PAINEL E KIT PARA O DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA".

Campo da Invenção

[0001] O presente pedido de patente refere-se à um método de diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama, mais particularmente em que o método compreende a detecção de subpopulações de células tumorais circulantes (CTCs), baseado na presença ou ausência de proteínas analisadas por meio de citometria de fluxo no sangue periférico para serem utilizadas como biomarcadores para o câncer de mama (CM). Além disso, o presente pedido de patente refere-se à um painel de marcadores e um kit para teste diagnóstico rápido de câncer de mama e monitoramento rápido do tratamento de pacientes com câncer de mama. Especificamente, o presente pedido de patente descreve um método para detecção de subpopulações de CTCs baseado (i) na ausência de CD45 e (ii) na presença de vimentina, CD44 e EpCAM. A análise desses marcadores foi realizada sem enriquecimento prévio das CTCs, otimizando o processo. Sendo assim, o método, painel de marcadores e kit para detecção baseado no resultado da análise de CTCs por citometria de fluxo, tem o potencial de ser utilizado como ferramenta complementar ao diagnóstico clinico, podendo também ser utilizado para monitoramento do tratamento. Ressalta-se ainda que a metodologia aqui proposta compreende uma técnica rápida e não invasiva.

Estado da Técnica

[0002] O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente entre as mulheres. Na última estimativa mundial, publicada em 2018, houve 18 milhões de novos casos de câncer e destes 11,6% foram de mama (BRAY et al.,2018). No Brasil, a estimativa para cada ano do triénio 2020-2022 é de 625 mil novos casos de câncer, sendo que o câncer de mama representará 29,7% dos cânceres em mulheres (INCA, 2019).

[0003] A carcinogênese caracteriza-se como um processo de múltiplas etapas orientadas por alterações tanto em nivel de genótipo quanto de fenótipo e o crescimento descontrolado das células que sofreram tais alterações é definido como câncer (BARTOSCH et al., 2017; WEIGELT et al., 2014). A progressão metastática é uma sequência de eventos não determinados, que envolve a migração das células por meio da membrana basal e tecido circundante, deslocamento pela corrente sanguínea para locais distantes, readaptação ao novo ambiente tecidual e por fim a formação de metástases clinicamente detectáveis (VANHARANTA & MASSAGUE, 2013). Para que as primeiras etapas ocorram, evidências sugerem que as células tumorais sofrem a transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal, o que desencadeará a liberação e disseminação destas células na corrente sanguinea (WERNER et al., 2017).

[0004] As mortes em decorrência do câncer são consequência, em sua maioria, das metástases em órgãos e tecidos distantes (HANAHAN & WEINBERG, 2000). O padrão ouro para avaliar a recidiva do câncer tem sido os mesmos testes utilizados para o diagnóstico do tumor, quando possivel a coleta do material. As técnicas de histopatologia, mamografia, ultrassonografia e imageamento por ressonância magnética são as análises mais utilizadas na rotina clinica, porém são demoradas e exigem protocolos rigidos (TRIA et al., 2013).

[0005] A biópsia do tecido é utilizada para o diagnóstico e fornece informações histológicas e permite estabelecer o perfil imuno-histoquimico dos receptores hormonais e do status do receptor HER-2. Porém, possui limitações e pode fornecer informações de apenas um momento e apenas do tecido tumoral coletado (TAY & TAN, 2019). Mas, os tumores são heterogêneos e ainda podem sofrer alterações de acordo com o tipo de tratamento realizado (GERLINGER et al., 2012). A possibilidade de utilizar CTCs para complementar ou substituir biópsias de tecidos tumorais para o diagnóstico e terapêutica torna tal metodologia relevante e aplicável como "biópsias liquidas em tempo real" (PANTEL & ALIX-PANABIERES, 2010; BARDELLI & PANTEL, 2017). A biópsia liquida pode suprir tanto a carência de dados em relação a diferentes tempos e ainda detectar a inerente heterogeneidade do tecido tumoral.

[0006] O único método para realizar a biópsia liquida aprovado pelo Food and Drug Administration (EDA) é o CellSearch. Este método se baseia na expressão de moléculas de adesão celular epitelial (EpCAM), para seleção das CTCs, seguido por caracterização das células selecionadas em: i) negativo para CD45 e ii) positivo para citoqueratinas. Porém, estudos demonstraram que esta técnica não captura CTCs com baixa expressão de EpCAM adequadamente. Assim, CTCs que sofrem o processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT), perdem seus antigenos epiteliais e não são detectadas pelo CellSearch. Além disso, essas CTCs negativas para EpCAM parecem ser um subtipo altamente agressivo e invasivo (PUNNOOSE et al., 2010; GEORGES et al., 2012).

[0007] Diante desse quadro, fica evidente a necessidade de novos métodos para a detecção de CTCs, que possibilitem não somente a identificação de CTCs com diferentes fenótipos, mas também que seja exequivel e que não requeira muitos processos até a obtenção do resultado final. A presente invenção busca atender essas exigências.

[0008] Apesar das limitações do CellSearch, vários estudos que utilizaram essa técnica, comprovaram a relevância da análise de CTCs para estabelecimento do prognóstico. Pacientes com câncer de mama e com valores de ≥ 5 CTCs por 7.5 mL de sangue total em comparação com aqueles com valores de < 5 CTCs apresentaram significativamente menor sobrevida livre de progressão e sobrevida global (CRISTOFANILLI et al.,2004; BUDD et al., 2006; PIERGA et al.,2012; ROSSI et al., 2018).

[0009] Para o diagnóstico do câncer de mama, a utilização de CTCs ainda precisa ser melhor investigada pois evidencia-se a existência de resultados muito pouco significativos. Porém, sondas ativadas por nucleases derivadas de CTCs foram capazes de discriminar pacientes com câncer de mama metastático de controles saudáveis (KRUSPE et al., 2017).

[00010] Os documentos de patente US9671407B2, EP283121, CN105518464B, WO201600431IA, CN104781007B,

JP2018079327A, TW201920928A e US20200055048A1 utilizam um dispositivo (chip microfluido ou microfiltros) para capturar e/ou detectar CTCs. Apesar de também utilizarem anticorpos, porém imobilizados no microchip ou filtro, verifica-se a necessidade da utilização de técnicas após a captura para caracterização das células alvo, tais como imunohistoquimica, citometria de fluxo, hibridização in situ, análise de mutações no DNA e imunofluorescência.

[00011] O documento de patente US20190107542A1 fornece métodos para detectar e isolar CTCs por anticorpos ligados a esferas magnéticas e posterior caracterização da expressão gênica destas células. Os documentos de patentes EP2948776B, CA2798250A1 e US20140154799A1 selecionam CTCs com base em um conjunto de anticorpos, tais como EpCAM, CD45, CD44, CD14, CD24, CD34, Citoqueratinas como 8, 18 e 19, EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) , ALDH1 (aldeidesidrogenase 1), vimentina, dentro outros, e em seguida as coloca em cultura para enriquecimento, com o objetivo principal de selecionar fármacos para a terapia dos pacientes, além de poder caracterizar as CTCs em cultura por imagem.

[00012] O documento de patente AU2016228165A1 fornece métodos para obter CTCs e a possibilidade de analisar uma única célula. Essa identificação se dá por imunohistoquimica com a aspiração das células por pipetagem e posterior análise morfológica, genômica, epigenética ou proteômica. Utiliza marcadores epiteliais e mesenquimais. Da mesma forma, o documento de patente JP2006509185A fornece um método para detectar e descriminar mudanças nos niveis de expressão de marcadores moleculares, utiliza, entre outros marcadores, o CD44.

[00013] O documento de patente WO2017180499A2 utiliza um método para capturar CTCs de fluidos biológicos que compreende o contato do material biológico com a lectina presa na superfície magnética. A separação ocorre em um aparato magnético. A análise das CTCs ocorre a posteriori por técnicas como imunhistoquimica, genômica e metabolômica, por exemplo. De uma maneira semelhante, o documento de patente CN107428837A utiliza um método para enriquecimento e detecção de CTCs baseado em anticorpo anti-TROP2, porém tal análise é valida apenas para tumores positivos para esse marcador. Análises posteriores incluem imunofluorescência, FISH e RT-PCR.

[00014] O documento de patente US20170038389A1 utiliza um método de detecção de CTCs visando sua diferenciação de células endoteliais circulantes e confirma que a vimentina é expressa nestas últimas células, mas quando analisada em conjunto com outros marcadores (CD45 e CD144) é possível separar as populações. O documento de patente CN108588018A utiliza uma membrana de eritrócitos para capturar CTCs, sendo uma captura mais efetiva que os métodos disponíveis .

[00015] O documento de patente EP3160654A2 identifica ácidos nucleicos de CTCs utilizando a combinação de PCR e FACS (seleção ativada por PCR), os primers podem ser de EpCAM, CD44 e vimentina, entre outros. Em outra abordagem, o documento de patente CN106868101A utiliza marcadores semelhantes para detecção de CTCs por sonda e hibridização in situ, mas não houveram análises deste método para o monitoramento do tratamento ou diagnóstico.

[00016] Os documentos de patente JP2017207516A, US20130129681A1 e EP2529223B1 utilizam marcadores epiteliais e mesenquimais e detecção por citometria de fluxo, mas utilizam métodos de enriquecimento como passos iniciais, esferas magnéticas, RosetteSep e CellSearch, respectivamente .

[00017] Nenhum dos ensinamentos do estado da técnica demonstram ou sugerem um método que utilize da combinação dos marcadores: vimentina, CD44, CD45 e EpCAM, nem da detecção destes 4 marcadores utilizando a técnica de citometria de fluxo, e nem muito menos, que tal método permitisse a análise de diferentes populações de CTCs sem a necessidade de uma etapa de inicial de enriquecimento. O método proposto pelo presente pedido de patente se mostrou eficaz na detecção direta de diferentes populações de CTCs em amostras biológicas, por exemplo, amostras de sangue periférico. Proporcionando então o desenvolvimento de um método, painel de marcadores e kit para o diagnóstico do câncer de mama e monitoramento do tratamento, sendo que a técnica utilizada e descrita no presente pedido de patente fornece uma ferramenta simples e poderosa para analisar amostras biológicas com pouca preparação, permitindo que a amostra seja analisada diretamente, sem a necessidade de etapas adicionais de enriquecimento das CTCs. Além disso, o método , painel e kit aqui descritos facilitam ainda mais a utilização na rotina clinica, produzindo um ponto de inflexão (cut off) e informando o diagnóstico positivo ou negativo para o câncer de mama e a possibilidade de acompanhamento do perfil destas células durante o tratamento.

[00018] Dessa forma, apesar dos documentos do estado da técnica revelarem à busca pela captura e detecção de CTCs no diagnóstico de câncer, há ainda a necessidade de um método de diagnóstico sensível, especifico e simples que possa ser implementado na rotina clinica, para o câncer de mama.

Objetivo da invenção

[00019] O presente pedido de patente teve como objetivo de resolver um problema no estado da técnica desenvolvendo um método, painel de marcadores e kit para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama, sensível, especifico e simples que possa ser implementado na rotina clinica de forma otimizada.

Breve descrição das figuras

[00020] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:

[00021] A FIGURA 1 a) mostra a porcentagem de CTCs mesenquimal. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05;

[00022] A FIGURA 1 b) mostra a porcentagem de CTCs intermediário. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05;

[00023] A FIGURA 1 c) mostra a porcentagem de CTCs epitelial. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05.

Descrição detalhada da invenção

[00024] Os inventores do presente pedido de patente, por meio de experimentos utilizando amostras biológicas de sangue periférico e tecidos de pacientes com doença benigna da mama ou com câncer de mama submetidos ou não à quimioterapia, foram capazes de identificar que a expressão de somente quatro marcadores especificos seria útil no desenvolvimento de um método, painel de marcadores e kit de diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama simplificado. Mais particularmente, a análise dos referidos marcadores dentro do método desenvolvido é capaz de indicar, através de um cut off definido especificamente para separação dos grupos, se o paciente apresenta: doença benigna da mama (DBM), câncer de mama sem tratamento por quimioterapia (CM sem QT) ou câncer de mama com tratamento por quimioterapia (CM com QT).

[00025] O painel de marcadores propostos pela presente invenção engloba a detecção de: CD45, um marcador para seleção negativa, definido como um marcador pan- leucocitário; Vimentina, marcador tipico do fenótipo mesenquimal e com estudos demonstrando que maiores niveis dessa proteína estão associados ao maior poder de invasão de células tumorais in vitro e consequentemente, o seu silenciamento reduz a formação de metástases (ZELENKO et al., 2017); CD44, marcador estabelecido para células tronco, sendo uma molécula de adesão, relacionada às interações célula a célula e célula-matriz (KLINGREIL et al., 2010).

Por meio das interações anteriormente citadas, o CD44 promove a invasão e migração das CTCs (SENBANJO et al., 2017); EpCAM, uma glicoproteina transmembrana, que possui função de adesão e está relacionada com a sinalização, proliferação, diferenciação e migração celular (OSTA et al.,2004).

[00026] Frente a estes fatos, o presente pedido de patente propõe a utilização de um painel de marcadores, que compreende anticorpos marcados anti-CD45 (para seleção negativa), anti-CD44, anti-vimentina e anti-EpCAM. Esse painel de marcadores é capaz de, identificar subpopulações de CTCs do câncer de mama (CM), selecionadas a partir de amostras biológicas, como por exemplo sangue periférico, de pacientes com CM ou DBM por meio de um método de diagnóstico simplificado e isento de etapa de enriquecimento, usando a citometria de fluxo.

[00027] A utilização de um método de detecção baseado na expressão de vimentina, CD44 e EpCAM em CTCs que são CD45 negativas, de amostras biológicas de pacientes com doença benigna da mama ou com câncer de mama submetidos ou não à quimioterapia, demonstrou possibilitar não somente o diagnóstico de CM ou DBM, mas também a possibilidade de monitoramento do tratamento com a identificação dos grupos: câncer de mama sem tratamento por quimioterapia (CM sem QT) e câncer de mama com tratamento por quimioterapia (CM com QT).

[00028] Mais particularmente, a análise da expressão dos marcadores selecionados possibilita a identificação e separação das populações de CTCs com perfil mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina+), intermediário (CD45-, EpCAM+, CD44+ e vimentina+) e epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-). Tal identificação dos perfis de CTCs a partir da análise da expressão dos referidos marcadores, com a determinação de cut offs específicos em relação a porcentagem de populações de CTCs em cada perfil, mostrou um alto potencial no diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama.

[00029] Assim, a presente invenção propõe a utilização de um método simplificado para detecção de populações de CTCs, isento da necessidade de uma etapa de enriquecimento prévio das CTCs, baseado: (i) na seleção de CTCs ausentes de CD45 (CD45-) e (ii) na identificação do perfil das CTCs através da presença ou ausência de vimentina, CD44 e EpCAM, a identificação destas populações compõem um painel simplificado para diagnóstico e monitoramento do tratamento .

[00030] Para o diagnóstico, a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 73% e especificidade de 83% para CM vs DBM e odds ratio de 13.33 (p=0.0443). A análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% para CM vs DBM e odds ratio de 84.33 (p=0.0096). A análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem tratamento, apresentou uma sensibilidade de 83% e especificidade de 100% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). A análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257).

[00031] Para o monitoramento do tratamento, a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 91% para câncer de mama sem QT vs doença benigna da mama e CM com QT, e odds ratio de 91 (p=0.0082). A análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172). A análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172).

[00032] Assim, o presente pedido de patente propõe mais particularmente a utilização de um método de diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama, baseado na detecção, identificação e análise de populações de CTCs, preferencialmente por citometria de fluxo, em que compreende as etapas de: obtenção da amostra biológica, preferencialmente sangue, mais preferencialmente sangue periférico;

- preparação da amostra para receber os anticorpos marcadores, em que a preparação é isenta da necessidade de uma etapa de enriquecimento prévio;

- por em contado a amostra preparada com os anticorpos marcados com fluorocromos anti-CD45, anti-CD44, anti-Epcam e anti-vimentina,

- seleção de CTCs ausentes de CD45 (CD45-); e

- identificação e análise do perfil das CTCs através da presença ou ausência de vimentina, CD44 e EpCAM.

[00033] A etapa de identificação dos perfis das CTCs compreende a identificação dos perfis:

(i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina4);

(ii) intermediária (CD45-, EpCAM4, CD444 e vimentina4); e

(iii) epitelial (CD45-, EpCAM4, CD44- e vimentina-), por citometria de fluxo.

[00034] A identificação e análise do perfil das CTCs compõem então um painel de marcadores simples para diagnóstico e monitoramento do tratamento, a etapa de análise dos perfis das CTCs compreende o uso de cut offs definidos em relação a porcentagem de populações de CTCs em cada um dos perfis identificados, para o diagnóstico de doença benigna da mama (DBM) ou câncer de mama (CM), ou monitoramento de câncer de mama com quimioterapia (CM com QT) e câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT).

[00035] O presente pedido de patente descreve ainda um painel de marcadores para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama em que compreende anticorpo marcado com fluorocromos anti-CD45, anticorpo marcado com fluorocromos anti-CD44, anticorpo marcado com fluorocromos anti-vimentina e anticorpo marcado com fluorocromos anti-EpCAM para detecção de populações de CTCs, em que o painel permite a identificação dos perfis das CTCs:

(i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina+);

(ii) intermediária (CD45-, EpCAM+, CD44+ e vimentina+); e

(iii) epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-).

[00036] O Painel ainda compreende um painel de diagnóstico e um painel de monitoramento com base na análise dos perfis das CTCs, em que o painel de diagnóstico compreende :

- a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off acima de 4,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama;

- a análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,04% de células tumorais circulantes intermediárias indicando diagnóstico de câncer de mama;

- a análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem QT, com um cut off acima de 5,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama; e

- a análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT, com um cut off abaixo de 0,28% de células tumorais circulantes epiteliais indicando diagnóstico de câncer de mama; e o painel de monitoramento compreende:

- a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,27% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento; a análise do perfil intermediário para CM sem QT vs

CM com QT, com um cut off acima de 0,0004% de células tumorais circulantes intermediárias indicando tumor sem tratamento; e

- a análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off abaixo de 0,6% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento.

[00037] O presente pedido de patente descreve ainda um kit para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama em que compreende, combinados ou separados em um ou mais recipientes: anticorpo marcado com um fluorocromo anti-CD45, anticorpo marcado com um fluorocromo anti-CD44, anticorpo marcado com fluorocromo anti-vimentina e anticorpo marcado com fluorocromo anti-EpCAM; em que ainda compreende instruções de uso.

[00038] O referido kit ainda pode compreender em outra modalidade o referido painel de marcadores descrito no presente pedido de patente, bem como pode compreender instruções para uso no referido método descrito no presente pedido de patente.

[00039] A presente invenção será ainda melhor compreendida por meio da descrição dos resultados obtidos. Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados no final desse relatório descritivo.

Exemplo 1

[00040] Esse exemplo refere-se às características dos sujeitos do estudo, sendo estes agrupados em pacientes com câncer de mama que foram ou não submetidos a quimioterapia (grupo CM com QT ou CM sem QT), pacientes com doença benigna da mama (grupo DBM).

[00041] A Tabela 1 apresenta as características clinicas, hormonais, diagnósticas e terapêuticas de pacientes com câncer de mama.

[00042] A Tabela 1 apresenta as características clinicas, hormonais, diagnósticas e terapêuticas de pacientes com câncer de mama.

Exemplo 2

[00043] Esse exemplo refere-se a análise por RT-qPCR dos níveis transcricionais dos grupos câncer de mama e doença benigna da mama. [00044] A Tabela 2 apresenta a comparação dos níveis transcricionais entre câncer de mama (CM) e doença benigna da mama (DBM).

1Teste de Mann-Whitney 2Teste t para amostras independentes

[00045] A Tabela 3 apresenta a comparação dos níveis transcricionais entre câncer de mama com quimioterapia (CM com QT), câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT) e doença benigna da mama (DBM).

1Teste de Mann-Whitney 2Teste t para amostras independentes.

As medianas horizontais seguidas de letras diferentes diferiram estatisticamente de acordo com o teste de post-hoc de Tukey a 5% de probabilidade; *p <0,005.

Exemplo 3

[00046] Para análise da expressão dos marcadores em nivel proteico, com os resultados obtidos na RT-qPCR e dados da literatura, os marcadores EpCAM, CD44 e vimetina foram selecionados .

[00047] As diferentes populações de CTCs (mesenquimal, intermediário e epitelial) apresentam diferentes porcentagens para cada grupo.A figura 1 apresenta as porcentagens de CTCs com perfil mesenquimal, intermediário e epitelial do sangue de pacientes com doença benigna da mama (DBM), câncer de mama com quimioterapia (CM com QT) e câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT).

[00048] Para o diagnóstico, a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off acima de 4,5% de CTCs mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 73% e especificidade de 83% para câncer de mama vs doença benigna da mama (DBM) e odds ratio de 13.33 (p=0.0443). A análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,04% de CTCs intermediárias indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% para câncer de mama vs doença benigna da mama (DBM) e odds ratio de 84.33 (p=0.0096). A análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem QT, com um cut off acima de 5,5% de CTCs mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 83% e especificidade de 100% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). A análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT, com um cut off abaixo de 0,28% de CTCs epiteliais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). Para o monitoramento do tratamento, a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,27% de CTCs epiteliais , apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 91% para CM sem QT vs DBM e CM com QT, e odds ratio de 91 (p=0.0082). A análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off acima de 0,0004% de CTCs intermediárias indica tumores sem tratamento prévio, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172). A análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off abaixo de 0,6% de CTCs epiteliais indicando tumor sem tratamento prévio, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172).

Metodologia Empregada

[00049] A seguir, é descrita a metodologia para o desenvolvimento do método de detecção a partir da análise de populações de CTCs por citometria de fluxo em amostras de sangue de pacientes com CM sem QT, CM com QT e DBM.

Aspectos éticos e participantes do estudo

[00050] A presente invenção foi conduzida no Hospital de Clinicas da Universidade Federal de Uberlândia e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (número do protocolo: 174.009/2013) e baseado na Declaração de Helsinque. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi obtido de todas as participantes. Os critérios de exclusão foram idade inferior a 18 anos, sitio do tumor primário diferente da mama e incapacidade fisica ou mental para responder o questionário.

[00051] Os dados foram coletados em duas etapas de diferentes pacientes. Na primeira etapa, o perfil transcricional foi avaliado de 2013 a 2016, com 62 pacientes com câncer de mama (49 não submetidas a quimioterapia e 13 submetidas a quimioterapia) e 25 pacientes com doença benigna da mama. Na segunda etapa de 2019 a 2020, o perfil proteico foi analisado com 6 pacientes com câncer de mama e não submetidas a quimioterapia, 5 pacientes com câncer de mama e submetidas a quimioterapia e 6 pacientes com câncer de mama.

Coleta da amostra e processamento

[00052] Sangue periférico foi coletado em tubos Vacutainer™ contendo 7.2 mg de K2EDTA. O tecido obtido foi armazenado a -80°C submergido em RNAlater (Invitrogen™) para extração de RNA.

[00053] O RNA foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e seguindo as recomendações do fabricante. O produto da extração foi analisado por eletroforese em gel de agarose (1,5% de agarose). Para a transcrição reversa foi utilizado Ipg de RNA total, 10 U de inibidor de RNase (Invitrogen), 40 U de MMLV-RT (Amersham Biosciences), IX de Tampão da MMLV- RT (Amersham Biosciences), 200 pM de dNTPs (dGTP, dATP, dTTP e dCTP) e 126 pmoles. A solução foi incubada em termociclador PTC-100 (MJ Research) a 37°C por 1 hora e aquecida a 95°C por 5 minutos. Reações controle (sem RNA) foram realizadas para a verificação de possíveis contaminantes exógenos. O cDNA foi estocado a -20°C para posterior amplificação.

[00054] As quantificações transcricionais relativas dos genes alvos (citoqueratinas, ALDH1, CD44, E-caderina,

Ep-CAM, MMP-2, MMP-9, N-caderina e vimentina) em relação ao gene endógeno (B2M) foram estimadas por meio de PCR em tempo real a partir do cDNA obtido. As amostras foram amplificadas em duplicata e a detecção ocorreu a partir da emissão de fluorescência do corante dye SYBRGreen de acordo com o uso do kit Master Mix SYBR®Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems) .

[00055] A análise das proteínas envolvidas na EMT em CTCs foi realizada por citometria de fluxo usando BD ACCURITM C6 (Becton, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA). Para este experimento dois tubos (4mL) contendo sangue periférico estabilizado com EDTA foi utilizado. O primeiro tubo foi descartado para evitar contaminação com células epiteliais. A amostra foi primeiramente submetida a centrifugação e então a monocamada de leucócitos coletada. A monocamada foi incubada com soro AB para bloquear as porções FC, evitando ligações inespecificas e então marcadas com os anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos anti-CD45 (304008, PE) (Biolegend, San Diego, CA, USA), anti- CD44 (338816, PE/Cy7) (Biolegend, San Diego, CA, USA) e anti- EpCAM (324208, APC) (Biolegend, San Diego, CA, USA). Em seguida, os eritrócitos foram lisados com solução de lise BD FACS (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes

FL, USA) e lavagem da amostra duas vezes com solução de lavagem (Tampão fosfato salino lx, Albumina do soro bolvino 1% e Azida sódica 0,1%). As células foram ressuspendidas em 150pL de solução de lavagem. Para marcação intracelular, as células foram incubadas com solução de permeabilização BD FACS (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA). Em seguida, as amostras foram incubadas com soro AB, lavadas duas vezes com solução de lavagem e então incubadas com o anticorpo monoclonal marcado com fluorocromo anti-vimentina (562338, Alexa fluor 488) (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) e lavadas duas vezes com a solução de lavagem e ressuspendidas em 150 pL de solução de lavagem. BD™ CompBeads (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) foram utilizadas para compensação da fluorescência, assim como a marcação com iodeto de propidio realizada para avaliação da viabilidade celular. Células não marcadas e anticorpos isotipos controles foram utilizados para controle. Para cada tubo, 300.000 eventos foram coletados.

[00056] A estratégia de gate seguiu uma ordem especifica para analisar os dados: (i) eliminação dos debris celulares, (ii) eliminação dos doublets, (iii) eliminação dos leucócitos totais (CD45+), e (iv) seleção positiva para CTCs mesenquimais (CD45-EpCAM-CD44+Vimentina+), intermediárias (CD45-EpCAM+CD44+Vimentin+) e epiteliais (CD45-EpCAM+CD44-Vimentin-). Análise Estatistica

[00057] Inicialmente, o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov foi realizado. Dependendo do comportamento das variáveis, testes paramétricos foram realizados para variáveis com distribuição normal ou teste não paramétricos para variáveis sem distribuição normal. Para comparar a expressão (mRNA e proteína) dos genes alvo entre os grupos estabelecidos o teste Mann-Whitney ou teste t para amostras independentes foi utilizado. O intervalo de confiança de 95% foi considerado e valores de p<0.05 foi considerado significante. Analises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) e SPSS versão 21.0 (SPSS, IBM, Chicago, IL, USA).

[00058] Para análise da sensibilidade, especificidade e odds ratio foi definido um cut off para separação dos grupos em relação a porcentagem de população de CTCs especificas, e calculados por meio do site https://www.medcalc .org.

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