DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a un método para predecir la respuesta al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino en pacientes con cáncer, preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico, donde dicho método se basa en la detección de la presencia de metilación del gen IGFBP-3 El método de la invención puede ser cuantitativo o sem ¡cuantitativo. La presente invención también se refiere a una sonda para la detección cuantitativa de la metilación del gen IGFBP-3. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo del tratamiento del cáncer. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La terapia combinada de radioterapia y quimioterapia en un paciente con cáncer permite combinar los beneficios de ambas técnicas y ha conseguido mejorar la supervivencia en diversos tipos de cáncer, por ejemplo, cáncer de pulmón, sin embargo, la toxicidad se ve aumentada con dicho tratamiento (Moreno-Jiménez M et al. Rev Med Univ Navarra 51 (4): 13-33).

En quimioterapia, el cisplatino, también denominado c/s-diaminodicloroplatino (II) (CDDP), es el tratamiento de elección para diversos tipos de cánceres, entre ellos, el cáncer de pulmón no microcítico. El cisplatino se puede administrar en terapia combinada con radioterapia ya que estudios multicéntricos han demostrado mejor respuesta global (Curran WJ, Jr. et al. 201 1 Journal of the National Cáncer Institute 103: 1452-60).

Se ha descrito que los agentes quimioterápicos basados en platinos, entre los que se encuentra el cisplatino, metilan de novo el promotor de ciertos genes, alterando así su expresión. Entre dichos genes se encuentra el gen que codifica para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP-3) (Ibáñez de Cáceres I. et al. 2010 Oncogene 29: 1681 -90). La hipermeíüación de la región 5 ^' del promotor del gen IGFBP-3, es un proceso epigenético que acontece con elevada frecuencia en el cáncer humano (40%- 60%) (Chang YS et al. 2002 Clin Cáncer Res 8:3796-802; Ibáñez de Cáceres I et al. 2010 Oncogene 29:1681 -90; Torng PL et al. 2009 Mol Cáncer 8: 120). La metilación del gen IGFBP-3 puede detectarse a través del uso de diferentes técnicas, como por ejemplo, secuenciación con bisulfito y el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para metilación (MSP) (Ibáñez de Cáceres I et al. 2010 Oncogene 29: 1681 -90; Tomii K et al. 2007 Int J Cáncer 120:566-73; Ibáñez de Cáceres I et al. 2006 Cáncer Res 66:5021 -8).

En la actualidad existe una necesidad clínica de conocer si un paciente va a responder o no a un tratamiento combinado de quimioterapia y radioterapia para poder adaptar el tratamiento a cada caso de manera individual, para evitar así los efectos secundarios asociados a la toxicidad de la terapia combinada y evitar el sobretratamiento en pacientes que no vayan a responder al mismo.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar un método de predicción de la respuesta de un sujeto al tratamiento con radioterapia combinado con quimioterapia basada en platinos.

En la presente invención se demuestra que la detección y/o cuantificación de la región promotora del gen IGFBP-3, en concreto de la región comprendida entre las posiciones -584 y -492 del promotor (posiciones numeradas desde el ATG iniciador), es útil para la predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en platino, así como para diseñar un tratamiento individualizado del sujeto. El método de la invención puede realizarse mediante la utilización de parejas de cebadores que detecten la presencia de metilación y/o parejas de cebadores que detecten la ausencia de metilación, lo que en la presente invención se denomina detección "semicuantitativa". Además, también puede realizarse mediante el uso de una sonda, lo que permite una detección" cuantitativa". Los estudios que demuestran la invención se llevaron a cabo tanto en líneas celulares como en muestras quirúrgicas de pacientes Además, los inventores han demostrado que el uso de una sonda que detecta las posiciones -532 y -526 del promotor del gen IGFBP-3, permite la cuantificación del grado de metilación de dicho gen. El uso de la sonda descrita en la invención permite predecir si un sujeto que padecer cáncer va a responder a un tratamiento combinado de quimioterapia basada en platinos y de radioterapia con mayor sensibilidad y eficacia.

Por lo aquí descrito, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, que comprende detectar y/o cuantificar en una muestra biológica de dicho sujeto la metilación del promotor del gen IGFBP-3.

En la presente invención, preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, gliomas y cáncer de mama. Más preferiblemente el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

El término "cáncer de pulmón no microcítico", "cáncer no microcítico pulmonar", "carcinoma no microcítico de pulmón" (CNMP), "carcinoma de pulmón no microcítico" (CPNM), o cáncer pulmonar de células no pequeñas (en inglés "non-small cell lung cáncer", NSCLC) se refiere a un tipo de cáncer o tumor de pulmón que comprende, según clasificación histológica, el subtipo carcinoma escamoso o epidermoide, adenocarcinoma, adenoescamoso, carcinoma sarcomatoide, y carcinoma de células grandes. Se entiende por "tratamiento" al conjunto de medios que se emplean para curar o aliviar una enfermedad.

En la presente invención se entiende como "tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino" a aquel tratamiento secuencial que comprende primeramente un tratamiento de quimioterapia basada en cisplatino y posteriormente un tratamiento de radioterapia según los criterios particulares de cada caso y conocidos por el experto en la materia.

La presente invención la quimioterapia también podría estar basada en otros fármacos derivados del platino, como por ejemplo, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino y picoplatino. Se entiende por "metilacion del promotor" la presencia de grupos metilo en las posiciones 5' de las citosinas de la isla CpG previas y contiguas a una guanina (es decir, de un dinucleótido CG) del promotor de un gen.

Se entiende por "hipermetilacion" al aumento de la metilacion de un promotor con respecto a valores considerados normales por el experto en la materia. Se entiende por "hipometilación" a la disminución de la metilacion de un promotor con respecto a valores considerados normales por el experto en la materia.

En la presente invención se entiendo como "isla CpG" aquella región del promotor de un gen que contiene al menos 500 pares de bases, una proporción de dinucleótidos CG (citosina-guanina) mayor del 50%.

En la presente invención se entiende por "promotor" o "región promotora", a una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción de un gen determinado, en la presente invención se trata del gen IGFBP-3.

En la presente invención se define el gen IGFBP-3 (o IGFBP3) como el gen que codifica para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina. Dicho gen {Entrez ID: 3486) está localizado en la región cromosómica 7p12.3 y codifica para dos transcritos alternativos que comparten el mismo promotor, NM_000598.4 y NM_001013398.1. La isla CpG del gen IGFBP-3 se encuentra localizada en posición -518/+744 respecto el primer exón y engloba 688 pares de bases por encima del sitio ATG, incluyendo el promotor descrito de! gen (SEQ ID NO: 1 ).

La detección y/o cuantificación en la presente invención se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia, como por ejemplo, pero sin limitarnos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR específica de metilación (MSP), MSP cuantitativa (QMSP o qMSP) o secuenciación. Previamente, el ADN puede haber sido sometido a una reacción con bisulfito previo a su detección y/o cuantificación. El término "muestra biológica" incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica comprende ácido desoxirribonucleico (ADN). Dicho ADN puede o no estar metilado y puede presentar distintos grados de metilación.

En la presente invención el término "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente.

En la presente invención se ha demostrado que la presencia de metilación en el promotor del gen IGFBP-3 es indicativa de que el tratamiento a administrar es radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, mientras que la ausencia de metilación en dicho promotor es indicativa de que la terapia a administrar es quimioterapia basada en cisplatino únicamente. Por lo tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para diseñar un tratamiento individualizado para un sujeto que padece cáncer que comprende detectar y/o cuantificar en una muestra biológica de dicho sujeto la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en el que la presencia de metilación en dicho promotor es indicativa de que el tratamiento a administrar es radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino.

El término "in vitro" se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto. Una realización preferida del primer y del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor de gen IGFBP-3 se realiza en la región del promotor comprendida entre las posiciones -584 y -492 del promotor ambas posiciones incluidas (SEQ ID NO: 2).

En la presente invención la localización de las posiciones -584 y -492 del promotor del gen IGFBP-3 se realizan desde el codón ATG iniciador, conforme a la forma realizada por cualquier experto en la materia.

Otra realización aún más preferida del primer y del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde la detección y/o la cuantificación de la metilación del promotor de gen IGFBP-3 se realiza en las posiciones -532 y- 526 desde el codón ATG iniciador. Es decir, estas posiciones corresponden a las posiciones 157 y 163 de la SEQ ID NO: 1 y a las posiciones 53 y 59 de la SEQ ID NO:2. Las posiciones -532 y-526 son citosinas comprendidas en dinucleótidos CG. Otra realización aún más preferida del primer y del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa. Preferiblemente, la reacción en cadena de la polimerasa comprende el empleo de las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 (cebador sentido, de secuencia 5'-ttttacgaggtatatacgaatgc-3') y SEQ ID NO: 4 (cebador antisentido, de secuencia 5'-tctcgaaataaaatctccctacg-3') (cebadores para la detección de metilación) y/o SEQ ID NO: 5 (cebador sentido, de secuencia 5'-agaaagttttatgaggtatatatga-3') y SEQ ID NO: 6 (cebador antisentido, de secuencia 5'-cactctcaaaataaaatctccct-3') (cebadores para la detección de ausencia de metilación). Preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa comprende el empleo de las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. El término "cebador" (también denominado "oligo"), como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa. Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).

Como se ha indicado anteriormente, el método de la invención puede ser realizado mediante también el uso de una sonda, de modo que sería un método cuantitativo, mientras que si no se utilizara una sonda y se utilizaran sólo los cebadores sería un método semicuantitativo.

Por lo tanto, otra realización aún más preferida del primer y del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde además se emplea una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 (5'-ccgatatcgaaaaaact-3'). Preferiblemente, la sonda consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, la sonda comprende en su extremo amino terminal y/o en su extremo carboxilo terminal un fluoróforo, por ejemplo FAM™, o VIC®. En una realización aún más preferida, en el extremo amino terminal la sonda comprende el fluoróforo 6- FAM™ y en el carboxilo terminal un "minor groove binder" (MGB) sin fluorescencia (MGB-NFQ).

En la presente invención nos referiremos a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 como a la "sonda de la invención". La sonda de la invención se puede producir por los métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede producirse a partir de síntesis química. La sonda de la invención se une al ADN del promotor del gen IGFBP-3 cuando éste está metilado.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para la predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a. aislamiento de ácido desoxirribonucleico en una muestra biológica aislada de un sujeto;

b. modificación del ácido desoxirribonucleico aislado mediante bisulfito sódico;

c. hibridación con cebadores específicos;

d. amplificación de una secuencia comprendida entre los cebadores descritos en el paso (c);

e. detección de la metilación del promotor del gen IGFBP-3;

f. comparar la metilación del paso (d) con niveles estándar;

g. encontrar diferencias significativas en la comparación del paso (f); h. asociar las diferencias significativas del paso (g) a una metilación o desmetilación del promotor del gen IGFBP-3;

i. asociar la presencia de metilación del paso (h) a una respuesta favorable al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino; o asociar la desmetilación del paso (h) a una respuesta a tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino desfavorable.

En la presente invención el aislamiento del ADN y la modificación del ácido desoxirribonucleico aislado mediante bisulfito sódico se realiza por los métodos conocidos por el experto en la materia.

El término "niveles estándar" tal como se entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a los niveles de metilación obtenidos de una muestra de referencia que presente un grado de metilación conocido. En la presente invención "diferencia significativa" se refiere a que existen diferencia estadísticas entre los valores comparados, siendo la probabilidad estadística al menos mayor que 0,05 (p>0,05) o mayor que 0.005 (p>0.005) y obteniéndose ésta según el test estadístico aplicable a cada caso.

En la presente invención los términos "desmetilación", "ausencia de metilación" y "falta de metilación" se utilizan indistintamente.

En la presente invención se considera "favorable" a un aumento de la supervivencia del individuo tras el tratamiento. Se considera "desfavorable" a una disminución de la supervivencia del individuo tras el tratamiento.

Una realización preferida del método tercero de la invención, se refiere al método donde la muestra de referencia y las muestras de estudio han sido previamente normalizadas antes de la comparación.

Se entiende por "normalización" la utilización de una muestra control que sirva para eliminar variaciones experimentales entre las distintas muestras. Una realización preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde los cebadores del paso (c) son las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Una realización aún más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde los cebadores del paso (c) son SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

Otra realización aún más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde además en el paso (c) se incluye una sonda y en el paso (e) se cuantifica la metilación. Preferiblemente la sonda comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, la sonda consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7. Otra realización aún más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, glioma o cáncer de mama. Preferiblemente, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

Una realización preferida del primer, del segundo y del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar, saliva, orina o fluido ascítico.

Otra realización preferida del primer, del segundo y del tercer aspecto de la invención se refiere al método donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

Una realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere a la sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

Otra realización aún más preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere a la sonda que además comprende en su extremo amino terminal y/o en su extremo carboxilo terminal un fluoróforo, por ejemplo FAM™, o VIC®. En una realización aún más preferida, en el extremo amino terminal la sonda comprende el fluoróforo 6-FAM™ y en el carboxilo terminal un "minor groove binder" (MGB) sin fluorescencia (MGB-NFQ).

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso in vitro de la sonda de la invención para la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en una muestra biológica de un sujeto. Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso in vitro de la sonda de la invención para determinar la respuesta de un sujeto al tratamiento de radioterapia combinado con quimioterapia basada en cisplatino. Una realización preferida del quinto y del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde el sujeto padece cáncer. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, gliomas y cáncer de mama. Más preferiblemente, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

Otra realización preferida del quinto y del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar, saliva, orina o fluido ascítico.

Otra realización preferida del quinto y del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende la sonda del cuarto aspecto de la invención.

Una realización preferida del séptimo aspecto de la invención se refiere al kit que además comprende cebadores. Más preferiblemente los cebadores son las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

El kit además puede comprender al menos una ADN polimerasa, una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo. Además el kit puede comprender una mezcla de deoxinucleótidos tri-fosfato (dNTPs), una mezcla de nucleótidos tri-fosfato (NTPs), deoxiribonucleasa (DNasa), inhibidores de la ribonucleasa (RNasa), Dithiothreitol (DTT), pirofosfatasa inorgánica (PPi) y los tampones necesarios para las enzimas proporcionadas en el kit. En la presente invención la sonda o los cebadores pueden estar situados en un soporte sólido, por ejemplo, pero sin limitarse, cristal, plástico, tubos, placas multipocillo, membranas, o cualquier otro soporte conocido.

Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso in vitro del kit del séptimo aspecto de la invención para determinar y/o cuantificar de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en una muestra biológica de un sujeto. Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso in vitro del kit del séptimo aspecto de la invención para predecir la respuesta de un sujeto al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino.

Una realización preferida del octavo y del noveno aspecto de la invención se refiera al uso donde el sujeto padece cáncer. Preferiblemente el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, glioma o cáncer de mama. Más preferiblemente el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico. Otra realización preferida del octavo y del noveno aspecto de la invención se refiere al uso donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar, saliva, orina o fluido ascítico. Otra realización preferida del octavo y del noveno aspecto de la invención se refiera al uso donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

Los términos "secuencia de nucleótidos", "secuencia nucleotídica", "polinucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos. Dichos nucleótidos pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1 muestra el estado de metilación de cada posición CpG analizada en la isla CpG que engloba el promotor del gen IGFBP-3 y su frecuencia de metilación en ADN tumoral o no neoplásico. Se indica codón de inicio de la transcripción (ATG) y caja TATA (TATA). A, ADN tumoral; B, ADN de tejido control no neoplásico. Las flechas muestran la ubicación de los cebadores y de la sonda de la invención que detecta sólo presencia de ADN metilado. Círculos negros: frecuencia de metilación alta, >30%; círculos grises: frecuencia de metilación media, 15-30%; círculos blancos: frecuencia de metilación baja, 0- 15%. Fig. 2 representa las curvas cuantitativas estándar para los genes IGFBP-3 (A) y β-actina (B) a partir de cuatro diluciones seriadas de ADN modificado por bisulfito (3ng- 0,003ng). El producto amplificado se detecta de modo cuantitativo a través del uso de la sonda de la invención, que genera una señal de fluorescencia, que permite cuantificar los niveles del producto metilado amplificado por PCR para una región del promotor de gen IGFBP-3 y nos permiten la amplificación y por tanto la cuantificación de los niveles de ADN metilado que contiene la muestra que analicemos para el gen IGFBP-3, hasta una sensibilidad de 1 alelo metilado en un fondo de 10.000 alelos no metilados (sensibilidad 1 :10.000). Los datos para cada muestra se normalizan con los obtenidos de la interpolación en la curva de β -actina. "aprox", aproximado; "cel" célula; CT, número de ciclo de corte del umbral ("cycle threshold").

Fig. 3 curvas estándar para la identificación del gen IGFBP-3 metilado. Se muestra la linealidad esperada entre las curvas estándar para la identificación del gen IGFBP-3 metilado las curvas estándar para el gen de referencia β - actina, y la interpolación de los ADN control positivo (SW780 y HT29) (A) y control negativo (SKOV3 y PANC1 ) (B). A, interpolación de las líneas celulares controles positivas (SW780 y HT29) en las curvas respectivas para el gen IGFBP-3 metilado y para β -actina como control endógeno no metilado, mientras que en (B) se observa como las líneas control negativas (SKOV3 de cáncer de mama y PANC1 de cáncer de páncreas), sólo interpolan en la curva para β -actina como control endógeno no metilado. Estos resultados confirman la especificidad de la metodología de la invención.

Fig. 4 comparación de la sensibilidad y la especificidad de la detección cuantitativa de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 mediante la sonda de la invención mediante QMSP frente a la tradicional MSP en una cohorte de muestras de pacientes con CPNM conservadas en parafina. Se muestra un ejemplo de un gel de la técnica MSP completo con controles positivos (IVD), negativos (C-) y agua, en el que se confirma que los pacientes 2, 4 y 23 están metilados, y que la metilación en los pacientes 15 y 27 no se detecta por esta técnica, mientras que por QMSP fuimos capaces de detectar presencia de metilación en estos pacientes.

Fig. 5 muestra los niveles de metilación de IGFBP-3 en una segunda cohorte de 40 pacientes y diez muestras no neoplásicas, y las curvas Kaplan Meier de supervivencia global representada en días en pacientes con IGFBP-3 no metilada sometidos a un tratamiento con quimioterapia o con quimioterapia- radioterapia. (A), Niveles de metilación de IGFBP-3 en una segunda cohorte de 40 pacientes y diez muestras no neoplásicas, a través de los ratios IGFBP- 3/ACTB NSCLC-M: muestras de cáncer de pulmón no microcítico consideradas metiladas para IGFBP-3; NSCLC-U: muestras de cáncer de pulmón no microcítico consideradas no metiladas para IGFBP-3. (B) Curvas de Kaplan Meier comparando el estado de metilación de IGFBP-3 no metilado con supervivencia acumulada en días en 40 pacientes con CPNM sometidos a un tratamiento con quimioterapia o con el tratamiento combinado de quimioterapia- radioterapia. Censurados son los pacientes cuya supervivencia no se han podido seguir más allá del tiempo indicado para la censura. "Radioterapia +" significa tratamiento con radioterapia; "Radioterapia -", significa que no hay tratamiento con radioterapia.

EJEMPLOS

Ensayo cuantitativo de metilación:

Para valorar el estado de metilación del gen IGFBP-3 en cada muestra, se procedió en primer lugar a la modificación de la secuencia del ADN genómico a través del uso combinado de bisulfito sódico e hidroquinona. El ADN modificado se amplificó a través de una PCR a tiempo real basada en fluorescencia según protocolo descrito previamente (Harden SV et al. 2003 Clin Cáncer Res 8: 1370-5). Los oligos que se utilizaron en la presente invención fueron descritos anteriormente (Ibáñez de Cáceres I et al. 2010 Oncogene 29: 1681 -1690). La utilización de estos oligos (también denominados "cebadores" en la presente invención) permite identificar la presencia de metilación en la zona promotora del gen IGFBP-3 utilizando la técnica de PCR específica de metilación (MSP), que es una técnica sem ¡cuantitativa. Los cebadores son la pareja SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 que detecta metilación; y la pareja SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que detecta ausencia de metilación.

La utilización de la sonda de la invención (SEQ ID NO: 7) permitió la cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3, mediante la técnica MSP cuantitativa (QMSP).

Se realizaron numerosos ensayos en un panel de 26 líneas celulares de cáncer humano, modificando el ADN, eliminando la presencia de citosinas no metiladas, y su sustitución por uracilos seguido de su amplificación y secuenciación del área de ADN comprendido entre ambos oligos, con la finalidad de identificar las posiciones de los nucleotidos CpG que más frecuentemente y de manera inalterada y constante se muestran metiladas cuando el gen está inactivado. De esta manera se pudo identificar la región específica de metilación para ADN modificado comprendida entre las posiciones -584 y -492 del promotor del gen IGFBP-3 y seleccionar el mareaje adecuado en los extremos 5 ^' y 3 ^' , para producir una sonda que hiciera efectiva la técnica. El producto amplificado por esta técnica (denominada "QMSP- IGFBP-3"), se detecta de modo cuantitativo a través del uso de la sonda específica de la presente invención (SEQ ID NO: 7), marcada con el fluorocromo FAM™, en su extremo 5 ^' y con un "Minor Groove Binder" (MGB) sin fluorescencia (NFQ) en el extremo 3 ^' (6FAM5'-CCGATATCGAAAAAACT- 3 ^' MGB-NFQ). Tras su unión, esta sonda generó una señal de fluorescencia, que permitió cuantificar los niveles del producto metilado amplificado por PCR. La cuantificación del grado de metilación del gen IGFBP-3 depende exclusivamente de la especificidad de la sonda de la invención y no de la técnica QMSP en sí misma. La técnica QMSP descrita en la presente invención para detectar la metilación del gen IGFBP-3 se denominó "QMSP-/GFBP-3".

Por lo tanto, la técnica Q SP-/GF6P-3 de la presente invención, se basa en la amplificación con fluorescencia de ADN modificado que permite cuantificar la metilación del promotor de IGFBP-3 en muestras de ADN modificadas por bisulfito. Los niveles relativos de ADN con el promotor del gen IGFBP-3 metilado ("niveles relativos de metilación") en cada muestra, se determinaron como un ratio entre los valores obtenidos de la amplificación de la región seleccionada del promotor del gen IGFBP-3 y los obtenidos de la amplificación del gen β-actina como referencia endógena. El ratio se multiplicó por 1000 para facilitar su tabulación (gen de interés/gen referencia x 1000), obteniéndose un cociente de metilación (MQ) que representa el nivel relativo de metilación de la muestra de estudio, tal como se ha descrito para la valoración en otros genes (Eads CA et al. 2000 Nucleic Acid Res 28:E32; Eads CA et al. 1999 Cáncer Res 59:2302-6). En nuestro análisis de metilación, las amplificaciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios en el sistema StepOnePlus™ de detección de amplicones de la casa Applied Biosystems con un volumen final de 25 μΙ en cada pocilio, conteniendo;

600 n de cada cebador para la amplificación de ADN modificado y metilado para el gen IGFBP-3; 200 nM de sonda específica; 2X TaqMan Universal Master Mix II, esta reacción contiene AmpliTaq Gold® ADN Polimerasa, Uracil- N glycosilasa (UNG), dNTPs con dUTP y ROX™ como referente junto con un buffer optimizado, todo ello de la casa Applied Biosystems; y ADN modificado, donde se utilizan 3μΙ de ADN tratado para cada reacción de QMSP. Las condiciones de la reacción de la QMSP fueron las siguientes: 1 ciclo de 2 minutos a 50°C; 1 ciclo de 10 minutos a 95°C y 50 ciclos de 15 segundos a 95°C y de 1 minuto a 60°C, en un volumen final de 25 μί. Las condiciones de la MSP habían sido descritas anteriormente (Ibáñez de Cáceres i, et ai. 2012 Oncogene 29: 1681 -1690). Cada placa contenía las muestras tumorales, múltiples blancos con agua ( TCs) y controles positivos y negativos. El ADN de las líneas de cáncer humano SW780 (vejiga), HT29 (Colon) and 41 MR (ovario), se usó como control positivo, ya que estas líneas presentan metilacion en el promotor del gen IGFBP-3. Diluciones seriadas de un "pool" de estos ADNs modificados, en un rango desde 30 ng/μΙ a 0,003ng/pl, sirvió como control para las curvas estándar de β-actina e IGFBP-3 en cada palca utilizada para cada ensayo.

En cada ensayo se determinó la sensibilidad y especificidad para un rango de valores de "threshold" en ambas curvas estándar, seleccionándose un "threshold" ideal que diferenciaría los casos verdaderos positivos (independientemente de los niveles de metilacion que presentase cada muestra) de los verdaderos negativos. Todos los casos verdaderos negativos en la tecnología que presentamos se validaron como negativos por las técnicas de secuenciacion por bisulfito (BS) y/o PCR de metilacion específica (MSP), lo que correspondería con una especificidad del 100%.

Considerándose positiva una muestra para metilacion cuando el valor de MQ es mayor de 1 . Este valor se obtiene para promotor del gen IGFBP-3 metilado en cada muestra, determinado como un ratio entre los valores obtenidos de la amplificación de la región seleccionada del promotor del gen IGFBP-3 y los obtenidos de la amplificación del gen B-actina como referencia endógena. El ratio se multiplica por 1000 para facilitar su tabulación (gen de interés/gen 5 referencia x 1000), obteniéndose un cociente de metilacion (MQ) que representa el nivel relativo de metilacion de la muestra de estudio, tal como se ha descrito para la valoración en otros genes como MGMT, APC, MLH1 , p16 (Durr ML, et al. PLoS One 2010 May 26;5(5):e10828). i o Resultados

El diseño de los cebadores y sonda de la presente invención son específicos para la región del promotor de gen IGFBP-3 comprendida entre las posiciones - 584 y -492, incluyendo ambas posiciones, y permiten la amplificación y por tanto la cuantificación de los niveles de ADN metilado que contiene la muestra

15 que analicemos para el gen IGFBP-3, hasta una sensibilidad de 1 alelo metilado en un fondo de 10.000 alelos no metilados (sensibilidad 1 : 10.000) (figura 1 ). Las curvas estándar para la identificación del gen IGFBP-3 metilado cumplen la linearidad y el paralelismo esperados con las curvas estándar para el gen de referencia β-actina. Mostramos como ejemplo ambas curvas

20 obtenidas en el mismo proceso experimental, en la figura 2.

Se testó la nueva metodología en las líneas de cáncer humano que nos sirvieron como control ya que fueron las utilizadas para la identificación de la sonda, y cuyo estado de metilacion para el gen IGFBP-3 fue testado tanto por

25 la técnica de secuenciación por bisulfito como por la técnica de PCR de metilacion específica (MSP). En la figura 3 se puede observar en el panel izquierdo, la clara interpolación de las líneas celulares controles positivas (SW780 y HT29) en las curvas respectivas para el gen IGFBP-3 metilado y para β-actina como control endógeno no metilado, mientras que el panel

30 derecho se observa como las líneas control negativas (SKOV3 de cáncer de mama y PANC1 de cáncer de páncreas), sólo interpolan en la curva para B- actina como control endógeno no metilado. Estos resultados confirman la especificidad de la metodología que presentamos en esta invención (Figura 3). Posteriormente se comparó la sensibilidad y la especificidad de esta nueva tecnología QMSP-IGFBP-3 frente a la tradicional MSP en dos series de muestras de pacientes con CPNM conservadas en parafina. En la primera cohorte de pacientes se comprobó la especificidad de la técnica que presentamos (QMSP-IGFBP-3), comparándola con la tradicional MSP (descrita en Ibáñez de Cáceres I. et al. 2010 Oncogene 29: 1681 -1690). En 28 de 32 pacientes con CPNM extirpados en el Hospital Universitario La Paz, encontramos el mismo estado de metilacion del gen IGFBP-3 utilizando ambas técnicas, y los restantes 4 pacientes fueron rescatados, ya que con la técnica tradicional MSP no se encontró presencia de metilacion, siendo en su momento identificadas como muestras no metiladas, mientras que la utilización de la sonda de la invención permitió identificar la presencia de un grado moderado de metilacion en estas 4 muestras de pacientes, ya que la sensibilidad se incrementa en un orden de magnitud (tabla 1 , con asterisco). Esta técnica además incorpora valores de grado de metilacion, ya que es una valoración cuantitativa, lo que permite estudios de correlaciones con variable continua, aumentando su valor estadístico. En la Figura 4, mostramos a modo de ejemplo un gel de la técnica MSP completo con controles positivos (IVD), negativos (C-) y agua, en el que se confirma que los pacientes 2, 4 y 23 están metilados, y que la metilacion en los pacientes 15 y 27 no se detecta por esta técnica, mientras que por QMSP con la sonda de la invención fuimos capaces de detectar presencia de metilacion en estos pacientes. Tabla 1 . Se muestra en tejido de pacientes los resultados obtenidos para la MSP y para la qMSP de la presente invención.

Muestr qMSP(RQ

Anatomía nivel relativo

Patológica TNM Estadio MSP de metilacion)

1 Célula grande T2N1 2B M M (0,55)

2 Epidermoide T2N0 1 B M M (0,15)

3 Epidermoide T2N1 2B U ^* M (12,95)

4 Epidermoide T3N0M0 2B M M (10,84)

5 Epidermoide T2N0M0 1 B M M (3,9)

6 Adenocarcinom T1 N0M0 1A U U

TNM, clasificación del cáncer de pulmón. "RQ", cuantificación relativa; U, metilado; M, metilado.

Así mismo hemos comprobado en una segunda serie confirmativa de 40 piezas tumorales embebidas en parafina de pacientes con CPNM extirpados en el Hospital del Mar de Barcelona, la sensibilidad de la técnica para identificar presencia y grado de metilación y comprobar en primer lugar si el rango de valores es similar al obtenido en la primera cohorte. La totalidad de los pacientes interpolaron en la curva del control endógeno no metilado β -actina, lo que garantiza la presencia de ADN modificado objeto de estudio mientras que 21 pacientes de los 40 interpolaron también en la curva para el gen IGFBP- 3 metilado, resultando en la obtención de valores relativos de la presencia de DNA metilado para el gen IGFBP-3 de diferente grado de metilación (reflejado en el valor entre paréntesis y denominado "nivel relativo de metilación"), con valores aproximados de cociente de metilación (MQ) comprendidos entre 0,01 y 100 (Figura 5A). Los valores obtenidos de MQ concuerdan en grado con los obtenidos en la cohorte inicial del H U La Paz (Figura 4 y tabla 1 ). En segundo lugar se ha demostrado que la ausencia de metilación del promotor del gen IGFBP-3 es indicativa de que el tratamiento a administrar es quimioterapia con cisplatino, en vez de la terapia combinada con quimio-radioterapia (Figura 5B), por lo que los pacientes con ausencia de metilación no deberían recibir radioterapia, ya que la supervivencia global en los pacientes con IGFBP-3 no metilado que reciben sólo quimioterapia es superior a los que reciben tratamiento combinado con quimioterapia y radioterapia.

La técnica es por tanto, capaz de identificar la presencia de ADN metilado en un amplio rango (Figura 5A). Estos resultados satisfacen una necesidad existente y no resuelta hasta la fecha en la práctica clínica, que es identificar qué pacientes son los que presenta alta probabilidad de respuesta a un tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en derivados del platino, como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, sartraplatino, etc .