SECTOR DE LA TÉCNICA.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, la farmacia y la biología molecular, y más concretamente en el campo de la oncología. Específicamente, está relacionada con un método para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano que padece un cáncer al tratamiento con un antagonista del receptor NK1, que permite agrupar a los sujetos en respondedores y no respondedores, asi como al kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método, y su uso.

ESTADO DE LA TÉCNICA. Los receptores NK1 (receptores de la Neurokinina 1 o neuropeptídicos de la Sustancia P y de las taquicininas), están ampliamente distribuidos en las células del organismo. Actualmente se conocen numerosos procesos biológicos en cuya regulación están involucrados los receptores NK1. Los receptores NK1 son receptores del tipo de los receptores acoplados a la proteína G. Como otros receptores, los receptores NK1 tienen sus propios agonistas naturales. El más selectivo de éstos es la Sustancia P. La Sustancia P (SP) es un undecapéptido de origen natural, que pertenece a la familia de las taquicininas, es producido en los mamíferos y su secuencia fue descrita por Veber et al, (US 4,680,283). La familia de las taquicininas también incluye otros péptidos como Neurokinina A, Neurokinina B, Neuropéptido K, Neuropéptido Gamma y Hemokinina I, entre otros. La implicación de la SP y de otras taquicininas en la etiopatogenia de diversas enfermedades ha sido ampliamente referida en la bibliografía científica. En este sentido, la acción de las taquicininas se ha relacionado con la etiopatogenia de enfermedades del sistema nervioso humano como la Enfermedad de Alzheimer, la Esclerosis Múltiple, la Enfermedad de Parkinson, la ansiedad y la depresión (Barker R. et al, 1996; Kramer MS, et al, 1998). También se ha constatado la implicación de las taquicininas en la etiopatogenia de diversas enfermedades con componente inflamatorio como la artritis reumatoide, el asma, la rinitis alérgica, las enfermedades inflamatorias intestinales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (Maggi CA, et al, 1993).

En este sentido, la industria farmacéutica ha desarrollado antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 como medicamentos para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema nervioso central como la depresión, la psicosis y la ansiedad (WO 95/16679, WO 95/18124, WO 95/23798 y WO 01/77100). Se ha descrito que el uso de antagonistas selectivos del receptor NKl es útil en el tratamiento de las náuseas y el vómito inducido por quimioterápicos antineoplásicos, así como en el tratamiento de ciertas formas de incontinencia urinaria (Quartara L. et al, 1998; Doi T. et al, 1999).

En un trabajo publicado en 2003 (Giardina G, et al, 2003) y en otro publicado en 2010 (Huang SC, et al, 2010) se hace una revisión de las patentes más recientes sobre antagonistas de receptores NKl . Se describen las moléculas de los más importantes fabricantes mundiales con indicación de sus posibles aplicaciones entre las que cabe destacar: antidepresivo, antinflamatorio, ansiolítico, antiemético, tratamiento de la colitis ulcerosa y otros.

Se ha publicado que el uso de diversos antagonistas de la SP para inhibir la proliferación de carcinoma de células pulmonares (Orosz A, et al, 1995; Bunn PA Jr. et al, 1994).

Es conocido que los astrocitos del sistema nervioso central expresan receptores funcionales para varios neurotransmisores incluidos los receptores NKl(Palma C. et al, 2000). En los tumores cerebrales, las células gliales malignas derivadas de astrocitos desencadenan bajo la acción de las taquicininas y por mediación de los receptores NKl, la secreción de mediadores que aumentan su velocidad de proliferación. Consecuentemente, los antagonistas selectivos del NKl pueden ser muy útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de gliomas malignos.

En la patente EP 773026 (Pfizer) se hace referencia a la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NKl para el tratamiento de cánceres en mamíferos. Particularmente en el tratamiento de pequeños carcinomas pulmonares, APUDOMAS (tumores de células enterocromafines que se localizan de modo predominante en la mucosa del tubo digestivo. Sus siglas significan "Amine Precursos Uptake and Decarboxylation", utilización y decarboxilación de los precursores de aminas). Por otro lado, en la patente WO 2001001922 se describe el uso de antagonistas de receptores NKl para el tratamiento de adenocarcinomas y muy específicamente los carcinomas prostáticos.

Diversos estudios con antagonistas específicos de los receptores de la neurokinina como el CP- 96341-1 (Pfizer), MEN 11467, SR 48968 (Sanofi) y MEN 11420 (Nepadutant) han demostrado la eficacia de los mismos en el bloqueo de la proliferación celular (Singh D et al, 2000; y Bigioni M. et al, 2005).

Se ha descrito que los antagonistas no peptídicos de receptores NKl inducen apoptosis (muerte celular) en las células cancerosas de diversos tumores como el carcinoma de estómago, el carcinoma de colon (Rosso M, et al, 2008) , el melanoma (Muñoz M, et al, 2010) o el carcinoma de pulmón (Muñoz M, 2012).

La patente ES 2246687 reivindica la utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la SP en la elaboración de una composición farmacéutica para la producción de apoptosis en células tumorales cancerosas de mamíferos. La solicitud de patente española P201 10131 1 (PCT/ES2012/070865) reivindica el uso de agentes modificadores del microambiente peritumoral, en concreto los antagonistas de los receptores NKl, para el tratamiento del cáncer. Por otro lado, la solicitud de patente WO2012020162 describe el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a los receptores NK l , NK2 y/o NK3 , útiles en el tratamiento del cáncer, mediante la producción de apoptosis de las células tumorales.

Actualmente son de uso común en la práctica clínica diversos fármacos dirigidos para antagonizar los efectos de ciertos receptores de membrana con objeto de tratar el cáncer. Los ejemplos más representativos son el uso de anticuerpos monoclonales contra el receptor Her2 para el tratamiento del cáncer de mama y estómago, el uso de fármacos inhibidores de la Tirosín Kinasa para el tratamiento del cáncer del Pulmón y el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor EGFR (Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico) para el tratamiento del cáncer de colon, entre otros. En todos estos casos se conoce la existencia de marcadores biológicos predictivos de la respuesta a dichos tratamientos. Por ejemplo, en el caso del cáncer de mama, es conocido que, en humanos, el anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor Her-2 sólo es efectivo si existe una sobrexpresión de dicho receptor observada mediante la realización de un estudio inmunohistoquímico o una amplificación del gen observada mediante mareaje de dicho gen con sondas específicas que se pueden visualizar, por métodos de hibridación "in situ". En el caso del tratamiento del cáncer de pulmón con fármacos inhibidores de la Tirosín Kinasa, se sabe que estos fármacos sólo son efectivos si existe una mutación del gen que codifica el receptor EGFR, que condicionan una alteración en la estructura del mismo, que condiciona, a su vez que dicho receptor se encuentre "constitucionalmente" y permanentemente activado, mientras que si no existe dicha mutación en este gen, los mencionados fármacos no son efectivos en el tratamiento del cáncer de pulmón. En el caso del cáncer de colon, se sabe que el tratamiento con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor EGFR es efectivo sólo si no existe mutación a nivel del gen K-ras, mientras que si existe mutación a nivel de este gen, que condiciona un cambio a nivel de la proteína codificada por este gen de forma que ésta se encuentra constitucionalmente activada, dichos anticuerpos no son efectivos en el tratamiento de estos tumores cancerosos de colon.

Se ha descrito en la literatura científica que algunas células tumorales pueden tener una forma truncada de receptor NK1 (Gillespie E, et al. 201 1).

Por lo tanto y en conclusión, en la actualidad son conocidos en el estado del arte, los siguientes hechos:

1. Que los receptores NK1 están ampliamente difundidos en el organismo del ser humano.

2. Que las taquicininas y en concreto la SP actúan sobre los receptores NK1.

3. Que la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NK1 ha demostrado efectos sobre las células tumorales, que se traducen en su muerte celular por apoptosis (ES 2246687).

4. Que la utilización de agentes modificadores del microambiente tumoral, en concreto los antagonistas de los receptores NK1, es útil en el tratamiento de los tumores cancerosos (PCT/ES2012/070865).

5. Que el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a los receptores NK1, es útil en el tratamiento del cáncer, mediante la producción de apoptosis de las células tumorales (WO2012020162).

6. Que algunas células tumorales pueden tener una forma truncada del receptor NK1.

7. Que existen marcadores predictivos de respuesta a diversos tratamientos dirigidos a tratar el cáncer mediante la modificación del funcionamiento de diversos receptores de la membrana de las células tumorales, diferentes al receptor NK1.

Es conocido, en el estado de la técnica, que la ruta de las MAP Kinasas, específicamente a través de sus eferentes "aguas abajo" como por ejemplo, ERK o MEK puede modular la proliferación celular a través de varios eferentes, a su vez "aguas abajo", de gran importancia como Fos/Jun o P90rsk, entre otros. Por otro lado, también es conocido en el estado de la técnica, que la ruta de las PI3 Kinasas tiene una gran importancia en el control del ciclo celular. La activación de la ruta de las PI3 Kinasas produce un aumento de uno de sus aferentes finales "aguas abajo" como es AKT. Por lo tanto, algunos tumores utilizan las rutas de las MAP Kinasas y de las PI3 Kinasas, lo que les confiere ventajas competitivas en lo referente a su capacidad de proliferación. Estos tumores presentan altas cantidades de las proteínas ERK, MEK y AKT, que son propias de estas rutas (MAP Kinasas y PI3 Kinasas).

La proteína RAS es un elemento clave de la ruta de las MAP kinasas y de la ruta de la PI3 Kinasa. La proteína Ras ocupa un lugar clave "aguas abajo" en las rutas de señalización de las MAP Kinasas y de la PI3 Kinasas. La mutación del gen K-ras, condiciona la expresión de una proteína "constitucionalmente activada", que mantiene permanentemente activadas dichas rutas, independientemente del estado del receptor y de sus eferentes "aguas arriba", por lo que emite una señal de acitvación de dichas rutas de manera continua, lo que induce un estímulo permanente de la proliferación celular.

No obstante, las anterioridades conocidas, que incluyen la utilización de los antagonistas (antagonistas no peptídicos o anticuerpos -o fragmentos de los mismos-) de los receptores NK1 para la producción de muerte y/o apoptosis en las células tumorales (bien por acción directa sobre estas células tumorales o a través de la modificación del microambiente), actualmente se desconoce que grupos de pacientes podrían responder mejor al tratamiento con antagonistas de los recpetores NK1. Este conocimiento permitiría establecer las dosis del antagonista del receptor NK1 más adecuada y su utilización de manera conjunta con otros tratamientos anticancerosos (por ejemplo, quimioterápicos o fármacos bloqueadores específicos de otras rutas moleculares de importancia en un determinada tipo de tumor) o de soporte propios de pacientes oncológicos, para conseguir un resultado más eficaz y eficiente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN. Breve descripción de la invención

Un primer objeto de la presente invención se refiere a un método in vi tro para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano al tratamiento con un antagonista del receptor NK1, en el que el sujeto padece un cáncer, que comprende usar, como un indicador, los niveles de expresión del receptor NK1. Preferiblemente, se detectan los niveles de expresión del receptor NK1 o del ARNm que codifica para el receptor NK1, en una muestra biológica aislada que comprende células tumorales de un sujeto humano que padece un cáncer. En otra realización preferida, se determina la presencia o no de mutaciones en el gen K-ras en las células tumorales de la muestra biológica aislada. En otra realización preferida, se determina la presencia o no de la proteína ERK en las células tumorales de la muestra biológica aislada. Más preferiblemente, se determina la presencia o no de la proteína AKT en las células tumorales de la muestra biológica aislada. Aún más preferiblemente, se determina la presencia o no de la forma truncada del receptor NKl en las células tumorales de la muestra biológica aislada. Aún mucho más preferiblemente, se determina si las células tumorales de la muestra biológica aislada presentan una forma constitutivamemente activada del receptor NKl .

Un segundo objeto de la invención se refiere a un método in vi tro para clasificar un sujeto humano que padece de cáncer en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los sujetos identificables mediante el método del primer objeto de la invención, y en el que el grupo 2 representa el resto de sujetos.

Un tercer objeto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NKl, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano del grupo 1 identificable mediante el método del segundo objeto de la invención.

Un cuarto objeto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo el método del primer o del segundo objeto de la invención.

Un quinto objeto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo del cuarto objeto de la invención para llevar a cabo el método del primer o del segundo objeto de la invención.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención se refiere al uso de un marcador que se selecciona de entre:

a) el nivel de expresión del receptor NKl, o del ARNm que lo codifica, y/o

b) la presencia de mutación en el gen K-ras, y/o

c) el nivel de expresión de las proteínas ERK, preferentemente ERK1 y ERK2, o del ARNm que las codifica, y/o

d) el nivel de expresión de las proteínas MEK, preferentemente MEK1 y MEK2, o del ARNm que las codifica, y/o

d) el nivel de expresión de la proteína AKT, preferentemente AKT 1 y AKT2, o del ARNm que las codifica, y/o

e) la presencia o no de la forma truncada del receptor NKl, o del ARNm que lo codifica, y/o

f) la presencia del receptor NKl constitutivamente activado, o cualquiera de sus combinaciones, para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano al tratamiento con un antagonista del receptor NKl . Preferiblemente, los marcadores se emplean simultáneamente . Método para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano que padece cáncer al tratamiento con un antagonista del receptor NKl

En la presente invención se demuestra que los tumores que presentan una sobrexpresión del receptor NKl o una amplificación del gen NKl, presentan una mejor (más efectiva) respuesta al tratamiento con los antagonistas del receptor NKl .

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro, de ahora en adelante primer método de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano al tratamiento con un antagonista del receptor NKl, en el que el sujeto padece un cáncer, que comprende usar, como un indicador, los niveles de expresión del receptor NKl .

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se usa como indicador la expresión del receptor NKl, o del ARNm que codifica para el receptor NKl . En otra realización preferida, el primer método de la invención comprende:

a. obtener una muestra biológica aislada que comprende células tumorales de un sujeto humano que padece un cáncer, y

b. detectar los niveles de expresión del receptor NKl o del ARNm que codifica para el receptor NKl, en la muestra obtenida en el paso (a).

Preferiblemente, el resultado del primer método de la invención es indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento) si los niveles de expresión del receptor NKl, o del ARNm que codifica para el receptor NKl, están sobreexpresados en comparación con una muestra o valor de referencia y/o un control que expresa unos niveles indicativos de falta de respuesta.

Más preferiblemente, la sobreexpresión se define como un nivel de expresión del receptor NKl, o del ARNm que codifica para el receptor NKl, aumentado en más del 20% de las células de la muestra biológica aislada obtenida en el paso (a). Aún más preferiblemente, el nivel de expresión del receptor NKl, o del ARNm que codifica para el receptor NKl, aumentado en más del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, y aún muccho más preferiblemente, en más de un 90% de las células de la muestra biológica aislada obtenida en el paso (a).

En una realización, la respuesta es una respuesta a la reducción de la carga tumoral. En una realización alternativa, la respuesta es una mejora o ausencia de deterioro del estado del tumor. En otra realización, la respuesta es un resultado clínico, tal como la supervivencia exenta de progresión o la supervivencia global.

Los sujetos cuya respuesta se predice son sujetos humanos que padecen cáncer. Los términos "sujeto humano", "sujeto" y "paciente" se usan por tanto de manera indistinta en esta memoria descriptiva.

En esta memoria se entiende por receptor NK1 (también denominado receptor de la neurokinina 1, SPR; NK1R; NKIR; o TAC IR) a un receptor acoplado a proteína G (GPCR, del inglés: G protein- coupled receptor s). Se trata de un receptor del tipo de los receptores acoplados a la proteína G, con siete puentes transmembrana, codificado por el gen TAC1R que se encuentra en el cromosoma 2 en humanos. Este gen pertenece a una familia de genes de receptores de taquiquinina. Estos receptores de taquiquinina se caracterizan por la interacción con las proteínas G y contienen siete regiones transmembrana hidrófobas. Este gen codifica para el receptor de la sustancia P taquiquinina, también conocida como la neurocinina o neurokinina 1 . La proteína codificada también está implicado en la mediación del metabolismo de fosfatidilinositol de la sustancia P.

En el contexto de la presente invención, TAC1R se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 (con número en el GeneBank NP_001049.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína NK1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 2 En esta memoria se entiende por ERK (del inglés Extracellular-signal-regulated lañases) a un tipo de proteína que forma parte de la ruta molecular de las MAP Kinasas y que participa en importantes múltiples funciones celulares, de importancia en la fisiopatología del cáncer. La MAP quinasa (ERK) es una serín treonín quinasa que es capaz de traslocarse al núcleo para, allí, regular la transcripción modificando la actividad de proteínas (incluyendo factores de transcripción, modulando así la expresión de distintos genes. En el contexto de la presente invención, ERK1 (también denominada Mitogen-activated protein kinase 3 ó MAPK3) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 3 (con número en el GeneBank M84490.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 3,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ERK1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 4.

En el contexto de la presente invención, ERK2 (también denominada Mitogen-activated protein kinase 1 ó MAPKl) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 5 (con número en el GeneBank M84489.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ERK2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 6

En esta memoria se entiende por MEK un tipo de proteínas que comprende entre otras MEK1 y MEK2. MEK1 (del inglés Mitogen-Activated Protein kinase kinase 1 ó MAPKK1 ó MAP2Kl,es codificada en un gen localizado en el cromosoma 15 (locus 15q22.1q22.3). En el contexto de la presente invención, MEK1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 7 (con número en el GeneBank Ll 1284.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 7,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 7, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MEK1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 8.

En el contexto de la presente invención, MEK2 {Mitogen-Activated Protein kinase kinase 2 ó MAPKK2 ó MAP2K2) es codificada en un gen localizado en el cromosoma 19 (locus 19pl3.3) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 9 (con número en el GeneBank Ll 1285.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 9,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MEK2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 10.

En esta memoria se entiende por AKT un grupo de proteínas que participan en los mecanismos de control de la apoptosis (muerte celular programada) y de la proliferación délas células. Entre ellas destacan, por ejemplo, la proteína AKT1 (también denominada proteín Kinasa B). En el contexto de la presente invención, AKT1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 11 (con número en el GeneBank M63167.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 11,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 11, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína AKT1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 12.

En el contexto de la presente invención, AKT2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 13 (con número en el GeneBank M77198.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 13,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 13, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína AKT2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 14.

En el contexto de la presente invención, se entiende "muestra de referencia" o "valor de referencia" como la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de las proteínas de la presente invención. En una realización de la invención, el valor de referencia se obtiene a partir de la señal proporcionada usando una muestra de tejido obtenida de un individuo que presenta un tumor no respondedor o menos respondedores al tratamiento del cáncer con antagonistas de los receptores NKl . Preferiblemente, las muestras se toman del mismo tejido de varios individuos no respondedores y se combinan, de tal manera que el valor de referencia refleja el valor promedio de dichas moléculas en la población de no respondedores. "Valor de referencia" es el nivel de expresión de una proteína de la invención (receptor NKl, ERK, AKT, o forma truncada del receptor NKl) en la muestra de referencia, o el número de células que expresan una proteína de la invención en una muesta de referencia. El valor de referencia indicativo de la no respuesta para cada proteína concreta debe conocerse antes de llevar a cabo el método de la presente invención. Se prefiere que la muestra de referencia sea del mismo tejido y/u obtenida mediante el mismo procedimiento (opciones descritas anteriormente) que la muestra a partir de la cual se va a predecir la respuesta del individuo. Se prefiere que la muestra se origine a partir de la misma etapa o gravedad del cáncer que la muestra a partir de la cual se va a predecir la respuesta del individuo.

En la presente invención "pronóstico" se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0, 1, 0,05.

Por "predicción de la respuesta" se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado, incluyendo el tratamiento quirúrgico. Especialmente, el término "predicción", como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%), al menos del 95%>. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0, 1 ó 0,05. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado en oncología y conocido por el experto en la materia.

A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0, 1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

En el contexto de la presente invención el término "respuesta positiva" hace referencia a una respuesta, por parte de los pacientes que padecen cáncer, más efectiva al tratamiento con antagonistas del receptor NK1, que otros pacientes que padecen cáncer pero que no reponden de dicha manera efectiva al tratamiento con los antagonistas del receptor NK1. La respuesta puede referirse a las características de los tumores del sujeto. De manera alternativa pero no mutuamente excluyente, la respuesta puede referirse al resultado clínico del sujeto. De esta manera, mediante el primer método de la invención, se puede predecir si un paciente individual mostrará (i) una respuesta (R) al tratamiento con antagonistas del receptor NK1 o (ii) no mostrará respuesta (NR) al tratamiento con antagonistas del receptor NK1.

Siempre que la respuesta se refiera a las características de los tumores del sujeto, la distinción entre R y NR se puede llevar a cabo sobre la base del cambio en el tamaño de la lesión. Por ejemplo, se puede definir "Respuesta" como una disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes al valor inicial, sin la aparición de una nueva lesión. De manera particular, la respuesta puede ser > 5 % de disminución en la carga total del tumor, tal como > 10 % de disminución en la carga total del tumor, > 15 % de disminución en la carga total del tumor, > 20 % de disminución en la carga total del tumor, > 25 % de disminución en la carga total del tumor, > 30% de disminución en la carga total del tumor, > 35 % de disminución en la carga total del tumor, > 40 % de disminución en la carga total del tumor, > 45 % de disminución en la carga total del tumor o > 50 % de disminución en la carga total del tumor, definida cada una como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente. En una realización preferida de la presente invención, la respuesta se define como > 30% de disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes a los valores iniciales, sin la aparición de una nueva lesión. La falta de respuesta (NR) se define de forma contraria a (R). Preferiblemente, sin respuesta (NR) se define como < 30% de disminución en el área del tumor de una o más lesiones medibles, o la aparición de al menos una nueva lesión. Esto incluye normalmente un aumento, tal como > 20% de aumento en el área de una o más lesiones medibles o la aparición de al menos una nueva lesión. Siempre que "Respuesta" se refiera al resultado clínico del sujeto, se puede expresar la "Respuesta" como la supervivencia global o la supervivencia exenta de progresión. La supervivencia de pacientes de cáncer se expresa de manera adecuada generalmente mediante las curvas de Kaplan- Meier, que han recibido su denominación de Edward L. Kaplan y Paul Meier que fueron los que describieron éstas en primer lugar (Kaplan, Meier: Amer. Statist. Assn. 53 :457- 35 481).

En la presente invención, también se demuestra que los tumores que presentan una mutación en el gen K-ras, presentan una respuesta menor (menos efectiva) al tratamiento con antagonistas del receptor NK1.

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invenciónl, en el primer método además se determina la presencia o no de mutaciones en el gen K-ras en las células tumorales de la muestra del paso (a), siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1) si las células cancerosas no presentan mutación en el gen K-ras {K-ras no mutado o "wild typé").

En esta memoria se define ras como un tipo de proteínas que actúan en múltiples rutas de señalización molecular que regulan procesos biológicos de gran importancia en el cáncer, como por ejemplo la proliferación celular, la migración, etc. Una de estas rutas es la ruta de las MAP Kinasas (del inglés Mitogen-Activated Protein Kinases). La familia de proteínas ras, comprende H-ras, N- ras y K-ras. La proteína K-ras es codificada por el gen K-ras, localizado en el cromosoma 12.

En la presente invención también se demuestra que los antagonistas de NK1 son capaces de inhibir el crecimiento y proliferación tumoral, con más eficacia, en aquellos tipos de tumores en los que las vías de señalización de las MAP Kinasas y PI3 Kinasas se encuentran íntegras en las células que los componen, es decir, están activas y no sufren alteraciones las moléculas que las componen, y por lo tanto el tratamiento con dichos antagonistas inhibe la proliferación de las células tumorales a través de las rutas de las MAP Kinasas y PI3 Kinasas, preferentemente a través de la inhibición de la expresión de diferentes efectores "aguas abajo" de dichas rutas, como por ejemplo ERK, MEK (para la ruta de las MAP Kinasas) y AKT (para la rutas de las PI3 kinasas). Sin embargo, cuando dichas vías no están íntegras, el uso de los antagonistas de NK1 presenta una menor efectividad.

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el primer método además se determina la presencia o no de las proteínas ERK y/o MEK, o del ARNm que la/s codifica, en las células tumorales de la muestra del paso (a), siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1) si las células cancerosas presentan las proteínas ERK y/o MEK, o una cantidad elevada de ARNm de dichas proteínas.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el primer método además se determina la presencia o no de la proteína AKT, o del ARNm que la codifica, en las células tumorales de la muestra del paso (a), siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) si las células cancerosas presentan la proteína AKT, o una cantidad elevada de ARNm de dichas proteínas. En esta memoria se define como ERK (del inglés Extracellular-signal-regulated lañases) a un tipo de proteína que forma parte de la ruta molecular de las MAP Kinasas y que participa en importantes múltiples funciones celulares, de importancia en la fisiopatología del cáncer. Por ejemplo ERK1 (también denominada Mitogen-activated protein kinase 3 ó MAPK3) es una proteína codificada en un gen situado en el cromosoma 16. ERK2 (también denominada Mitogen- activated protein kinase 1 ó MAPK1) es una proteína codificada en un gen situado en el cromosoma 22.

En esta memoria se define como MEK un tipo de proteínas que comprende, entre otras MEK1 y MEK2. MEK1 también denominada Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1 ó MAPKK1 ó MAP2K1, es codificada en un gen localizado en el cromosoma 15 (locus 15q22.1-q22.3). MEK2 también denominada Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 2 ó MAPKK2 ó MAP2K2, es codificada en un gen localizado en el cromosoma 19 (locus 19p l3.3).

En esta memoria se define como AKT un grupo de proteínas que participan en los mecanismos de control de la apoptosis (muerte programada) y de la proliferación de las células. Entre ellas destacan, por ejemplo AKT1 (también denominada protein Kinasa B), que se codifica en un gen localizado en el cromosoma 14 y AKT2 que se codifica en un gen localizado en el cromosoma 19.

Además, en la presente invención se demuestra que los tumores que presentan una mayor cantidad de forma truncada del receptor NKl, tienen una mejor (más efectiva) respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NK 1.

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el primer método además se determina la presencia o no de la forma truncada del receptor NKl en las células tumorales de la muestra del paso (a), siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) si las células cancerosas presentan la forma truncada del receptor NKl, o del ARNm que lo codifica.

Por último, en la presente invención se demuestra que las células tumorales con alteraciones en el gen N K l que dete rm inan alte rac i one s e structurale s que hac en que e ste g e n e sté constitucionalmente activo, es decir que el receptor transmita señales "aguas abajo" independientemente que esté o no unido a alguno de sus agonistas, tienen una mejor respuesta (más eficaz) al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el primer método además se determina si las células tumorales de la muestra del paso (a) presentan una forma constitutivamemente activada del receptor NKl, siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) si las células cancerosas presentan una forma constitutivamemente activada del receptor NKl . Más preferiblemente, la determinación de si las células tumorales de la muestra del paso (a) presentan una forma constitutivamemente activada del receptor NKl o no se realiza exponiendo las células a la sustancia P, considerando que las células presentan una forma constitutivamemente activada del receptor NKl, si presentan escasa respuesta proliferativa ante la exposición a la sustancia P. Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.

Así pues, la detección de los niveles de proteínas o del nivel de expresión de los genes puede hacerse por cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia. Así, en otra realización preferida de este aspecto de la invención,

a) la detección de los niveles de expresión del receptor NK1, o del ARNm que codifica para el receptor NK1, o

b) de la presencia o no de mutaciones en el gen K-ras,

c) de la presencia de la proteína ERK, y/o

d) de la presencia de la proteína MEK, y/o

e) de la presencia de la proteína AKT, o

f) de la presencia o no de la forma truncada del receptor NK1,

se realiza por

i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o

ii. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real;

y/o

transferencia Northern, y/o

un procedimiento inmunohistoquímico. En otra realización preferida, la muestra biológica es un tejido reciente, tejido embebido en parafina o ARN extraído de un tejido de un paciente con cáncer. Más preferiblemente, el primer método de la invención se lleva a cabo in vi tro usando una muestra originaria del sujeto humano, y en el que en el momento de tomar la muestra del sujeto humano, el sujeto humano no ha sido tratado con un antagonista del receptor NK1.

En otra realización preferida, la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas NK1, ERK, MEK, AKT y/o el receptor truncado de NK1, se realiza mediante técnicas inmmunológicas. En una realización más preferida, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. En otra realización más preferida, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. En otra realización aún más preferida, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas , inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría. Aún más preferiblemente, la citometría es citometría de flujo.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el sujeto humano padece un cáncer que se selecciona de entre los siguientes: carcinoma gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico, carcinoma de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon, carcinoma de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas, carcinoma renal, preferentemente carcinoma renal de células claras, carcinoma de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama, carcinoma de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides, carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma), sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing, melanoma, cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NKl son antagonistas no peptídicos, y aún más preferiblemente, los antagonistas no peptídicos se seleccionan de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY- 686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP- 100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, , CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP- 99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NKl son antagonistas peptídicos, y aún más preferiblemente, se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra el receptor NKl .

Como se usa aquí "antagonista no peptídico de los receptores NKl " significa cualquier sustancia de naturaleza no peptídica con un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse al receptor NKl y así inhibir su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la SP u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores. Preferentemente, en la presente invención se han ensayado los siguientes antagonistas no peptídicos de los receptores NKl comerciales: L-733,060 ((2S,3S)-3-[(3,5-bis(Trifluoromethyl)phenyl)methoxy]-2-pheny lpiperidine hydrochloride) (Sigma-Aldrich), L-732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl ester) (Sigma-Aldrich), L-703,606 (cis-2-(Diphenylmethyl)-N-[(2-iodophenyl)methyl]-l- azabicyclo[2.2.2]octan-3-amine oxalate salt) (Sigma-Aldrich), WIN 62,577 (Sigma-Aldrich), CP- 122721 (Pfizer), Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), TAK-637 (Takeda/Abbot), Vestipitant ó GW597599 (GSK), Casopitant ó GW679769 (GSK) y R673 (Roche). CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735. De manera similar, se pueden utilizar otros compuestos antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la SP tales como: Vofopitant ó GR-205171 (Pfizer), Ezlopitant ó CJ -11974 (Pfizer), CP-122721 (Pfizer), L-758298 (MSD), L-741671, L-742694, CP-99994, Lanepitant ó LY-303870, T-2328, LY-686017. Son preferidos los compuestos: Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), Vestipitant ó GW597599 (GSK) y Casopitant ó GW679769 (GSK).

Los anticuerpos son compuestos peptídicos con capacidad para unirse de forma altamente selectiva a diversas moléculas orgánicas. Su unión a determinados receptores celulares induce una modificación en la actividad de los mismos, lo que puede determinar una modificación en las actividades fisiológicas habituales del metabolismo celular.

Como se usa aquí "anticuerpo contra los receptores NKl" significa cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal o fragmentos de estos anticuerpos contra los receptores NKl . Un fragmento de anticuerpo significa una parte de un anticuerpo contra los receptores NKl que es de un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse a un epítopo presente en los receptores NKl y así modificar su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la sustancia P u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores.

El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular de diversos receptores celulares, como tratamiento para el cáncer, está ampliamente difundido en la clínica. Entre estos anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, destacan el trastuzumab que es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab que es un anti- ErbB l/EGFR para el cáncer de colon y el bevacizumab que es un anti-VEGFR (receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio vascular) para diversos tipos de cánceres (Adams GP. et al, 2005).

Por "cáncer" se entiende un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. De acuerdo con la presente invención, el antagonista no peptídico del receptor NKl se administra a individuos con un cáncer.

En el contexto de la presente invención, como se usa "fármacos dirigidos a modificar el funcionamiento de los receptores NKl " se refieren a moléculas antagonistas no peptídicos o anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que actúan sobre el receptor NKl y que modifican su funcionamiento, con objeto de la producción de inhibición de la proliferación, producción de muerte y/o apoptosis en las células tumorales, en un mamífero, incluyendo el hombre, bien por acción directa sobre los mecanismos fisiológicos de las células tumorales o bien por la modificación del microambiente tumoral.

En el contexto de la presente invención, la enfermedad es el cáncer, preferentemente carcinoma gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico, carcinoma de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon, carcinoma de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas, carcinoma renal, preferentemente carcinoma renal de células claras, carcinoma de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama y/o carcinoma de mama, carcinoma de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario y/o carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, preferentemente adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar metastatizante y/o carcinoma folicular de tiroides, carcinoma de vejiga, preferentemente carcinoma de vejiga de la orina y/o carcinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, Tumor de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma), sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing (aunque también es de utilidad en el sarcoma del estroma endometrial humano, osteosarcoma y/o rabdomiosarcoma), melanoma, cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma (aunque también es útil en méduloblastoma, retinoblastoma, nefroblastoma y/o hepatoblastoma) y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, leucemias, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, mieloma múltiple.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro, de ahora en adelante segundo método de la invención, para clasificar un sujeto humano que padece de cáncer en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los sujetos identificables mediante el método descrito previamente y denominado primer método de la invención, y en el que el grupo 2 representa el resto de sujetos.

Composiciones farmacéuticas de la invención

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NKl, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano del grupo 1 identificable mediante el segundo método de la invención. Alternativamente, se refiere a una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NKl para su uso en el tratamiento de un sujeto humano del grupo 1 identificable mediante el segundo método de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NKl son antagonistas no peptídicos. Más preferiblemente, los antagonistas no peptídicos se seleccionan de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735 , CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones.

Antagonistas no peptídicos del receptor NKl son, pero sin limitarse, : L-733,060 ((2S,3S)-3-[(3,5- bis(Trifluoromethyl)phenyl)methoxy]-2-phenylpiperidine hydrochloride) (Sigma-Aldrich), L- 732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl ester) (Sigma-Aldrich), L-703,606 (cis-2-(Diphenylmethyl)-N-[(2-iodophenyl)methyl]-l-azabicycl o[2.2.2]octan-3-amine oxalate salt) (Sigma-Aldrich), WIN 62,577 (Sigma-Aldrich), CP-122721 (Pfizer), Aprepitant ó MK 869 ó L- 754030 (MSD), TAK-637 (Takeda/Abbot), Vestipitant ó GW597599 (GSK), Casopitant ó GW679769 (GSK) y R673 (Roche). CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735. De manera similar, se pueden utilizar otros compuestos antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la SP tales como: Vofopitant ó GR-205171 (Pfizer), Ezlopitant ó CJ -11974 (Pfizer), CP-122721 (Pfizer), L-758298 (MSD), L-741671, L-742694, CP-99994, Lanepitant ó LY-303870, T-2328, LY-686017. Son preferidos los compuestos: Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), Vestipitant ó GW597599 (GSK) y Casopitant ó GW679769 (GSK), o combinaciones de los mismos. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NKl son antagonistas peptídicos. Más preferiblemente, los antagonistas peptídicos se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra el receptor NKl .

Estos antagonistas del receptor NKl, tanto peptídicos como no peptídicos, se pueden usarse solos, combinados entre ellos o con diversos agentes anticancerosos que se seleccionan, pero sin limitarnos, de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6- mercaptopurina, 5-fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab, o cualquiera de sus combinaciones.

Kit o dispositivo de la invención Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en delante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar:

a) el nivel de expresión del receptor NKl, y/o

b) la presencia de mutación en el gen K-ras, y/o

c) el nivel de expresión de las proteínas ERK, ERK1 y ERK2, y/o

d) el nivel de expresión de las proteínas MEK, y más preferiblemente MEK1 y MEK2, y/o d) el nivel de expresión de la proteína AKT, preferentemente AKT 1 y AKT2, y/o e) la presencia o no de la forma truncada del receptor NKl, y/o

f) la presencia del receptor NKl constitutivamente activado

en las células cancerosas de la muestra biológica del primer o segundo método de la invención. En una realización preferida el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes NK1, ERK, MEKy/o AKT, para la posterior amplificación por PCR. Preferiblemente, el kit o dispositivo de la invención comprende al menos un anticuerpo que se selecciona de entre:

a) un anticuerpo anti-NKl en su forma completa o "full length"

b) un anticuerpo anti-NKl en su forma truncada

c) un anticuerpo anti-ERK, y/o

d) un anticuerpo anti.MEK, y/o

e) un anticuerpo anti- AKT

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización más preferida, el anticuerpo es monoclonal. En otra realización más preferida, el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo. Más preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en el paso (b.) con una cantidad de referencia.

El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

Cuando para la cuantificación génica y/o proteica mediante el kit de la invención se utiliza la técnica RQ-PCR, una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible, se desea que el kit comprenda adicionalmente un cebador del oligonucleótido poliT además del (de los) oligonucleótido(s) del kit. Estos reactivos pueden estar comprendidos opcionalmente en el kit. Una Transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y l a p o ste rior dete cción con un (o s) o ligonucleótido(s) (sonda de hibridación) complementaria con (parte de) la secuencia diana del ARN de interés. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido . Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos . Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes NK1, ERK, MEK y/o AKT. Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonuleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes NK1, MEK, ERK y/o AKT.

Así, por ejemplo, las secuencias de oligonuleótidos son construidas en la superficie de un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual. Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleóitidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen. La síntesis in si tu sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.

Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos anti- NK1, anticuerpos anti- ERK, anticuerpos anti-MEK, anticuerpos anti-AKT y/o anticuerpos anti- receptor truncado de NK1. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, la micromatriz, o el microarray de la invención, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico del adenocarcinoma de pulmón o del carcinoma escamoso.

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención).

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los habitualmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes, no tienen carácter limitativo y por lo tanto no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Por el contrario, la palabra "consiste" y sus variantes, sí que presentan carácter limitativo, refiriéndose exclusivamente a las características técnicas, aditivo, componentes o pasos que la acompañan. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Ejemplos de la invención

A continuación, se muestran ejemplos a modo de ilustración, sin pretender que sean limitativos de la presente invención, dónde se ponen de manifiesto las ventajas de la invención. Ejemplo 1. Las células cancerosas con mayor expresión del receptor NKl presentan una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl.

Para comprobar que las células cancerosas con mayor expresión del receptor NKl (mayor porcentaje de células con expresión de dicho receptor o mayor intensidad en la expresión del mismo) mostraban una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NKl, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se determinó la presencia del receptor NKl mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica en las mismas y se pusieron en cultivo en presencia de diversos antagonistas de los receptores NKl . Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular.

Sexo

Tipo de tumor (tipo Número

(Hombres Edad Tipo histológico histológico). de casos

/Mujeres)

Carcinoma de estómago. 10 4/6 52±3 Adenocarcinoma

Carcinoma de Colon. 12 5/7 58±4 Adenocarcinoma

Carcinoma de Páncreas. 9 4/5 52±7 Adenocarcinoma

Carcinoma Renal. 9 5/4 52±7 Carcinoma de células claras

Carcinoma de mama. 9 0/9 49±6 Adenocarcinoma ductal.

Carcinoma de Ovario. 9 0/9 52±5 Adenocarcinoma

Carcinoma de 9 0/9 61±5 Adenocarcinoma

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 9 0/9 35±4 Carcinoma de células escamosas

Carcinoma de pulmón 10 8/2 59±5 Carcinoma de células Pequeñas

Carcinoma de pulmón 10 8/2 66±4 Carcinoma de células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides. 9 2/7 46±5 Carcinoma folicular

Carcinoma de tiroides. 9 2/7 38±4 Carcinoma papilar

Carcinoma Vejiga de la 9 7/2 Carcinoma transicional

Orina

Carcinoma de próstata. 9 9/0 70±5 Adenocarcinoma (Gleasson 3+4)

Glioma 9 6/3 59±4 Astrocitoma

Fbrosarcoma 9 6/3 60±4 Fiborarcoma Grado histológico 2

Histiocitoma fibroso 9 6/3 68±5 Histiocitoma fibroso maligno (Grado maligno 3).

Sarcoma de Ewing. 9 5/4 33±4 Sarcoma de Ewing

Melanoma 10 5/5 56±4 Melanoma nodular.

Neuroblastoma 9 5/4 10±5 Neuroblastoma

Leucemia B 9 6/3 24±4 Leucemia crónica B

Leucemia T 9 6/3 31±5 Leucemia crónica T

Linfoma No Hodgking B 9 5/4 51±4 Linfoma B difuso

Linfoma No Hodgkin T 9 5/4 35±5 Linfoma T difuso

Linfoma de Burkitt 9 5/4 25±4 Linfoma de Burkitt

Linfoma de Hodgkin 9 5/4 Linfoma de Hodgkin

Mieloma 9 5/4 61±3 Mieloma múltiple Cultivos celulares. Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en De Bari et al (De Bari et al. 2001). Brevemente, pequeños trozos de los tumores fueron digeridos en una solución de hialuronidasa (Sigma-Aldrich, USA) a una concentración de 1 mg/ml durante 15 minutos a 37°C y posteriormente tratados con 6 mg/ml de colagenasa tipo IV (Invitrogen) durante 2 horas a 37°C. A continuación, se lavaron las células, se resuspendieron en medio de cultivo DMEM con alta concentración de glucosa (Dulbecco ^' s Modified Eagle ^' s Médium, Invitrogen) suplementado con 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen) y con un 1 % de piruvato de sodio (Invitrogen), y se sembraron en placas de cultivo a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado. Cuando las células alcanzaron la confluencia, las células adherentes fueron separadas utilizando tripsina estéril al 0,5% (Invitrogen) y se utilizó entre los pases 3 y 9. Para los ensayos mostrados a continuación, las células tumorales se sembraron en placas a una concentración de 25.000 células por pocilios. Un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se utilizaron como control de supervivencia. Otros grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de de los diferentes antagonistas del receptor NK1 como Aprepitant, Vestipitant, Casopitant y anticuerpos contra dicho receptor (obtenidos de Sigma-aldrich, número de catálogo S8305). Todos los cultivos se mantuvieron durante 48 horas y posteriormente fueron recolectados para su análisis.

Western-Blot. Se comprobó en todas las líneas celulares tumorales que presentaban receptor NK1, mediante la ténica de Western-Blot. Brevemente, la extracción de las proteínas totales se realizó a partir de las muestras obtenidas de los cultivos celulares. Las células se Usaron mediante métodos comúnmente conocidos en el estado de la técnica y se cuantificó su concentración mediante un kit comercial "Protein Assay" de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, S.A. Madrid), siguiendo para ello las instrucciones del fabricante. De cada muestra, se separaron 50 mg de proteína por electroforesis en geles al 10% SDS-poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Dichas membranas fueron incubadas durante toda la noche en una solución de bloqueo (5% de leche descremada en tampón fosfato -PBS- con un 0, 1% de Tween-PBST), seguido de una incubación durante la noche con los anticuerpos primarios diluidos 1/4000 en tampón PBST. Como anticuerpo primario se utilizó el anticuerpo anti-NKl (S8305, Sigma-Aldrich) que reconoce el dominio correspondiente a la región carboxilo terminal del receptor NK1 entre los aminoácidos 393-407. A continuación, las membranas fueron lavadas con tampón fosfato salino (PBS) y en presencia del detergente Tween-20 (PBST) y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante 2 horas a temperatura ambiente (dilución 1 : 10000). Para confirmar que se había cargado la misma cantidad de proteína, las membranas se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-p-tubulina. La detección de anticuerpos se realizó con una reacción de quimioluminiscencia (ECL Western Blot detección; Amersham Life Science, Reino Unido).

Técnicas de inmunohistoquímica. La presencia de receptores NKl también fue analizada mediante técnicas inmunohistoquímicas. Brevemente, una muestra de cada uno de los cultivos de las líneas celulares utilizadas en la presente invención, se centrifugó (5 minutos a 1.500 rpm) y el pellet obtenido se deshidrató mediante un tratamiento a concentraciones crecientes de etanol y, finalmente, en xilol. A continuación, dichas muestras deshidratadas se incluyeron en parafina creándose un bloque de células. Dichos bloques de parafina se cortaron en un microtomo a un grosor de 5 mieras, que se colocaron sobre portaobjetos adecuados para la realización de técnicas de inmunohistoquímica. Posteriormente se desparafinaron mediante su inmersión en xilol, para posteriormente ser hidratados a través de una serie de soluciones que contienen concentraciones decrecientes de etanol, para finalmente, sumergirlos en agua. Después, dichas muestras se sometieron a un tratamiento en olla a presión en tampón citrato lOx a pH 6.0, para obtener una mayor exposición de los antígenos. Posteriormente, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con 0,05 M de tampón Tris, se incubaron con suero de cerdo no-inmune al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para comprobar la expresión de receptores NKl, las muestras celulares se incubaron en presencia de los anticuerpos anti-NKl (S8305, Sigma-Aldrich) diluido 1 : 1000, durante toda la noche a 4 ^o C. Transcurrido dicho tiempo se lavaron en tampón Tris 0,05 M a temperatura ambiente. El siguiente paso fue la adición de los reactivos Envision System-HRP (Dako) durante 30 min a temperatura ambiente. Trascurrido dicho tiempo, se lavaron nuevamente las muestras en tampón Tris 0,05 M, y la inmunorreactividad fue visualizada mediante microscopía de luz con una solución cromogénica con 3,3'-Diaminobencidina (DAB+; Dako, USA). Para diferenciar los núcleos celulares, éstos se tiñeron ligeramente con hematoxilina. Como control negativo, se utilizaron muestras a las que no se les incubó con el anticuerpo primario anti-NKl, siendo reemplazado por suero no inmune. Todas las muestras fueron evaluadas. Para valorar la inmunotinción en cada uno de los casos se realizaron seis cortes a los que se realizó la técnica de inmunohistoquímica. En cada uno de los seis cortes se realizó un contaje de las células en 20 campos de gran aumento (400x) mediante un microscopio de la marca Olympus (modelo CX31). En cada uno de los campos se contó el número de células total y el número de células que presentaban inmunotinción, hallándose posteriormente el porcentaje de células que presentaban dicha inmunotinción. Los tumores se distribuyeron en grupos en función del porcentaje de células que presentaban inmunotinción para el receptor NK1 : grupo 1 a aquellos casos en los que se apreciaba inmunotinción en menos del 20 % de las células cancerosas, grupo 2 a aquellos en los que se observaba inmunotinción entre el 20 y el 80% de las células cancerosasy grupo 3 a aquellos en los que se observaba inmunotinción en más del 80% de las células cancerosas. También se valoró la intensidad de la inmunotinción que se graduó de 1 a 3 (en relación al control). Como control se utlizó una muestra de tejido sano (los controles utilizados en cada caso se detallan en la Tabla 3). Se asignó el nivel de intensidad 1 a aquéllos casos en los que más del 80% de las células tumorales presentaban un nivel de inmunotinción similar al control y el 20% de las mismas , un nivel de intensidad mayor al control. Se asignó el nivel de intensidad 2 a aquéllos casos en los que entre el 40 y el 80% de las células tumorales presentaban un un nivel de inmunotinción de mayor intensidad que el control. Se asignó el nivel de intensidad 3 a aquéllos casos en los que más del 80% de las células tumorales presentaban un un nivel de inmunotinción de mayor intensidad que el control.

En la Tabla 2 se exponen los tipos de tumores de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y la distribución de casos en función de la intensidad de inmunotinción, determinada mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Tabla 2. Características de los tipos de cánceres para los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y distribución de casos en función del porcentaje de células cancerosas que presentaban inmunotinción para el receptor NK1, mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Número de Número de Número de

Tipo de tumor casos del grupo casos del grupo casos del grupo

Número de

(tipo 1 (expresión en 2 (expresión en 3 (expresión en casos (totales)

histológico). menos del 20% el 20-80% de más del 80% de de las células). las células). las células).

Carcinoma de 10 4 3 3

estómago.

Carcinoma de 12 4 4 5

Colon.

Carcinoma de 9 3 3 3

Páncreas.

Carcinoma 9 3 3 3

Renal.

Carcinoma de 9 3 3 3

mama.

Carcinoma de 9 3 3 3

Ovario. Número de Número de Número de

Tipo de tumor casos del grupo casos del grupo casos del grupo

Número de

(tipo 1 (expresión en 2 (expresión en 3 (expresión en casos (totales)

histológico). menos del 20% el 20-80% de más del 80% de de las células). las células). las células).

Carcinoma de 9 3 3 3

endometrio.

Carcinoma de 9 3 3 3

cérvix.

Carcinoma de 10 3 3 4

pulmón

Carcinoma de 10 3 4 3

pulmón

Carcinoma de 9 3 3 3

tiroides

(carcinoma

folicular)

Carcinoma de 9 3 3 3

tiroides

(carcinoma

papilar)

Carcinoma 9 3 3 3

Vejiga de la

Orina

Carcinoma de 9 3 3 3

próstata.

Glioma 9 3 3 3

Fbrosarcoma 9 3 3 3

Histiocitoma 9 3 3 3

fibroso malig no

Sarcoma de 9 3 3 3

Ewing.

Melanoma 10 3 3 4

Neuroblastoma 9 3 3 3

Leucemia B 9 3 3 3

Leucemia T 9 3 3 3

Linfoma No 9 3 3 3

Hodgking B

Linfoma No 9 3 3 3

Hodgkin T

Linfoma de 9 3 3 3

Burkitt

Linfoma de 9 3 3 3

Hodgkin

Mieloma 9 3 3 3

En la Tabla 3 se exponen los tipos de tumores de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular, el control utilizado para la valoración de la intensidad de la expresión inmunohistoquímica del receptor NKl y la distribución de casos en función de la intensidad de inmunotinción. Tabla 3. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular, tipos de tumores de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular, control utilizado para la valoración de la intensidad de la expresión inmunohistoquímica del receptor NKl y distribución de casos en función de la intensidad de inmunotinción.

Tipo de Control Número de Número de Número de Número de tumor (tipo casos casos con casos con casos con histológico). (totales) intensidad intensidad intensidad grado 1 grado 2 grado 3

Carcinoma Células 10 3 4 3

de estó mucosas

mago. gástricas

normales

Carcinoma Células 12 4 5 3

de Colon. mucosa

colónicas

normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

de Páncreas. ductales

pancreático

pancreáticas

normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

Renal. ductales

renales

normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

de mama. ductales

renales

normales

Carcinoma Células de la 9 3 3 3

de Ovario. superficie

ovárica

normales

Carcinoma Células de 9 3 3 3

de las glándulas

endometrio. endometriale

s normales.

Carcinoma Células 9 3 3 3

de cérvix. escamosas

cervicales

normales.

Carcinoma Células 10 3 4 3

de pulmón bronquiales

normales

Carcinoma Células 10 4 3 3

de pulmón bronquiales

normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

de tiroides foliculares Tipo de Control Número de Número de Número de Número de tumor (tipo casos casos con casos con casos con histológico). (totales) intensidad intensidad intensidad grado 1 grado 2 grado 3

(carcinoma tiroideas

folicular) normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

de tiroides foliculares

(carcinoma tiroideas

papilar) normales

Carcinoma Células del 9 3 3 3

Vejiga de la epitelio de la

Orina vejiga de la

orina

normales

Carcinoma Células 9 3 3 3

de próstata. glándulares

prostáticas

normales.

Glioma Astrocitos 9 3 3 3

normales

Fbrosarcoma Fibroblastos 9 3 3 3

normales

Histiocitoma Fibroblastos 9 3 3 3

fibroso normales

maligno

Sarcoma de Fibroblastos 9 3 3 3

Ewing. normales

Melanoma Melanocitos 10 3 4 3

normales

Neuroblasto Neuronas 9 3 3 3

ma normales

Leucemia B Linfocitos 9 3 3 3

normales

Leucemia T Linfocitos 9 3 3 3

normales

Linfoma No Linfocitos 9 3 3 3

Hodgking B normales

Linfoma No Linfocitos 9 3 3 3

Hodgkin T normales

Linfoma de Linfocitos 9 3 3 3

Burkitt normales

Linfoma de Linfocitos 9 3 3 3

Hodgkin normales

Mieloma Células 9 3 3 3

plasmáticas

normales

Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que presentaban mayor porcentaje de células con inmunotinción para el receptor NKl por inmunohistoquímica. En las Tablas 4 a 7 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 4), Casopitant (Tabla 5), Vestipitant (Tabla 6) y anticuerpos contra el receptor NKl - obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 7), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que presentan un mayor porcentaj e de inmunotinción del recpetor NK l . De forma, que en la medida que el porcentaje de células cancerosas que presentan expresión del receptor NKl es mayor, la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl es mayor. Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que presentaban una mayor intensidad de inmunotinción para el receptor NKl por inmunohistoquímica. En las Tablas 8 a 11 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 8), Casopitant (Tabla 9), Vestipitant (Tabla 10) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 1 1), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que presentan una mayor intensidad de inmunotinción del receptor NKl . De forma, que en la medida que la intensidad de la expresión del receptor NKl es mayor, la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl es mayor. En los experimentos reflejados en las Tablas 4 a 1 1, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 1 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl se usó a concentración 1/100. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar. Tabla 4. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Aprepitant en función del porcentaje de células que presentaban inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de 100 10±3 45±3 92±3

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 1 1±4 44±2 95±4

Carcinoma de 100 12±3 47±1 94±6

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 10±3 45±4 93±6

Carcinoma de mama. 100 1 1±1 46±3 94±5

Carcinoma de Ovario. 100 U±2 45±4 93±3

Carcinoma de 100 12±2 49±2 95±4

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 10±2 48±5 95±5

Carcinoma de pulmón 100 9±3 41±3 94±7

Carcinoma de pulmón 100 10±2 42±3 97±6 Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de tiroides 100 10±2 45±2 97±5

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 10±3 47±3 97±6

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 10±2 48±4 96±5

la Orina

Carcinoma de 100 1 1±3 46±6 95±5

próstata.

Glioma 100 1 1±4 47±4 94±6

Fbrosarcoma 100 10±3 48±3 96±5

Histiocitoma fibroso 100 1 1±2 47±2 95±6

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 1 1±2 48±6 94±6

Melanoma 100 1 1±3 49±5 96±4

Neuroblastoma 100 10±3 44±5 97±5

Leucemia B 100 1 1±2 43±4 95±4

Leucemia T 100 1 1±3 46±6 97±5

Linfoma No Hodgking 100 10±2 47±4 96±5

B

Linfoma No Hodgkin 100 1 1±3 48±5 95±6

T

Linfoma de Burkitt 100 10±2 45±6 96±4

Linfoma de Hodgkin 100 10±3 49±3 94±5

Mieloma 100 1 1±2 46±5 95±4

Tabla 5. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Casopitant en función del porcentaje de células que presentaban inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de 100 12±4 46±2 90±2

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 13±3 46±3 92±3

Carcinoma de 100 10±4 45±2 92±4

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 16±4 46±3 91±5

Carcinoma de mama. 100 15±3 47±4 92±3

Carcinoma de Ovario. 100 14±3 49±3 94±4

Carcinoma de 100 16±3 46±3 92±3

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 16±3 47±4 93±3

Carcinoma de pulmón 100 10±2 46±2 92±5 Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de pulmón 100 12±2 45±2 93±4

Carcinoma de tiroides 100 14±3 44±3 94±4

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 16±2 44±2 95±5

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 17±3 45±3 94±6

la Orina

Carcinoma de 100 16±2 45±4 93±4

próstata.

Glioma 100 16±3 46±4 93±5

Fbrosarcoma 100 \5±2 47±5 93±4

Histiocitoma fibroso 100 14±3 46±4 94±5

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 \5±2 47±5 93±5

Melanoma 100 15±3 46±4 93±5

Neuroblastoma 100 16±2 45±4 94±4

Leucemia B 100 17±3 46±5 94±6

Leucemia T 100 16±2 47±5 95±3

Linfoma No Hodgking 100 15±3 46±5 94±4

B

Linfoma No Hodgkin 100 14±2 46±6 94±5

T

Linfoma de Burkitt 100 15±3 46±5 94±5

Linfoma de Hodgkin 100 15±2 47±4 95±4

Mieloma 100 16±3 47±4 94±5

Tabla 6. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Vestipitan en función del porcentaje de células que presentaban inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de 100 1 1±3 48±3 92±3

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 12±4 45±3 91±2

Carcinoma de 100 1 1±3 45±2 91±3

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 10±4 45±3 93±6

Carcinoma de mama. 100 12±3 46±3 93±4

Carcinoma de Ovario. 100 14±4 47±4 95±5

Carcinoma de 100 15±3 44±3 93±6

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 17±4 46±3 94±4 Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de pulmón 100 15±2 45±2 93±4

Carcinoma de pulmón 100 16±3 46±3 93±3

Carcinoma de tiroides 100 16±3 45±3 95±5

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 15±3 47±5 96±4

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 15±3 47±4 92±5

la Orina

Carcinoma de 100 17±4 46±3 92±5

próstata.

Glioma 100 15±4 45±4 92±4

Fbrosarcoma 100 16±3 45±3 91±3

Histiocitoma fibroso 100 15±4 46±4 91±5

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 16±3 46±4 90±6

Melanoma 100 16±3 45±4 92±6

Neuroblastoma 100 17±2 46±3 93±3

Leucemia B 100 16±5 47±5 92±5

Leucemia T 100 17±4 46±3 94±4

Linfoma No Hodgking 100 14±3 45±5 93±5

B

Linfoma No Hodgkin 100 13±4 46±4 93±6

T

Linfoma de Burkitt 100 12±3 45±3 92±4

Linfoma de Hodgkin 100 14±3 46±3 92±5

Mieloma 100 \5±2 45±4 93±6

Tabla 7. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpo contra el receptor NKl, en función del porcentaje de células que presentaban inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células).

Carcinoma de 100 21±4 51±4 95±5

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 22±4 53±4 94±4

Carcinoma de 100 23±3 53±4 96±5

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 22±4 52±5 94±5

Carcinoma de mama. 100 22±4 54±4 96±5

Carcinoma de Ovario. 100 24±4 55±5 97±6

Carcinoma de 100 22±5 53±3 96±5 Tipo de tumor (tipo Control Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 histológico). (expresión en (expresión en el (expresión en menos del 20% 20-80% de las más del 80% de de las células). células). las células). endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 24±3 54±4 95±5

Carcinoma de pulmón 100 23±4 55±5 94±3

Carcinoma de pulmón 100 24±4 56±3 95±4

Carcinoma de tiroides 100 25±2 54±3 96±4

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 22±4 53±5 94±3

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 23±5 54±3 95±5

la Orina

Carcinoma de 100 23±4 57±4 96±4

próstata.

Glioma 100 24±5 54±3 97±4

Fbrosarcoma 100 23±4 55±5 97±5

Histiocitoma fibroso 100 22±4 56±3 96±6

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 23±4 54±3 95±4

Melanoma 100 24±5 55±5 96±5

Neuroblastoma 100 22±4 54±4 95±4

Leucemia B 100 23±3 55±4 95±5

Leucemia T 100 24±2 56±5 96±6

Linfoma No Hodgking 100 23±3 54±4 96±4

B

Linfoma No Hodgkin 100 23±4 55±3 96±5

T

Linfoma de Burkitt 100 24±4 54±4 97±4

Linfoma de Hodgkin 100 22±4 55±3 97±5

Mieloma 100 23±3 56±6 96±6

Tabla 8. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Aprepitant en función de la intensidad de la inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de

histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de 100 25±6 57±5 96±4

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 26±6 56±6 95±5

Carcinoma de 100 27±7 56±5 94±3

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 27±6 57±6 95±6

Carcinoma de mama. 100 28±6 58±5 95±7

Carcinoma de Ovario. 100 23±6 58±6 96±8

Carcinoma de 100 25±7 59±5 94±5

endometrio. Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de cérvix. 100 27±4 56±4 95±4

Carcinoma de pulmón 100 28±5 57±5 95±3

Carcinoma de pulmón 100 29±6 56±6 96±4

Carcinoma de tiroides 100 26±6 57±5 95±5

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 27±6 56±4 94±6

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 26±5 57±3 96±6

la Orina

Carcinoma de 100 27±5 58±6 93±7

próstata.

Glioma 100 28±7 55±6 97±4

Fbrosarcoma 100 27±6 54±5 95±5

Histiocitoma fibroso 100 28±7 56±5 94±3

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 27±6 57±4 95±6

Melanoma 100 26±4 55±5 96±7

Neuroblastoma 100 27±6 57±6 97±5

Leucemia B 100 28±5 54±5 95±6

Leucemia T 100 27±7 53±5 96±5

Linfoma No Hodgking 100 27±5 55±5 97±6

B

Linfoma No Hodgkin 100 26±5 55±3 92±3

T

Linfoma de Burkitt 100 27±5 55±3 92±5

Linfoma de Hodgkin 100 26±5 55±3 92±6

Mieloma 100 28±5 55±3 92±5

Tabla 9. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Casopitant en función de la intensidad de la inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de

histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de 100 31±3 53±3 91±3

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 32±4 54±4 92±2

Carcinoma de 100 33±5 53±3 93±1

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 34±2 55±5 91±4

Carcinoma de mama. 100 35±3 56±6 92±2

Carcinoma de Ovario. 100 33±4 54±4 91±3

Carcinoma de 100 34±5 55±5 94±4

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 33±3 53±3 92±2

Carcinoma de pulmón 100 32±4 54±4 93±3

Carcinoma de pulmón 100 33±2 55±3 94±4

Carcinoma de tiroides 100 34±3 54±5 93±2

(carcinoma folicular) Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de tiroides 100 35±4 55±6 92±3

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 34±4 56±4 93±4

la Orina

Carcinoma de 100 33±5 53±3 94±2

próstata.

Glioma 100 36±3 54±5 91±3

Fbrosarcoma 100 35±6 55±3 92±4

Histiocitoma fibroso 100 32±5 53±4 93±2

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 33±4 54±3 92±4

Melanoma 100 34±3 52±4 93±3

Neuroblastoma 100 35±4 55±5 94±4

Leucemia B 100 36±3 52±3 92±5

Leucemia T 100 34±2 56±4 93±3

Linfoma No Hodgking 100 32±3 55±5 94±4

B

Linfoma No Hodgkin 100 36±5 54±5 92±2

T

Linfoma de Burkitt 100 37±5 55±3 93±3

Linfoma de Hodgkin 100 34±5 54±4 92±4

Mieloma 100 35±3 55±3 93±3

Tabla 10. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con Vestipitan en función de la intensidad de la inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de

histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de 100 19±4 49±4 92±4

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 18±5 46±4 91±5

Carcinoma de 100 21±4 47±5 91±5

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 21±3 46±4 93±4

Carcinoma de mama. 100 19±4 45±3 93±3

Carcinoma de Ovario. 100 15±3 46±2 95±4

Carcinoma de 100 18±2 47±4 93±5

endometrio.

Carcinoma de cérvix. 100 19±3 48±3 94±3

Carcinoma de pulmón 100 17±2 49±5 93±5

Carcinoma de pulmón 100 18±3 45±3 93±3

Carcinoma de tiroides 100 19±4 46±4 95±3

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 16±2 47±5 96±5

(carcinoma papilar) Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma Vejiga de 100 17±3 46±3 92±3

la Orina

Carcinoma de 100 18±4 47±4 92±4

próstata.

Glioma 100 19±3 48±5 92±3

Fbrosarcoma 100 18±2 47±3 91±2

Histiocitoma fibroso 100 17±3 48±4 91±5

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 16±4 47±3 90±6

Melanoma 100 15±3 48±4 92±4

Neuroblastoma 100 16±1 49±5 93±4

Leucemia B 100 n±2 47±3 92±4

Leucemia T 100 15±3 48±4 94±5

Linfoma No Hodgking 100 16±4 47±5 93±4

B

Linfoma No Hodgkin 100 17±2 48±4 93±5

T

Linfoma de Burkitt 100 15±3 47±5 92±6

Linfoma de Hodgkin 100 16±4 48±3 92±4

Mieloma 100 n±2 47±4 93±5

Tabla 11. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpo contra el receptor NKl, en función de la intensidad de la inmunotinción para el receptor NKl .

Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de

histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de 100 24±3 53±4 96±4

estómago.

Carcinoma de Colon. 100 23±3 52±4 96±3

Carcinoma de 100 22±4 54±4 93±4

Páncreas.

Carcinoma Renal. 100 23±5 53±5 97±3

Carcinoma de mama. 100 24±3 54±4 96±4

Carcinoma de Ovario. 100 23±4 54±5 96±4

Carcinoma de 100 24±3 54±3 97±6

endometrio

Carcinoma de cérvix. 100 25±4 53±4 96±4

Carcinoma de pulmón 100 24±3 55±5 97±4

Carcinoma de pulmón 100 25±3 54±3 94±3

Carcinoma de tiroides 100 26±4 53±3 95±5

(carcinoma folicular)

Carcinoma de tiroides 100 24±3 56±5 94±4

(carcinoma papilar)

Carcinoma Vejiga de 100 25±4 55±3 96±3

la Orina Tipo de tumor (tipo Control Grado 1 de Grado 2 de Grado 3 de histológico). intensidad intensidad intensidad

Carcinoma de 100 24±5 56±4 93±6

próstata.

Glioma 100 26±4 55±3 95±4

Fbrosarcoma 100 24±6 54±5 94±5

Histiocitoma fibroso 100 25±4 55±3 95±4

maligno

Sarcoma de Ewing. 100 24±5 55±3 96±4

Melanoma 100 23±3 56±5 97±4

Neuroblastoma 100 25±4 53±4 93±5

Leucemia B 100 24±3 54±4 94±6

Leucemia T 100 25±2 55±5 95±4

Linfoma No Hodgking 100 26±5 55±4 96±5

B

Linfoma No Hodgkin 100 27±3 56±3 95±4

T

Linfoma de Burkitt 100 25±4 55±4 94±6

Linfoma de Hodgkin 100 24±3 56±3 95±4

Mieloma 100 25±4 56±6 95±5

Ejemplo 2. Las células cancerosas sin mutación en el gen K-ras (K-ras mo mutado o "wild type" presentan una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl.

Para comprobar que las células cancerosas sin mutación en el gen K-ras (K ^' ras no mutado o de forma "wild type") mostraban una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NKl, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban el receptor NKl mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica y se determinó si presentaban mutaciones en K-ras o no las presentaban (forma "wild type"). Posteriormente se pusieron en cultivo en presencia con diversos antagonistas de los receptores NKl . Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 12.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NKl mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y cultivadas según se explica en el Ejemplo 1, en presencia de diversos antagonistas del receptor NKl , como Aprepitant, Casopitant, Vestipitant y un anticuerpo contra dicho receptor. En cada caso se determinó la presencia o no de mutaciones en el gen K-ras. Para determinar la existencia de mutaciones en el gen K-ras se realizó una extracción de ADN de las células tumorales cancerosas a partir de muestras obtenidas de los diferentes tumores cancerosos utilizando los kits de extracción de ADN de Takara (Madison, WI, EE.UU.) o Ambion (Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y según se ha publicado previamente (Di Fiore F, et al. 2007). Posteriormente se realizó el análisis de secuenciación del gen KRAS, exón 2, mediante amplifición por PCR a partir del ADN tumoral canceroso extraído previamente, usando el siguiente sentido (SEQ ID NO. 15): 5'- AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' y antisentido (SEQ ID NO. 16): 5'- CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3'. Después de la purificación mediante el kit de extracción de gel de Qiagen, los productos PCR se secuenciaron utilizando el Big Dye Terminator Kit V3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y un ABI Prism 377 o 3100 secuenciador de ADN (Applied Biosystems). La presencia de una mutación heterocigota en el gen KRAS en las células tumorales cancerosas de los cultivos se definió como la aparición de un pico mutante con una altura de al menos un tercio de la del tipo salvaje. Todos los análisis de secuenciación se realizaron al menos dos veces en dos PCR independientes.

Tabla 12. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y número de casos con Kras mutado y "wild type" (salvaje).

Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número Número de casos histológico). de casos (Hombres de casos con Kras no

/Mujeres) con Kras mutado (wild

mutado type).

Carcinoma de 8 3/5 51±4 4 4

estómago

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 8 4/4 54±3 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de 8 3/5 53±2 4 4

Páncreas

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal 8 4/4 52±4 4 4

(carcinoma renal de

células claras)

Carcinoma de mama 8 0/8 46±5 4 4

(Adenocarcinoma

ductal).

Carcinoma de Ovario 8 0/8 51±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de 8 0/8 63±3 4 4

endometrio.

Carcinoma de cérvix 8 0/8 34±2 4 4 Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número Número de casos histológico). de casos (Hombres de casos con Kras no

/Mujeres) con Kras mutado (wild

mutado type).

(Carcinoma de células

escamosas).

Carcinoma de pulmón 8 6/2 52±4 4 4

(Carcinoma de células

Pequeñas)

Carcinoma de pulmón 8 6/2 64±3 4 4

Carcinoma de células

No Pequeñas

Carcinoma de tiroides 8 2/6 45±5 4 4

(Carcinoma folicular).

Carcinoma de tiroides 8 2/6 38±4 4 4

(Carcinoma papilar).

Carcinoma Vejiga de 8 6/2 62±5 4 4

la Orina (Carcinoma

transicional).

Carcinoma de próstata. 8 8/0 71±3 4 4

Glioma (astrocitoma) 8 5/3 56±4 4 4

Sarcoma Pleomorfo 8 5/3 67±2 4 4

Indiferenciado

(Histiocitoma fibroso

maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma 8 3/5 58±3 4 4

Nodular).

Linfoma No Hodgking 8 4/4 54±4 4 4

B (Linfoma B difuso).

Linfoma No Hodgkin 8 4/4 33±3 4 4

T (Linfoma T difuso).

Linfoma de Burkitt 8 4/4 24±4 4 4

Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que no presentaban mutación de Kras. En las Tablas 13 a 16 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitan (tabla 13), Casopitant (Tabla 14), Vestipitant (Tabla 15) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 16), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que no presentan mutación de Kras. De forma, que en las células cancerosas procedentes de tumores que no presentan mutación de Kras, es mayor la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . En los experimentos reflejados en las Tablas 13 a 15, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 100 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl (Tabla 16) se usó a concentración 1/50. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar. Tabla 13. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con aprepitant, en función de la presencia o no de mutaciones de Kras en las células tumorales cancerosas.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con Casos con Kras

Kras no mutado (wild mutado type).

Carcinoma de estómago 100 24±3 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 23±4 94±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 22±4 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 23±3 94±5

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 22±2 94±3

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 24±5 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 25±4 94±3

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 23±3 94±5

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 22±4 94±4

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 21±2 94±3

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±3 94±6

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±4 94±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 26±5 94±4

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 24±3 94±3

Glioma (astrocitoma) 100 23±4 94±4

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 24±3 94±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 26±4 94±4

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 27±5 94±3

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±4 94±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±3 94±5 Tabla 14. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con casopitant, en función de la presencia o no de mutaciones de Kras en las células tumorales cancerosas.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con Casos con Kras

Kras no mutado (wild mutado type).

Carcinoma de estómago 100 25±5 95±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 32±4 94±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 27±3 93±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 27±4 94±3

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 28±6 96±4

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 29±4 97±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 28±2 94±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 27±3 93±3

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 26±4 94±2

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±5 95±5

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±4 96±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±5 94±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±4 95±6

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 23±3 93±7

Glioma (astrocitoma) 100 26±4 94±6

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±5 95±5

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±6 94±6

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 26±3 95±4

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 26±4 96±5

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 25±2 92±5 Tabla 15. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con vestipitant, en función de la presencia o no de mutaciones de Kras en las células tumorales cancerosas.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con Casos con Kras

Kras no mutado (wild mutado type).

Carcinoma de estómago 100 24±4 96±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 33±5 96±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 24±4 97±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 25±5 95±6

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 26±4 97±5

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 27±5 96±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 24±6 95±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 25±5 94±3

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 23±4 95±4

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 24±5 96±6

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±3 97±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±4 94±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±5 95±6

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 24±4 96±4

Glioma (astrocitoma) 100 25±3 97±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±4 95±6

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 23±5 96±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±4 97±6

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±5 96±5

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±3 95±3 Tabla 16. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpos contra el receptor NKl, en función de la presencia o no de mutaciones de Kras en las células tumorales cancerosas.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con Casos con Kras

Kras no mutado (wild mutado type).

Carcinoma de estómago 100 24±6 94±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 29±7 93±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 24±5 95±7

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 25±4 96±4

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 27±5 93±5

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 28±3 92±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 25±2 93±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 23±4 94±6

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 28±3 95±4

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±2 96±5

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 23±3 97±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±4 94±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 27±2 95±3

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 28±3 96±4

Glioma (astrocitoma) 100 24±2 93±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 25±4 94±4

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 26±3 95±3

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 23±2 93±4

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 24±4 94±5

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 26±3 95±4 Ejemplo 3. Las células cancerosas que presentan mayor actividad de la ruta de las MAP kinasas presentan una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl. Para comprobar que las células cancerosas que tienen una mayor actividad de la ruta de las MAP Kinasas muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NKl, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban receptor NKl mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica y que no presentaban mutaciones en K-ras (forma "wild type"). Posteriormente se pusieron en cultivo en presencia con diversos antagonistas de los receptores NKl . Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 17.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NKl mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y fueron cultivadas según se explica en el ejemplo 1, en presencia de diversos antagonistas del receptor NKl, como Aprepitant, Casopitant, Vestipitant y un anticuerpo contra dicho receptor. Se comprobó en todos los casos que no existía mutación en Kras, según el método explicado en el Ejemplo 2. En cada caso se determinó la presencia o no del efector "aguas abajo" de la ruta de las MAP Kinasas, ERK. También se determinó la presencia de MEK, con similares resultados.

Para determinar la presencia de la proteína ERK, se realizó una técnica de Western Blot, utilizando como anticuerpo primario: Phospho-p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP ^® Rabbit mAb (4370, Cell Signalling). Para determinar la presencia de la proteína MEK, se realizó la técnica de Western Blot, utilizando como anticuerpo primario Phospho-MEK 1/2 (Ser217/221) (9121, Cell Signalling).

Tabla 17. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y número de casos con ausencia o presencia de la proteína ERK.

Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número de Número de histológico). de casos (Hombres casos con casos con

/Mujeres) ausencia presencia de de ERK ERK

Carcinoma de estómago 8 4/4 52±5 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 8 3/5 52±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 8 3/5 54±3 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma 8 5/3 51±5 4 4

renal de células claras)

Carcinoma de mama 8 0/8 49±4 4 4

(Adenocarcinoma ductal).

Carcinoma de Ovario 8 0/8 52±3 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 8 0/8 62±4 4 4

Carcinoma de cérvix 8 0/8 35±5 4 4

(Carcinoma

decélulasescamosas) .

Carcinoma de pulmón 8 6/2 54±3 4 4

(C a r c i n o m a d e c é l u l a s

Pequeñas)

Carcinoma de pulmón 8 6/2 63±4 4 4

Carcinoma de células No

Pequeñas

Carcinoma de tiroides 8 2/6 44±4 4 4

(Carcinoma folicular).

Carcinoma de tiroides 8 2/6 35±3 4 4

(Carcinoma papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 8 6/2 66±4 4 4

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 8 8/0 71±4 4 4

Glioma (astrocitoma) 8 5/3 55±3 4 4

Sarcoma Pleomorfo 8 5/3 66±4 4 4

Indiferenciado (Histiocitoma

fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma 8 3/5 54±4 4 4

Nodular).

Linfoma No Hodgking B 8 4/4 53±5 4 4

(Linfoma B difuso).

Linfoma No Hodgkin T 8 4/4 35±4 4 4

(Linfoma T difuso).

Linfoma de Burkitt 8 4/4 26±5 4 4 Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que muestran presencia del eferente "aguas abajo" de la ruta de las MAP Kinasas ERK. En las Tablas 18 a 21 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 18), Casopitant (Tabla 19), Vestipitant (Tabla 20) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma- Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 21 ), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que muestran más presencia de ERK. De forma, que en las células cancerosas procedentes de tumores presentan proteína ERK, signo de la activación de la ruta de la MAP Kinasas en estos tumores, es mayor la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . Se apreciaron similares resultados en el caso de la proteína MEK (mayor respuesta en los tumores cancerosos que presentan mayor cantidad de proteína). En los experimentos reflejados en las Tablas 18 a 20, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 100 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl (Tabla 21) se usó a concentración 1/50. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar.

Tabla 18. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con aprepitant, en función de la ausencia o presencia de proteína ERK.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de estómago 100 23±7 96±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 24±7 95±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±6 94±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 24±4 97±5

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 25±5 93±5

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 26±7 92±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 24±4 93±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 25±5 94±5

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 26±6 95±3

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 27±4 96±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±5 95±6

folicular). Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 23±3 93±7

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±4 94±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 26±5 95±6

Glioma (astrocitoma) 100 27±6 93±4

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 24±4 94±5

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±5 96±6

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 26±6 97±3

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 23±3 94±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±4 93±5

Tabla 19. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con casopitant, en función de la ausencia o presencia de proteína ERK.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de estómago 100 25±6 96±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 24±3 95±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±4 94±2

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 27±3 94±3

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 26±4 93±4

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 28±5 92±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 29±2 93±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 28±3 93±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 29±4 94±5

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 27±5 95±7

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±4 96±6

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 28±3 97±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 29±4 98±2

(Carcinoma transicional). Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de próstata. 100 27±4 94±5

Glioma (astrocitoma) 100 28±3 93±4

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±4 95±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 27±5 96±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 28±4 97±5

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 29±5 98±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 28±6 97±5

Tabla 20. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con vestipitant, en función de la ausencia o presencia de proteína ERK.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de estómago 100 24±4 95±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 23± 94±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 24±34 93±4

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 25±2 92±2

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 26±4 94±3

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 24±2 95±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 28±5 93±3

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 29±3 94±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (C arcinoma de 100 27±4 96±6

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 26±2 95±5

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±3 94±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±4 96±3

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 24±5 97±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 22±3 94±4

Glioma (astrocitoma) 100 27±4 95±3

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±2 93±4

(Histiocitoma fibroso malig no grado 3). Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±3 94±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±4 96±3

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±2 92±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 26±4 93±5

Tabla 21. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpos contra el receptor NKl, en función de la ausencia o presencia de proteína ERK.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Carcinoma de estómago 100 27±5 91±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 28±5 95±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 94±4 94±3

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 32±6 95±6

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 29±5 94±7

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 24±7 96±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 29±6 95±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 28±5 96±6

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (C arcinoma de 100 27±6 94±4

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 29±7 95±5

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±5 96±3

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 27±6 89±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 28±4 88±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 27±3 90±4

Glioma (astrocitoma) 100 28±4 89±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 27±5 90±4

(Histiocitoma fibroso malig no grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 28±3 90±5 Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

ERK ERK

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 29±4 98±6

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 27±5 97±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 28±3 96±5

Ejemplo 4. Las células cancerosas que presentan mayor actividad de la ruta de las PI3 kinasas presentan una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl.

Para comprobar que las células cancerosas que tienen una mayor actividad de la ruta de las PI3 Kinasas muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NKl, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban receptor NKl mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica y que no presentaban mutaciones en K-ras (forma "wild type"). Posteriormente se pusieron en cultivo en presencia con diversos antagonistas de los receptores NKl . Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 22.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NKl mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y fueron cultivadas según se explica en el ejemplo 1, en presencia de diversos antagonistas del receptor NKl, como Aprepitant, Casopitant, Vestipitant y un anticuerpo contra dicho receptor. Se comprobó en todos los casos que no existía mutación en Kras, según el método explicado en el Ejemplo 2. En cada caso se determinó la presencia o no del efector "aguas abajo" de la ruta de las PI3 Kinasas, AKT.

Para determinar la presencia de la proteína AKT en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot (según lo descrito en el ejemplo 1 -apartado Western Blot-), pero utilizando como anticuerpo primario con referencia: Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (4685, Cell Signalling). Tabla 22. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y número de casos con ausencia o presencia de la proteína AKT.

Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número de Número de histológico). de casos (Hombres casos con casos con

/Mujeres) ausencia presencia de de AKT AKT

Carcinoma de estómago 8 4/4 51±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 8 3/5 50±3 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 8 3/5 55±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma 8 5/3 50±3 4 4

renal de células claras)

Carcinoma de mama 8 0/8 48±2 4 4

(Adenocarcinoma ductal).

Carcinoma de Ovario 8 0/8 52±2 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 8 0/8 61±3 4 4

Carcinoma de cérvix 8 0/8 36±4 4 4

(Carcinoma

decélulasescamosas) .

Carcinoma de pulmón 8 6/2 53±5 4 4

(C a r c i n o m a d e c é l u l a s

Pequeñas)

Carcinoma de pulmón 8 6/2 62±3 4 4

Carcinoma de células No

Pequeñas

Carcinoma de tiroides 8 2/6 43±2 4 4

(Carcinoma folicular).

Carcinoma de tiroides 8 2/6 36±4 4 4

(Carcinoma papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 8 6/2 63±5 4 4

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 8 8/0 70±3 4 4

Glioma (astrocitoma) 8 5/3 58±3 4 4

Sarcoma Pleomorfo 8 5/3 65±3 4 4

Indiferenciado (Histiocitoma

fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma 8 3/5 57±3 4 4

Nodular).

Linfoma No Hodgking B 8 4/4 54±4 4 4

(Linfoma B difuso).

Linfoma No Hodgkin T 8 4/4 33±5 4 4

(Linfoma T difuso).

Linfoma de Burkitt 8 4/4 28±3 4 4 Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que muestran presencia del eferente de la ruta de las PI3 Kinasas, AKT. En las Tablas 23 a 26 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 23), Casopitant (abla 24), Vestipitant (Tabla 25) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 26), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que muestran más presencia de AKT. De forma, que en las células cancerosas procedentes de tumores presentan proteína AKT, signo de la activación de la ruta de la PI3 Kinasas en estos tumores, es mayor la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . En los experimentos reflejados en las Tablas 23 a 25, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 100 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl (Tabla 26) se usó a concentración 1/50. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar.

Tabla 23. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con aprepitant, en función de la ausencia o presencia de proteína AKT.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

Carcinoma de estómago 100 24±6 92±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 25±3 93±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 24±4 92±2

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 25±3 93±3

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 26±5 94±4

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 27±4 93±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 25±3 95±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 24±4 94±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 25±3 96±3

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 26±4 94±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±3 97±3

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±4 92±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 23±5 94±2 Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 24±4 97±6

Glioma (astrocitoma) 100 25±5 96±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±4 95±4

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±5 94±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±6 95±3

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±3 93±5

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 26±4 94±4

Tabla 24. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con casopitant, en función de la ausencia o presencia de proteína AKT.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

Carcinoma de estómago 100 26±5 95±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 24±5 96±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±4 95±3

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 24±3 96±5

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 23±4 95±4

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 24±3 94±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 23±4 95±46

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 24±3 97±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 23±4 96±5

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±6 95±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±5 96±5

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±2 95±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 24±3 94±3

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 23±4 95±3

Glioma (astrocitoma) 100 27±3 96±4 Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 25±3 95±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 23±4 94±4

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±5 95±5

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 23±3 98±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±4 96±3

Tabla 25. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con vestipitant, en función de la ausencia o presencia de proteína AKT.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

Carcinoma de estómago 100 25±5 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 24±3 93±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±5 94±4

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 23±3 96±5

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 22±5 95±4

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 23±6 94±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 24±4 95±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 25±5 93±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (C arcinoma de 100 23±4 94±5

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 24±3 95±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 23±4 94±5

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±5 96±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 24±4 95±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 26±3 94±4

Glioma (astrocitoma) 100 23±4 95±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 27±3 94±6

(Histiocitoma fibroso malig no grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±4 93±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±3 95±6 Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±5 96±5

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±4 95±6

Tabla 26. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpos contra el receptor NKl, en función de la ausencia o presencia de proteína AKT.

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos sin Casos con

presencia de presencia de

AKT AKT

Carcinoma de estómago 100 24±4 92±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 23±3 94±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 94±4 95±4

(Adenocarcinoma)

Carcinoma Renal carcinoma renal de 100 34±5 94±3

células claras

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 25±4 93±5

ductal)

Carcinoma de Ovario 100 24±6 95±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 23±5 95±4

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 23±4 96±5

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 24±5 94±4

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±6 95±5

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±5 96±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±6 89±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±5 91±6

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 26±6 90±5

Glioma (astrocitoma) 100 28±4 89±4

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 25±5 90±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±3 97±4

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±4 95±5

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±3 94±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 25±2 95±6 Ejemplo 5. Las células cancerosas que presentan mayor cantidad de la forma truncada del receptor NK1 muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1.

Para comprobar que las células cancerosas que tienen una mayor cantidad de la forma truncada del receptor NK1 muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NK1, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban receptor NK1 mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica. Se determinó la presencia de la forma truncada del receptor NK1 y posteriormente se pusieron en cultivo en presencia con diversos antagonistas de los receptores NK1. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 26.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NK1 mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y fueron cultivadas según se explica en el Ejemplo 1, en presencia de diversos antagonistas del receptor NK1, como Aprepitant, Casopitant, Vestipitant y un anticuerpo contra dicho receptor. En cada caso se determinó la presencia de la forma truncada del receptor NK1.

Para determinar la presencia de la expresión de la forma truncada de del gen del receptor NK1 se realizó una técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). La extracción de RNA, amplificaciones de PCR, condiciones de ciclo y el análisis cuantitativo fueron realizaron como se ha descrito previamente. Los cebadores -"primers"- específicos fueron las siguientes: Para el receptor NK1R de longitud completa -"full lengt"- (NM_001058.3; adelante -"forward" (SEQ ID N. 17)-: 5'-AACCCCATCATCTACTGCTGC-3 ' y reverso -"reverse"- (SEQ ID NO. 18): 5'- ATTTCCAGCCCCTCATAGTCG-3 ') y para el receptor NK1 truncado (NM_015727.2; adelante - "forward" (SEQ ID NO. 19): 5 '-GGGCCAC AAGACCATCTACA-3 'y reverso -"reverse" (SEQ ID NO. 20): 5'-AAGTTAGCTGCAGTCCCCAC-3 ').

Los casos se distribuyeron en dos grupos:

• Grupo A -baja expresión de la forma truncada del receptor NK1- para aquellos casos en los que la expresión de la forma truncada del receptor NK1 era menor del doble de la expresión de la forma de longitud completa de dicho • Grupo B -alta expresión de la forma truncada del receptor NKl - para aquellos casos en los que la expresión de la forma truncada del receptor NKl era mayor del doble de la expresión de la forma de longitud completa de dicho receptor. Tabla 27. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y número de casos con baja expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo A) y alta expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo B).

Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que muestran una alta expresión de la forma truncada del receptor NKl . En las Tablas 28 a 31 se aprecia como en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 28), Casopitant (Tabla 29), Vestipitant (Tabla 30) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 31), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que muestran más expresión de la forma truncada del receptor NKl . De forma, que en las células cancerosas procedentes de tumores presentan una alta expresión de la forma truncada del receptor NKl, signo de la activación de la ruta de la PI3 Kinasas en estos tumores, es mayor la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . En los experimentos reflejados en las Tablas 28 a 30, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 100 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl (Tabla 31) se usó a concentración 1/50. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar. Tabla 28. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con aprepitant, en función la existencia de baja expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo A) o alta expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo B).

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con baja Casos con alta

expresión de la expresión de la forma truncada forma truncada del receptor del receptor NKl NKl (Grupo A) (Grupo B)

Carcinoma de estómago 100 25±5 94±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 26±4 93±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±4 94±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 26±3 93±3

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 27±5 94±4

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 29±3 95±5

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 26±5 96±3

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 26±5 94±4

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 24±4 96±3

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±3 94±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±4 95±5

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 27±5 96±4

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±6 95±4

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 24±6 94±5

Glioma (astrocitoma) 100 27±5 95±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 27±6 96±6

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 25±7 96±5

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 23±4 97±7

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 26±5 98±6

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 27±6 99±5 Tabla 29. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con casopitant, en función la existencia de baja expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo A) o alta expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo B).

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con baja Casos con alta

expresión de la expresión de la forma truncada forma truncada del receptor del receptor NKl NKl (Grupo A) (Grupo B)

Carcinoma de estómago 100 22±4 95±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 22±3 94±2

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±4 95±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 24±5 94±5

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 23±3 95±3

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 25±4 95±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 26±3 94±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 25±5 93±6

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 24±5 94±5

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 25±4 95±6

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 23±3 93±4

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±5 94±5

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±4 95±7

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 23±6 94±4

Glioma (astrocitoma) 100 24±5 95±7

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 25±4 94±5

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 23±5 96±6

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±3 97±4

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 23±4 98±3

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±5 93±3 Tabla 30. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con vestipitant, en función la existencia de baja expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo A) o alta expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo B)

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con baja Casos con alta

expresión de la expresión de la forma truncada forma truncada del receptor del receptor NKl NKl (Grupo A) (Grupo B)

Carcinoma de estómago 100 24±4 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 23±3 93±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 24±4 94±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 25±5 95±5

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 24±3 93±3

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 25±4 94±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 26±3 95±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 24±5 96±6

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 25±5 95±6

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 26±4 94±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 27±3 95±5

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 26±5 96±6

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 25±4 94±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 24±6 95±6

Glioma (astrocitoma) 100 25±5 94±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 26±4 95±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 24±5 96±4

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 23±5 98±5

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 23±4 98±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 24±5 93±5 Tabla 31. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpo contra el receptor NKl, en función la existencia de baja expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo A) o alta expresión de la forma truncada del receptor NKl (Grupo B)

Tipo de tumor (tipo histológico). Control Casos con baja Casos con alta

expresión de la expresión de la forma truncada forma truncada del receptor del receptor NKl NKl (Grupo A) (Grupo B)

Carcinoma de estómago 100 22±4 96±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 100 24±3 94±3

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 100 23±4 95±4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal (carcinoma renal de 100 24±5 93±5

células claras)

Carcinoma de mama (Adenocarcinoma 100 24±3 94±3

ductal).

Carcinoma de Ovario 100 25±4 95±6

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 100 26±3 94±5

Carcinoma de cérvix (Carcinoma de 100 24±5 95±6

células escamosas).

Carcinoma de pulmón (Carcinoma de 100 25±5 96±6

células Pequeñas)

Carcinoma de pulmón Carcinoma de 100 26±4 95±4

células No Pequeñas

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 24±3 94±5

folicular).

Carcinoma de tiroides (Carcinoma 100 25±5 95±6

papilar).

Carcinoma Vejiga de la Orina 100 26±4 96±5

(Carcinoma transicional).

Carcinoma de próstata. 100 27±6 95±6

Glioma (astrocitoma) 100 24±5 96±5

Sarcoma Pleomorfo Indiferenciado 100 25±4 95±3

(Histiocitoma fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma Nodular). 100 26±5 96±4

Linfoma No Hodgking B (Linfoma B 100 24±5 95±5

difuso).

Linfoma No Hodgkin T (Linfoma T 100 25±4 95±4

difuso).

Linfoma de Burkitt 100 26±5 96±5 Ejemplo 6. Las células cancerosas que presentan amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NKl. Para comprobar que las células cancerosas que tienen amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NKl, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban receptor NKl mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica. Se determinó la presencia o no de amplificación del gen que codifica el receptor NKl y posteriormente se pusieron en cultivo en presencia con diversos antagonistas de los receptores NKl . Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 32.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NKl mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y fueron cultivadas según se explica en el ejemplo 1, en presencia de diversos antagonistas del receptor NKl, como Aprepitant, Casopitant, Vestipitant y un anticuerpo contra dicho receptor. En cada caso se determinó la presencia o no de amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl .

Para determinar la presencia de amplificación (aumento en el número de copias) del gen que codifica el receptor NKl (TAC IR) se utilizó una técnica de Hibridación Genómica Comparada (CGH Array). En primer lugar se realizó una extracción de ADN genómico de cada uno de los casos. Posteriormente se realizó un mareaje e hibridación del ADN de cada una de las muestras junto con ADN de una referencia comercial sin alteraciones genómicas (de sexo masculino o femenino según el sexo del paciente del que se obtuvieron las muestras). El Array utilizado es el Sureprint G3 Human CGH Microarray obtenido de la empresa Agilent, con una separación media entre sondas de 5,3Kb y 4,6Kb para los genes RefSeq. La lectura del microarray se realizó con el DNA Microarray Scanner G2565CA de Agilent a una resolución de 3 μιη. El análisis de los resultados se realizó con el software Cytogenomics v 2.0.6.0 de Agilent con ADM-2 : 6.0; Centralización: ON (Threshold: 6.0, Bin size: 10); Fuzzy zero: ON; Aberration filters: ON (minProbes=5 and minAvgAbsLopRatio= 0,5); Feature Level Filters:ON. Las coordenadas genómicas se corresponden con el genoma NCBI36 (hgl 8). Los casos se distribuyeron en dos grupos: Grupo I para aquellos casos sin amplificación del gen que codifica para el receptor NKl (locus 2pl3.1-pl2) y Grupo II para aquellos casos con amplificación del gen que codifica para el receptor NKl (locus 2pl3.1-pl2).

Tabla 32. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular y número de casos del Grupo I sin amplificación del gen que codifica del receptor NKl (locus 2pl3.1 -p 12) y del Grupo II con amplificación del gen que codifica del receptor NKl (locus 2p 13.1- pl2).

Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número de Número de histológico). de casos (Hombres casos sin casos con

/Mujeres) amplificación amplificación del gen que del gen que codifica el codifica el receptor receptor NKl. NKl.

Carcinoma de estómago 8 4/4 54±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Colon 8 4/4 54±3 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de Páncreas 8 4/4 52±4 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma Renal 8 4/4 51±3 4 4

(carcinoma renal de células

claras)

Carcinoma de mama 8 0/8 43±2 4 4

(Adenocarcinoma ductal).

Carcinoma de Ovario 8 0/8 53±2 4 4

(Adenocarcinoma) .

Carcinoma de endometrio. 8 0/8 62±3 4 4

Carcinoma de cérvix 8 0/8 33±4 4 4

(Carcinoma

decélulasescamosas) .

Carcinoma de pulmón 8 5/3 53±5 4 4

(Carcinoma de cé lul as

Pequeñas)

Carcinoma de pulmón 8 6/2 63±3 4 4

Carcinoma de células No

Pequeñas

Carcinoma de tiroides 8 2/6 45±2 4 4

(Carcinoma folicular).

Carcinoma de tiroides 8 2/6 33±4 4 4

(Carcinoma papilar).

Carcinoma Vejiga de la 8 6/2 64±5 4 4

Orina (Carcinoma

transicional).

Carcinoma de próstata. 8 8/0 71±4 4 4

Glioma (astrocitoma) 8 4/2 50±3 4 4 Tipo de tumor (tipo Número Sexo Edad Número de Número de histológico). de casos (Hombres casos sin casos con

/Mujeres) amplificación amplificación del gen que del gen que codifica el codifica el receptor receptor NKl. NKl.

Sarcoma Pleomorfo 8 5/3 62±2 4 4

Indiferenciado(Histiocitoma

fibroso maligno grado 3).

Melanoma (Melanoma 8 3/5 53±5 4 4

Nodular).

Linfoma No Hodgking B 8 4/4 55±4 4 4

(Linfoma B difuso).

Linfoma No Hodgkin T 8 4/4 32±5 4 4

(Linfoma T difuso).

Linfoma de Burkitt 8 4/4 22±3 4 4

Se aprecia un aumento de la inhibición de la proliferación celular en los cutivos de células cancerosas que muestran amplificación del gen que codifica el recepto del NKl . En las Tablas 33 a 36 se aprecia cómo en cultivos tratados con Aprepitant (Tabla 33), Casopitant (Tabla 34), Vestipitant (Tabla 35) y anticuerpos contra el receptor NKl -obtenido de Sigma-Aldrich, número de catálogo S8305- (Tabla 36), se produce una mayor inhibición de la proliferación celular en aquellos cultivos de células cancerosas que muestran amplificación de la región genómica que codifica el receptor NKl . De forma, que en las células cancerosas procedentes de tumores que presentan amplificación en la región genómica que codifica el receptor NKl, es mayor (más efectiva) la respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NKl . En los experimentos reflejados en las Tablas 33 a 35, Aprepitant, Casopitant y Vestipitant se usaron a concentración 100 micromolar. El anticuerpo contra el receptor NKl (Tabla 36) se usó a concentración 1/50. Los porcentajes de inhibición se expresan en porcentaje de variación respecto al control ± la desviación estándar.

Tabla 33. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con aprepitant, en función de la ausencia de amplificación del gen que codifica el receptor NKl (Grupo I) o la presencia de amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl (Grupo II).

Tabla 34. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con casopitant, en función de la ausencia de amplificación del gen que codifica el receptor NKl (Grupo I) o la presencia de amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl (Grupo II).

Tabla 35. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con vestipitant, en función de la ausencia de amplificación del gen que codifica el receptor NKl (Grupo I) o la presencia de amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl (Grupo II).

Tabla 36. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con anticuerpos contra el receptor NKl en función de la ausencia de amplificación del gen que codifica el receptor NKl (Grupo I) o la presencia de amplificación a nivel del gen que codifica el receptor NKl (Grupo II).

Ejemplo 7. Las células cancerosas que presentan una forma constituvamemente activada del receptor NK1, muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1. Para comprobar que las células cancerosas que presentan una forma constitutivamente activada del receptor NK1 muestran una respuesta más efectiva al tratamiento con los antagonistas de los receptores NK1, se tomaron células tumorales humanas primarias procedentes de tumores de pacientes, se comprobó que presentaban receptor NK1 mediante técnicas de western-blot e inmunohistoquímica. Se determinó el aumento de proliferación o no con la exposición a la sustancia P (agonista del receptor NK 1 ), de forma que los cultivos celulares que crecían independientemente de la exposición a la sustancia P, se consideró que tenían formas constituvamente activadas de dicho receptor, ya que se transmitía una señal mitogénica independientemente de la presencia del agonista. Se comprobó que todas las células tumorales presentaban integridad de las rutas de las MAP Kinasas y de las PI3 Kinasas, así como del gen K- ras y la proteína derivada de él.

Las células tumorales fueron recolectadas de muestras de cánceres primarios humanos tomadas de pacientes voluntarios, se determinó la presencia de receptor NK1 mediante técnicas de Western- Blot e inmunohistoquímica y fueron cultivadas según se explica en el Ejemplo 1, en presencia del agonista sustancia P. El grupo I estaba constituido por células con escasa respuesta proliferativa ante la exposición a la sustancia P (receptor constitutivamente activado, independientemente de la unión al agonista) y el grupo II estaba constituido por células con mayor respuesta proliferativa ante la exposición al agonista de dicho receptor sustancia P (receptor con respuesta normal al estímulo con el agonista).

En la Tabla 37 se aprecia cómo se produce una mayor inhibición del crecimiento con el tratamiento con el antagonista Aprepitant, de las células tumorales cancerosas en el grupo con escasa respuesta proliferativa ante la exposición a la sustancia P (con presencia de la forma constitucionalmente activada del receptor NK1). Se pueden observar resultados similares con Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant. También se observan resultados similares con el tratamiento con anticuerpos contra el receptor NK1. Tabla 37. Porcentaje de inhibición de los cultivos celulares tratados con el antagonista Aprepitant en función de la presencia de forma constitucionalmente activada del receptor NKl (Grupo I) o la presencia de de forma normofuncionante del receptor (Grupo II).

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