Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prädiktion der therapeutischen

Wirksamkeit von EGFR-Inhibitoren.

Krebs ist nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste

krankheitsbedingte Todesursache in den westlichen Ländern. Die meisten

Todesfälle sind dabei auf maligne Tumoren der Lunge, der weiblichen Brustdrüse, des Darms, der männlichen Prostatadrüse, des Magens, der Ovarien, der

Mundhöhle und der Harnblase zurückzuführen. Diese Karzinome entstehen aus den Epithelzellen der genannten Organe. Sie verursachen lange keine Symptome und werden daher häufig in einem fortgeschrittenen, dann oftmals nicht therapierbaren Stadium erkannt. Phänotypisch wird ein maligner Tumor durch die Fähigkeiten definiert, unkontrolliert und invasiv zu wachsen und in anderen Geweben oder Organen Metastasen ausbilden zu können. Diese phänotypischen Eigenschaften sind die Folge von genetischen Veränderungen der Tumorzellen, die sich in vielen Fällen als Chromosomenaberrationen und DNA- Sequenzmutationen feststellen lassen.

Es wurden Gene identifiziert, so genannte, Onkogene, deren Funktion unmittelbar mit der Transformation einer Zelle zu einer malignen Tumorzelle in

Zusammenhang stehen. Der Tumorgenese und Metastasierung liegt eine Störung bzw. Veränderung dieser für die Signaltransduktion wichtigen Gene zu Grunde, die zu unreguliertem Wachstum, Eindringen (Invasionen) in andere Gewebe über die Basalmembranen und Bildung von Tochtergeschwülsten (Metastasen) führt. Diese kann in allen Signalwegen vorliegen, die Zellen modellieren oder verändern, sowie das empfindliche Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Wachstum gegenüber der Apoptose, also dem programmierten Zelltod, stören. Zu den wichtigsten Signalproteinen, deren kodierende Gene für onkogene Mutationen anfällig sind, zählen die Rezeptortyrosinkinasen (RTKs). RTKs sind

Zelloberflächenproteine, die durch eine einzelne Transmembrandomäne, eine intrazelluläre Domäne mit Proteinkinaseaktivität und eine extrazelluläre

ligandenbindende Domäne charakterisiert sind. Eine Ligandenbindung führt.zu Homo- bzw. Heterodimerisierung der RTKs. Durch die sterisch günstigere Lage der beiden intrazellulären Domänen zueinander erfolgt eine Aktivierung der Tyrosinkinase-Domänen mit der daraus resultierenden Aktivierung einer Autobzw. Transphosphorylierung der carboxyterminalen Region. Es werden dadurch verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden ausgelöst, die die Zellteilung, die Apoptose, die Angiogenese (Blutgefäßbildung), die Zell-Adhäsion und die Motilität der Zellen steuern.

Die am besten charakterisierten Proteine, die mit der Entstehung und Entwicklung des Mammakarzinoms im Zusammenhang stehen, gehören zur so genannten ErbB-Familie, die aus ErbB-1 , ErbB-2, ErbB-3 und ErbB-4 besteht. ErbB ist die englische Abkürzung für„Erythroblastic leukemia viral oncogene". ErbB-1 wird auch als HER1 , ErbB-2 als HER2, ErbB-3 als HER3 und ErbB-4 als HER4 benannt, wobei die Abkürzung HER für„Human Epidermal growth factor

Receptor" steht. ErbB-1 bzw. HER1 wird außerdem als„Epidermal Growth-Factor- Receptor" bezeichnet und als„EGF-Rezeptor" oder„EGFR" abgekürzt. Für EGFR wurde durch zahlreiche Studien an unterschiedlichen Tumorentitäten eine

Überexpression nachgewiesen. Da die Überexpression von EGFR zur Steigerung der Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierungsrate bei Verringerung der Apoptose führt, bietet EGFR einen Angriffspunkt, um durch eine gezielte Therapie (englischer Fachbegriff:„targeted therapy") das onkogene Signal von EGFR und damit das Tumorwachstum zu hemmen. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen: Beispielsweise kann die Dimerisierung blockiert werden, die extrazellulären Rezeptorbindungsstellen können besetzt oder die

Tyrosinkinaseaktivität kann intrazellulär inhibiert werden. Bereits zur Therapie zugelassene niedermolekulare Substanzen sind unter anderem Gefitinib und Lapatinib. Außerdem wurden therapeutische monoklonale Antikörper wie beispielsweise Cetuximab und Panitumumab entwickelt.

Es hat sich allerdings gezeigt, dass nur eine kleiner Anteil der Patienten (ca. < 10%) sehr gut auf die genannten Wirkstoffe ansprechen, während sie bei anderen Patienten praktisch keine klinische Wirkung zeigen. Da die Therapie einerseits teuer ist und andererseits bei manchen Patienten unerwünschte Wirkungen wie z.B. Hautakne zeigt, ist es sinnvoll, nur solche Patienten zu behandeln, die auch auf die Therapie ansprechen. Es besteht daher ein großer Bedarf an einem Verfahren, den Therapieerfolg für einen Patienten individuell vorherzusagen.

Darüber hinaus wurde für die Expression des EGFR in klinischen Studien gezeigt, dass er auch prädiktiv für das Ansprechen auf Chemotherapeutika ist. So wird eine verminderte Sensitivität von EGFR-exprimierenden Tumorzellen gegenüber Anthrazyklinen, platinhaltigen Therapeutika und Taxanen beobachtet. Außerdem sprechen Mammakarzinome mit einer EGFR-Expression nicht auf die

Hormontherapie und Kolonkarzinome nur vermindert auf 5-Fluorouracil an.

Es ist bekannt, dass das kodierende Gen ErbB-1 für den humanen EGF-Rezeptor auf dem Chromosom 7p11.2 lokalisiert ist und 177 kBp umfasst. Durch Abgleich (englischer Fachbegriff:„alignments") der EGFR-cDNA („complementary DNA" oder kurz„cDNA" ist eine DNA, die mittels der reversen Transkriptase aus RNA synthetisiert wird) mit der genomischen Sequenz konnte gezeigt werden, dass der EGF-Rezeptor von insgesamt 28 Exonen kodiert wird. Alle Exone werden von GT- AG Konsensus-Spleißstellen flankiert. Wie von Callaghan und Mitarbeitern bereits 1993 beschrieben („A complete description of the EGF-receptor exon structure: implication in oncogenic activation and domain evolution." Oncogene. 1993 Nov; 8 (11):2939-48. PMID: 8414496), umfasst das humane Exon 1 eine 5 ^'

untranslatierte Region und Sequenzen, die für das Signalpeptid und die ersten fünf Aminosäuren des reifen EGF-Rezeptors kodieren. Die extrazelluläre Region wird durch die Exone 2 bis 16 kodiert, wobei die beiden cysteinreichen Regionen von den Exonen 5 bis 7 und 13 bis 16 kodiert werden. Exon 17 kodiert für die transmembrane Region, die Exone 18 bis 24 für die intrazelluläre

Tyrosinkinasedomäne und die Exone 25 bis 28 für die intrazelluläre

carboxyterminale Region des Rezeptors. Für EGFR wurde in verschiedenen Karzinomen eine Steigerung der Expression beobachtet, wie in der folgenden Tabelle gezeigt. Tabelle 1 : Steigerung der EGFR-Expression. in. menschlichen Tumoren.

EGF als Ligand des EGFR-Proteins wird entsprechend von vielen Krebszellen als Wachstumsfaktor zur Stimulierung der Proliferation genutzt. Neben der

Rezeptorexpression und -aktivierung kommt es in vielen Tumoren zu Mutationen im Gen des EGFR. Die Mutationen umfassen erhöhte Genkopienzahlen

(Amplifikationen) des gesamten EGFR-Gens, wie sie hauptsächlich bei

Glioblastomen zu finden sind. In Mamma-, Mundschleimhaut- und

Blasenkarzinomen finden sich die wesentlich häufigeren Amplifikationen im Intron 1 des EGFR-Gens. Darüber hinaus gibt es Deletionen, die zum Verlust der Ligandenbindungsdomäne (Exone 2 bis 7) und einen konstitutiv-aktiven Rezeptor führen. Die konstitutive Aktivierung der Kinase des EGFR durch Punktmutation in den Exonen 18 bis 21 führen zu einer erhöhten Sensitivität des Rezeptors gegenüber den Tyrosinkinasehemmern Gefitinib und Erlotinib beim

Lungenkarzinom und stellen dort einen Therapieprädiktor für eine kleine

Untergruppe des Lungenkarzinoms (ca. 6%) dar.

Einer erhöhten EGFR-Expressionsrate aufgrund einer erhöhten Genkopienzahl liegen oftmals auch komplexe Veränderungen des Chromosoms 7p und der DNA- Sequenz in dieser Region zugrunde. Im telomeren Bereich des EGFR-Amplikons von Brustkrebszellen befindet sich ein HERV-K-Abschnitt.„HERV-K" ist die Abkürzung für das„Humane endogene Retrovirus K". HERV sind eine Unterfamilie von endogenen Retroviren (ERV), die sich lange zurückliegend in die Keimbahn des Menschen eingekreuzt haben, aber keine intakten Retroviren bilden können. In der telomerwärtigen Startregion des Amplikons wurden im Bereich eines retroviralen HERV-K-Abschnitts durch quantitative PCR (qPCR) Kopienzahlen bestimmt, die, bezogen auf die durchschnittliche Genkopienzahl (englischer Fachbegriff:„Average Gene Copy Number" oder„AGCN") von EGFR, um Faktor .2 bis 16 erhöht waren (Mayer J, Meese EU. The human endogenous retrovirus family HERV-K(HML-3). Genomics. 2002, 80: 331-43. PMID: 12213204; Sauter G et al., Patterns of epidermal growth factor receptor amplification in malignant gliomas. Am J Pathol. 1996, 148(4):1047-53. PMID: 8644846).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und schnell durchzuführendes

Verfahren vorzuschlagen, durch den der Erfolg von Antitumortherapien, die am EGF-Rezeptor ansetzen, vorhergesagt werden kann. Zu diesen Therapien zählen insbesondere niedermolekulare Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI), therapeutische Anti-EGFR-Antikörper, also gegen EGFR gerichtete Antikörper, oder

Chemotherapien mit Anthrazyklinen, platinhaltigen Substanzen, Taxanen oder 5- Fluorouracil.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass einem Patienten eine Zellprobe entnommen wird, ein oder mehrere DNA-Abschnitte im Bereich des EGFR-Gens mittels quantitativer Real-Time-PCR vervielfältigt und quantitativ bestimmt werden und die so erhaltene Kopienzahl als Maß für die zu erwartende therapeutische Wirksamkeit verwendet wird. Dies ist mit der Erfindung einfach, routinemäßig, verlässlich und schnell durchzuführen. Erfindungsgemäß wurde hierzu

nachgewiesen, dass die Genkopienzahl des EGF-Rezeptors mit dem Ansprechen einer Krebstherapie, die am EGFR ansetzt, korreliert. Eine effiziente klinische Diagnostik setzt somit die verlässliche Quantifizierung der Genkopienzahl des EGF-Rezeptors voraus. Allerdings ist die Bestimmung der Genkopienzahl des gesamten EGFR-Gens sehr aufwändig. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Kopienzahl ein oder mehrerer auf dem p-Arm des Chromosoms 7 lokalisierter DNA-Abschnitte mit der Genkopienzahl des gesamten EGFR-Gens korreliert. Daher kann eine Prädiktion über das Ansprechen einer Therapie durch Bestimmung der Kopienzahl eines geeigneten DNA-Abschnitts erfolgen.

Das Verfahren ist vorzugsweise zur Prädiktion des wahrscheinlichen

Therapieerfolgs von therapeutischen, gegen EGFR gerichteten Antikörpern oder von Chemotherapeutika, insbesondere Carboplatin und/oder Paclitaxel, geeignet. Es ist weiterhin zur Prädiktion des wahrscheinlichen Therapieerfolgs von

Kombinationstherapien mit Anti-EGFR-Antikörpern und Chemotherapeutika geeignet.

Da das EGFR-Amplikon dynamisch reguliert wird, ist es vorteilhaft, verschiedene, einzelne seiner DNA-Abschnitte zur Quantifizierung heranzuziehen, um eine effiziente prädiktive Diagnostik für die Therapie mit EGFR-Inhibitoren zu betreiben. Es hat sich dazu gezeigt, dass die Exone 3, 4, 5, 7, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 und 21 des EGFR-Gens bzw. des HERV-K1 -Abschnitts oder HERV-K2-Abschnitts des EGFR-Amplikons besonders geeignete DNA-Abschnitte für die quantitative Real-Time-PCR sind. Deren Kopienzahl kann einzeln oder in Kombination quantitativ bestimmt werden. Bisher wurden Quantifizierungen von HERV-K- Abschnitten im EGFR-Amplikon nicht im Zusammenhang mit Amplifikationen des EGFR-Gens durchgeführt. Beispielsweise können jeweils die Kopienzahl der DNA-Sequenz von Exon 7 und die Kopienzahl der DNA-Sequenz des HERV-K1 - Abschnitts bestimmt werden. Aus den gemessenen Werten wird dann ein

Mittelwert gebildet, wodurch die Messgenauigkeit des Verfahrens verbessert wird.

Für die Vervielfältigung der genannten Exone des EGFR-Gens mittels

quantitativer Real-Time-PCR werden Primer mit den Sequenzen gemäß Anspruch 3 verwendet. Die Primer sind außerdem in der Tabelle 7 aufgeführt.

Für die Vervielfältigung des HERV-K1 -Abschnitts oder des HERV-K2-Abschnitts werden Primerpaare mit den Sequenzen gemäß Anspruch 4 verwendet. Die Primer sind außerdem in der Tabelle 8 aufgeführt.

Eine therapeutische Wirksamkeit von Inhibitoren gegen den EGF-Rezeptor ist wahrscheinlich, wenn die gemessene Kopienzahl der bestimmten DNA-Abschnitte einzeln oder im Durchschnitt über 1 ,35 liegt. Dies heißt, dass bei einem Wert von über 1 ,35 von einem therapeutischen Ansprechen der Inhibitoren gegen den EGF- Rezeptor auszugehen ist und deshalb eine Therapie empfohlen wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt wenige bis hin zu Einzeizellen verwendet, die aus einem Primärtumor oder seiner Biopsie gelöst wurden. Auch ist es möglich, Einzelzellen, die sich von einem Primärtumor gelöst haben und in Körperflüssigkeiten gefunden werden, zum Beispiel im Blut, zu verwenden. Dies erhöht die Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität der

quantitativen Bestimmung. Die Identifizierung der Tumorzellen erfolgt durch Antikörpermarkierungen. Dazu werden einzelne oder wenige Zellen analysiert, die entweder als zirkulierende Tumorzellen aus dem Blut, im Aszites, der

Pleuraflüssigkeit oder Lymphknoten, nachfolgend abgekürzt als verstreute

Tumorzellen bezeichnet (englischer Fachbegriff: STC für Spread Tumor Cells). In den STC wird ein sehr frühes Stadium der Metastasierung gesehen, wobei weniger als 0,001 % der aus einem soliden Tumor freigesetzten Tumorzellen die Fähigkeit besitzen, Metastasen zu bilden. Das Auftreten von tumorfernen, einzelnen STC ist im Unterschied zur manifesten Metastasierung reversibel und daher kurativ therapierbar. Ein weiterer Vorteil ist dabei, dass eine Analyse auch nach bereits erfolgter Entfernung des soliden Primärtumors erfolgen kann. Das Einwandern einzelner Tumorzellen in tumorferne Gewebe oder Organe ohne die Ausbildung von soliden Metastasen, bezeichnet man als„minimale residuale Krebserkrankung". Die vorliegende Erfindung schließt mit ein, dass die hier gezeigte Methode zur Diagnose der möglichen Entstehung von Metastasen und zur Prädiktion des Erfolgs einer Antitumortherapie auch nach bereits. erfolgter Entfernung eines Sekundärtumors, Tertiärtumors und möglicher weiterer erfolgen kann.

Es hat sich gezeigt, dass als Probe Zellen aus primären Tumoren der Mamma, der Ovarien, der Mundschleimhaut, der Harnblase, der Lunge und des Darms, sowie Lymphknoten, Knochenmark, Tumorzellen aus dem Blut, und/oder Biopsien der oben genannten Tumoren, und ihrer Metastasen, insbesondere Lebermetastasen von Darmkrebs, Aszites, Pleuraflüssigkeit, Absaugflüssigkeit der Brust (englischer Fachbegriff:„Nipple Aspirate Fluid") oder Abstriche geeignet sind.

Wenn die Anzahl der Kopien des Chromosoms 7p und der Anzahl der Kopien des EGFR Gens mittels quantitativer PCR über die Verwendung von Sequenzen der Chromosomen 2 und 10 und der LINE1 repetitiven Sequenz bestimmt wird, kann die Genauigkeit des Verfahrens weiter verbessert werden.

Die Erfindung umfasst außerdem ein Kit zur Prognose der therapeutischen

Wirksamkeit von Inhibitoren gegen den EGF-Rezeptor und/oder

Chemotherapeutika, insbesondere Carboplatin und/oder Paclitaxel, wobei das Kit Reagenzien und/oder Reaktionsbehälter und/oder andere Mittel zur Durchführung des beschrieben Verfahrens aufweist.

Die Erfindung wurde anhand der Brustkrebszelllinie MDA-MB-468 validiert. Diese besitzt den Phänotyp eines invasiven Mammakarzinoms. Die Zelllinie MDA-MB- 468 trägt im Bereich des Chromosoms 7p11-14 eine distinkte Amplifikation, die das EGFR-Gen einschließt. Die Zelllinie MDA-MB-468 trug eine durchschnittliche AGCN (Genkopienzahl) für EGFR von ungefähr 30, wobei der Wert 1 als diploider Satz definiert wurde. Mittels Durchflusszytometrie und Anti-EGFR-Antikörper wurden in einer Population von MDA-MB-468 Zellen Subpopulationen isoliert, die eine erhöhte bzw. verminderte EGFR-Expression zeigten. Die anschließende Untersuchung durch komparative genomische Hybridisierung (englischer

Fachbegriff: Comparative Genomic Hybridization oder abgekürzt CGH),

Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (abgekürzt FISH) und quantitative Real-Time PCR (abgekürzt q PCR) zeigten, dass MDA-MB-468 heterogen für den EGFR- Locus und die AGCN war. Es bestand eine positive Korrelation zwischen der AGCN für EGFR und dessen Expression.

Es wurden drei Subzelllinien von MDA-MB-468 hergestellt, die sich in der durchschnittlichen AGCN des EGFR unterscheiden. Durch permanente EGF- Stimulierung wurden MDA-MB-468 Subzelllinien mit absteigender AGCN für das EGFR-Gen generiert (MDA(+): 2 bis 3 Genkopien; MDA0107: 3 bis 7 Genkopien; MDA0106 14 bis 17 Genkopien). An ihnen konnte der Zusammenhang zwischen Genkopienzunahme und Zunahme der mRNA-Expressionshöhe bestätigt werden (Agelopoulos et al., Selective regain of egfr gene copies in CD44+/CD24-/low breast Cancer cellular model MDA-MB-468. BMC Cancer, 2010;10:78. PMID: 20199686).

Für die MDA-MB-468 Subzelllinie konnte ein mehrstufiges Amplifikationsmuster beschrieben werden, wobei die Länge des Amplikons mit steigender AGCN für EGFR zunahm. Dabei bildete das Amplikon der Subzelllinie MDA(+) das zentrale Element des Hauptamplikons aus. Dem Hauptamplikon wurden zwei weitere Regionen telomer- und zentromerwärts des zentralen Elementes zugeordnet. Diese Regionen zeigten ab dem Amplikon der Subzelllinie MDA0107 Zugewinne an DNA. Eine gering amplifizierte Region schloss sich zentromerwärts dem Hauptamplikon von dem Subklon MDA0106 und MDA-WT an. In der

telomerwärtigen Startregion des Amplikons wurden im Bereich eines retroviralen HERVK-Elements (Mayer und Meese, The human endogenous retrovirus family HERV-K(HML-3). Genomics. 2002 Sep;80(3):331-43. PMID: 12213204; Sauter et al., Patterns of epidermal growth factor receptor amplification in malignant gliomas. Am J Pathol. 1996 Apr;148(4):1047-53. PMID: 8644846) durch qPCR Kopienzahlen bestimmt, die - bezogen auf die AGCN von EGFR - um Faktor 2 bis 16 erhöht waren.

In Zellen mit der niedrigsten AGCN für EGFR konnte ein zentrales Element von 561.146 bp (Basenpaare) im entsprechenden Amplikon des EGFR-Gens identifiziert werden. In Zellen mit höherer AGCN ist dieses zentrale Element zur telomeren Seite hin mit 147.444 bp ausgedehnt. Weitere Extensionen wurden in Zellen mit der höchsten AGCN gefunden. In diesem Fall zeigt die amplifizierte Region einen kleinen zusätzlichen Teil der zentromeren Seite des zentralen Elements von 623.560 bp. Die gesamte amplifizierte Region reicht von Position 54.475.287 zu Position 55.807.437. Diese schloss, mit Ausnahme der MDA-MB- 468 Subzelllinie mit nahezu diploider EGFR-Genkopienzahl, jeweils das EGFR- Gen in voller Länge ein. Das Amplikon der Subzelllinie MDA(+) zeigte nach den Exonen 4 bis 7 keine erhöhte AGCN für EGFR.

Die Figur 1 a zeigt die Struktur eines EGFR-Amplikons S1 mit einer hohen EGFR- Genkopienzahl auf Chromosom 7p. Jedes Nukleotid des Amplikons ist als Punkt dargestellt, wobei die Abszisse die Position in der Sequenz zeigt. Die Ordinate zeigt als logarithmiertes Verhältnis die DNA-Kopienzahl von normaler DNA zur Variation der Tumor-DNA-Kopienzahl. Das Amplikon besteht aus drei Hauptteilen, wobei die Grenzen des Amplikons mit den 1 und 3 bezeichneten vertikalen Linien dargestellt sind. Die Linie 1 zeigt die Grenze des Amplikons zur telomeren Seite, die Linie 3 zur zentromeren Seite hin. Die Position des EGFR-Gens wird durch die mittlere Linie 2 angezeigt. Die drei Teile des Amplikons sind somit das eigentliche EGFR-Gen sowie seine beiden Extensionen zur telomeren Seite bzw.

zentromeren Seite hin. Links von der Linie 1 bzw. der telomeren Extension des Amplikons verläuft die Basislinie des logarithmierten Verhältnisses der DNA- Kopienzahl, die mit 4 gekennzeichnet ist. Das logarithmierte Verhältnis liegt hier bei etwa 0, d.h. es liegt die gleiche DNA-Kopienzahl in Tumorzellen und normalen Zellen vor. Dagegen liegt das logarithmierte Verhältnis der DNA-Kopienzahl des Amplikons aus Tumorzellen zu normalen Zellen zwischen -2 und -4, d.h. es liegen mehrere Kopien dieses Sequenzabschnitts vor.

Die Figur 1b zeigt die Struktur eines EGFR-Ampiikons S3.2 mit einer geringen EGFR-Genkopienzahl auf Chromosom 7p. Es besteht ebenfalls aus den drei Hauptteilen, wobei deren Grenzen durch vertikale Linien dargestellt sind. Die Position des EGFR-Gens wird durch die mittlere Linie 2 angezeigt. Die linke Linie 1 zeigt die Grenze der telomeren Extension, und die rechte Linie 3 die Grenze der zentromeren Extension des EGFR-Amplikons. Bei dem Amplikon in Zellen mit geringer EGFR-Genkopienzahl ist im Vergleich zu Zellen mit hoher EGFR- Genkopienzahl die zentromere Extension deutlich kürzer.

Die Figur 2 zeigt die Struktur des Amplikons bei verschiedenen Kopienzahlen des EGFR-Gens. Die Abszisse zeigt die Position in der Sequenz. Die Ordinate zeigt das logarithmierte Verhältnis die DNA-Kopienzahl von normaler DNA zu der Variation der Tumor-DNA-Kopienzahl. Hierbei weist der linke Teil in Richtung zur telomeren, der rechte Teil in Richtung zur zentromeren Seite. Kurve 1 1 zeigt das Amplikon mit 2 bis 4 EGFR-Genkopien; Kurve 12 das Amplikon mit 6 Kopien; Kurve 13 das Amplikon mit 8 Kopien; Kurve 14 das Amplikon mit 12 Kopien und Kurve 15 das Amplikon mit 30 Kopien. Die vertikalen schwarzen Linien zeigen dabei jeweils die Positionen der EGFR-Exone an.

Die AGCN des EGFR-Gens von einzelnen oder wenigen Zellen wurde mithilfe von qPCR)-Assays (quantitativen PCR-Assays) bestimmt. Die qPCR-Assays wurden vom 5 ^' -Ende des EGFR-Amplikons her und für das EGFR-Gen mit seinen Exonen 4 bis 21 durchgeführt. Die qPCR wurde durch einen SYBR green-Assay mit 58 Sequenzen für die Bestimmung der EGFR-Amplifizierung optimiert. Die

Aussagekraft der qPCR-Assays lag zwischen 98,07 % und 99,02 %, wobei der Durchschnitt 98,78 % und die Standardabweichung 0,36 war.

Tabelle 2: AGCN für verschiedene MDA-MB-468 Subzelllinien.

Exon 4 Exon 7 Exon 9 Exon 15 Exon 21 MDA-low 2,18 2,37 2,55 1 ,68 2,03

MDA-Re1 6,41 5,67 5,21 5,44 6,33

MDA-Re2 28,51 20,33 22,56 25,99 21 ,97

MDA-WT 45,57 36,59 40,50 50,80 42,42

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse quantitativer PCR Assays der Exone 4, 7, 9 15 und 21 des EGFR-Gens für verschiedene MDA-MB-468 Subzelllinien. Dabei bezeichnet„MDA-WT" den Wildtyp,„MDA-low" Zellen mit geringer Amplifikation des EGFR-Gens und „MDA-Re1 " und „MDA-Re2" Zellklone mit zwei unterschiedlichen Amplifikationen des EGFR-Gens. Die über die verschiedenen Exone (Exon 4, 7, 9, 15 oder 21) bestimmten AGCN des EGFR-Gens lagen jeweils im vergleichbaren Rahmen (Tabelle 2).

Tabelle 3: Quantitative Einzelzell-PCR der Exone 7 und 9 von Knochenmark- und Blutproben. H, starke, relative Amplifikationen des EGFR-Gens; L, schwache, relative Amplifikationen; SD, Standardabweichung.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der qPCR-Analysen für Exon 7 und 9 in einzelnen Tumorzellen aus dem Blut oder Knochenmarksproben von Patienten mit metastasierendem Brustkrebs. Es sind Messungen der relativen EGFR- Genkopienzahl von einzelnen Tumorzellen gezeigt. Starke, relative Amplifikationen des EGFR-Gens sind mit einem „H", schwache, relative Amplifikationen mit einem„L" gekennzeichnet.

Der Vergleich der über die Exone 7 oder 9 gemessenen Mediane der relativen EGFR-Genkopien von Nicht-Tumorzellen und Tumorzellen ergab beispielhaft, dass bei Tumorzellen der Median mindestens 1 ,35 betrug. Es ist davon auszugehen, dass auch bei den anderen Exonen 3, 4, 5, 14 bis 17 und 19 bis 21 des EGFR-Gens und des HERV-K1- und HERV-K2-DNA-Abschnitts der Median bei Tumorzellen mindestens 1 ,35 betrug.

Tabelle 4: In vitro-Therapieresistenz von Brustkrebszellen gegenüber Gefitinib (abgekürzt als Ge) und Lapatinib (abgekürzt als La).

Die Tabelle 4 zeigt die in vitro-Therapieresistenz von Brustkrebszellen, die von der gleichen Zelllinie abstammen. Zellen mit hoher AGCN des EGFR-Gens, nämiich mit 30 Kopien, waren Wildtyp-Zellen, die mit„WT" bezeichnet sind. Zellen mit mittlerer AGCN, nämlich mit 10 Kopien, sind als„reamplifiziert" und Zellen mit unterdrückter AGCN, nämlich mit 2 bis 4 Kopien, sind als„supprimiert" bezeichnet. Für jede Zelllinie wurde jeweils ein Ansatz in An- bzw. Abwesenheit des

Wachstumsfaktors EGF kultiviert, der in der Lage ist EGFR zu aktivieren und damit unter anderem Zeilproliferation anregt. Die mit dem nachgestellten Zusatz„- EGF" gekennzeichneten Zelllinien wurden in Abwesenheit des Wachstumsfaktors EGF kultiviert. Abwesenheit von EGF vermindert in EGF-abhängigen Tumorzellen unter anderem die Proliferation im Vergleich zu EGF-abhängigen Tumorzellen, die in Anwesenheit von EGF kultiviert werden. Aus dem Vergleich der

Zellkulturansätze mit bzw. ohne EGF im Zellkulturmedium lässt sich zeigen, in wie weit die untersuchten Tumorzellen tatsächlich abhängig von EGFR als

Wachstumsfaktorrezeptor waren. Die Zellen wurden mit den EGFR-Inhibitoren Gefitinib, in den Spalten als„Ge" bezeichnet, und Lapatinib, in den Spalten als„La" bezeichnet, mit verschiedenen Konzentrationen behandelt. Die Spalten zeigen jeweils die Messwerte für den Inhibitor bei einer bestimmten Konzentration an. Die Spalte Ge 5 zeigt also die Messwerte für Gefitinib bei einer Konzentration von 5, die Spalte Ge 10 die Messwerte für Gefitinib bei einer Konzentration von 10 usw. an. Bei den

Messwerten handelt es sich um normierte Proliferationsraten der jeweiligen Brustkrebszellen.

Anhand der Brustkrebszelllinie MDA-MB-468, die als Zellmodell metastasierender Brustkrebszellen anzusehen ist, und dreier Subzelllinien von MDA-MB-468, ließen sich hier sowohl Unterschiede in der Struktur des Amplikons als auch der durchschnittlichen Kopienzahl des Gens (AGCN) des EGF-Rezeptors feststellen. Die Behandlung dieser Zelllinien zeigte eine Therapieresistenz gegenüber einer Behandlung mit den niedermolekularen EGF-Inhibitoren Gefintinib bzw. Lapatinib, wenn deren EGFR-Genkopienzahl relativ gering war.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden für die klinische Routine-Diagnostik und -Prognostik die Kopienzahl für HERV-K des EGFR-Amplikons oder die Exone 7 und 9 des EGFR-Gens bestimmt. Hierbei können je nach gewünschter

Genauigkeit einer der drei genannten Genabschnitte oder zwei oder alle zusammen hinsichtlich ihrer Kopienzahl bestimmt werden. Wie oben gezeigt wurde, beträgt der Median der Messwerte in Nicht-Tumorzellen ungefähr 0,9. Alle Mediane über 1 ,35 der Exons 7 oder 9 repräsentieren eine Vervielfältigung des EGFR-Gens. Bei Messwerten über 1 ,35 ist daher ein Ansprechen auf EGFR- Inhibitoren wahrscheinlich.

Ausführungsbeispiele

Die hier beschriebenen methodischen Ausführungsbeispiele wurden einerseits für die Validierung der Erfindung, andererseits für den Anwendungsteil der Erfindung aufgeführt. Die für die Erfindung wesentlichen Anwendungen umfassen die Aufarbeitung und den Nachweis von disseminierten Tumorzellen und die qPCR unter Verwendung der spezifischen Primerpaare.

1.1. Quantitative Real-Time PCR Die quantitative Real-Time PCR (qPCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA, basierend auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die zusätzlich die Quantifizierung der gebildeten DNA in Echtzeit erlaubt. Die Quantifizierung erfolgt jeweils am Ende eines jeden PCR-Zyklus über die Fluoreszenz eines Reportermoleküls, die proportional zur gebildeten DNA-Menge zunimmt. Der Methode liegt die Annahme zugrunde, dass die erste signifikant messbare Zunahme an Fluoreszenz proportional zu der Menge des eingesetzten Startmaterials ist. Dies setzt eine maximale Effizienz der Reaktion voraus, die einer Verdopplung pro PCR-Zyklus entspricht. Die korrekte Quantifizierung kann deshalb nur im exponentiell verlaufenden Teil der PCR-Reaktion durchgeführt werden, der oft nur wenige Zyklen andauert. Als Reportermoleküle wurden hauptsächlich der DNA-interkalierende Farbstoff SYBR green sowie doppelt gelabelte Hydrolysierungs-Sonden (TaqMan-Sonden) verwendet.

Die quantitative Real-Time PCR wurde im Mastercycler S Realplex (bezogen von Eppendorf, Hamburg) entweder unter Verwendung des QuantiTect SYBR green Master Mixes (bezogen von Qiagen, Hilden) oder des qPCR MasterMix Plus, No ROX (bezogen von Eurogentec, Liege, Belgien) für TaqMan Probe Assays durchgeführt. In einer qPCR wird - anders als in einer konventionellen PCR - die Anzahl der gebildeten DNA Moleküle mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen am Ende von jedem Zyklus gemessen.

Anschließend konnte für SYBR green-Assays eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden, anhand derer sich indirekt über deren Schmelztemperatur die Fragmentlänge(n) und die Spezifität bestimmen ließ. Indem die Temperatur kontinuierlich von 60°C auf 90°C erhöht wurde, wurde die DNA aufgeschmolzen, so dass einzelsträngige DNA entstand. Der Farbstoff SYBR green wurde freigesetzt, der als Fluoreszenzabnahme registriert wurde. Da unspezifische Primerdimere einen niedrigeren Schmelzpunkt besaßen als die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten, wurde eine Unterscheidung möglich. Die Höhe des Peaks der Schmelzkurve, also des Gipfels, gab ebenfalls Auskunft über die Menge des gebildeten Fragments und somit über die Anfangskonzentration der DNA oder cDNA (Ferre F., Quantitative or semi-quantitative PCR: reality versus myth. PCR Methods Applications 1992; 2: 1-9. PMID: 1490169). Aufgrund der Sensitivität der Methode wurden alle Proben in Triplikaten gemessen, um abweichende Messwerte identifizieren zu können. Für die absolute Quantifizierung wurden in jedem PCR-Lauf Kalibrierungsgeraden für das Zielgen sowie die Referenzen gemessen. Für die Quantifizierung von DNA wurde für die Messung der Kalibrierungsgerade 15 pg bis 10 ng DNA in einer seriellen 1 :4 Verdünnung eingesetzt. Als Template für die Quantifizierung von DNA wurde jeweils

Leukozyten-DNA verwendet. Es war notwendig sicherzustellen, dass die gemessenen DNA Mengen innerhalb der Kalibrierungsgerade lagen, da nur so ein linearer Verlauf der PCR-Reaktion vorausgesetzt werden konnte. Für die

Kalibrierungsgeraden wurde jeweils die lineare Regression der Datenpunkte ermittelt.

Um eine reproduzierbare Messung der AGCN für EGFR zu erreichen, wurde der Assay auf Basis von TaqMan-Sonden und unter Verwendung von zwei

Referenzregionen entwickelt. Da Tumore mit fortschreitender Entwicklung zunehmend Aberrationen akkumulieren, zu denen Punktmutationen, Deletionen, Amplifikationen sowie Additionen oder Reduktionen von Chromosomenarmen oder ganzen Chromosomen bis hin zu polyploiden Chromosomensätzen gehören, war die Auswahl der Referenzregionen von entscheidender Bedeutung. Die Auswahl der Referenzregionen wurde basierend auf den Array-Daten und einer anschließenden Literaturdurchsicht getroffen (Naylor et al., High resolution genomic analysis of sporadic breast Cancer using array-based comparative genomic hybridization. Breast Cancer Res. 2005;7(6):R1 186-98. PMID:

6457699). Die Loci auf Chromosom 2 und Chromosom 10 zeigten für

Mammakarzinome geringe Aberrationsraten von <10%. Der Locus des EGFR- Gens wies in >55% aller analysierter Array-CGHs DNA-Zugewinne auf. Neben dem Primer- und TaqMan-Sonden-Design wurden die Primer anhand einer Kalibrierungsgeraden in einem SYBR green Assay auf ihre Effizienzen überprüft.

Der Ansatz unter Verwendung QuantiTect SYBR green Master Mixes umfasste: 7,5 μΙ 2x Master Mix, 0,4 μΙ Primer vorwärts (100 pmol/μΙ), 0,4 μΙ Primer rückwärts (100 pmol/μΙ), 2 μΙ DNA (5 ng/μΙ), ad Aqua dest. 15 μΙ. Das entsprechende

Protokoll der Durchführung der Quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5: Protokoll der Quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR).

Die folgenden Tabellen 6 bis 12 zeigen die Sequenzen der für die verschiedenen Analysen verwendeten Oligonukleotide. Diese weisen eine kennzeichnende Bezeichnung auf. Dabei sind einheitlich Vorwärts-Primer bzw. Sense-Primer mit dem der Bezeichnung nachgestellten Zusatz„F" und Rückwärts- Primer bzw. Antisense-Primer mit dem nachgestellten Zusatz„R" gekennzeichnet. Zusätzliche Primer sind mit einem der Bezeichnung vorangestellten„N" gekennzeichnet. In den Tabellen 7 bis 10 bedeutet der Zusatz„F0" eine telomerseitige, und der Zusatz„E0" eine zentromerseitige Amplikongrenze. Die Tabelle 6 zeigt die Quantifizierung des Chromosoms 2, des Chromosoms 10 und des EGFRs mittels TaqMan Assay.

Tabelle 6: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien.„P" bedeutet "doppelt markiertes Oligonukleotid", und zwar am 5 ^' - Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff 6-FAM-phosphoramidit„[6-FAM]" und am 3 ^' - Ende mit dem 3 ^' -Black-Hole-Quencher-1 a gegen 6-FAM-phosphoramidit.

Für die präzise Quantifizierung der Genkopienzahl von Einzelzellen nach WGA (Abkürzung für„Whole Genome Amplification", lineare Vervielfältigung der Template-DNA) und der Unterscheidung zwischen Polyploidien und distinkten Genamplifikationen des EGFRs, wurde ein weiteres Referenzgenkonzept erstellt. Dieses basierte auf einem Assay mit einem einzelnen Referenzgen, der repetitiven LINE1 -Sequenz, die im menschlichen Genom in ca. 1.000 Kopien vorliegt und dadurch eine präzisere Messung des DNA-Gehalts in einer Zelle nach WGA erlaubt als die Verwendung von diploide Regionen, wie den Chromosom 2- und Chromosom 10-Sequenzen. Bedingt durch die hohe Kopienanzahl der LINE1 konnte eine kostengünstiges Protokoll mit dem interkallierenden DNA-Farbstoff SYBR green etabliert werden. Durch die Einsparung eines zweiten

Referenzassays wurde Raum für ein zweites parallel durchführbares Assay im EGFR-Gen geschaffen. Dies ermöglichte die Verifizierung der Reproduzierbarkeit der Einzelzell-WGAs am EGFR-Gen-Locus im gleichen qPCR-Laufs. Die Effizienz der PCR lag für den Assay mit MDA-MB 468-DNA, die eine 30-fache Amplifikation trägt, bei 98,8%, und mit Leukozyten-DNA als diploider Kontrolle bei 98,6%. Die Effizienzen der PCR waren damit für Mehrfach- und Einzelkopien vergleichbar, womit die Verlässlich keit des Protokolls zur Quantifizierung gezeigt wurde. Für die LINE-1-Assays lag der gemittelte VK bei 9,9%. Die AGCNs für das EGFR-Gen nach Einzelzell-WGA für diploide Zellen lagen im Bereich von 0,2 bis 1 ,7. Bei einem erwarteten Wert von 1 entsprachen der höchste gemessene Wert einer Abweichung von 70% (0,7 CTs (Abkürzung für den englischen Fachbegriff„Cyclus Threshold" für den Zyklus-Schwellenwert)), und der niedrigste Messwert einer . Abweichung von 80% (2,25 CTs). Der Varianzkoeffizient der Messung lag im Mittel bei 1 ,5%.

Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien.

Die Tabelle 7 zeigt die SYBR green Assay-basierte Quantifizierung von LINE1 und EGFR. Es sind die zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl geeigneten Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die Exone 3, 4, 5, 7, 9, 14, 15, 16, 17, 19, 20 und 21 des EGFR-Gens gezeigt. Tabelle 8: Verwendete Oiigonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien: SYBR green Assay-basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 WT, abgekürzt als WT.

Bezeichnung Sequenz (5' 3') Annealing Amplikon SEQ ID

Temperatur [Bp] NO

[°C]

WT-F01-F CAGTCAGCACATTGACACTGG 60 108 37

WT-F01-R AAGTGTGGACCAGCTCTGTCTC 38

WT-F02-F AG C C AG CTCTTTG ATTCTTG G 60 109 39

WT-F02-R CA A AG G AA ACCTATTG CAA G C 40

WT-F03-F TCTGTAGCTCATGGATTACTTGG 60 209 41

WT-F03-R TACCCGTGGGCTGTGTACC 42

WT-F04-F GAATCCAGGTCAAACCATGTG 60 105 43

WT-F04-R TACACAGATGCCTGCTCAAAG 44

HERV-K1-F CCAAAGAAGAGACTCTGAGAGGAC 60 59 45

HERV-K1-R AGTCTTGACATGGCTGTTATTGAG 46

HERV-K2-F G AAATCCAAG CTGTATGTTCAATG 60 268 47

HERV-K2-R ATTAGAAGTCAGCCTAATGCCATC 48

WT-F05-F GGCTCCCATGATTCTCCTG 60 219 49

WT-F05-R G G G CAA CA CTG A G CATTAAG 50

N-WT-F01-F AACCAGCCATATTCCATTCATC 60 212 51

N-WT-F01-R GCCCAAAGTCAGGTCATATACAG 52

N-WT-F02-F TCACCCAAGTCGTGTATGTCAG 60 251 53

N-WT-F02-R CCACTCTCGAAATTGTTCAGC 54

N-WT-F03-F AAGAAAGGTGATGAGCATGGAC 60 50 55

N-WT-F03-R CCCTTAAATTTGAGAACAAGTGG 56

N-WT-F04-F G A AA G CATTTCA G CCTTTCA C 60 174 57

N-WT-F04-R CACATGTTCAAATG AATTG ATG C 58

N-WT-F05-F TTCTTTGCAGATTAAATTGTTTG 60 1 11 59

N-WT-F05-R AGAGGAATAGGCAGATCAATGG 60

N-WT-F06-F ACTGTTCTTGGGTAGATTGTTCTG 60 257 61

N-WT-F06-R TGTTGGTCGTTGTATTTGTTTC 62

N-WT-F07-F TTTAG AAG ATG GATTG GTG AGG AG 60 50 63

N-WT-F07-R CCTGTTCTTGTTCTGACCATTG 64

WT-E01-F CTCCAGAAGCCCTGACATTG 60 91 65

WT-E01-R CTTCCTCCTATCCCTCACTGC 66

WT-E02-F CTG G GAG G ACAAG GTAAGAG G 60 208 67

WT-E02-R AATGGTG GAGTCACAG CTCAC 68

N-WT-E01-F GGGACCACATCTTACTCTCCAG 60 149 69

N-WT-E01-R ACAGCACCTTCCTCCTTACATC 70

N-WT-E02-F AGGAGAGTGCAGTGAGGGATAG 60 71 71

N-WT-E02-R ACAGCACCTTCCTCCTTACATC 72

N-WT-E03-F TACCAACAGTTCTCCCTCATCC 60 144 73

N-WT-E03-R AGTCTG CGGTGTAG AG G AAATC 74

N-WT-E04-F ATATAGATTCGGCAGCCTTCAG 60 120 75

N-WT-E04-R TCCAATATCCAAGAGGCAGAAC 76

N-WT-E05-F TCCTCAAAGATTGGTTTGTTTG 60 288 77

N-WT-E04-R TCCAATATCCAAGAGGCAGAAC 76 Tabelle 9: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien: SYBR green Assay-basierte Validierung der Tiling Array Daten MDA-MB-468 0106, abgekürzt als 0106.

Tabelle 10: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien: SYBR green Assay-basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 0107, abgekürzt 0107.

Tabelle 1 1 : Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA- Genkopien: SYBR green Assay-basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 +, abgekürzt MDA+.

Tabelle 12: Verwendete Oligonukleotide zur Charakterisierung der telomerwärts gerichteten Amplikongrenze von MDA-MB-468 WT, abgekürzt WT.

1.2. Auswertung

Zur Auswertung der Daten wurden je nach Versuchsansatz zwei unterschiedliche Methoden für die absolute oder relative Quantifizierung verwendet. Grundsätzlich unterschieden sich die beiden Methoden durch den Einsatz einer

Kalibribierungsgeraden (Rutledge und Cote, Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of Standard curves. Nucleic Acids Res., 2003, Vol. 31 , No. 16 e93. PMID: 12907745) für die absolute Quantifizierung, die bei relativer Quantifizierung durch eine einzelne Referenzprobe ersetzt wurde, zu der die Proben jeweils relativ in Bezug gesetzt wurden. Die Relative Quantifizierung (PfaffI, Real-time RT-PCR: Neue Ansätze zur exakten mRNA Quantifizierung. BlOspektrum 1/04, 10. Jahrgang. Holzapfel und Wickert, Die quantitative Real- Time-PCR (qRT-PCR). Biologie in unserer Zeit. 2007 Band 37, Nr. 2, S. 120-126) setzte voraus, dass die Effizienzen der zu vergleichenden Assays identisch waren. Die Effizienz der Assays wurde durch eine Kalibrierungsreihe über die Steigung bestimmt. Als Kontrolle für die Quantifizierung von DNA wurde jeweils Leukozyten- DNA eingesetzt. Da bei dieser Art der Berechnung die Kontrolle als arbiträre Konstante betrachtet wurde, floss diese nicht in die Fehlerberechnung ein. Die Fehlerberechnung wurde wie folgt durchgeführt: Der Wert CV (Koeffizient der Variation) entsprach dem Mittelwert für die absolute Quantifizierung (Pfaffl, Realtime RT-PCR: Neue Ansätze zur exakten mRNA Quantifizierung. BlOspektrum 1/04, 10. Jahrgang. Holzapfel und Wickert, Die quantitative Real-Time-PCR (qRT- PCR). Biologie in unserer Zeit. 2007 Band 37, Nr. 2, S. 120-126) wurden in jedem PCR-Lauf Kalibrierungsgeraden für das Zielgen sowie die Referenzen gemessen. Für die Quantifizierung von DNA wurde für die Messung der Kalibrierungsgeraden 15 pg bis 10 ng DNA in einer seriellen 1 :4- Verdünnung eingesetzt. Als Template für die Quantifizierung von DNA wurde jeweils Leukozyten-DNA verwendet. Es war notwendig sicher zustellen, dass die gemessenen DNA Mengen innerhalb der Kalibrierungsgerade lagen, da nur so ein linearer Verlauf der PCR-Reaktion voraus gesetzt werden konnte. Für die Kalibrierungsgerade wurde jeweils die lineare Regression der Datenpunkte ermittelt.

1.3. Zellkulturbedingungen

Alle Zelllinien wurden in sterilen Kulturflaschen der Firma Nunc (Wiesbaden) kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in Hera150-Brutschränken (Heraeus Kendro, Langselbold) bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre mit 5% (v/v) C0 ₂ . Die Zelllinien wurden abhängig der Zellteilungsrate ein- bis zweimal wöchentlich unter sterilen Bedingungen bei einer Konfluenz von etwa 80% passagiert. Hierzu wurden die adhärent-wachsenden Zellen mit PBS bei 37°C gewaschen und anschließend mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,02% (w/v)) von der Kulturschale abgelöst. Der Vorgang wurde durch Zugabe von frischem vorgewärmtem

Vollmedium gestoppt und die resuspendierten Zellen in einer Dichte von 20% bis 30% ausgesät. Zur längeren Lagerung von eukaryotischen Zellen wurden die Zellen in Flüssigstickstoff bei -196°C eingefroren. Um die Bildung von Eiskristallen in den Zellen zu verhindern, wurden den Zellen durch Zugabe des stark hygroskopischen Dimethylsulfoxids (DMSO) langsam das Wasser entzogen. 2x10' Zellen wurden in 1 ml Einfriermedium (10% (v/v). DMSO, 90% (v/v) Vollmedium) resuspendiert, in Kryotubes (Nunc, Wiesbaden) überführt und auf -80°C gekühlt. Nach 24 h (die Maßeinheit„Stunde" ist stets als„h" abgekürzt") wurden die

Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert. Um die kryokonservierten Zellen wieder in Kultur zu nehmen, wurden die Zellen nach dem Auftauen (37°C im Wasserbad) mit Vollmedium gewaschen, um das toxische DMSO zu entfernen. Die im Vollmedium resuspendierten Zellen wurden in T75-Zellkulturflaschen ausgesät.

2.1. DNA-Quantifizierungsmethoden zur Untersuchung des EGFR-Amplikons in

Tumorzellen und Fine Tiling Array-CGH

Die Methode der CGH (Comparative Genomic Hybridization) dient zum

spezifischen Nachweis von Veränderungen in der DANN-Kopienzahl. Die Methode beruht auf der gleichzeitigen Hybridisierung gleicher Anteile von unterschiedlicher fluoreszenzmarkierter Test- (Tumor-DNA) und Referenz-DNA (normale DNA) auf Metaphasechromosomen oder auf Mikroarrays mit cDNA-Klonen, BAC-Klonen oder Oligonukleotiden. Tumor- und Referenz-DNA wurden dabei gleichzeitig auf normale Metaphasechromosomen (klassische CGH), BAC-Klonen, cDNA oder Oligonukleotiden (Array-CGH) hybridisiert. Sowohl die Proben-DNA, als auch Referenz DNA (Nimblegen) wurden vor der Hybridisierung mit

Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um nach der Hybridisierung durch Einlesen an einem Microarray-Scanner quantifiziert werden zu können. Die Markierung der Proben-DNA erfolgte mit Cy3 (Kanal 532 nm), die der Referenz DNA mit Cy5 (Kanal 633 nm). Bei der hier verwendeten Fine Tiling Array-CGH wurden nach unseren Spezifikationen erstellte Arrays verwendet. Pro Array standen ohne die firmeneigenen Qualitätskontrollen 395.000 Oligonukleotide zur Verfügung, die bei einer Länge von 50 bis 75 Basen und einem Tiling (Überlappung) von 15 Basen, wobei alle 15 Basen ein neues Oligonukleotid beginnt, einen maximalen

abzubildenden Bereich von etwa 5,7 Megabasen ergaben. Das Design des Arrays wurde von der Firma Nimblegen (Wisconsin, USA) durchgeführt. Die

Oligonukleotide wurden auf eine einheitliche Hybridisierungstemparatur von 76°C eingestellt. Diese sollten spezifisch für das menschliche Genom sein. Dies, führte jedoch dazu, dass in einigen Bereichen mit hochkonservierten oder repetitiven Sequenzmotiven kein eindeutiges Probendesign möglich war, so dass Lücken in der abzubildenden Sequenz auftraten. Basierend auf Daten von älteren Arrays mit BAC-Klonen umfasste unser Array-Design einen Bereich von etwa 4,7 Megabasen auf Chromosom 7 im Bereich des EGFR-Gens, sowie 177 Kilobasen auf

Chromosom 2 und 196 Kilobasen auf Chromosom 10, den beiden Bereichen, in denen die Referenz-Assays unserer quantitativen Real-Time PCR liegen (Auswahl basierend auf Naylor et al., High resolution genomic analysis of sporadic breast Cancer using array-based comparative genomic hybridization. Breast Cancer Res. 2005;7(6): R1186-98. PMID: 16457699). Dieses Array-Layout erlaubt eine hochauflösende Abbildung der Sequenzbereiche, die zuvor mit quantitativer Real- Time PCR untersucht wurden. Als Proben wurden Leukozyten-DNA als

Normalreferenz, drei Tumorzelllinien mit einer Amplifikation des EGFR-Gens (A431 , BT20, MDA-MB-468), die hemizygote Tumorzelllinie MCF-7, die nur noch eine Kopie des EGFR-Gens trägt, drei Subklone der Zelllinie MDA-MB-468 mit unterschiedlich hoher EGFR-Genkopien, sowie Whole Genome-Amplification (WGA)-Produkte dieser Linie aus 500 Zellen und sechs Einzelzell-WGAs verwendet. Von diesen Proben wurden jeweils 2,5 μg hochmolekulare DNA mit einer Konzentration von etwa 250 ng/μΙ benötigt. Dabei sollte das Verhältnis der optischen Dichten des Absorptionsmaximums von Nukleinsäuren, gemessen bei 260 nm, zum Absorptionsmaximum von Proteinen, gemessen bei 280 nm, >1 ,7 entsprechen, und eine Aussage über die Pröteinfreiheit der Nukleinsäure-Lösung treffen. Das Verhältnis der optischen Dichten bei 260 nm zu 230 nm sollte bei >1 ,5 liegen, und eine Aussage über die Reinheit einer RNA-Lösung gegenüber bestimmten Verunreinigungen mit organischen Substanzen wie z.B. Phenolaten, Thiocyanaten oder anderen, die ein Absorptionsmaximum bei 230 nm haben, treffen.

2.2. Hybridisierung der Fine Tiling Array-CGH

Die Probenvorbereitung, die Markierung, die Hybridisierung, sowie die

Datenerfassung wurden von der Firma Nimblegen durchgeführt. 2.3. Auswertung der Fine Tiling Array-CGH

Die erhaltenen Datensätze wurden mit dem Algorithmus Quantsmooth unter Verwendung der Regionen von Chromosom 2 und Chromosom 10 normalisiert und die Signale geglättet. Die Normalisierung und Anpassung der Daten wurden am Institut für Bioinformatik der Universität Hamburg (Dr. H. Pospisil)

durchgeführt.„Quantsmooth" ist Teil eines auf der Programmiersprache R basierten Softwarepackets. Anschließend wurde die Glättungsfunktion des Algorithmus verwendet, um die maximalen Änderungen in den Anstiegen und Gefällen der Arrays zu detektieren. Diese wurden dann als Start- bzw. Endpunkte der jeweiligen Amplikone definiert.

3. Nachweis von EGFR-Gen-Amplifikationen in Mammakarzinom- und

Metastasengeweben

EGFR ist in bis zu 95% der Mammakarzinomen überexprimiert, und wird in einigen Studien mit einer ungünstigen Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs in Zusammenhang gebracht (Übersicht in: Wolfram Dempke, Molekulare Therapie in der Hämatologie, Onkologie, Verlag Unl-Med, Bremen, ISBN: 3837410218). Um eine reproduzierbare Messung der AGCN für EGFR zu erreichen, wurden Assays auf Basis von TaqMan-Sonden und unter Verwendung von zwei

Referenzregionen entwickelt. Da Tumore mit fortschreitender Entwicklung immer mehr genomische Aberrationen akkumulieren, zu denen Punktmutationen, Deletionen, Amplifikationen oder Zugewinne bzw. Verluste von

Chromosomenarmen oder ganzen Chromosomen bis hin zu polyploiden

Chromosomensätzen gehören, war die Auswahl der Referenzregionen von entscheidender Bedeutung. Um die Wahrscheinlichkeit abweichender Messungen zwischen den Referenzen zu minimieren, die eine gesicherte Quantifizierung ausgeschlossen hätten, wurden diese basierend auf der Auswertung von 65 High Resolution Array-CGHs ermittelt (Wang et al., DNA amplification method tolerant to sample degradation. Genome Res. 2004 Nov;14(11):2357-66. PMID:

15520297). Das Panel der analysierten Proben umfasste 47 primäre Mammakarzinome sowie 18 Mammakarzinom-Zelllinien. Das Array-System besaß eine Auflösung von durchschnittlich 0,9 Mb. Die Auswahl der Referenzregionen wurde basierend auf den Array-Daten und einer anschließenden Literatur- Recherche getroffen. Die Loci auf Chromosom 2 und Chromosom 10 zeigten für Mammakarzinome geringe Aberrationsraten von <10%. Der Locus des EGFR- Gens wies in >55% aller analysierter Array-CGHs DNA-Zugewinne auf. Nach dem Primer- und TaqMan Sonden-Design wurden die Primer anhand einer

Kalibrationsgerade in einem SYBR green-Assay auf ihre Effizienzen überprüft. Es ergaben sich Effizienzen von 98,2% (Chromosom 2), 98,4% (Chromosom 10) und 98,7%) (EGFR). Durch eine Schmelzkurvenanalyse sowie die Überprüfung der PCR-Produkte auf einem Agarosegel wurden Primer-Mismatching (englischer Fachbegriff für eine Fehlverknüpfung) und Dimerbildung ausgeschlossen (Sönke Meyer-Staeckling, Untersuchungen zur Struktur eines Amplikons im Intron 1 des humanen epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors: Erstmutation in der

Mammakarzinom-Entstehung. Dissertation, Universität Hamburg, 2009).

4. Bestimmung der Anzahl der Kopien des EGFR-Gens in prämalignem Gewebe der Mundschleimhaut und der weiblichen Brustdrüse

Das Karzinom der Mundschleimhaut ist die häufigste Krebsform im Kopf-Hals- Bereich. In Deutschland erkranken jedes Jahr ca. 10.000 Personen (Altersspitze zwischen 55 und 65 Jahren). Männer sind dabei 3-mal häufiger betroffen als Frauen. Die Mortalität des Schleimhautkarzinoms ist hoch. Die mittlere relative 5 Jahres-Überlebensrate liegt unter 50% und konnte trotz einiger Fortschritte in der Therapie in den letzten 2 Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert werden. Das liegt vor allem daran, dass zwei Drittel der Fälle in fortgeschrittenen Stadien, häufig mit Lymphknotenmetastasen, diagnostiziert werden. Die orale Leukoplakie ist die häufigste orale intraepitheliale Neoplasie. Sie wird als eine Präkanzerose des Mundschleimhautkarzinoms angesehen. Eine frühe Erkennung in einem Stadium, wo die Neoplasie noch nicht invasiv ist und damit intraepithelial vorliegt, würde die Prognose erheblich verbessern.

Wie alle Karzinome entsteht auch das Mundschleimhautkarzinom durch Veränderungen (Mutationen) der DNA und Aberrationen der Chromosomen. im Zellkern. In einer Arbeit von Lippman et al. (Oral cancer prevention and the evolution of molecular-targeted drug development. J. Clin. Oncol. 23, 346-356, 2005) wurden die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen weltweit zu einem Progressionsmodell zusammengefügt. Dabei steht am Anfang der Entwicklung einer oralen intraepithelialen Neoplasie eine Aktivierung der EGFRs und des Enzyms Telomerase, die die zum Zelltod führende Verkürzung der Telomeren der Chromosomen verhindert und so die Weitergabe von Mutationen in Tochterzellen begünstigt. Beide Ereignisse sind möglicherweise miteinander verknüpft.

Es wurde beschrieben, dass die Aktivierung des EGFRs mit einer chromosomalen Aberration am EGFR-Locus auf dem kurzen Arm des Chromosoms 7

zusammenhängt (Werkmeister et al., The erbB oncogenes as prognostic markers in oral squamous cell Carcinoma. Am. J. Surg., 172, 681 -683, 1996; Werkmeister et al., Clinical relevance of aberrations of erbB-1 and erbB-2 oncogenes detected by competitive differential Polymerase chain reaction in oral carcinomas. Oral Oncology 36, 100-105, 2000. PMID: 10889928). Schon in der Leukoplakie, einer oralen intraepithelialen Neoplasie (OIN), sind diese häufig nachweisbar, wenn daraus ein Karzinom entsteht.

Der Nachweis der Aberration erfolgt mit einer etablierten Labormethode, der Fluoreszenz In-situ-Hybridisierung, abgekürzt FISH. Dazu wird ein etwa 4 im dicker Schnitt des Paraffin-eingebetteten Gewebes der Leukoplakie benötigt. Bei der Fluoreszenz In-situ-Hybridisierung wird die DNA der Tumorzellen direkt im Gewebeverband untersucht, d.h. bei dieser Untersuchung bleibt die Histologie der entnommenen Leukoplakie und ihres umgebenden Gewebes erhalten. Der Befund für die molekulargenetische Untersuchung FISH kann so direkt bestimmten Zellen im Gewebeverband zugeordnet werden (,,ln situ"-Analyse).

Die Auswertung der FISH stellte sich als rote und grüne punktförmige Signale im Zellkern dar. Das Signal wird durch die Anlagerung von so genannten DNA- Sonden, die in diesem Fall komplementär zur DNA-Sequenz des EGFR-Gens und der Zentromeren des Chromosoms 7 sind, hervorgerufen. Jede DNA-Sonde trägt Farbstoffe, die durch eine spezielle Anregungswellenlänge des Mikroskops zur Lichtemission (Fluoreszenz) angeregt wurden, und dadurch unter dem Mikroskop sichtbare punktförmige Signale erzeugten. Der Befund wurde unmittelbar mithilfe einer empfindlichen CCD-Kamera aufgenommen und als Bilddatei auf einem Computer gespeichert. Die Methode der FISH ist sehr sensitiv und erlaubt den Nachweis weniger Zellen mit einer Aberration des EGFRs unter tausenden unveränderter Zellen.

Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass in ca. 1/3 der Mammakarzinome und in % des diese umgebenden morphologischen Normalgewebes ein allelisches Ungleichgewicht (AI, Allelic Imbalance) im EGFR Gen auftritt. Die Feinkartierung dieser Genregion mit weiteren Mikrosatellitenmarkern ergab, dass die AI bevorzugt an diesem Locus auftrat (84% aller Fälle mit AI). Mittels quantitativem PCR-Assay zeigte sich, dass die AI auf Amplifikationen zurückzuführen waren, die auch zu einer Überexpression des EGFRs führten. Neben den prämalignen Vorstufen ADH (Atypische duktale Hyperplasie) und DCIS (Duktales Carcinoma in situ) in der Brust der Tumorpatientinnen wiesen auch ihre

Lymphknotenmetastasen die gleiche Mutation im EGFR-Gen-Locus auf. Die Kaplan-Meier-Analyse der Verlaufsdaten ergab für die Patientinnen mit einem AI im EGFR-Gen-Locus ein kurzes, metastasenfreies Intervall. Es kann deshalb angenommen werden, dass der AI im EGFR-Gen-Locus ein frühes Ereignis in der Entstehung eines aggressiven Mammakarzinoms darstellt.

5. Bestimmung der Anzahl der Kopien des EGFR-Gens in einzelnen Tumorzellen in Körperflüssigkeiten

5.1. Aufarbeitung und Nachweis von Tumorzellen in Knochenmarkaspiraten oder

Blut

Das durch Punktion aus dem oberen Beckenkamm und/oder dem Brustbein entnommene Knochenmark wurde in Heparin-enthaltene Monovetten aspiriert. Die mononuklearen Zellen wurden durch eine Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation (Dichte 1 ,077 g/mol) bei 800 x g für 30 min bei Raumtemperatur separiert. Die Interphase mit den mononuklearen Zellen wurde abgenommen und mit 50 ml PBS für 10 min bei 1.400 U/min gewaschen. Abhängig von dem Erythrozytenanteil wurde gegebenenfalls eine zusätzliche Erythrozyten-Lyse nach Angaben des Herstellers durchgeführt (Whole Blood Erythrocyte Lysing Kit, R&D Systems, Minneapolis). Von den mononuklearen Zellen wurden jeweils 7x10 ⁵ Zellen für 3 min bei 1 .000 U/min auf einen Objektträger (Superfrost Plus, Fischer) zentrifugiert (Zytospins). Die Zytospins wurden über Nacht getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C eingefroren.

Die zu untersuchenden Tumorzellen aus einer Blutprobe wurden in einem Zwei- Schrittverfahren bis um das circa 20.000-fache gegenüber den Blutzellen angereichert. Im ersten Schritt wurden in einer Dichtegradienten-Zentrifugation mit 1.068 NycoPrep® (Nycomed, Luxemburg) als Dichtemedium epitheliale Zellen angereichert. Die Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgt dabei wie in Brandt und Griwatz (Two-layer buoyant density centrifugation gradient for enrichment of prostate-derived cells and cell Clusters from peripheral blood. Clin. Chem. 42, Nr. 1 1996 S. 1881-1882. PMID: 8906098) beschrieben. Die Anreicherung von epithelialen Zellen gegenüber dem Blut gelang durchschnittlich um das 20-fache. Während die Erythrozyten weitgehend abgereichert waren, waren Leukozyten nur zu 90% bis 98% abgereichert, weshalb ein weiterer Anreicherungsschritt notwendig war. In einem zweiten Anreicherungsschritt wurden Zytokeratin-positive Zellen mit einer immunomagnetischen Methode angereichert. Zytokeratin 8 bzw. 18 sind dabei Zytoskelettproteine, die spezifisch für Epithelzellen sind. Mit dem MACS®-System (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach), das superparamagnetische Microbeads mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm Durchmesser besitzt, und an die entsprechende Antikörper gebunden waren, konnten in Abhängigkeit der Qualität der Antikörper-Antigen-Bindung Anreicherungen um den Faktor 1 .000 erzielt werden. Insgesamt konnten somit Epithelzellen aus dem Blut um das circa 20.000-fache spezifisch angereichert werden (Dissertation Cord Griwatz, 1996, Westfälische Wilhelms-Universität Münster). Die immunomagnetische

Zeliisolierung ist auch in Griwatz et al. (An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. J. Immunol. Meth. 183, 1995, S. 251-265. PMID: 7602148) beschrieben (siehe auch: Deutsches Patent B. Brandt DE 102 17 102 B4 2005.04.14).

Zur Detektion der Tumorzellen in Zytospins aus Knochenmark oder aus Blut wurden fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet. Hierfür wurden die mononuklearen Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit einer 4 %igen

Paraformaldehyd- bzw. 3,5 %igen Formalin-Lösung fixiert, und anschließend einmal mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) gewaschen. Nach 5 min Permeabilisierung der fixierten Zellen mit 0,2 % (v/v) Triton X (DAKO, Hamburg) wurden die Zellen dreimal für 2 min in PBS gewaschen, und 20 min mit DAKO Blocking Solution (DAKO) oder mit AB-PBS gegen unspezifische

Antikörperbindung blockiert. Für die bei Raumtemperatur durchgeführte Inkubation mit den primär markierten Antikörpern wurden jeweils einer der gegen

Zytokeratine gerichteten Antikörper A45/CY3 (1 :300) (Micromet, München) bzw. CK5/8 oyster red (1 :500) (Progen Scientific GmbH, Heidelberg) zusammen mit CD45/Alexa488 (1 :150) (Denovo Biolabels, Münster) verwendet, der gegen das Leukozyten-spezifische Antigen CD45 gerichtet ist. Nach einmaligem Waschen in PBS wurde eine Kernfärbung mit DAPI für 2 min bei Raumtemperatur

durchgeführt. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in PBS mit einem Deckgläschen fixiert und bis zur Verwendung dunkel bei 4°C aufbewahrt.

5.2. Transfer der Zellen in PCR-Reaktionsgefäße

Um einen Verlust von zu transferierenden Zellen oder Teilen des Zellkerns auszuschließen, wurden zum Überführen spezielle, aus 0,19 bis 0,23 pm starkem Glas geschnittene Stäbchen (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda- Königshofen, auf Anfrage) als Zellträger verwendet. Diese Stäbchen wurden vor ihrer Verwendung mit einem hydrophoben Silan beschichtet, um eine irreversible Bindung der bei der Zelllyse freigesetzten DNA an die Glasoberfläche zu verhindern.

Zur Vorbereitung der Silanisierung wurden die Stäbchen in einer 1 :1 Mischung aus NeoDisher (Dr. Weigert GmbH, Hamburg) und HPLC-gereinigtem Wasser in stark alkalischem Milieu 30 min bei 80°C bis 90°C geschwenkt, getrocknet und für 1 h in konzentrierter Schwefelsäure geschwenkt, um Verunreinigungen und

Fettrückstände von der Oberfläche zu entfernen. Nach rückstandslosem Entfernen der Schwefelsäure durch HPLC-gereinigtes Wasser wurden die Stäbchen 15 min bei 1 15°C im Heizschrank getrocknet. Die Silanisierung erfolgte durch Schwenken in einer 0,5% (v/v) Lösung Octadecyltrichlorsilan in Oktanfraktion (Fluka,

Erlangen) für 2 bei Raumtemperatur. Ungebundenes Silan wurde durch

Schwenken in Ethanol >99,9% (v/v) für eine Stunde bei Raumtemperatur entfernt. Abschließend wurde der Ethanol mit einem scharfen Strahl HPLC-gereinigtem Wasser aus einer Spritzflasche von jedem Stäbchen einzeln entfernt. Der

Lysepuffer bestehend aus 0,25 % (w/v) Sarcosyl, 2 M Guanidinthiocyanat, 0,01 M Natriumeitrat (pH7,0), 1 % (v/v) Dimethylsulfoxid und Nuklease-freiem Wasser enthielt Detergenzien und Schwefelbrücken-spaltende Substanzen. Der Puffer wurde aliquotiert bei -20°C aufbewahrt. Jedem Aliquot wurde vor der Verwendung 60 mM Dithiotreitol als Antioxidationsmittel frisch zugesetzt (verändert nach Hartshorn et al., Rapid, single-tube method for quantitative preparation and analysis of RNA and DNA in samples as small as one cell. BMC Biotechnol. 2005; 5:2. PMID: 15649321). Um eine effiziente Zelllyse zu erreichen, wurden 20 nl Lysepuffer auf ein Ende des Stäbchens gegeben (0,2 μΙ 1 :10 verdünnter

Lysepuffer) und bei Raumtemperatur eingetrocknet. Die Silanbeschichtung bewirkte eine Konzentrierung der Salze des Lysepuffers auf eng begrenzten Raum zu einem so genannten Lysospot. Auf dem Lysospot wurde die zu transferierende Zelle in einem möglichst kleinen Volumen Flüssigkeit abgesetzt. Das Reaktionsgefäß wurde zur Effizienzsteigerung der Lyse >20 min bei -80 °C eingefroren (Spits et al., Whole-genome multiple displacement amplification from Single cells. Nat. Protocols 2006;1 (4):1965-70. PMID: 17487184). Anschließend wurde dem Lysat 1 μ1 1 :10 verdünnte Protease (Qiagen, Hilden) zugegeben und das Reaktionsgefäß 15 min bei 50 °C (Aktivierung der Protease) und 15 min bei 70 °C (Inaktiviemng der Protease) inkubiert.

5.3. Whole Genome Amplifikation (WGA) durch Multiple Displacement

Amplification (MDA)

Die WGA des Genomiphi Kits basiert auf der isothermalen Amplifikation der DNA durch die strangverdrängende Eigenschaft der phi29-DNA Polymerase. Die fast ringförmig geschlossene Polymerase wurde mit 3-Exonuklease geschützten Random Hexamer Primern kombiniert, die zwei Thiophosphat-Modifikationen am Zuckerrückrad des 3 ^' -Endes tragen. Das WGA-Produkt ist doppelsträngig und hochmolekular (>10 kb). Die durchschnittlichen Produktmengen lagen bei

Einzelzellen mit einem genomischen Gewicht von 6 bis 7 pg bei 2,5 bis 3 pg. Aus 1 ng genomischer DNA wurden 5 bis 7 pg Produkt gebildet. Nach der

Proteasebehandlung wurde die Probe nach Herstellervorschrift 2 min auf 95 °C erhitzt und sofort auf Eiswasser gestellt, um einzelsträngige DNA zu bilden.

Anschließend wurden 9 pl Genomiphi Reaction-Buffer und 1 pl Enzyme-Mix hinzugegeben, vorsichtig gemischt, zentrifugiert und anschließend 16 h (Kitversion 1) oder 2,5 h (Kitversion 2) bei 30 °C im Thermocycler inkubiert. Die Inaktivierung der Polymerase erfolgte für 15 min bei 65°C.

Zur Reinigung des WGA-Produkts wurden NucleoSEQ-Säulen (Macherey - Nagel, Düren) verwendet. Diese auf dem Prinzip einer Gelfiltration basierenden Säulen separierten kleine DNA-Moleküle wie Random Hexamer Primer und nicht verbrauchte dNTPs von dem WGA-Produkt. Die Säulen wurden 2 h mit 600 pl Nuklease-freiem Wasser äquilibriert. Nach einer 1 min Zentrifugation bei 3.500 U/min wurden die Säulchen nochmals mit 300 pl Nuklease-freiem Wasser beladen und wiederum 1 min zentrifugiert. Anschließend wurden die Säulchen auf ein frisches Eppendorf Reaktionsgefäß gesetzt, mit 20 pl WGA-Produkt beladen und 5 min. bei 3.500 U/min zentrifugiert. Das gereinigte Produkt wurde anschließend mit 20 pl Nuklease-freiem Wasser verdünnt. Die Qualität und Quantität des WGA- Produkts wurden anschließend am Nanodrop-Spektralphotometer bestimmt.

Die Sequenzierung WGA-amplifizierter DNA aus Einzelzellen wurde zur

Validierung der Replikationsgenauigkeit durch die phi29-Polymerase durchgeführt. Zusätzlich wurde die Kontaminationswahrscheinlichkeit bei dem bestehenden Manipulations- und Amplifikationssystem durch die Anwender oder andere äußere Einflüsse abgeschätzt. Der sequenzierte DNA-Bereich der Exone 5 bis 9 des TP53 Gens wurde durch drei Primerpaare abgedeckt und umfasste eine

Sequenzlänge von 1.300 Basen. Für den Validierungsversuch wurde die

Gliomzelllinie G22 verwendet, die zwei bekannte Punktmutationen innerhalb der DNA-Bindedomäne trug. Es wurde hochmolekulare genomische DNA von G22 als Template für die Sequenzierungen mit drei unabhängig voneinander amplifizierten G22 Einzelzell-WGAs verglichen. Die Punktmutation in Exon 7 hatte einen Aminosäure-Austausch von Glyzin nach Serin zur Folge. Die Mutation in Exon 5 führt zu einem Austausch von Arginin nach Histidin.

Durch die dreifache Wiederholung der Sequenzierung sowohl aus der 3 ^' - als auch aus der 5 ^' -Richtung wurde eine Gesamtlänge von 7.200 Basen sequenziert. Gemessen an der hohen Korrektur-Lese-Aktivität der Polymerase stimmte das Ergebnis mit den Angaben des Herstellers dahingehend überein, dass eine durch die phi29-Polymerase erzeugte Mutation ausgeschlossen werden konnte. Die beiden Punktmutationen zeigten in allen Sequenzierungen eine identische Allelfrequenz. Eine Kontamination mit Fremd-DNA oder -Zellen konnte daraufhin ausgeschlossen werden.

Die Validierung der WGA-amplifizierten DNA aus Einzelzellen durch quantitative Real-Time-PCR wurde unter Verwendung des Genomiphi V2-Kit durchgeführt. Das V2-Kit stellte die Weiterentwicklung des V1-Kits dar. Die Versionen unterschieden sich in zwei maßgeblichen Punkten:

1. Die Amplifikationszeit wurde von 16h des V1-Kits auf 2,5 h des V2-Kits

verkürzt.

2. Kit- Version 1 generierte im Gegensatz zur Kit-Version 2 immer auch

hochmolekulare DNA in der Negativkontrolle (NTC). Laut Hersteller handelte es sich hierbei um verlängerte Hexamer-Primer.

Es wurde eine Testreihe zur Maximierung der Reaktionszeit von Kit-V2

durchgeführt, um den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem noch kein unspezifisches Produkt in der Negativkontrolle generiert wurde. Dies sollte die Produktausbeute der WGA-amplifizierten DNA aus Einzelzellen maximieren. Dieser Versuchsansatz wurde bereits zu einem früheren Zeitpunkt für Kit-V1 durchgeführt. Die Ergebnisse der Testreihen sind in der Figur 3 dargestellt. Die Figur 3 zeigt, dass die vom Genomiphi Kit-V1 gebildete Produktmenge über die Zeit linear anstieg. Die gebildete Produktmenge in der Negativkontrolle lag bei jedem Messpunkt bei etwa 70% der gebildeten Produktmenge der Positivkontrolle. Die vom Genomiphi Kit-V2 nach 5h gebildete Produktmenge in der Negativkontrolle entsprach etwa 80% der gebildeten Produktmenge der Positivkontrolle nach 2,5 h. Die Produktmenge der Negativkontrolle stieg nach 16 h Reaktionszeit um etwa 5% an. Bis zu einer Reaktionszeit von 2,5 h war kein gebildetes Produkt in der Negativkontrolle nachweisbar. Die gebildete Produktmenge beider Genomiphi Kit-Versionen war nach der vom Hersteller empfohlenen Amplifikationszeit identisch. Basierend auf den Ergebnissen der Testreihe wurde die vom Hersteller empfohlene

Amplifikationszeit von 2,5 h beibehalten, um die Bildung von unspezifischen Produkten zu unterbinden.

Um bei der Quantifizierung von Einzelzell-WGAs Ungenauigkeiten identifizieren zu können, die durch die WGA verursacht wurden, wurde ein weiteres Assay- Konzept erstellt. Dieses basierte auf einem einzelnen Referenz-Assay, welches eine LINEI-Sequenz ampiifizierte, die genomweit in ungefähr 1.000 Kopien vorlag und dadurch wesentlich unanfälliger für WGA-bedingte Schwankungen war als normale diploide Regionen. Bedingt durch die hohe Kopienanzahl wurde eine SYBR green-basierte Methode gewählt. Durch die Einsparung eines zweiten Referenzassays wurde Raum für einen zweiten, parallel durchführbaren Assay im EGFR-Gen geschaffen. Dies ermöglichte die Verifizierung der Stabilität der Einzelzell-WGAs am EGFR-Locus innerhalb desselben qPCR-Laufs. Die LINE1- Primer wurden ebenfalls über die Schmelzkurve und ein Agarosegel überprüft.

6. Bestimmung der EGFR-AGCN in Ovarialkarzinomgewebe zur Prädiktion der Resistenz gegenüber Platin-/T axan-haltigen Chemotherapien

Nach der Operation des Primärtumors wurden alle Patientinnen mit einer

Chemotherapie aus Carboplatin und Paclitaxel behandelt. Seit dem Zeitpunkt ihrer Diagnosestellung wurden die Patientinnen beobachtet. Hierbei wurden u.a. die Zeit bis zum ersten Wiederauftreten eines Rezidivtumors und das

Gesamtüberleben betrachtet. Von den Paraffin-eingebettetem Primärtumoren wurden 4 μιη dicke Schnitte entnommen. Anschließend erfolgte die

Mikrodissektion jeweils eines Tumor- und eines Bindegewebsbereiches für die DNA-Isolierung. Als Erstes wurden 20 μΙ Puffer ATL aus dem Qiagen MicroAmp- Kit in ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Die Tumor- und Bindegewebsbereiche wurden am jeweiligen, zu bearbeitenden Objektträger lichtmikroskopisch bestimmt. Danach wurde die Kanüle mit etwas Puffer ATL aus dem

Reaktionsgefäß benetzt und die Mikrodissektion der Tumorzellbereiche erfolgte unter dem Mikroskop. Die Tumorzellen werden mit der Kanüle vom Objektträger , abgekratzt und in das Reaktionsgefäß mit Puffer ATL gegeben. Wenn viel tumorzellfreies Bindegewebe auf dem Objektträger vorhanden war, erfolgte auch die Mikrodissektion dieses Gewebes. Ist das Bindegewebe mit Tumorzellen durchsetzt oder zu wenig Gewebe auf dem Objektträger vorhanden, um genug DNA isolieren zu können, wurde nur Tumorgewebe gekratzt. In diesem Falle war sonst die Herkunft der DNA nicht sicher zu unterschieden.

Aus dem gekratzten Tumorzell- bzw. Bindegewebe wurde die genomische DNA zur weiteren Analyse mit dem Quiagen QIAamp-DNA-Micro-Kit nach den

Vorgaben des Herstellers isoliert. Das vorher gekratzte Tumor- oder

Normalgewebe in 20 μΙ Lyse-Puffer-ATL wurde zusätzlich mit 10 μΙ Proteinase K versetzt und für 15 s im Vortexer geschüttelt. Die Reaktionsgefäße wurden für mindestens 3 h bei 56°C im Thermoblock inkubiert. Für eine bessere Ausbeute an DNA konnte die Inkubation auch verlängert über Nacht erfolgen. Danach wurden die Reaktionsgefäße aus dem Thermoblock genommen, 25 μΙ Puffer-ATL und 50 μΙ Puffer-AL hinzupipettiert und die Reaktionsgefäße für 15 s am Vortexer geschüttelt, was zur Lyse der Zellen führte. Es wurden 50 μΙ Ethanol (96-100%) hinzugegeben, erneut für 15 s mittels Vortexer geschüttelt, und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es kam zur Fällung der DNA. Mit der Eppendorf- Zentrifuge 5418 wurde kurz zentrifugiert, um eventuell Tropfen aus dem Deckel und vom Rand des Reaktionsgefäßes zu entfernen. Der Überstand wurde vorsichtig in ein QiaAmp MinElute-Säulchen überführt und bei 8000 U/min für 1 min mit der Eppendorf Zentrifuge 5418 zentrifugiert. Es kam zur Adsorption der DNA an der Membran am Boden des Säulchens. Das Sammelgefäß zum Säulchen mit der abzentrifugierten Flüssigkeit wurde verworfen, und das Säulchen in ein neues Sammelgefäß hineingestellt. Es wurden 500 μΙ Waschpuffer AW1 in das Säulchen hinzugegeben, und bei 8000 U/min für 1 min mit der Eppendorf-Zentrifuge 5418 zentrifugiert. Wiederum wurde das Sammelgefäß mit der Flüssigkeit verworfen und das Säulchen in ein neues Sammelgefäß hineingestellt. Im Folgenden wurden 500 μΙ Wasch puffer AW2 hinzugegeben und bei 8000 U/min für 1 min mit der Eppendorf-Zentrifuge 5418 zentrifugiert. Das Sammelgefäß mit der Flüssigkeit wurde verworfen und das Säulchen in ein neues Sammelgefäß hineingestellt. In diesen Schritten wurde die DNA zweimal gewaschen, um Rückstände der vorherigen Puffer und eventuelle Zellreste zu entfernen. Um die Membran des Säulchens vollständig zu trocknen erfolgte eine Zentrifugation mit der

EppendorfZentrifuge 5418 bei 13.000 U/min für 3 min. Danach wird das

Sammelgefäß mit der Flüssigkeit erneut verworfen und das Säulchen in ein ,5 ml Reaktionsgefäß hineingestellt. Es wurden 20 μΙ destilliertes Wasser direkt auf die Membran des Säulchens pipettiert, für 3 min bei RT inkubiert, und bei 13.000 U/min für 1 min mit der Eppendorf-Zentrifuge 5418 zentrifugiert. Die DNA wurde von der Membran mit destilliertem Wasser eluiert und im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß gesammelt. Mit dem NanoDrop ND-1000-Spektralphotometer wurde die DNA- Konzentration bestimmt. Hierbei wurde in 1 μΙ destilliertem Wasser gelöste DNA auf das Nano-Drop-Gerät pipettiert und die Konzentration über den Anteil der Absorption der UV-Strahlen mit dem Computer bestimmt. Bei guter DNA- Anreicherung sollte der Absorptionskoeffizient A260nm/A280nm einen Wert von 1 ,8 aufweisen.

Zur Bestimmung der EGFR-AGCN wurde mit der isolierten DNA von Patienten eine quantitative Real-time-PCR wie in Abschnitt 1.1. beschrieben durchgeführt. Nur 10% der Patienten mit einer Amplifikation des EGFR Gens haben ein Rezidiv nach der Carboplatin und Paclitaxel, während 55% mit einem diploiden Tumor für das EGFR-Gen ein Rezidiv nach der Therapie entwickelten.