

e (A) +P _l CA19-9+p ₂ Albu min)

Pr ob ( V Pancreatic— cáncer τ- _Ω

/ ) = — _α „ _{Λ Λ η} » _Q — rx

-i (β ₀ + _i CA\9-9+ iAlbu m)

(II), donde βθ, β1 , β2, son parámetros estimados por el modelo GLM.

Este ensayo permite afirmar que con solo el análisis sérico de dos marcadores de práctica habitual en clínica (CA 19-9 y albúmina) es suficiente para obtener datos muy relevantes de sensibilidad y especificidad, lo que reduce la complejidad de la metodología.