PROCEDE DE DEPOLLUTION DE SOLS CONTAMINES PAR LES METAUX

LOURDS

La présente invention concerne un procédé de dépollution des sols contaminés par les métaux lourds.

Les métaux lourds tels que le plomb, l'arsenic, le cadmium, le cuivre, le zinc, le nickel et le mercure constituent une des principales sources de pollution des sols et sont continuellement introduits dans les sols en raison de diverses activités telles que les activités agricoles, notamment par l'utilisation de produits agrochimiques ou de boues d'épuration dans des sols agricoles, ainsi que les activités industrielles telles que l'incinération de déchets, l'élimination des déchets ou l'extraction minière (Khan A. G., Journal of trace éléments in medicine and biology, 18, 355-364, 2005).

Les techniques de dépollution des sols reposent généralement sur des processus physiques ou chimiques et quelques fois bactériens (microfilms). Ces approches demandent un investissement relativement important et une technicité particulière qui limite leur utilisation en particulier dans les pays en voie de développement.

Dans les années 1980, une nouvelle conception de la réhabilitation des sols pollués a été proposée en utilisant des plantes présentant la particularité de se développer sur des milieux métallifères. Cette approche appelée « phytoréhabilitation » est basée sur l'utilisation de plantes supérieures susceptibles d'extraire, stabiliser ou dégrader des substances polluant l'environnement. Toutefois, ces espèces végétales dites « hyperaccumulatrices » sont généralement peu utilisées en phyto extraction en raison de leur croissance lente et leur faible production de biomasse.

La mycorhization est une association à bénéfice mutuel entre un végétal et un champignon mycorhizien. En règle générale, l'approche utilisée pour la phytoréhabilitation est une approche de type « mycorhization contrôlée », à savoir, la sélection d'une souche fongique performante quant à son impact sur un paramètre donné, notamment le développement de la plante hôte ou l'absorption de métal par la plante. Cependant les résultats de cette approche sont contradictoires en fonction des champignons ou des plantes utilisées.

Ainsi, le document Arriagada et al. (Journal of environmental management, 84 (1), 93- 99, 2007) décrit l'effet d'un champignon mycorhizien arbusculaire, Glomus mossae ou Glomus deserticola sur la croissance de l'Eucalyptus co-cultivé ou non en présence de soja

dans un sol minier. Le contenu en Pb et Cd des parties aériennes d'Eucalyptus globulus co- cultivé ou non en présence de soja n'est pas augmenté en présence de Glomus mossae par contre, il est plus que doublé en présence de Glomus deserticola.

Le document Liao et al. (Chemosphere, 50(6), 847-853, 2003) décrit l'effet d'un champignon mycorhizien arbusculaire sur le contenu en métaux lourds de plants de maïs cultivés avec des concentrations croissantes de ces mêmes métaux. Le poids de la biomasse des parties aériennes et des racines est supérieur dans le cas de plants non mycorhizés pour des concentrations en Cu inférieures à 3 mg/1 ou en Cd inférieures à 1 mg/1. Le contenu en Cu des plants mycorhizés est significativement plus élevé que dans le cas des plants non mycorhizés surtout à faible concentration en Cu. A forte concentration de métaux (3 mg/1 de Cu), il est observé un effet inverse des microorganismes et un contenu en Cu plus faible dans les plants mycorhizés.

Par conséquent, cette approche est difficilement généralisable aux différents métaux lourds trouvés dans les sols pollués ainsi qu'à toute sorte de plantes.

Un des objets de l'invention est de fournir un procédé, basé sur une approche globale, permettant la dépollution et la réhabilitation de grandes surfaces de sols pollués, en particulier dans les pays en voie de développement.

Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé simple de dépollution de sols pollués et généralisable aux différents métaux lourds.

La présente invention concerne l'utilisation d'au moins un complexe endomycorhizien inoculé à des plantes à croissance rapide pour la dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds.

Par « complexe endomycorhizien », il faut comprendre une association de deux ou plusieurs champignons endomycorhiziens.

On entend par champignon endomycorhizien (ou champignon mycorhizien arbusculaire), un champignon, dont le mycélium pénètre les cellules racinaires et développe des arbuscules ou des vésicules lorsqu'il est associé à des racines de plantes. Il ne forme pas de manteau fongique autour de la racine (Smith, S. E. & Read, DJ. (1997). Mycorrhizal symbiosis. 2 ^nd édition, UK, Académie Press.).

Une plante à croissance rapide désigne une plante pour laquelle une augmentation d'au moins 10 m ³ de bio masse par hectare est observée pour une plantation évoluant dans des conditions environnementales favorables (humidité, fertilité des sols) et avec un entretien assuré par des techniques sylvicoles adéquates.

L'expression "espaces de sols contaminés par des métaux lourds" désigne tout terrain dans lequel un métal ou plusieurs métaux lourds sont présents naturellement ou accidentellement, ou ont été introduits en raison de diverses activités agricoles ou industrielles.

Dans la suite de la description, le terme sol ou zone est utilisé et désigne strictement la même chose. De même, l'expression sol « pollué » ou sol « contaminé » est utilisée et possède exactement la même signification.

Les métaux lourds désignent les éléments métalliques naturels dont la masse volumique dépasse 5 g/cm ³ . Dans cette description, les métaux lourds peuvent également être dénommés contaminants.

Par « dépollution d'espaces de sols», on entend la décontamination desdits espaces de sols qui consiste principalement à rendre le sol et le sous-sol de cet espace apte à un nouvel usage.

Un intervalle de valeur seuil peut être déterminé au dessus duquel une dépollution doit être envisagée.

Le tableau I suivant définit ces valeurs pour les différents métaux suivant deux classifications :

- Denis Baize (Le courrier de l'environnement n°39, février 2000)

- La norme AFNOR NF U 44-041.

Par exemple, une zone dont la teneur en Cu dans le sol est supérieure à un intervalle de 35-100mg/kg sera considérée comme zone polluée et une dépollution utilisant le procédé de l'invention pourra alors être envisagée.

Dans la présente invention, il a été trouvé que l'utilisation de complexes mycorhiziens permet la dépollution de sols contaminés par des métaux lourds par un mécanisme de phytoréhabilitation, notamment par phytostabilisation, c'est-à-dire par immobilisation et réduction de la mobilité et de la biodisponibilité des contaminants par les racines des plantes et de leurs microbes associés, et/ou par phytoextraction, c'est-à-dire par enlèvement des métaux du sol et concentration desdits métaux dans les parties aériennes de la plante.

Dans un mode de réalisation avantageux, ledit complexe endomycorhizien est constitué d'au moins deux champignons endo mycorhiziens prélevés sur des plantes issues de sols contaminés ou à la périphérie de la zone contaminée par des métaux lourds.

Les champignons endomycorhiziens sont avantageusement prélevés sur les racines des plantes

L'expression « plantes issues de sols contaminés » désigne des plantes telles que Haloxylon scoparium, Atriplex colerei, Ononis ssp., Hyparrhenia hirta et Cynodon dactylon mais sans être limitées à celles-ci, capables de se développer naturellement sur des sols contenant des métaux lourds, lesdits sols peuvent être les mêmes ou différents des espaces de sols contaminés désignés ci-dessus, c'est-à-dire qu'ils peuvent être originaires d'autres régions ou d'autres espaces de sols contaminés.

Lesdites plantes peuvent aussi provenir de la périphérie de la zone contaminée dans laquelle il y a une concentration en métaux lourds inférieure d'environ 30% (m/m) à environ 50% de celle de la zone contaminée.

Par exemple, dans une mine de cuivre du Nord-Ouest de Marrakech, les teneurs en Cu et Pb dans les différentes zones sont les suivantes (tableau II) :

Tableau II

Les teneurs limites en métaux sont bien entendus fonction du sol contaminé et de sa localisation.

Par conséquent, les plantes proviennent de sols dont la teneur en chaque métal présent dans lesdits sols est d'au moins 30 à plus de 100% supérieure à l'intervalle de valeur seuil, c'est-à-dire d'environ 3 à plus de 30 fois la concentration minimale pour le Cu et d'environ 1,3 à plus de 4 fois la concentration admise pour le plomb selon D. Baize ou selon la norme AFNOR NF U 44-041.

Dans un autre mode de réalisation, ledit complexe endomycorhizien est constitué d'au moins deux champignons endomycorhiziens prélevés sur des plantes issues de sols non contaminés par des métaux lourds.

Lesdites plantes proviennent de la zone non contaminée, c'est-à-dire une zone dans laquelle il y a une concentration en métaux lourds d'environ 10% (m/m) de la concentration présente dans les sols contaminés.

Par conséquent, les plantes proviennent de sols dont la teneur en chaque métal présent dans lesdits sols est inférieure à l'intervalle de valeur seuil déterminé selon D. Baize ou selon la norme AFNOR NF U 44-041.

Dans un mode de réalisation avantageux, ledit complexe endomycorhizien est constitué d'au moins deux champignons endomycorhiziens prélevés sur des plantes issues d'un mélange de sol contaminés et de sol issu de la périphérie de la zone contaminée, ou d'un mélange de sols issus de la périphérie de la zone contaminée et de sol non contaminé, ou d'un mélange de sol contaminés et de sol non contaminé.

Selon un autre mode de réalisation, le complexe endomycorhizien ci-dessus défini provient de sols contenant des métaux lourds choisis parmi le Cu, Pb, Zn, Cr, Ni, Cd, W, As.

Le sol peut contenir un seul ou plusieurs métaux lourds choisi parmi la liste ci-dessus, en proportions identiques ou différentes.

Par exemple, mais sans être limité à ceux-ci, le sol contaminé peut contenir un mélange de Pb et Cd (respectivement 2582 mg/kg et 44,2 mg/kg), de Pb, Zn et Cd (respectivement 1806 à 2022 mg/kg, 1025 à 2406 mg/kg et 45,6 à 51,7 mg/kg), de Pb, As, Zn (respectivement 1115 mg/kg, 1605 mg/kg et 1117 mg/kg) (H. M. Leung et al. ; Chemosphere 66(2007), 905- 915). Ces différents mélanges peuvent également contenir d'autres métaux lourds mais en proportion inférieure aux intervalles de valeurs seuils selon D. Baize ou selon la norme AFNOR NF U 44-041.

Selon un mode de réalisation avantageux, les champignons endomycorhiziens présents dans le complexe endomycorhizien ci-dessus défini sont notamment choisis parmi le genre Glomus et préférentiellement du genre G. aggregatum et G.fasciculatum.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, le complexe endomycorhizien ci- dessus défini est inoculé à une plante à croissance rapide choisie parmi le genre Eucalyptus, Casuarina et acacias australiens, en particulier l'Eucalyptus.

Ces trois genres, sans limitation aucune, représentent les principales essences forestières à croissance rapide utilisées dans les opérations de réhabilitation des zones polluées. Cependant, d'autres espèces végétales peuvent également être utilisées, telles que les plantes utilisées pour les biocarburants, en particulier Jatropha curcas.

Selon un autre mode de réalisation, le complexe endomycorhizien défini ci-dessus est multiplié à l'aide d'une plante hypermycotrophe telles que les céréales, en particulier le mil ou le maïs, et les légumineuses.

Après prélèvement sur des plantes issues de sol contaminé, de la périphérie de sol contaminé ou de sol non contaminé ou d'un mélange de ceux-ci, le complexe est multiplié, par inoculation à une plante hypermycotrophe, c'est-à-dire une plante capable de développer de nombreuses mycorhizes sur ses racines et donc d'amplifier le nombre de champignons endomycorhiziens présents sur les plantes issues des différents sols. Le facteur de multiplication ainsi obtenu est d'environ 10, c'est-à-dire qu'il y a dix fois plus de spores présentes sur les racines de la plante hypermycotrophe après inoculation.

Pour la multiplication, le complexe est associé à du sol permettant la croissance des plantes hypermycotrophes.

Dans le cas où la multiplication est effectuée au moyen de légumineuses, celles-ci sont cultivées dans un sol sableux préalablement stérilisé pendant 40 minutes à 120 degrés.

Selon un mode de réalisation encore plus avantageux, ledit complexe multiplié défini ci- dessus est associé à un substrat, notamment constitué d'un mélange de sol contaminé et de sol non contaminé, le rapport sol non contaminé : sol contaminé est compris d'environ 10% (v/v) de sol non contaminé par rapport au total à environ 100% (v/v) de sol non contaminé, préférentiellement d'environ 30 % (v/v) à environ 100% (v/v), plus préférentiellement d'environ 50% (v/v) à environ 100% (v/v), encore plus préférentiellement d'environ 70% (v/v) à environ 100% (v/v) et plus préférentiellement d'environ 90% (v/v) à environ 100% (v/v), en particulier 100%(v/v) de sol non contaminé.

Après multiplication, le complexe est donc associé à un substrat. Ledit substrat est constitué d'un mélange de sol contaminé et de sol non contaminé par les métaux lourds, qui

sont issus d'espaces de sols contaminés et d'espaces de sols non contaminés pour débuter la croissance de la plante à croissance rapide.

La proportion croissante de sol non contaminé présente dans le substrat favorise la croissance aussi bien de la biomasse aérienne que de la biomasse racinaire et ce, quelle que soit la provenance du complexe mycorhizien, d'un sol contaminé ou d'un sol non contaminé (figure 2 A et 2B, figure 3A et 3B, figure 4A et 4B).

Dans un autre mode de réalisation, le complexe endomycorhizien défini ci-dessus est utilisé dans un rapport complexe endomycorhizien multiplié: substrat compris d'environ 1 % (v/v) à environ 10 % (v/v), préférentiellement d'environ 1 % (v/v) à environ 5 % (v/v), et plus préférentiellement d'environ 1 % (v/v).

Dans le cas où le rapport est inférieur à 1%, il n'y a pas assez de champignons endomycorhiziens pour permettre la dépollution.

Dans le cas où le rapport est supérieur à 10%, la quantité de champignons endomycorhiziens à utiliser est trop importante pour être utilisée à grande échelle.

Dans un mode de réalisation avantageux, le complexe endomycorhizien défini ci-dessus est utilisé dans des espaces de sols contaminés par des métaux lourds tels que les stériles miniers, les décharges urbaines, les zones de stockage de déchets industriels.

Par « stérile minier », on désigne tout produit ou dépôt qui résulte de la recherche et de l'exploitation minière ou du traitement du minerai. Ces résidus peuvent être des produits naturels (stériles francs, produits minéralisés non exploitables) ou des produits artificiels, issus des phases de traitement et d'enrichissement du minerai (rejets de laverie) contenant d'éventuels additifs chimiques, minéraux ou organiques, ou générés lors d'une étape de fusion métallurgique (scories).

Par «décharge urbaine », on désigne un lieu public ou privé où l'on déverse débris et déchets divers.

Par « zone de stockage de déchets industriels », il faut entendre des zones dans lesquelles des déchets provenant de l'industrie et contenant des métaux lourds sont entreposés avant élimination.

Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant : au moins un complexe endomycorhizien multiplié, ledit complexe comprenant au moins deux champignons mycorhiziens, choisis notamment parmi les champignons du genre Glomus et préférentiellement G. aggregatum et G.fasciculatum, un substrat, notamment choisi parmi un mélange de sol contaminé et non contaminé,

le rapport sol non contaminé :sol contaminé étant compris d'environ 10% (v/v) de sol non contaminé par rapport au total à environ 100% (v/v) de sol non contaminé, préférentiellement d'environ 30 % (v/v) à environ 100% (v/v), plus préférentiellement d'environ 50% (v/v) à environ 100% (v/v), encore plus préférentiellement d'environ 70% (v/v) à environ 100% (v/v) et plus préférentiellement d'environ 90% (v/v) à environ 100% (v/v), en particulier 100%(v/v) de sol non contaminé.

Dans un mode de réalisation avantageux, le rapport complexe endomycorhizien multiplié:substrat de la composition ci-dessus définie est compris d'environ 1 % (v/v) à environ 10 % (v/v), préférentiellement d'environ 1 % (v/v) à environ 5 % (v/v), et plus préférentiellement d'environ 1 % (v/v).

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds, comprenant une étape d'inoculation de plantes à croissance rapide par un complexe endomycorhizien.

Par « inoculation », on entend la mise en contact des plantes à croissance rapide avec le complexe endomycorhizien pour effectuer une symbiose mycorhizienne entre la plante et les champignons endomycorhiziens.

Dans un mode de réalisation avantageux, le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus, comprend une étape préalable de multiplication du complexe endomycorhizien à l'aide d'une plante hypermycotrophe.

Selon un mode de réalisation avantageux, le complexe endomycorhizien du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus, est constitué d'au moins deux champignons endomycorhiziens prélevés sur des plantes issues de sols contaminés par des métaux lourds.

Dans un autre mode de réalisation, le complexe endomycorhizien du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus, est constitué d'au moins deux champignons endomycorhiziens prélevés sur des plantes issues de sols non contaminés par des métaux lourds.

Dans un mode de réalisation avantageux, le rapport complexe endomycorhizien multiplié:substrat du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus, est compris d'environ 1 % (v/v) à environ 10 % (v/v), préférentiellement d'environ 1 % (v/v) à environ 5 % (v/v), et plus préférentiellement d'environ 1 % (v/v).

Selon un autre mode de réalisation, le substrat du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds, est notamment choisi parmi un mélange de sol contaminé et non contaminé, le rapport sol non contaminé :sol contaminé étant compris d'environ 10% (v/v) de sol non contaminé par rapport au total à environ 100% (v/v) de sol non contaminé, préférentiellement d'environ 30% (v/v) à environ 100% (v/v), plus préférentiellement d'environ 50% (v/v) à environ 100% (v/v), encore plus préférentiellement d'environ 70% (v/v) à environ 100% (v/v) et plus préférentiellement d'environ 90% (v/v) à environ 100% (v/v), en particulier 100% (v/v) de sol non contaminé.

Selon un mode de réalisation avantageux, les métaux lourds traités par le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus, sont choisis parmi le Cu, Pb, Zn, Cr, Ni, Cd, W, As.

Par exemple, dans le cas du cuivre, la teneur en cuivre dans les parties aériennes des plants d'Eucalyptus camaldulensis est significativement augmentée par le traitement avec un complexe endomycorhizien provenant d'un sol contaminé ou non par rapport au témoin non inoculé, permettant ainsi de dépolluer le sol (figures 5A, 5B et 5C).

Dans un mode de réalisation avantageux, les champignons endomycorhiziens du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds, sont notamment choisi parmi les champignons du genre Glomus et préférentiellement G. aggregatum et G. fasciculatum.

Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds défini ci-dessus comporte une étape d'introduction d'un élément unitaire de culture, dans des espaces destinés aux cultures, contenant le complexe endomycorhizien et le substrat, ledit élément unitaire de culture étant une graine de plante à croissance rapide ou une plante à croissance rapide.

L'introduction d'une graine de plante à croissance rapide ou d'une plante à croissance rapide dans des espaces destinés aux cultures, contenant le complexe endomycorhizien de l'invention et le substrat permet d'effectuer l'inoculation de la graine ou de la plante favorisant ainsi la croissance de la biomasse aérienne à partir de la graine ou de la plante.

Dans un mode de réalisation avantageux, le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds, comportant une étape de transfert des plantes à croissance rapide élevées dans le complexe endomycorhizien associé au substrat.

Ainsi, après trois mois de croissance en serre, les graines ou plants inoculés par le complexe de l'invention possèdent une biomasse suffisante pour être transférés dans les espaces à dépolluer.

Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, la graine ou la plante à croissance rapide du procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés par des métaux lourds, est choisie parmi le genre Eucalyptus, Casuarina et acacias australiens en particulier l'Eucalyptus.

Les graines ou plantes à croissance rapide sont utilisées dans le procédé de l'invention de manière à permettre un développement rapide de la biomasse aérienne et par conséquent une teneur en cuivre dans les parties aériennes augmenté d'un facteur d'environ 2 à environ 4 pour les plants inoculés par un complexe issu d'une zone contaminée ou non, en fonction de la proportion de sol non contaminé présente dans le substrat (figures 5A, 5B et 5C).

Dans un autre mode de réalisation, le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés comprend les étapes suivantes : a. prélèvement d'au moins deux champignons endomycorhiziens sur des plantes poussant dans un sol contaminé pour obtenir un complexe endomycorhizien, b. multiplication du complexe endomycorhizien par croissance avec des plantes hypermycotrophes pour obtenir un complexe endomycorhizien multiplié, c. mélange du complexe endomycorhizien multiplié avec un substrat notamment choisi parmi un mélange de sol contaminé et non contaminé, le rapport sol non contaminé :sol contaminé étant compris d'environ 10% (v/v) de sol non contaminé par rapport au total à environ 100% (v/v) de sol non contaminé, préférentiellement d'environ 30 % (v/v) à environ 100% (v/v), plus préférentiellement d'environ 50% (v/v) à environ 100% (v/v), encore plus préférentiellement d'environ 70% (v/v) à environ 100% (v/v) et plus préférentiellement d'environ 90% (v/v) à environ 100% (v/v), en particulier 100%(v/v) de sol non contaminé, et le rapport complexe endomycorhizien multiplié:substrat est compris d'environ 1% (v/v) à environ 10% (v/v), préférentiellement d'environ 1% (v/v) à environ 5% (v/v), et plus préférentiellement d'environ 1% (v/v), d. introduction d'un élément unitaire de culture constitué d'une graine de plante à croissance rapide ou d'une plante à croissance rapide, dans des espaces destinés aux cultures contenant le mélange pour effectuer l'inoculation et faire croître la dite graine ou plante,

e. transfert des plantes à croissance rapide cultivées dans ledit mélange, dans un espace de sol contaminé par des métaux lourds pour la dépollution dudit sol.

Le procédé de l'invention utilisé ici est effectué avec un complexe endomycorhizien issu de sol contaminé.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de dépollution d'espaces de sols contaminés comprend les étapes suivantes : a. prélèvement d'au moins deux champignons endomycorhiziens sur des plantes poussant dans un sol non contaminé pour obtenir un complexe endomycorhizien. b. multiplication du complexe endomycorhizien par croissance avec des plantes hypermycotrophes pour obtenir un complexe endomycorhizien multiplié, c. mélange du complexe endomycorhizien multiplié avec un substrat notamment choisi parmi un mélange de sol contaminé et non contaminé, le rapport sol non contaminé :sol contaminé étant compris d'environ 10% (v/v) de sol non contaminé par rapport au total à environ 100% (v/v) de sol non contaminé, préférentiellement d'environ 30 % (v/v) à environ 100% (v/v), plus préférentiellement d'environ 50% (v/v) à environ 100% (v/v), encore plus préférentiellement d'environ 70% (v/v) à environ 100% (v/v) et plus préférentiellement d'environ 90% (v/v) à environ 100% (v/v), en particulier 100%(v/v) de sol non contaminé, et le rapport complexe endomycorhizien multiplié:substrat est compris d'environ 1% (v/v) à environ 10% (v/v), préférentiellement d'environ 1% (v/v) à environ 5% (v/v), et plus préférentiellement d'environ 1% (v/v). d. introduction d'un élément unitaire de culture constitué d'une graine de plante à croissance rapide ou d'une plante à croissance rapide, dans des espaces destinés aux cultures contenant le mélange pour effectuer l'inoculation et faire croître la dite graine ou plante. e. transfert des plantes à croissance rapide cultivées dans ledit mélange, dans un espace de sol contaminé par des métaux lourds pour la dépollution dudit sol.

Le procédé de l'invention utilisé ici est effectué à partir d'un complexe endomycorhizien issu de sol non contaminé.

Description des figures.

Les figures IA, IB, IC et ID représentent l'effet de la teneur du sol en cuivre sur la croissance et la nutrition minérale de Eucalyptus camaldulensis après 4 mois de plantation en serre :

Figure IA : poids sec de biomasse aérienne en g de matière sèche (ordonnée) en fonction de la teneur en Cu en mg/kg (abscisse).

Figure IB : poids sec de biomasse racinaire en g de matière sèche (ordonnée) en fonction de la teneur en Cu en mg/kg (abscisse).

Figure IC : Teneur en P des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction de la teneur en Cu en mg/kg (abscisse), MS = Matière sèche.

Figure ID : Teneur en N des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction de la teneur en Cu en mg/kg (abscisse), MS = Matière sèche.

Les figures 2A, 2B, 2C et 2D représentent l'effet de l'inoculation avec un complexe mycorhizien issu de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur la croissance des plants à' E. camaldulensis et leur nutrition minérale après 3 mois de croissance en serre sur un sol non contaminé. NI : Non inoculé (témoin).

Figure 2A : poids sec de biomasse aérienne en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 2B : poids sec de biomasse racinaire en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 2C : Teneur en P des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Figure 2D : Teneur en N des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Pour chaque type de sol et pour chaque paramètre mesuré, les colonnes indexées par une même lettre représentent des valeurs qui ne sont pas significativement différentes d'après le test « t » de Student (p < 0,05).

Les figures 3A, 3B, 3C et 3D représentent l'effet de l'inoculation avec un complexe mycorhizien issu de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur la croissance des plants à' E. camaldulensis et leur nutrition minérale après 3 mois de croissance en serre sur un sol avec un rapport sol contaminé / sol non contaminés = 1/1 ; v/v. NI : Non inoculé (témoin).

Figure 3A : poids sec de biomasse aérienne en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 3B : poids sec de biomasse racinaire en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 3C : Teneur en P des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Figure 3D : Teneur en N des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Pour chaque type de sol et pour chaque paramètre mesuré, les colonnes indexées par une même lettre représentent des valeurs qui ne sont pas significativement différentes d'après le test « t » de Student (p < 0,05).

Les figures 4A, 4B, 4C et 4D représentent l'effet de l'inoculation avec un complexe mycorhizien issu de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur la croissance des plants à' E. camaldulensis et leur nutrition minérale après 3 mois de croissance en serre sur un sol avec un rapport sol contaminé / sol non contaminés = 2/1 ; v/v/. NI : Non inoculé (témoin).

Figure 4A : poids sec de biomasse aérienne en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 4B : poids sec de biomasse racinaire en g (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse).

Figure 4C : Teneur en P des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Figure 4D : Teneur en N des feuilles en mg/g MS (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), MS = Matière sèche.

Pour chaque type de sol et pour chaque paramètre mesuré, les colonnes indexées par une même lettre représentent des valeurs qui ne sont pas significativement différentes d'après le test « t » de Student (p < 0,05).

Les figures 5A, 5B et 5C représentent les teneurs en cuivre (exprimées en μg par plant) dans les parties aériennes des plants à'E. camaldulensis inoculés ou non par un complexe mycorhizien issu de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) dans les différents traitements de sol après 3 mois de plantation en serre sur différents sols : NI : Non inoculé (témoin).

Figure 5 A : Teneur en Cu (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé.

Figure 5B : Teneur en Cu (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol avec un rapport sol contaminé / sol non contaminés = 1/1 ; v/v.

Figure 5C : Teneur en Cu (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse) obtenue sur un sol avec un rapport sol contaminé / sol non contaminés = 2/1 ; v/v/.

Les figures 6A, 6B et 6C représentent l'évolution de la croissance en hauteur des plants de E. camaldulensis au cours de l'expérience en pot en fonction de l'origine du complexe mycorhizien issu de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) et du taux de contamination des sols par le cuivre après différents temps de croissance. NI : Non inoculé (témoin).

Figure 6A : Hauteur en cm des plants (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé et non contaminé, après 1 mois de croissance.

Figure 6B : Hauteur en cm des plants (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé et non contaminé, après 2 mois de croissance.

Figure 6C : Hauteur en cm des plants (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé et non contaminé, après 3 mois de croissance.

Les figures 7A et 7B représentent l'effet de l'inoculation par les complexes mycorhiziens issus de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur la croissance des parties aériennes et racinaires des plants de E. camaldulensis après 3 mois de croissance sur le sol contaminé non stérilisé et sur le sol non contaminé non stérilisé. NI : Non inoculé (témoin).

Figure 7A : Biomasse aérienne (g de poids sec) des plants (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé et non contaminé, après 3 mois de croissance.

Figure 7B : Biomasse racinaire (g de poids sec) des plants (ordonnée) en fonction du type d'inoculum (abscisse), obtenue sur un sol non contaminé et non contaminé, après 3 mois de croissance.

EXEMPLES :

Exemple 1 : production des complexes endomycorhiziens (inocula fongiques) de la zone contaminée et non contaminée

Les travaux ont été réalisés dans une mine de cuivre abandonnée située au Nord-Ouest de la ville de Marrakech. Des parcelles ont été matérialisées dans 4 zones comportant des teneurs en cuivre croissantes, allant de 104,9 mg kg ^"1 (zone non contaminée selon la norme AFNOR NF U 44-041) jusqu'à 1075,2 mg kg ^"1 .

Dans chaque parcelle, les espèces végétales ont été répertoriées et leurs systèmes racinaires ainsi que le sol conditionné par chaque espèce ont été échantillonnés puis conservés à 4°C. Les principales espèces identifiées étaient les suivantes : Haloxylon scoparium, Atriplex colerei, Ononis ssp., Hyparrhenia hirta et Cynodon dactylon. Le nombre de spores et l'intensité de mycorhization ont été déterminés pour chaque espèce dans chaque parcelle. Puis les racines prélevées dans les différents sites (sites contaminés ou non) ont été rassemblées et inoculées à des plants de maïs dans des pots remplis par un sol sableux non pollué et désinfecté (120 ⁰ C, 20 min).

Après 4 mois de croissance en serre, les plants de maïs ont été dépotés. Leur système racinaire a ensuite été soigneusement lavé puis découpé en fragments de 1 cm. Deux types de complexes endomycorhiziens ont ainsi été produits :

(i) complexe endomycorhizien (inoculum fongique) issu de la zone non contaminée en Cu (ZNC) et (ii) complexe endomycorhizien (inoculum fongique) issu de la zone contaminée en Cu (ZC).

Exemple 2 : Préparation des sols et inoculation des complexes endomycorhiziens à des plants <¥ Eucalyptus camaldulensis en serre

Les 2 types de sol (contaminé ou non) ont ensuite été prélevés dans les différents sites étudiés puis désinfectés (120 ⁰ C, 60 min). Le sol contaminé désinfecté a ensuite été dilué avec le sol non contaminé selon les rapports (sol contaminé / sol non contaminés) suivants : (0/1 ; v/v) (témoin), (1/1 ; v/v) et (2/1 ; v/v/) avec des teneurs en Cu de 104,9 mg kg ^"1 (témoin), 356 mg kg ^"1 et 439 mg kg ^"1 , respectivement.

Les différents mélanges ont ensuite été répartis dans des pots de 1 litre où ont été plantés de jeunes semis de Eucalyptus camaldulensis inoculé ou non (témoin) par l'un ou l'autre des inocula fongiques, à raison d'une plantule par pot.

Pour chaque mélange de sol, il y avait donc 3 traitements : NI (non inoculé), ZNC, (inoculé par le complexe endomycorhizien issu de la zone non contaminée) et ZC (inoculé par le complexe endomycorhizien issu de la zone contaminée).

Exemple 3 : Transfert des plants élevés en serre en milieu naturel contaminé

Les plants d'Eucalyptus ayant été élevés dans le sol non contaminé et inoculés ou non par les inocula fongiques issus de la zone contaminée ou non ont été transférés dans des pots de 20 litres remplis par le sol prélevé dans la zone contaminée. Les pots ont été ensuite placés en conditions in situ. La croissance en hauteur des plants a été mesurée mensuellement.

Après 3 mois de plantation en serre, les plants ont été dépotés et leurs biomasses (bio masse aérienne et racinaire) ont été déterminées.

Résultats :

1) Effet de la teneur en cuivre sur la croissance et la nutrition minérale d'Eucalyptus camaldulensis après 4 mois de plantation en serre.

Après 4 mois de croissance en serre, les plants d'Eucalyptus ont été dépotés, leurs biomasses (aérienne et racinaire) ont été déterminées ainsi que les teneurs en P, N et Cu des feuilles. Les taux de mycorhization ont également été calculés.

Au cours de la phase d'élevage en serre (4 mois), l'augmentation des teneurs en cuivre a significativement inhibé la croissance des plants tant au niveau de la biomasse aérienne que racinaire ainsi que leur nutrition minérale (N, P) (Fig. 1).

2) Effet de l'inoculation avec les différents complexes endomycorhiziens

L'inoculation par les complexes endomycorhiziens issus de la zone contaminée ou non améliore significativement la croissance des plants et limite l'effet toxique du cuivre sur le développement des plants d'E. camaldulensis ainsi que leur nutrition minérale dans les différents sols (Fig. 2, 3 et 4). Il est à noter également que l'inoculum ZC est significativement plus performant que l'inoculum ZNC quant à son impact sur la croissance des parties aériennes quel que soit le type de sol (Fig. 2, 3 et 4).

3) Teneur en cuivre dans les parties aériennes d'Eucalyptus camaldulensis après 4 mois inoculés ou non par les complexes endomycorhiziens (ZC et ZNC).

Les teneurs en Cuivre des parties aériennes par plant ont également été mesurées dans chaque traitement de sol (Fig. 5).

Les résultats montrent que l'inoculation endomycorhizienne améliore signifïcativement l'absorption du cuivre par E. camaldulensis avec une tendance supérieure pour le traitement utilisant le complexe mycorhizien issu du sol contaminé.

4) Evolution de la croissance en hauteur des plants de E. camaldulensis au cours de l'expérience en pot.

Pour l'expérience visant à simuler les conditions naturelles de plantation (transfert des plants mycorhizés (ou non) dans des pots de 20 litres remplis par le sol non stérilisé et non contaminé, [Cu] = 104,9 mg kg ^"1 , ou non stérilisé et contaminé, [Cu] = 607,6 mg kg ^"1 ), les résultats montrent que l'inoculation par les complexes fongiques ZC et ZNC, ont signifïcativement stimulé la croissance en hauteur des plants de E. camaldulensis dans le sol contaminé après 3 mois de plantation (Fig. 6).

5) Effet de l'inoculation par les complexes mycorhiziens issus de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur la croissance des parties aériennes et racinaires des plants de E. camaldulensis.

Pour la croissance des parties aériennes et racinaires dans les sols non stérilisés et contaminés ou non par le cuivre, l'effet négatif du métal lourd sur le développement des plants d'E. camaldulensis est retrouvé (Fig. 7).

Dans le sol contaminé, l'inoculation des 2 complexes a augmenté signifïcativement la croissance des plants après 3 mois de culture (Fig. 7).

6) Effet de l'inoculation par les complexes mycorhiziens issus de la zone contaminée (ZC) ou non contaminée (ZNC) sur l'accumulation du Cuivre dans des plants transférés élevés en pots de 20 litres en serre dans les sols non stérilisés et contaminés ou non par le cuivre (simulation de transplantation).

Les résultats sont indiqués dans le tableau 3 et 4 ci-dessous :

Tableau 3. Mesures d'accumulation du Cuivre (μg par plant) dans les plants d'Eucalyptus camaldulensis inoculés ou non par les différents complexes endomycorhiziens après 3 mois de culture dans des sols non contaminés (ZNC) ou contaminés (ZC). PA : parties aériennes ; PR : Partie racinaire ; PT : Poids sec total.

: pour chaque origine de sol, les valeurs suivies par une même lettre ne sont pas signifïcativement différentes d'après le test de Newman & Keuls (p < 0,05)

Tableau 4 : Calcul du coefficient d'enrichissement (CE) et du facteur d'accumulation (FA) du cuivre dans les différents traitements

: CE - [CU]PA / [Cu]sol ; : FAi - [Cu]piant mycorrhizé / [Cu]p _lan t non mycorhizé (pour une même origine de SOl) ; ⁽³⁾ FA ₂ = [Copiant mycorrhizé / [Cu] _P l _an t non mycorhizé ZNC D'après Zu et al.( Zu, Y.Q., Li, Y.,

Chen, H.Y., Qin, L. & Schwartz, C. (2005). Hyperaccumulation of Pb, Zn, and Cd in herbaceous grown on lead-zinc mining area in Yunnan, China. Environment International, 31 :

755-762.).

^ : pour chaque origine de sol, les valeurs suivies par une même lettre ne sont pas signifïcativement différentes d'après le test de Newman & Keuls (p < 0,05)

Conclusion :

L'inoculation de complexes de champignons mycorhiziens à arbuscules de l'invention possède les avantages suivants: - Dans des sols stérilisés et contaminés ou non par un métal lourd tel que le cuivre

o elle améliore la tolérance des plants d'E. camaldulensis à des teneurs croissantes en cuivre, o elle permet aux plants d'E. camaldulensis d'avoir une croissance et une nutrition minérale sensiblement égales à celles enregistrées chez les plants évoluant dans un sol non contaminé, o elle permet aux plants d'E. camaldulensis de fixer une quantité plus importante de cuivre dans ses parties aériennes, - Dans des sols non stérilisés simulant une plantation naturelle de d'E. camaldulensis o elle améliore la croissance des plants, o elle permet aux plants de recouvrer une croissance identique à celle mesurée dans un sol non contaminé, o elle améliore d'un facteur d'environ 10 le coefficient d'enrichissement, c'est-à-dire le rapport de la quantité de Cu présente dans les parties aériennes de la plante sur la quantité de Cu présente dans le sol.