GASTRO-INTESTINALE À UN TRAITEMENT INHIBITEUR

La présente invention se situe dans le domaine médical et plus précisément dans le domaine de la thérapie anti-cancéreuse. L'invention a principalement pour objet un procédé in vitro ou ex vivo de sélection de patients atteints de tumeurs gastro-intestinales susceptibles de bénéficier d'une thérapie anti-tumorale comprenant l'administration d'un inhibiteur de la voie de la kynurénine. Un procédé selon l'invention comprend notamment une étape de détermination de l'expression de la protéine QPRT dans un échantillon test de ladite tumeur gastro-intestinale, l'expression de QPRT dans des cellules épithéliales de l'échantillon test étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

La présente invention a également pour objet l'utilisation de la protéine QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Afin d'optimiser les traitements thérapeutiques et la pertinence des essais cliniques dans le domaine de la thérapie anti-cancéreuse, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et de biomarqueurs prédictifs de la sensibilité des patients à ce traitement, qu'il soit utilisé seul d'un ou en combinaison avec d'autres approches thérapeutiques, demeure un objectif important pour le développement futur de ces traitements. Il est donc nécessaire de disposer de nouveaux traitements et de procédés efficaces permettant de prédire la sensibilité d'un patient à ces traitements lourds et associés à des effets secondaires importants.

Les inventeurs ont maintenant développé un nouveau procédé permettant la sélection de patients atteints d'une tumeur gastro-intestinale susceptibles de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine. Ce procédé comprend la détermination de l'expression de la protéine QPRT dans les cellules épithéliales d'un échantillon de la tumeur du patient avant tout traitement, une expression supérieure de la protéine QPRT dans l'échantillon test par rapport à un échantillon de référence étant indicatrice de la sensibilité du patient à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Plusieurs signatures d'expression génique (« classifiers ») permettant de suivre l'évolution des maladies de Crohn et les colites ont été décrites (Montero-Melendez et al., 2013).

La publication de Watanabe (2013) décrit une signature d'expression génique et une méthode de prédiction de l'évolution d'une colite ulcérative vers un cancer colorectal. La signature décrite dans ce document comprend 40 gènes exprimés de façon différentielle selon que les patients atteints de lésions néoplasiques, ou non atteints par de telles lésions.

La publication de Malik et al. (2014) décrit la structure cristallographique de la QPRT humaine sous une forme complexée avec son inhibiteur, l'acide phtalique. Cet inhibiteur est cependant peu spécifique, la concentration à laquelle il est effectif in vitro est de l'ordre du millimolaire (10 ^"3 M). La publication de Sahm ei al. (2013) enseigne que l'acide quinolique, métabolite endogène du tryptophane et précurseur du NAD ⁺ , confère aux gliomes une résistance au stress oxydatif.

L'inflammation chronique constitue un terrain fertile au développement de cancers. Dans les muqueuses enflammées, pour autant le stress oxydatif induit une érosion des télomères et des signes de sénescence réplicative au sein des cellules souches intestinales.

Les inventeurs ont montré que la comparaison du profil d'expression génique de cellules épithéliales de colon humaines ayant échappé à la sénescence induite par un stress oxydatif avec le profil génique de la lignée parentale met en exergue l'induction d'un programme génique spécifique, caractérisé par l'activation de l'expression d'une trentaine de gènes et la répression d'une trentaine d'autres. Ce programme génique est orchestré par les facteurs de transcription ZEB et se différencie du programme de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT selon l'acronyme anglais) communément induit par ces facteurs. Ce nouveau programme génique est nommé ALEP pour Alternative to EMT Program. Les inventeurs ont montré in vitro que l'expression de QPRT confère un avantage de survie aux cellules ayant échappé à la sénescence, dans des conditions d'inflammation chronique ou lorsqu'elles sont soumises à un agent oxydant. Les inventeurs ont aussi montré que la déplétion en QPRT des cellules ayant échappé à la sénescence induit la mort de ces cellules par apoptose dans des conditions d'inflammation chronique, et que l'inhibition de l'expression de QPRT empêche ces cellules de tolérer des activations oncogéniques. Ils ont également démontré que des cellules de lignées cancéreuses intestinales ayant un programme ALEP actif (score de la signature élevé) sont dépendantes la protéine QPRT pour leur prolifération. Au-delà de la protéine QPRT, l'inhibition d'une autre enzyme clef de la voie de la kynurénine située en amont de QPRT, la protéine TD02, inhibe de manière très similaire la prolifération de ces lignées. L'activité de la voie de la kynurénine dans sa globalité serait donc nécessaire à la prolifération des lignées colorectales dans lesquelles le programme ALEP est activé.

Par ailleurs, les inventeurs ont montré que la protéine QPRT est absente dans les entérocytes de tissu normal de l'intestin, alors qu'une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées lors de la détection de QPRT est observée dans une proportion significative de dysplasies de bas- ou de haut-grade et de cancers développés dans un contexte inflammatoire, ainsi que dans les cellules épithéliales d'une proportion significative d'adénomes et de cancers sporadiques. De plus, une proportion des adénocarcinomes œsophagiens exprime la protéine QPRT alors qu'aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne.

La protéine QPRT, et au-delà de celle-ci les autres enzymes de la voie de la kynurénine, sont donc des cibles thérapeutiques particulièrement intéressantes et leur inactivation constitue donc une approche thérapeutique anti-tumorale prometteuse, le cas échéant en association avec un autre traitement anti-tumoral, en particulier avec une thérapie capable d'induire un stress oxydant. L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée à l'aide d'exemples destinés à l'illustrer sans la limiter, diverses modifications pouvant y être apportées sans sortir du cadre général de l'invention.

La présente invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale, susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, à partir d'un échantillon test de ladite tumeur avant traitement dudit patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

a) La détermination de l'expression de la protéine QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test,

b) La comparaison de l'expression de la protéine QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de protéine QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

La présente invention a également pour objet un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale (avant traitement) à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : i) l'obtention d'un échantillon test de ladite tumeur, ii) la détermination de l'expression de protéine QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test, iii) la comparaison de l'expression de protéine QPRT dans ledit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, iv) la prédiction de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine à partir de la comparaison de l'étape iii), un niveau d'expression supérieur de protéine QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Par « sensibilité d'un patient à un traitement », on entend l'observation d'un effet thérapeutique tel que l'amélioration de la survie d'un patient ayant reçu ledit traitement thérapeutique. L'absence de réponse d'un patient, ou l'absence de sensibilité du patient à un traitement thérapeutique, est au contraire définie par le terme de « résistance » d'un patient audit traitement thérapeutique, dans laquelle aucun effet thérapeutique n'est observé. Un procédé ex vivo de sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, permet de prédire la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Par l'expression « avant traitement » ou « non-traité », on entend avant ou après un acte chirurgical, tel qu'une exérèse, pratiqué sur la tumeur mais avant tout traitement thérapeutique associé mais non chirurgical, tel que la chimiothérapie, la radiothérapie, l'hormonothérapie ou 1 ' immunothérapie .

La quinolinate phosphoribosyltransférase ou QPRT (UniProtKB Q 15274 mise à jour le 18 mai 2010 ; SEQ ID NO :1), aussi dénommée Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase catalyse la conversion de l'acide quinolinique (QA) en nicotinamide mononucleotide (NAMN) par le transfert du groupe phosphoribosyl du 5-phospho-D-ribose-l-diphosphate (PRPP), lors de la première étape de biosynthèse du NAD+.

Par « voie de la kynurénine », on entend la voie métabolique conduisant à la production de novo de NAD ⁺ à partir de tryptophane, un acide aminé essentiel. Les enzymes impliquées dans cette voie ont été décrites notamment par Vécsei et al., 2013.

Par « traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine » on entend l'application d'un traitement destiné à inhiber l'activité et/ou les effets d'au moins une des enzymes qui contribuent à cette voie métabolique, à savoir le tryptophane 2,3-dioxygénase (TD02), la kynurénine formylase, la kynurénine 3-monooxygénase (KMO), la kynuréninase (KYNU), la 3-hydroxyanthranilic acid oxygénase (3HAO) ou QPRT. Ce traitement inclut par exemple l'utilisation d'inhibiteurs de la protéine tryptophane 2,3-dioxygénase ou TD02 tel que la molécule 690C91 ((E)-6-fluoro-3-[2-(3- pyridyl)vinyl]-lH-indole, Sigma), d'inhibiteurs de la kynurénine 3-monooxygénase ou KMO tel que 2-3 teriflunomide et Ro-61-8048 (Selleckchem), PDE10A (Pfizer), JM6 (3,4-dimethoxy-N-(4- (3-nitrophenyl)-5-(piperidin-l -ylmethyl)thiazol-2-yl)benzenesulfonamide), d'inhibiteurs de l'enzyme 3HAO tels que décrits par Vallerini et al., 2013 ou d'inhibiteurs de QPRT. Un exemple connu d'un antagoniste de l'activité enzymatique de QPRT est l'acide phtalique (Malik et al. 2013).

Par « inhibiteur de la voie de la kynurénine » on entend toute substance, molécule, composé ou complexe capable d'inhiber de manière spécifique, notamment par compétition ou conformation, l'activité et/ou les effets d'au moins une enzyme de cette voie métabolique. Par exemple, ces inhibiteurs peuvent être de type allostérique, analogue de substrat(s), analogue de produit(s) ou intermédiaire(s) de réaction enzymatique notamment non catabolisable, spécifiques de l'enzyme concernée.

Dans tous les aspects de l'invention, le traitement inhibiteur de la voie de la kynyrénine est de préférence un traitement inhibiteur de QPRT ou de TD02, et plus particulièrement de QPRT.

Par conséquent, de manière préférée, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale, susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, à partir d'un échantillon test de ladite tumeur avant traitement dudit patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

a) La détermination de l'expression de la protéine QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test,

b) La comparaison de l'expression de la protéine QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de protéine QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale, avant traitement, susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, comprenant la détermination du niveau d'expression de protéine QPRT dans les cellules épithéliales d'un échantillon test de tumeur, dans lequel l'échantillon test de tumeur est choisi parmi : un tissu tumoral, une pièce opératoire et une biopsie.

Le procédé de sélection selon l'invention concerne un procédé ex vivo d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, avant que ledit patient n'ait été traité pour ladite tumeur.

D'une manière générale, dans le cadre de la présente invention, l'échantillon issu du patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale est obtenu avant traitement ; ledit patient étant considéré comme non-traité pour ladite tumeur.

L'échantillon de la tumeur gastro-intestinale peut être issu de la tumeur primaire ou bien de métastase(s). Selon un aspect particulier du procédé de sélection ex vivo selon l'invention, l'échantillon test de ladite tumeur est issu de la tumeur primaire.

L'expression «niveau d'expression supérieur » indique que le niveau d'expression observé dans ledit échantillon test est plus important que le niveau d'expression observé dans l'échantillon de référence, du point de vue du nombre de cellules dans lesquelles l'expression est détectée et/ou de l'intensité du signal détecté et/ou de la localisation des cellules pour lesquelles la protéine est détectée.

En effet, les inventeurs ont montré que la protéine QPRT est absente dans les entérocytes de tissu normal de l'intestin, alors qu'une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées lors de la détection de QPRT est observée dans une proportion significative de dysplasies de bas- ou de haut- grade et de cancers développés dans un contexte inflammatoire, ainsi que dans les cellules épithéliales d'une proportion significative d'adénomes et des cancers sporadiques.

De plus, une proportion des adénocarcinomes œsophagiens exprime la protéine QPRT alors qu'aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne.

De façon avantageuse, dans un procédé selon l'invention, l'expression de la protéine QPRT est déterminée par comparaison avec l'expression de la protéine QPRT dans un échantillon de référence, l'expression de la protéine QPRT dans un échantillon de référence étant notamment choisie parmi : l'expression de QPRT dans un échantillon test de tissu sain de même nature que le tissu de l'échantillon test, l'expression de QPRT dans un échantillon de tissu d'un patient atteint d'une maladie gastro-intestinale inflammatoire non associée à des lésions dysplasiques (c'est-à-dire de nature non tumorale), et/ou l'expression de QPRT dans un échantillon de tissu du patient testé, prélevé alors que le patient n'était pas atteint d'une tumeur gastro-intestinale.

Les maladies gastro-intestinales inflammatoires non tumorales connues sont : la maladie de Crohn, la colite ulcérative ; la gastrite chronique et les reflux gastro-œsophagiens chroniques (dans le cadre de l'adénocarcinome).

La détermination du niveau d'expression de la protéine QPRT est réalisée quantitativement ou semi-quantitativement par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique et/ou la quantification d'une protéine particulière dans un échantillon. Un tel procédé de détermination est notamment choisi parmi les procédés utilisant des anticorps liant QPRT, incluant en particulier l'immunohistochimie (IHC), une détection par immunofluorescence (IF).

L'expression de QPRT peut être définie à l'aide d'un score histologique prenant en compte, d'une part, l'intensité de marquage observée et, d'autre part, le pourcentage de cellules marquées, ou en combinant le pourcentage de cellules marquées et l'intensité de marquage. Selon ce procédé, des sections d'échantillon tumoral sont analysées par microscopie après avoir mis en présence lesdites sections avec un anticorps liant spécifiquement QPRT.

Par « cellules marquées » on entend des cellules pour lesquelles un signal est détecté lors de la recherche de l'expression de la protéine QPRT.

Selon un mode plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, dans lequel la détermination de l'expression de la protéine QPRT comprend la détermination de la présence de QPRT comprenant au moins une étape d'immunohistochimie.

Par « immunohistochimie », on entend d'une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection d'un antigène particulier au moyen d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux liant cet antigène. Le couple anticorps-antigène peut être visualisé par exemple par la conjugaison à une enzyme qui peut catalyser une réaction de production de couleur, par l'utilisation d'anticorps marqués, notamment par un fluorophore, ou par l'utilisation d'anticorps dits « secondaires » capables de lier les anticorps liant l'antigène.

Dans une méthode d'immunohistochimie, le tissu est placé sur un support solide. Un anticorps primaire lié à un système de détection (ou un anticorps primaire suivi d'un anticorps secondaire) est ajouté. Le signal est observé par des techniques de microscopie.

Dans un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, l'échantillon test de ladite tumeur est mis en contact avec un anticorps liant QPRT, ledit anticorps étant choisi parmi les anticorps polyclonaux anti-QPRT et les anticorps monoclonaux anti-QPRT. Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention, ledit anticorps lie QPRT en conditions natives, l'homme de l'art peut aisément choisir un anticorps répondant à ce critère, on peut citer notamment l'anticorps Sigma HPA011887.

Selon un mode encore plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, dans lequel la détermination de la présence de la protéine QPRT dans l'échantillon test de ladite tumeur est réalisée au moyen d'au moins une étape d'immunohistochimie comprenant la localisation de cellules marquées au sein du tissu épithélial de l'échantillon test.

Selon un mode encore plus particulier, un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, comprend la détermination du pourcentage de cellules épithéliales marquées au sein du tissu épithélial de l'échantillon test.

Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, dans lequel la détermination de l'expression de protéine QPRT comprend la détermination du pourcentage de cellules tumorales marquées.

Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, un niveau d'expression de protéine QPRT dans l'échantillon test correspondant à au moins 10% des cellules épithéliales marquées est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Dans le cadre de la présente invention, il est également décrit un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie la voie de la kynurénine, dans lequel la détermination du niveau d'expression de QPRT comprend la détermination du niveau d'expression d'un ARNm codant pour la protéine QPRT. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend la détermination de la quantité d'un ARNm codant pour la protéine QPRT, en particulier dans les cellules épithéliales de la tumeur. La détermination de la quantité de l'ARNm codant pour la protéine QPRT peut être réalisée par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique d'un ARNm, par exemple après microdissection des cellules épithéliales d'une tumeur. Un tel procédé comprend notamment la détection spécifique d'un ARNm à l'aide de sondes d'acide nucléique complémentaires de la séquence dudit ARNm, notamment par RT-PCR, par un procédé de type Northern-Blot. Elle peut être également obtenue par hybridation sur une sonde immobilisée (Hybridation in situ).

La PCR quantitative permet de mesurer la quantité initiale d'acide nucléique. Les acides nucléiques amplifiés, et notamment les ARNm, peuvent être détectés et quantifiés par tout procédé connu par un homme du métier, tel que notamment par spectrométrie à 260 nm ou par Northern blot en utilisant un procédé d'hybridation de sondes radioactives ou fluorescentes sur l'acide nucléique amplifié. La séquence nucléotidique de l'ARNm correspondant à la quinolinate phosphoribosyltransférase est connue (NCBI référence NM 014298, mise à jour le 15 mars 2015, SEQ ID NO :2). Un homme du métier spécialiste du domaine technique concevra aisément, à partir de cette séquence nucléotidique, des amorces capables de s'hybrider de manière spécifique à l'acide nucléique codant pour QPRT, permettant ainsi sa détection. A titre d'exemple, les amorces décrites dans la présente demande de brevet (SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4) sont utilisables dans un procédé selon l'invention.

Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, à partir d'un échantillon test de ladite tumeur avant tout traitement, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

a) La détermination, dans ledit échantillon test, du niveau de l'expression de la protéine QPRT et d'au moins une autre protéine du programme ALEP, dans les cellules épithéliales de la tumeur

b) La comparaison de l'expression protéique, dans ledit échantillon test, de QPRT et d'au moins une autre protéine du programme ALEP, avec l'expression protéique de QPRT et d'au moins l'autre protéine du programme ALEP, dans les cellules épithéliales d'un échantillon de référence,

c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine à partir de la comparaison de l'étape b),

i. un niveau d'expression supérieur de protéine QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test et un niveau d'expression supérieur d'au moins une autre protéine du programme ALEP dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence, et/ou

ii. un niveau d'expression supérieur de protéine QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test et un niveau d'expression inférieure d'au moins une protéine du programme ALEP dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Les protéines du programme ALEP, désigne les 59 protéines codées par les gènes indiqués dans la Figure 13, dont les inventeurs ont démontré que l'expression est soit supérieure soit inférieure dans des cellules épithéliales résistantes au stress oxydatif.

Les gènes codant les protéines du programme ALEP dont l'expression est supérieure sont :

APOE, SPARC, C6ORF160, SNHG5, SLC2A3, GALC, MT1G, SH3GL2, GNE, SUNC1, EXOSC8, LCPl, KCNJ8, NDRGl, SNCG, FGD3, LGALSl, TXNIP, SUM03, EMILIN2, TNNCl, TNNT1, TGFB1, LOC728031, KRT19 et GABARAPL1. Les gènes codant les protéines du programme ALEP dont l'expression est inférieure sont : IL32, ETV5, S100A3, SGK1, PRSS1, IRAK2, S100A9, GPR56, TNFAIP3, PIM2, PRRX2, BIRC3, CXCL5, DIAPH1, AD AMI 9, LRIG1, SLC7A11, EVL, WNT5A, TNFAIP2, EN02, TNFRSF1B, PROM1, TNF, TMPRSS2, LOC100134294, NFIX, RIN2, CXCL1, CXCL2, CARD9, CCL20.

De préférence, l'étape b) consiste à comparer l'expression de la protéine QPRT et au moins l'expression de la protéine APOE dans les cellules épithéliales dudit échantillon test, étant entendu qu'un niveau d'expression supérieur de QPRT et de APOE est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, en particulier à un inhibiteur de QPRT ou TD02, en tout particulièrement à un inhibiteur de QPRT.

Selon un mode particulier de réalisation, dans un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est choisie parmi : le cancer colorectal, le cancer gastrique et l'adénocarcinome de l'œsophage.

L'expression « tumeur » désigne une tumeur maligne ou cancer.

L'expression « cancer colorectal » désigne une tumeur issue de la transformation néoplasique des cellules épithéliales de la muqueuse du colon ou du rectum. Le cancer colorectal peut se développer sur un contexte inflammatoire (colites ulcératives ou maladie de Crohn) ou non et selon résulter de la progression maligne de dysplasie ou de polypes. Selon la taille et la profondeur de la tumeur, l'infiltration des ganglions et leur nombre, les tumeurs sont classées des stades de O à 4 (classification TNM).

L'adénocarcinome gastrique désigne une tumeur issue de la transformation néoplasique de la muqueuse de l'estomac et résulte de la progression d'une gastrite chronique en gastrite chronique atropique, métaplasie, dysplasie avant l'éventuelle évolution en adénocarcinome. On distingue les stades localisés, localement avancés et métastatiques.

L'adénocarcinome œsophagien désigne une tumeur issue de l'épithélium de la glande de

Barrett et résulte d'une cicatrisation anormale de lésions liées à l'agression chronique de la muqueuse du bas de l'œsophage par un reflux gastro-œsophagiens chronique. Les tumeurs sont classées selon la classification TNM).

Selon un mode plus particulier de réalisation, dans un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est développée dans un contexte inflammatoire chronique.

L'expression « contexte inflammatoire chronique » désigne la répétition de phases d'inflammation et de rémission, cette période peut s'étendre sur des années, comme pour les patients atteints de maladie de Crohn ou de colites ulcératives, conduisant progressivement à une altération de l'épithélium, en induisant par exemple une instabilité génétique dans les cellules épithéliales. Cette inflammation chronique augmente sur du long terme l'incidence de cancers. Selon un mode encore plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale développée sur un contexte inflammatoire chronique à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale étant un cancer colorectal.

Selon un autre mode particulier de réalisation, dans un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal sporadique.

Les tumeurs qui ne se développent pas sur un contexte inflammatoire sont dites sporadiques, elles résultent en général de la mutation du gène APC.

Selon un autre mode particulier de réalisation, dans un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal qui atteint des patients ayant des mutations germinales sur le gène APC. Ces patients développent des polyposes adénomateuses juvéniles (FAP), qui peuvent évoluer en CRC.

Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, combiné à un autre traitement anti-tumoral. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement anti-tumoral est choisi parmi : la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie.

Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, ledit patient ayant fait l'objet d'une étape de chirurgie destinée à retirer ladite tumeur (ou exérèse).

La présente invention a également pour objet un procédé ex vivo d'identification d'une tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la kynurénine, à partir d'un échantillon test de ladite tumeur avant traitement dudit patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

a. La détermination de l'expression de QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test,

b. La comparaison de l'expression de QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test avec l'expression de QPRT dans les cellules épithéliales d'un échantillon de référence,

c. L'identification de la tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la voie de la kynurénine, à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de QPRT dans les cellules épithéliales de l'échantillon test par rapport à celui des cellules épithéliales d'un échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

Dans le cadre de cet objet de l'invention, l'expression de QPRT peut être déterminée par l'expression protéique de QPRT ou l'expression transcriptionnelle de QPRT, en particulier l'expression de l'ARNm de QPRT. Selon un mode de réalisation particulièrement préférée de cet objet de l'invention, c'est l'expression de la protéine QPRT qui est déterminée.

Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur protéique pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastrointestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine.

L'invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, de préférence choisi parmi un inhibiteur de QPRT et un inhibiteur de TD02, de manière encore plus préférée à un traitement inhibiteur de QPRT, ledit patient étant non-traité pour ladite tumeur et l'expression de la protéine QPRT étant mesurée dans les cellules épithéliales d'un échantillon de ladite tumeur.

Selon un aspect particulier, l'invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastrointestinale à un traitement inhibiteur de la voie de la kynurénine, de préférence choisi parmi un inhibiteur de QPRT et un inhibiteur de TD02, combiné à un traitement anti-tumoral, tel l'oxaliplatine, 5-FU ou irrinotecan, et de manière encore plus préférence de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figures 1A et 1B : L'échappement à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique permet l'émergence de cellules à risque.

Fig.lA : La soumission de cellules épithéliales de colon à une inflammation chronique les force à s'adapter au stress oxy datif. Des cellules épithéliales de colon humaines immortalisées (HCEC- hTERT) ont été soumises tous les deux jours à des surnageants de macrophages activés (SMA). Les cellules arrêtent rapidement de proliférer (comme démontré par le taux d'histone H3-phosphorylé, pS10-H3), entrent en sénescence comme démontré par la détection d'une activité SA-β- galactosidase, l'accumulation de protéine p53 acétylé (Ac-p53) et l'induction de son gène cible CIP1 (p21). Après un délai d'un mois, les cellules se remettent à proliférer. Fig. 1B : Les cellules émergentes sont résistantes au stress oxydatif et tolèrent des activations mitogéniques. Les cellules ayant échappé à la sénescence (Ech-Inf A et Ech-Inf B issues de deux expériences distinctes) et les cellules HCEC parentales (Par) ont été soit traitées au tert-butyl-hydoxy-peroxyde (TBHP) (panel de gauche) soit transduites par une version activée de la protéine RAS (HRASG12V, panel de droite) et colorées au cristal violet 12 jours plus tard. Le taux de protéine RAS est analysé par Western-blot.

Figures 2 A et 2B : Les facteurs de transcription ZEB orchestrent le mécanisme d'adaptation au stress oxydatif. Fig. 2A : L'échappement à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique ou un peroxyde chimique résulte de l'induction des gènes embryonnaires ZEB. Analyse de l'expression des gènes SNAI1, TWIST2, ZEB1 et ZEB2 par q-RT-PCR dans les cellules ayant échappé à l'inflammation chronique (panel de gauche) ou au stress oxydatif induit par un peroxyde chimique (panel de droite). L'expression relative est définie en comparaison au gène de ménage HPRTl et aux cellules HCEC parentales. L'expression des gènes SNAI2 et TWIST1 est en dessous du seuil de détection. Fig. 2B : L'expression ectopique de l'un des deux facteurs de transcription ZEB est suffisante pour permettre aux cellules de s'adapter au stress oxydatif. Les cellules HCEC- hTERT ont été transduites par Zebl ou Zeb2, soumises soit à des surnageants de macrophages activés (SMA) ou à du TBHP. Après 12 jours de traitement, les cellules ont été colorées au cristal violet.

Figures 3A et 3B : La résistance au stress oxydatif est liée à l'induction d'un programme génique spécifique. Fig. 3A : La comparaison des profils géniques de cellules HCEC-hTERT ayant échappé à l'inflammation chronique (issues de deux expériences indépendantes, Ech-Inf A et B), au stress oxydatif induit par un peroxyde chimique (Ech-TBHP) ou transduites par Zebl (HCEC-ZeW) ou Zeb2 (HCEC-Zeb2) met en exergue un ensemble de 27 gènes communément induits et de 32 gènes communément réprimés (voir Figure 13). Parmi cette liste, les deux gènes les plus induits sont QPRT et APOE. Fig. 3B : L'expression ectopique de l'une ou de l'autre de ces deux protéines est suffisante pour protéger les cellules du stress oxydatif. Les cellules HCEC ont été transduites par QPRT ou APOE et soumises soit à des surnageants de macrophages activés (SMA) soit un traitement au TBHP. Après 12 jours de traitement, les cellules ont été colorées au cristal violet. Figures 4A et 4B : L'activité de la protéine QPRT contribue à la résistance au stress oxydatif. Fig. 4A : La survie des cellules ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique est dépendante de l'expression de QPRT. Panel du haut : les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Ech-Inf) ont été infectées par des vecteurs lentiviraux exprimant deux shRNA distincts dirigés contre l'ARN QPRT (shRNA QPRT A et B) et soumises à des surnageants de macrophage activés (SMA). Après 12 jours de traitement, les cellules sont colorées au cristal violet. Les cellules HCEC parentales (Par) et Ech-Inf infectées par un shRNA contrôle ont été utilisées respectivement comme contrôles négatif et positif. Panel du bas : analyse de QPRT et de la caspase 3 clivée (cl. casp. 3) par Western blot.

Fig. 4B : L'activité de la protéine QPRT est essentielle pour permettre aux cellules ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique de tolérer des activations oncogéniques. Panel du haut : les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Ech-Inf) ont été déplétées en QPRT par ARN interférence et infectées par un vecteur rétroviral exprimant la version activée de la protéine HRAS (HRASG12V). 12 jours après infection, les cellules ont été colorées au cristal violet. Panel du bas : analyse de QPRT et RAS par Western blot.

Figure 5 : Classification des lignées humaines de carcinomes colorectaux en fonction du score du programme ALEP. Les lignées utilisées dans les tests suivants et dans lesquelles le programme est induit sont OUMS-23, C2BBel, CL-14 ; les lignées dans lesquelles le programme n'est pas induit sont SW116, HCT116, HT-29, SW403, COLO-320.

Figure 6 : La prolifération des lignées cancéreuses colorectales dans lesquelles le programme ALEP est induit est dépendante de l'expression de QPRT. Panels du haut: différentes lignées colorectales dans lesquelles le programme alternatif est induit (ALEP actif) ou non (ALEP inactif) ont été infectées par des vecteurs lentiviraux exprimant des shRNA dirigés contre l'ARN QPRT (shRNA QPRT A et B) et colorées au cristal violet douze jours après infection. Panel du bas: analyse de QPRT dans les différentes lignées par Western blot.

Figure 7 : Panels A et B. L'inhibition de la voie de la kynurénine dans des lignées colorectales ALEP -positives OUMS-23 (panel A) ou C2BBel (panel B) s'accompagne d'un arrêt de prolifération, d'une induction d'une autophagie et de dommages à l'ADN. Panels du haut. L'inhibition de l'expression de QPRT par le biais de shRNA (A ou B) induit un arrêt de prolifération des cellules à en juger par des courbes de prolifération (panels en haut à gauche) et l'accumulation d'histone H3 phospho-serine 10 (pS10-H3, panels en haut à droite). L'inhibition de QPRTçw les shRNA ou l'inactivation de l'enzyme TD02 par le composé chimique 680C91 induit de l'autophagie, à en juger par l'accumulation de vacuoles (panels en bas à gauche) et de la protéine LC3 (panels en bas centraux et à droite) ainsi que l'accumulation de dommages à l'ADN à en juger par l'accumulation de la protéine γ-Η2ΑΧ (panels en bas centraux et à droite).

Figure 8 : Analyse de QPRT sur des échantillons humains par immunohistochimie (I). Exemples de marquage de QPRT par immunohistochimie sur des échantillons de colon sain (en haut à gauche), de muqueuses enflammées (en haut à droite), de dysplasies de bas- ou de haut-grade (2 ^nde et 3 ^ieme rangée en partant du haut) ou des carcinomes développés sur un contexte inflammatoires. Echelle : 100 μιη.

Figure 9 : Analyse de QPRT sur des échantillons humains par immunohistochimie (II). Exemples de marquage de QPRT par immunohistochimie sur des échantillons d'adénomes faiblement ou fortement dysplasiques et dans des cancers sporadiques. Echelle 100 μιη.

Figures 10A et 10B : Le programme ALEP est induit dans les muqueuses enflammées de patients atteints de colites ulcératives ou de maladie de Crohn. La comparaison de la signature du programme ALEP aux profils géniques de patients atteints de maladie de Crohn (CD) ou de colite ulcérative (UC) (séries GSE36807 et GSE37283) permet de ségréger un certain nombre de patients. Notons dans la série de patients atteints de colites ulcératives GSE37283 la capacité de la signature à ségréger ceux ayant ou non développé des lésions colorectales cancéreuses.

Figures 11A à 11C : Analyse de la signification biologique du programme alternatif sur une large cohorte de patients atteints de cancers colorectaux sporadiques (tumeurs primaires réséquées de patients n'ayant encore subi aucun traitement thérapeutique associé non chirurgical). L'analyse est menée sur une cohorte de 566 carcinomes colorectaux (GSE39582) classifiés selon leur profil génique en six types moléculaires (de Cl à C6, Marisa et al., 2013). Fig. 11A. Analyse du score de la signature du programme alternatif dans les six types moléculaires. Fig. 11B. Analyse de la corrélation entre les scores des signatures du programme alternatif et des cellules souches intestinales Lgr5 et EphB2. Fig. 11C. Représentation de Kaplan-Meier de la survie sans récidive de patients atteints de cancers colorectaux selon le score du programme ALEP, élevé, intermédiaire ou faible (avec des seuils pris à 4000 et 6000 en combinant les scores de chacun des gènes surexprimés ou sous-exprimés voire éteints).

Figure 12 : Analyse de QPRT par immunohistochimie dans les adénocarcinomes œsophagiens. Exemples d' adénocarcinomes œsophagiens exprimant (QPRT+) ou non (QPRT-) la protéine QPRT. L'épithélium malpighien du tiers inférieur de l'œsophage est utilisé comme contrôle interne (panel en bas à droite). Echelle 100 μιη.

Figure 13 : Liste des gènes communément induits ou réprimés dans les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Ech-Inf A et B) à un peroxyde chimique (Ech-TBHP A et B) ou transduites par Zebl ou Zeb2.

EXEMPLES

Exemple 1 : Matériel et méthodes

Plasmides et lignées : Les constructions HRAS ^G12V , ZEB1 et ZEB2 pBabe Puro ont été décrites antérieurement (Morel et al., 2012). Les vecteurs d'expression ΑΡΟΕε3 et QPRT en pbabe Puro ont été générés à partir des vecteurs pLenti-GIII-hAPOE-GFP-2A-Puro constructs (abm) et QPRT pCMV6 (Origene). Le cDNA QPRT RK138/139 a été synthétisé par la société Genscript et sous- cloné dans le vecteur rétro viral pBabe Puro (Addgene). Les shRNA QPRT A (5'- TCGCTCTGAAGGTGGAGT-3' ; SEQ ID NO : 5) and shRNA QPRT B (5'- AGTCCTAAACCGGAAGAGG-3'; SEQ ID NO : 6) en pLKO.l ont été obtenus auprès de la société Sigma. Les lignées HT-29, HCT116, SW403, COLO320HSR and C2BBel ont été obtenues auprès de l'ATCC. Les lignées OUMS23 et CL- 14 ont été fournies par la banque cellulaire JCRB (Japon) et le DSMZ GmbH (Allemagne), respectivement. Les lignées OUMS23 and c2BBel ont été cultivées en milieu DMEM (Life Technologies) complémenté par 10% SVF (Cambrex) et 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (PS, Life Technologies), les lignées HT-29 et HCT116 en milieu McCoy's 5A (Life Technologies) complémenté par 10% SVF + 100 U/ml PS, les lignées SW116, SW403 and COLO320 en milieu RPMI (Life Technologies) complémenté avec 10% FBS + 100 U/ml PS, et la lignée CL- 14 en milieu DMEM/HAMF 12 1:1 (Invitrogen) complémenté avec 20% FBS et 100 U/ml PS. Les cellules primaires épithéliales de colon ont été obtenues auprès de la société abm (T4056), immortalisées par transduction à'hTERT et cultivées in milieu Prigrow III (TM003, abm) complémenté 5% FBS and 100 U/ml PS sur des boites de collagène (BD BioCoat Collagen type I, Dutscher).

Induction d'un stress oxydatif dans les cellules HCEC : La lignée monocytaire THP-1 a été obtenue auprès de l'ATCC et cultivée en milieu RPMI (Life Technologies) complémenté avec 10% FBS, 100 U/ml PS, 1 mM Sodium pyruvate (Life Technologies) and des acides aminés non- essentiels (Life Technologies). La différentiation cellulaire (5.10 ⁷ cellules) a été induite par un traitement au PMA (0.162 μΜ, Sigma) pendant une journée et l'activation des macrophages ainsi obtenus ensuite induite par du LPS (LPS-EB ultra-pure de la lignée E.coli 0111:B4, InvivoGen) pendant une journée. Le surnageant a été collecté, filtré sur 0.45 μΜ, dilué au demi dans le milieu de culture des HCEC et placé sur les cellules HCEC (5 xlO ⁵ en boite 6 puits). Le surnageant des macrophages activés a été renouvelé tous les deux jours. De manière similaire, le traitement des cellules HCEC avec du tert-Butyl-hydroperoxide (30 μΜ, Sigma) a été renouvelé tous les deux jours. Les cellules ont été colorées au cristal violet après dix jours de traitement. Les tests SA-β- galactosidase ont été effectués comme préalablement décrits (Dimri et al., 1995).

Infections rétrovirales and lentivirales : La production ectopique de protéines dans les cellules HCEC-hTERT a été effectuée par le biais d'infections rétrovirales comme préalablement décrit (Gras et al., 2014). Brièvement, les cellules sont « murinisées » par l'expression ectopique d'un récepteur écotrope (Baker et al., 1992; Boehm et al., 2005) avant d'être infectées par les vecteurs d'expression rétroviraux. Les infections séquentielles sont espacées de 48h et la sélection est initiée 24h après la seconde infection avec de la puromycine (1.5 μg/ml). Les particules lentivirales des shRNA QPRT ont été générées par transfection de la lignée HEK293T avec les vecteurs pLKO.l, pCMV AR8.91 (gag-pop-Tat-Rev) (Zufferey et al., 1997) et phCMVG-VSVG (env) (Burns et al., 1993) par la technique de calcium phosphate. La déplétion en QPRT a été obtenue par trois infections successives, chacune séparée de 12h. Nous avons confirmé l'infection de plus de 90%> des cellules.

Analyse des protéines par Western-bot : Les extraits cellulaires ont été effectués en milieu RIPA (100 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH8) complémenté par des cocktails d'inhibiteurs de protéase (Roche) et de phosphatases (Sigma) et les débris cellulaires éliminés par centrifugation. Les protéines ont été analysées par Western-blot en utilisant les anticorps monoclonaux anti-TWISTl 2Cla (Abcam), anti-p21CIPl/WAFl clone SX118 (Dako) et anti- QPRT (ab57125, Abcam), et les anticorps polyclonaux anti-H-RAS N-18 (Santa-Cruz), anti-ZEBl H102 (Santa-Cruz), anti-ZEB2 (Sayan et al., 2009), p-histone H3 (SerlO)-R (Santa-Cruz), and phospho-histone H2A.X Serl39 (Cell Signaling) et des anticorps secondaires couplés à la peroxidase (Dako). Les complexes antigène-anticorps ont été révélés par le réactif Luminol (Santa Cruz). Immunohistochimie : Les échantillons de patients ont été obtenus auprès du Centre de Ressources Biologiques de l'Hôpital Lyon Est et Saint-Antoine (Paris) avec l'accord des comités éthiques locaux. Les échantillons ont été utilisés avec l'accord écrit informé des patients. Cette étude a été approuvée par les comités éthiques des deux institutions. Les marquages ont été opérés sur des sections de 40 μιη de tissus fixés en formol et incubés dans de la paraffine. Les lames ont été successivement déparaffinées par trois bains successifs de xylène et réhydratées par des bains en éthanol pur, à 90% et 80%. L'antigène a ensuite été démasqué en chauffant les lames au microonde (5 et 10 min) dans une solution de démasquage à PH6 (Dako). Après avoir bloqué l'activité peroxydase endogène par un bain d'eau oxygénée à 0.3% pendant 10 min, les lames ont été incubées en présence d'anticorps QPRT (anticorps Atlas, HPA011887, Sigma) à température ambiante pendant lh à une dilution au l/100ème. Le marquage est ensuite révélé en utilisant le Polymer Kit Novolink (Leica).

Analyse de l'expression transcriptionnelle des gènes par q-RT-PCR : La préparation des ADN et la transcription reverse ont été effectuées comme précédemment décrit (Gras et al., 2014). Les amorces de PCR ont été sélectionnées par le biais du logiciel primer3. Le gène de ménage HPRT1 a été utilisé pour la normalisation. Les couples d'amorces suivants ont été sélectionnés:

Tableau 1 Profils d'expression génique : Les profils d'expression génique et l'analyse des données ont été effectués par le biais de la plateforme ProfileXpert (Lyon, France). Les profils d'expression ont été analysés sur la base de puces contenant 47231 sondes (HumanHT-12 v4 Expression BeadChip;Illumina Inc., USA). L'ARN total (500 ng) a été amplifié et marqué à la biotine en utilisant le kit Illumina TotalPrepTM RNA Amplification Kit (Ambion Inc., USA). L'hybridation a été réalisée avec 750 ng de cRNA marqué à la biotine. Les puces ont été scannées en utilisant le protocole standard d'Illumina et le scanner theiScan (Illumina Inc., USA) et les données ont été normalisées en utilisant le logiciel Génome Studio 2010 (Illumina Inc.,USA).

Analyses in silico de la pertinence du programme alternatif : L'analyse des données a été effectuée par le biais du logiciel Array Studio (Omicsoft Corporation). Les données brutes des séries analysées (CEL) ont été traitées en utilisant la normalisation quantile et l'algorithme Robust multi-array average (PMA et transformées en Log2 (Irizarry et al., 2003). Différents outils informatiques dont le « Hierarchical clustering analysis », le « Principal Component Analysis (PCA) et la méthodologie de projection ssGSEA ont été utilisés. Le score de la signature a été déterminé en utilisant les « Empirical cumulative Distribution Functions » (ECDF) des gènes et les corrélations entre les signatures déterminées par une corrélation de Pearson.

Exemple 2 : L'échappement à îa sénescence ndui e en réponse à une inflammation chronique conduit à l'émergence de cellules à risque et résulte d'une reprogrammation des cellules, orchestrée par le facteur de transcription ZEB1.

Le modèle établi in vitro repose sur l'utilisation de cellules épithéliales de colon immortalisées (HCEC-hTERT) cultivées en présence de surnageant de macrophages activés (SMA, conditions mimant une inflammation chronique). Ces conditions expérimentales conduisent à l'induction de dommages à l'ADN simple brin qui évoluent en dommages double brin (confirmée par l'accumulation de protéine γΗ2ΑΧ). Ces dommages induisent un arrêt de la prolifération cellulaire (démontré par la diminution du taux d'histone H3 phosphorylée sur le résidu SerlO, p-S10-H3) et l'engagement des cellules épithéliales dans un programme de sénescence (mis en évidence par l'acétylation de la protéine p53 (Ac-p53), l'induction de son gène cible CIP1 (p21) et la détection d'une activité SA- -galactosidase): une séquence d'événements récapitulant les observations faites in vivo. Pour autant, après un délai d'un mois, les cellules se remettent invariablement à proliférer (Figure 1A). Les cellules émergentes (notées ensuite « Ech-Inf » pour « échappement à l'inflammation ») sont non seulement capables de proliférer dans des conditions d'inflammation chronique mais également de supporter des stress oxydatifs qu'ils soient induits en réponse à un peroxyde chimique (tel le tert-butyl-hydroxy-peroxyde ou TBHP) ou en réponse à une activation oncogénique (transduction d'une version activée de la protéine RAS, H-RAS ^G12V ) (Figure 1B). Les cellules émergentes ont donc acquis une résistance intrinsèque aux stress oxydatifs et en tolérant des activations oncogéniques sont susceptibles d'évoluer vers un phénotype malin. La soumission des cellules à un peroxyde chimique (TBHP) engendre de la même manière un arrêt de prolifération des cellules. Après trois semaines, des cellules de nouveau se remettent à proliférer (notées ensuite Ech-TBHP).

Le statut du gène TP53 est sauvage dans les cellules 'Ech-Inf et la voie de signalisation reste inductible en réponse à un stress génotoxique. L'analyse de l'expression des membres des trois principales familles Snail, Twist et Zeb a été analysée. Invariablement, sur trois expériences indépendantes, l'échappement au stress oxydatif induit par l'inflammation ou par le peroxyde chimique est associé à une induction du gène ZEB1 ou ZEB2 (Figure 2A), suggérant que les facteurs de transcription ZEB orchestrent le mécanisme d'adaptation au stress oxydatif. En accord avec cette hypothèse, la production ectopique de la protéine murine ZEB 1 ou de la protéine murine apparentée ZEB2 (lignées HCEC-ZeW et HCEC-Zeb2) octroie aux cellules HCEC un avantage prolifératif dans des conditions de stress oxydatif (induit soit par une inflammation chronique ou par un traitement au TBHP) (Figure 2B).

Exemple 3. Les protéines ZEB1 et ZEB2 induisent un programme génique spécifique accordant aux cellules une résistance au stress oxydatif.

La comparaison des profils d'expression génique des lignées Ech-Inf, Ech-TBHP, HCEC-Zebl et HCEC-Zeb2 à la lignée parentale (HCEC-Par) a permis de mettre en évidence l'activation d'un programme génique commun constitué de l'activation d'une trentaine de gènes et de la répression d'une trentaine d'autres (Figure 3A, gènes activés listés dans la Figure 13). Ce programme appelé ALEP (pour Alternative to EMT Program, alternatif au programme d'EMT communément induit par ces facteurs de transcription) n'inclut aucun des gènes de détoxification connu. L'implication dans l'octroi de cet avantage de survie des deux gènes les plus induits de ce programme, à savoir QPRT et APOE, a été testée. L'expression ectopique de l'un ou de l'autre, avec une efficacité supérieure pour QPRT, confère effectivement un avantage de survie aux cellules dans des conditions d'inflammation chronique ou lorsqu'elles sont soumises à un peroxyde chimique (Figure 3B). Cette observation confirme que plusieurs composantes de ce programme contribuent à accorder un avantage de survie et/ou de prolifération à des cellules épithéliales de colon dans ces conditions de stress. Exemple 4 : L'activation du programme alternatif se traduit par une dépendance des cellules à la protéine QPRT pour leur prolifération ou survie.

La protéine QPRT (pour quinolinate phospho-ribosyl-transférase) est une enzyme à l'origine décrite comme étant impliquée dans la voie de la kynurénine (Liu et al., 2007). Si sa contribution à la production de novo de NAD ⁺ est effective dans le foie et le rein, la protéine QPRT est également présente dans d'autres types cellulaires, assurant vraisemblablement d'autres fonctions, dont l'inhibition de l'activation de la caspase 3 comme récemment décrit dans des cellules HeLa (Ishidoh et al., 2010). La déplétion des cellules HCEC Echap en QPRT induit la mort des cellules par apoptose dans des conditions d'inflammation chronique (Figure 4A). De manière intéressante, l'inhibition de l'expression de QPRT empêche également ces cellules de tolérer des activations oncogéniques (Figure 4B). La comparaison du programme alternatif aux profils d'expression des 55 lignées cancéreuses colorectales de la banque du Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (données GSE36133) (Barretina et al., 2012) met en évidence dans un certain nombre de lignées une expression conjointe de plusieurs des gènes induits du programme ALEP (pas d'expression conjointe des gènes réprimés). L'ensemble des gènes activés du programme ALEP a été utilisé comme signature, les lignées ont été classées selon leur score et leur addiction à QPRT a été évaluée (Figure 5). Sur l'ensemble des lignées analysées, seules les cellules ayant un programme alternatif activé (score de la signature élevé) semblent être dépendantes de la protéine QPRT pour leur prolifération, à en juger par une coloration au cristal violet (Figure 6) et par l'analyse de courbes de prolifération (résultats non montrés). L'ensemble de ces données démontre la pertinence biologique de la signature ALEP et souligne son intérêt en termes prédictifs d'une dépendance à QPRT.

Le score de la signature ALEP est parallèle au taux de protéine QPRT détectée en Western-blot (Figure 6). Pour autant, bien que le programme ne soit pas actif dans la lignée COLO-320, la protéine QPRT y est détectable, à un taux certes plus faible. En immunohistochimie (IHC), le signal détecté dans cette lignée est suffisamment élevé pour être considéré comme faiblement positif.

L'inhibition de la protéine QPRT induit un arrêt de prolifération des lignées colorectales ALEP- positives à en juger par l'accumulation d'histone H3 phosphorylée sur le résidu SerlO. Cet arrêt s'accompagne d'une augmentation de l'autophagie (visualisée par l'accumulation de protéine LC3) et de l'accumulation de dommages à l'ADN (visualisée par l'accumulation de γΗ2ΑΧ). L'inactivation de l'enzyme TD02 située en amont de la protéine QPRT dans la voie de la kynurénine a des conséquences en tout point similaires (Figure 7). Les cellules colorectales ALEP- positives sont donc dépendantes de l'activité de la voie de la kynurénine pour maintenir leur prolifération.

Exemple 5 : L'expression de QPRT est induite dans les phases précoces du développement de cancers colorectaux, développés sur un contexte inflammatoire ou non.

L'analyse de l'expression de QPRT par IHC sur une cohorte de patients atteints de maladies chroniques de l'intestin montre une absence de la protéine dans les entérocytes du tissu normal (à l'inverse des fibroblastes de la lamina propria et des cellules immunes infiltrées qui expriment fortement la protéine), une induction de son expression limitée à quelques cellules épithéliales situées au fond des cryptes dans les muqueuses enflammées (lieu où sont localisées les cellules souches intestinales) et une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées dans les dysplasies de bas-grade (45.4%, n=22), de haut-grade (18.2%, n=22) et de cancers (38.1%>, n=21) développés sur un contexte inflammatoire (Figure 8). De même, l'expression de QPRT est induite dans les cellules épithéliales des adénomes (faiblement ou fortement dysplasiques, 50%, n=20) et des cancers sporadiques (30%, n=10) (Figure 9).

Exemple 6 : Le programme ALEP est induit dans les cellules souches intestinales et constitue un facteur de mauvais pronostic.

La signature génique du programme ALEP a été établie sur un modèle de cellules épithéliales. Pour affiner cette signature de telle sorte à pouvoir l'utiliser sur des tumeurs (en tenant compte de leur hétérogénéité cellulaire), elle a été comparée à deux cohortes de patients atteints de colites ulcératives (UC) ou de maladie de Crohn (CD) depuis plus de sept ans (datasets GSE36807 et GSE37283, (Montero-Melendez et al., 2013; Pekow et al., 2013)). Ces deux séries ont été sélectionnées du fait que les profils géniques aient été établis sur des muqueuses macroscopiquement non- enflammées de telle sorte à limiter l'impact direct de l'inflammation sur les niveaux de transcrits. L'analyse du score de cette signature permet dans les deux cohortes de patients de ségréger clairement deux sous-groupes (Figure 10 A-B). Elle permet en particulier dans la seconde série de patients de distinguer à partir des lésions non-néoplasiques ceux ayant développé des dysplasies ou des carcinomes colorectaux (Figure 10 B). Le score de la signature du programme ALEP reflète donc l'avancée de la maladie. Les analyses de QPRT par IHC révèlent cependant un certain nombre de patients présentant des dysplasies de bas-grade positives et de haut-grade négatives. La détection de QPRT ne semble donc pas constituer un facteur de mauvais pronostic en soi.

La distribution de la signature ALEP a été analysée dans une troisième cohorte de patients (n=466) ayant développé exclusivement des carcinomes colorectaux sur un contexte non-inflammatoire (données GSE39582) (Marisa et al., 2013). Ces tumeurs ont récemment été classées sur la base de leur profil génique en 6 catégories (de Cl à C6). L'analyse de la signature ALEP met en exergue une activation du programme dans un certain nombre de tumeurs (18%>, n=566), indépendamment de leur sous-type moléculaire (Figure 11 A). On peut noter une proportion plus forte de tumeurs positives dans le sous-groupe C4, décrit pour être enrichi en cellules souches (Marisa et al., 2013). Dans cette cohorte, le score de la signature ALEP et celui des signatures de cellules souches intestinales Lgr5 et EphB2 (Merlos-Suarez et al., 2011) corrèlent significativement, confortant l'hypothèse selon laquelle le programme ALEP est induit dans les cellules souches/précurseurs intestinales (Figure 11 B). Comme préalablement démontré pour les signatures EphB2 et Lgr5 (Merlos-Suarez et al., 2011), et démontré pour le sous-groupe C4 (Marisa et al., 2013), la signature ALEP s'avère être prédictive d'un risque de récidive élevé (Figure 11 C).

En conclusion cette analyse met en exergue un groupe de patients distincts, avec un risque de récidive élevé caractérisée par des scores de signatures souches intestinales et de programme ALEP élevé. Exemple 7 : Extension des observations à un deuxième modèle de tumeurs développées sur un contexte inflammatoire.

Les adénocarcinomes œsophagiens tirent leur origine de l'œsophage de Barrett (situé dans le tiers inférieur de l'œsophage) et l'inflammation chronique liée à la remontée de sucs gastriques y joue un rôle clef. L'analyse de QPRT par immunohistochimie montre qu'une proportion des adénocarcinomes testés exprime la protéine QPRT (20%, n=10) suggérant que l'induction du programme puisse dans ce contexte également jouer un rôle clef dans l'initiation tumorale. Aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne (Figure 11). Conclusions : Ces résultats mettent en lumière l'intérêt potentiel que représente QPRT en tant que cible thérapeutique. Ces résultats mettent aussi en évidence un nouveau programme induit dans les cancers gastro-intestinaux, très vraisemblablement au sein des cellules souches. Au-delà de sa valeur prédictive en termes de risque de récidive, l'intérêt de cette signature est de constituer un nouvel outil pour identifier des tumeurs qui pourraient être ciblées par des inhibiteurs de QPRT.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Baker,B.W., et al. (1992). Nucleic Acids Res. 20, 5234.

Barretina,J., et al. (2012). Nature 483, 603-607.

Boehm,J.S., et al. (2005). Mol. Cell Biol. 25, 6464-6474.

Burns,J.C, et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90, 8033-8037.

Dimri,G.P., et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 9363-9367.

Gras,B., et al. (2014). PLoS. One. 9, e92254.

Irizarry,R.A., et al. (2003). Biostatistics. 4, 249-264.

Ishidoh,K., et al. (2010). Biochim. Biophys. Acta 1803, 527-533.

Liu,H., et al. (2007). J. Mol. Biol. 373, 755-763.

Malik,S.S., et al. (2014) Proteins 82, 405-14.

Marisa,L., et al. (2013). PLoS. Med. 10, el001453.

Merlos-Suarez,A., et al. (2011). Cell Stem Cell 8, 511-524.

Montero-Melendez,T. et al. (2013). PLoS. One. 8, e76235.

MoreLA.P., et al. (2012). PLoS. Genêt. 8, e 1002723.

Pekow,J. et al. (2013) Inflamm. Bowel. Dis. 19, 461-470.

Sahm,F., et al. (2013) Cancer Res. 3225-34.

Sayan,A.E., et al. (2009). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106, 14884-14889.

Vallerini,G.P., et al. (2013). J. Med. Chem. 56, 9482-95.

Vecsei, L., et al (2013). Nat. Rev. Drud Discov. 12, 64-82.

Watanabe, T., et al (2013) Clin Can. Res. 13, 415-420.

Zufferey,R., et al. (1997). Nat. Biotechnol. 15, 871-875.