Campo de aplicación

La presente invención se relaciona con un procedimiento de preparación eficiente y simple para la obtención de una oleorresina partir de algas rojas que mantiene una alta capacidad de inducir la actividad transcripcional del receptor nuclear PPARy (peroxisome proliferator activated receptor gama). Hasta la fecha se desconocía la capacidad de este tipo de oleorresina de alga roja para generar la activación de PPARy, lo que fue identificado por nuestras investigaciones. La metodología de preparación fue optimizada para obtener la mayor eficiencia en la activación del receptor PPARy, la que fue puesta a prueba en ensayos in vitro e in vivo. Además nuestros estudios demostraron la capacidad de participar en la recuperación de patologías en el campo de la diabetes, como la resistencia a la insulina y neuropatologías tales como el infarto cerebro vascular.

El procedimiento de obtención de nuestro compuesto fue separado en etapas que permiten trabajar con sobre stock, controlando el almacenamiento tanto de la materia prima (alga), etapas intermedias de la producción y producto final, manteniendo en todas las etapas una alta capacidad de inducir la actividad transcripcional del receptor nuclear PPARy. Esto le da la capacidad de ser producido a nivel industrial con gran flexibilidad, para el posterior uso de la oleorresina como un fármaco natural directo, un nutraceútico o un complemento nutricional en diversos productos de consumo humano.

Estado de la técnica.

Nuestra invención está relacionada con un procedimiento de preparación de una oleorresina desde un alga roja, de preferencia Gracilaria chiiensis la cual es una de las especies del genero Gracilariae. La preparación y extracción de compuestos desde algas rojas, como Gracilaria chiiensis, en particular la extracción en la fase acuosa, han sido ampliamente desarrolladas para la obtención de hidrocoloides como el agar-agar, alginato y carragenina, utilizados en el ámbito de los alimentos y cosmética. Por otro lado, la extracción de fases oleosas está pobremente descrita y se han desarrollado solo a baja escala en investigación relacionada con la ecología del alga y sus mecanismos de defensa.

Los productos marinos naturales, en especial los derivados de metabolitos secundarios, han concitado gran interés científico por la potencial presencia en ellos de nuevos productos químicos o nuevos fármacos especialmente útiles en el tratamiento de enfermedades humanas y en el control de pestes en la agricultura (Liebezeit, 2005., Mayer and Hamann., 2005). Entre las actividades detectadas se encuentran actividad antiviral, antibiótica, de coagulación y migración celular, crecimiento celular, actividad antifúngica e insecticida, acciones antitrombóticas y anticoagulante, efectos antinflamatorios y antilipidémicos, hipoglicémicos e hipotensivos (Smith, 2004). Las ventajas del empleo de productos naturales en la industria, son que junto a sus principios activos pueden existir constituyentes de acción sinérgica, que potencian su acción por sobre el principio activo aislado o su similar sintético. Además a diferencia de los compuestos sintéticos, los cuales poseen efectos secundarios, los productos naturales son asimilados por el organismo humano en forma más equilibrada que los medicamentos sintéticos. Así mismo estos productos naturales se han consumido durante siglos por diferentes pueblos como parte del menú habitual en comidas, como es el caso de las algas marinas en países como Japón y China.

Las algas rojas al ser sometidas a daño físico o biológico generan moléculas llamadas oxilipinas las que corresponden a derivados oxidados de ácidos grasos poliinsaturados (PUF As). Al hacer una comparación estructural, muchas de estas moléculas son similares a los productos oxidados de ácidos grasos poliinsaturados en los vertebrados, como algunos eicosanoides provenientes de las reacciones catalizadas por enzimas de la familia de las lipoxigenasas. En los mamíferos una cantidad importante de estos productos corresponderían a ligandos endógenos del receptor nuclear PPARy. Este factor de transcripción participa en la homeostasis lipídica y es el blanco de las tiazolenedionas (TZDs), drogas que son ligandos de PPARy y modulan la resistencia a insulina, patología que precede a la diabetes. Las TZDs tienen además efectos neuro-protectores, neuro-regenerativos, y anti-inflamatorios. Sin embargo actualmente se ha descrito que las TZDs tienen efectos secundarios tales como un incremento en el riesgo de afección coronaria, edema periférico y edema macular (Singh, et al, 2007; Nikolaidis and Levine, 2004 y endall and Wooltorton, 2006). Esto ha llevado a retirar del mercado algunos de estos fármacos, siendo cuestionados los que aún se comercializan.

En este contexto se plantea que la generación de una oleorresina producida a partir de algas como materia prima, debería presentar un potencial como activador de receptor nuclear PPARy, ya que contendría en su composición moléculas (oxilipinas) similares a los ligandos endógenos de estos receptores en mamíferos. Modelo que nunca había sido descrito en el estado del arte previo. Debido a los efectos secundarios de las TZDs y a las dificultades y costos que implica la síntesis y prueba de nuevas moléculas con potencial activación de PPARy, esta patente se enfocó en el proceso de preparación de extractos de origen natural en algas marinas rojas, las cuales se comportarían como los activadores endógenos y son mejor toleradas por el organismo. Su validez como potenciales activadores de PPARy se determinó tanto in vitro (ensayos de gen reportero) como en dos modelos in vivo (ratones com resistencia a insulina inducida por dieta, y un modelo de infarto cerebral en rata) En general los ligandos endógenos de PPARy son moléculas lipofílicas y la mayoría de las veces capaces de entrar por sí mismas a las células. Esto les permite ser absorbidas directamente por el tracto gastrointestinal, facilitando su uso en terapias por vía oral (Bordoni et al, 2006). Las algas marinas presentan una diversidad de ácidos grasos polinsaturados (PUF As), y se ha determinado que en especial las algas rojas son particularmente abundantes en ácidos grasos de 18 y 20 átomos de carbono. Estos PUF As son los precursores de las ya mencionadas Oxilipinas, término con que fueron agrupados en plantas terrestres y organismos marinos los derivados oxidados de ácidos grasos C-18 (octadecanoicos) y C-16 (hexadecanoicos) y en menor proporción C-20 (Stefanov et al. 1988, Gerwick et al, 1993, Bouarab et al ,2004). En el curso de investigaciones sobre productos marinos naturales en algas tropicales se encontró que muchas macroalgas y especialmente el orden rhodophyta (algas rojas), presentaban la capacidad enzimática para metabolizar PUF As en vías análogas a las de las lipoxigenasas de mamíferos. También se hizo notar que estos compuestos se encontraban en concentraciones mucho mayores en el tejido de las algas que en los tejidos animales, lo que supone un rol importante en la fisiología del alga, tanto en su desarrollo como en defensa. Hoy en día las algas rojas son la fuente más prolífica de oxilipinas tanto conocidas como nuevas y contienen entre otras, oxilipinas de la familia de los eicosanoides, incluyendo prostaglandinas y leucotrienos, así como también octadecanoides. Por ejemplo las algas del género Gracilaria, así como también Gracilariopsis, son de interés particular, ya que contienen eicosanoides similares a los encontrados en mamíferos.

Para la supervivencia del alga en un ambiente competitivo, las plantas marinas desarrollaron defensas como la producción de disuasivos químicos. Dentro de estos disuasivos se evidencia un posible rol de las oxilipinas cuando las algas son expuestas a agentes dañinos o estrés. En uno de estos estudios se puede apreciar que la liberación o generación de estas moléculas no observa cuando las algas fueron previamente incubadas con un inhibidor de las lipoxigenasas (LOXs), lo que da cuenta de que este cambio se debe a la liberación previa de ácidos grasos desde membranas celulares frente al daño físico. Una gran diversidad de oxilipinas se detectaron al incubar diferentes ácidos grasos polinsaturados exógenos con extractos de un alga roja Chondrus crispus que habían sido expuestas a un patógeno, muchas de estas moléculas corresponden a eicosanoides que se encuentran también en animales superiores (Bouarab et al 2004).

Un segundo estudio realizado por Lion et al. (2006) determinó el papel de las oxilipinas frente al daño físico y biológico en un alga roja endémica en Chile, la Gracilaria chilensis (pelillo). Ellos demostraron que en algas sometidas a trituración con mortero se encontraron grandes cantidades de ácido araquidónico, ácido 8R-hidroxieicosatetraenoico (8- HETE) y ácido 7,8-dihydroxyeicosatetraenoic (7,8-di-HETE). También se detectó la presencia de fosfolipasa A2 y su inhibición previno la liberación de ácido araquidónico y 8-HETE. Por otra parte en ensayos de interacción con algas epífitas, su capacidad de invasión fue inhibida por los extractos de G. chilensis previamente tratadas. En resumen, lo conocido en el estado del arte es que frente a ciertos estímulos nocivos y de estrés en algas rojas se desencadena una cascada de procesos enzimáticos que dan a origen a una gama de oxilipinas, dentro de los cuales se encuentran derivados oxidados de PUF As muy similares a los que se producen en mamíferos, y algunas de ellas pueden corresponder a activadores endógenos del receptor nuclear PPARy. Este planteamiento fue corroborado por nuestras investigaciones donde estudios in vitro de transfecciones celulares con genes reporteros demostraron que nuestros extracto oleoso proveniente del alga roja Gracilaria chilensis, tiene la capacidad de inducir la actividad transcripcional de PPARy. Esta metodología fue utilizada posteriormente en la presente patente para medir o determinar la actividad de los extractos provenientes de diferentes procedimientos de generación y obtención del extracto. En general, los procesos de refinación de concentrados oleosos en algas rojas no están bien descritos y normalmente son adaptaciones de los clásicos procesos de refinación de los aceites de origen vegetal. Algunos de tales procesos se divulgan en patentes norteamericanas 4915876, 4804555 y 4838997 entre otros. Este tipo de procesos basa su tecnología en procesos de destilación de este tipo de aceites con lo cual muchas de sus características metabólicas y biológicas son perdidas en el proceso. Para la elaboración de este tipo de productos alimenticios, nutracéuticos y farmacéuticos se requieren productos con una actividad transcripcional del receptor PPARy mantenida o aumentada, lo que evidentemente no se puede lograr mediante los procesos de refinación tradicionales de aceites. Otro enfoque, radica en el hecho de que existen numerosos procesos en el estado de la técnica para la producción de concentrados en base a algas. La mayoría de los procesos de concentración comienza con la etapa de machacando o trituración del alga, para luego realizar extracción por solventes, generalmente en una mezcla etanol/agua, metanol/agua, propanol/agua, hexano/agua y acetona/agua, entre otras. Algunas patentes con este tipo de descripciones de proceso que pueden ser mencionadas son EP 07764849, EP06810942, EP1778219. Por otro lado, se utilizan solventes de extracción con mayor lipofilicidad (WO2010039024), para luego trabajar independientemente las fases.

El problema de los métodos previamente propuestos, radica en la sobre-generación de estrés al destruir las células del alga, esto se traduce en la perdida, en parte de la actividad transcripcional del receptor PPARy en mamíferos, descrito en la figura 5/10. En su estado basal, si no es estresada el alga, existe un nivel fijo en donde se genera una actividad transcripcional del receptor PPARy. El punto estuvo en lograr el estrés adecuado para obtener y mantener la actividad transcripcional del receptor PPARy.

Los problemas técnicos y objetivos que pretende solucionar este procedimiento de preparación, se resumen en que para poder hacer uso de estas algas como extractos, se requiere que en el proceso de producción se mantengan las características beneficiosas del alga. Por otro lado, uno de los objetivos con respecto a esta patente es poder mantener a través del proceso de preparación, la mantención de la capacidad inductora de la actividad transcripcional del receptor PPARy, relacionado con la actividad beneficiosa de este extracto en el ser humano. Por otra parte, la capacidad de almacenamiento en diferentes etapas del producto final o semi-elaborado manteniendo una alta actividad biológica, entrega una plasticidad en la operación de producción del extracto, tal como se presenta en la figura 7/10. Finalmente, una característica de este proceso es que permite que el extracto pueda ser consumido directamente en forma oral manteniendo la actividad biológica que se desea.

En consecuencia, el objetivo de la presente invención es proveer un proceso eficiente y simple, que no utiliza extracción por solventes, ni destilación en alta temperatura, para la producción de una oleorresina manteniendo la actividad de PPARy, de una materia prima natural derivada de algas rojas, de preferencia Gracilaria chilensis, aptos para el consumo oral humano y de calidad farmacéutica.

Descripción del Procedimiento de Preparación

La oleorresina se obtiene de un procedimiento de preparación que comprende cinco etapas de:

A) Extracción y transporte del alga fresca a baja temperatura;

B) preparación y picado del alga;

C) Secado por liofilización

D) Pulverización con extracción sólido-líquido discontinua de la oleorresina

E) Eliminación de solventes. El detalle de cada una de las etapas se presenta a continuación: A) Selección y transporte del alga fresca a baja temperatura. A. l) Selección y recolección del alga fresca:

La extracción del alga puede ser manual o automática, se recomienda la extracción del alga viva y entera, despegada directamente del sustrato marino con el objetivo de preservar la integridad celular, evitando inducir una respuesta metabólica temprana frente al daño. De preferencia se recomienda la extracción y selección manual del alga roja de preferencia Gracilaria chilensis, sin restringirla a esa alga roja en particular, de un tamaño igual o superior a 60 cm de largo, preservando así las algas en crecimiento.

A.2) transporte del alga fresca a baja temperatura:

Luego de la recolección el alga es depositada en recipientes termo-aislados y puestas en bolsas las cuales se cubren con ice-pack (bolsas congeladas) para preservarlas a baja temperatura durante su transporte. B) Preparación de la materia prima y picado del alga;

B. l) lavado con PBS y centrifugado con almacenaje al vacio a -20°C;

Una vez recibidas las algas son lavadas para retirar el agua de mar con una solución tampón, de preferencia una solución tampón Fosfato Salino (PBS) constituido por NaCl (137 mmol/L), KC1 (2.7 mmol/L), Na2HP04 · 2 H20 (10 mmol/L), KH2P04 (2.0 mmol/L) a pH 7.4 y a 4°C, sin restringir otro tipo de soluciones tampones. Este lavado se realiza pasando el alga por recipientes con PBS, de preferencia tres, luego se secan en una centrífuga de vegetales por centrifugación manual o automática (aprox. 500 rpm). Finalmente el alga se almacena en bolsas al vacío y se refrigera a -20°C. Este almacenamiento permite acumular la materia prima cuando se trabaja con sobre- stock de alga, evitando la rápida degradación que ocurre con este tipo de algas al exponerlas a temperatura ambiente fuera de sus medio natural, como se presenta en la figura 7/10. Adicionalmente permite aprovechar la abundancia estacional que puede presentar la extracción de este producto, como también suplir la falta de capacidad de procesamiento que pueda presentarse a nivel industrial o semi-industrial.

B.2) Descongelamiento del alga: El alga es descongelada a 4°C para generar un estrés moderado en la estructura del alga pero no en sus células y nuevamente se lava con PBS (pH 7,4 y 4°C), para posteriormente secarla al igual que el procedimiento mencionado en B.l .

B.3) Picado con cuchillo:

Una vez descongelada y secada el alga, corresponde realizar un picado rápido de ella con el objetivo de causar un daño moderado con el fin de generar una respuesta de la defensa del alga generando una serie de moléculas del tipo oxilipinas y antioxidantes. En este sentido se puede apreciar una diferencia significativa de la capacidad de inducir la actividad transcripcional de PPARy entre el alga sin daño y el alga dañada (Figura 3/10).

Por otro lado, el alga descongelada presenta características de fibras o hilachas las cuales impiden su procesamiento en maquinarias convencionales de corte con rotor debido a que estas se enredan en las aspas de cada una de ellas, trancándolas y aumentando la temperatura de sus rotores. Por este motivo y en la inducción del daño sobre el alga, se generó el siguiente protocolo descrito a continuación:

Se toma una cantidad de alga secada y se pica manual o automáticamente con cuchillas de acero inoxidable de medio golpe a temperatura ambiente (20-24°C), en trocitos entre 1 a 3 mm. Al estar en descongelación, el alga se comporta como un semi-sólido mejorando su presentación para ser picada. Este proceso constituye una reacción en ambiente húmedo del alga frente al daño expuesta al aire. Este picado es de suma importancia para mantener la actividad PPARy, ya que es en esta etapa crítica en donde se observa una mayor pérdida de actividad, tal como se presenta en la figura 5/10.

B.4) Congelamiento corto a -20°C:

Tal como se menciono en el protocolo luego de su procesamiento el alga es congelada a -20°C brevemente, para su posterior liofílización. Otra alternativa más corta es congelar a - 80°C con lo cual se ahorra más tiempo. Ya que este congelado no es al vacío, es opcional pero recomendable pasar al proceso de liofílización inmediatamente una vez congelada el alga para evitar cualquier deterioro por oxidación.

Este congelamiento genera una materia prima sem i-terminada para el proceso de desecación y entrega un segundo lapsus temporal en donde se puede almacenar materia prima, sin dañar sus características metabólicas.

C) Secado ó deshidratado por liofílización C.n Liofílización:

El alga previamente congelada se liofíliza por un rango de 12 a 48 horas, de preferencia 24 horas; a una temperatura entre -20°C y -90°C, de preferencia -50°C; a un rango de presión de 0.001 mbar a 0,03 mbar, de preferencia una presión de 0,014 mbar. Finalizado el tiempo de liofílización se obtiene un producto deshidratado el cual es almacenado en bolsas al vacío a -20°C. Este congelamiento permite generar un tercer lapsus temporal en donde se puede almacenar la materia prima previo a su proceso final y con el mínimo daño oxidativo de sus componentes activos. D) Pulverización con extracción sólido-líquido discontinua de la oleorresina

D. l) Temperado y Molido del alga liofilizada: Las bolsas con alga liofílizada al vacío se llevan a temperatura ambiente (20-24°C), siendo posteriormente abiertas y su contenido pesado. Una cantidad del alga liofílizada, dependiendo de cuanta oleorresina se quiera producir, es molida (moledora de café), con un tamiz capaz de alcanzar un polvo fino con un tamaño de partícula promedio inferior a ½ mm.

Cuando ha sido deshidratada por liofílización el alga, el daño que puede ser generado al producir un mayor estrés por la molienda de la misma, se minimiza por no tener agua disponible en donde puedan ser degradadas o afectadas las acciones beneficiosas de las oxilipinas y antioxidantes.

D.2) Extracción sólido-líquida discontinua:

Para el proceso de extracción se utiliza un contenedor, a modo de ejemplo un matraz de vidrio del tipo erlenmayer de 500 mi con tapa esmerilada, al cual se agrega una cantidad del alga finamente molida y se adiciona, en una rango de relación 1/2 a 1/10 peso alga finamente molida /volumen de diclorometano en una relación preferente de 1 es a 3,6 peso/volumen, para el caso de este ejemplo 180 mi de CH ₂ CL ₂ (diclorometano). Cada contenedor se llevo a una atmósfera saturada con gas nitrógeno y se tapan sellándolos. Inmediatamente se incubaron con agitación horizontal en un rango de 45°C a 25 °C, de preferencia 34°C; por un rango de 2 horas a 10 minutos, de preferencia 30 minutos. Finalizado este período se decanta la mezcla por 10 minutos y se filtra con vacio con un filtro de vidrio sinterizado y papel whatman N°l. La fase líquida es recibida en otro recipiente. La fase sólida se vuelve a resuspender en el solvente repitiéndose el procedimiento de extracción anterior por una segunda vez, aunque no sólo limitándose a solo dos extracciones oleosas.

Para optimizar el proceso, se compararon diferentes tipos de solventes oleosos, siendo el de mayor actividad la extracción mencionada con diclorometano (figura 1/10). Por otro lado, es una extracción oleosa porque el agua fue extraída inicialmente por liofílización, por lo tanto acá no se forman fases. Las alícuotas de líquido filtrado son concentradas por rota-vapor en un rango de temperatura entre los 20°C a 50°C, de preferencia 37-39°C, generándose una oleorresina semi-terminada con trazas del diclorometano; E) Eliminación de solventes:

Este producto es trasvasijado a un recipiente más pequeño para ser secado bajo gas nitrógeno hasta alcanzar peso constante y luego se resuspende en el mínimo volumen posible (esto dependerá de la cantidad de producto secado) de ciclohexano siendo congelada rápidamente a -80°C para ser liofilizada por 24 hrs (con el fin de eliminar completamente el ciclohexano en combinación con el diclorometano), obteniendo finalmente una oleorresina sin solventes como producto final.

Con respecto al almacenamiento de la oleorresina, ésta es almacenada bajo atmósfera saturada de gas argón (o un gas inerte para evitar procesos de oxidación) a -20°C. Este almacenaje permite mantener las características funcionales buscadas por largos períodos, sin disminuir la habilidad del extracto de activar PPARy (Figura 7/10).

La eficiencia del procedimiento de extracción de todo el proceso partiendo desde el alga fresca hasta la obtención de la oleorresina se puede apreciar en la siguiente tabla I:

Tabla I

Eficiencia del proceso de obtención de oleoresina a partir de alga picada

Figura 1/10

Esta figura presenta un esquema del procedimiento de preparación presentado en la presente patente y las etapas críticas en donde se produce el almacenamiento en frío para poder guardar el producto final o la materia prima semi-elaborada.

A: Alga Roja

B: Recolección y Transporte a baja temperatura

C: Preparación de la materia prima y picado del alga

D: Secado por liofilización

E: Pulverización con extracción sólido-líquido discontinua de la oleorresina

F: Eliminación de Solventes

G: Oleorresina del Alga

H: Almacenamiento a -20°C.

Figura 2/10

La siguiente figura presenta un esquema de los plásmidos utilizados.

El primero contiene la región promotora de los PPARs (3xPPRE) unido al reportero Luciferasa y el segundo corresponde a un plásmido de sobre-expresión de PPARy que está unido a un promotor fuerte como pCMV.

Donde: s: Corresponde a PPRE 3x

t: Corresponde a TK

u: Corresponde a Luciferasa

v: Corresponde a Pcmv

w: Corresponde a PPARy Figura 3/10

Esta figura presenta un gráfico de actividad transcripcional de PPARy en células CHO co-transfectadas con PPRE-tk-Luc y pCMV -PPARy y tratadas con AF (alga fresca) y ATPBS (alga molida con lavado en PBS).

I: presenta el eje de las abscisas donde se muestran las barras que corresponden a:

la: barra control (DMSO 0,02%).

Ib: barra RZG [Ι μπι]

Ic: barra blanca AF y barra negra ATPBS en una concentración de 40 j^g/ml] cada una.

J: presenta el eje de las ordenadas como los valores promedio ±SD de la actividad relativa (Luciferasa/p-gal) expresados como veces de activación respecto al control. Los resultados representan a lo menos tres experimentos independientes. Figura 4/10

Esta figura presenta un Gráfico de actividad transcripcional de PPARy en células PC12-yl4 transfectadas con PPRE-tk-Luc y tratadas con ATPBS (alga molida con lavado en PBS) y AP Alga Picada).

K: presenta el eje de las abscisas donde se muestran las barras que corresponden a:

Ka: barra control (DMSO 0,02%)

Kb: barra RZG [Ι μπι]

Kc: barras blanca AF y barra negra ATPBS e una concentración de 40 |^g/ml] cada una. Kd: barras con los mismos tratamientos con extracto a una concentración de 100 |^g/ml]. L: presenta al eje de las ordenadas, el cual corresponde al promedio ±SD de la actividad relativa (Luciferasa/p-gal) expresados como veces de activación respecto al control. Los resultados representan a lo menos tres experimentos independientes.

Figura 5/10

Esta figura presenta una diferencia porcentual de las veces de actividad transcripcional obtenida entre los extractos desde tres diferentes tipos de procesamiento del alga. LL: presenta el eje de las abscisas donde se muestran las barras que corresponden a:

LLa: Alga fresca sin daño (AF)

LLb: Alga procesada con ultraturrex (ATPBS)

LLc: Alga picada con cuchillo (AP)

M: presenta al eje de las ordenadas, el cual corresponden a porcentajes donde la barra LLa corresponde a un valor basal de activación y las otras barras a las diferencias porcentual entre ellas (AF v/s ATPBS y ATPBS v/s AP). Figura 6/10

Esta figura presenta los diferentes solventes probados en el procedimiento de extracción de la oleorresina, en la etapa de pulverización con extracción sólido-líquido discontinua de la oleorresina. Posteriormente se midió la actividad transcripcional de los diferentes extractos para PPARy, los que se expresan numéricamente como actividad relativa.

En el eje de las ordenadas, expresado numéricamente se presenta la actividad transcripcional relativa de PPARy. En el eje de las ordenadas están las diferentes pruebas extractivas con diferentes solventes.

a) Control (sin adiciones);

b) Diclorometano;

c) Etil acetato;

d) Hexano;

e) Methanol

En todos los casos se utilizaron 250 ug/ml de la oleoresina. Figura 7/10

Esta figura presenta un Gráfico de la estabilidad transcripcional para PPARy de la Oleorresina en el tiempo.

Q: presenta el eje de las abscisas donde se muestran las barras que corresponden de izquierda a derecha a:

Barra negra control solo con solvente a -20°C

Barra negra de oleorresina congelada a -20°C a tiempo 0

Barra negra de oleorresina congelada a -20°C a tiempo 4 semanas

Barra negra de oleorresina congelada a -20°C a tiempo 6 semanas

Barra negra de oleorresina congelada a -20°C a tiempo 9 semanas

Barra gris control solo en ausencia de la oleorresina

Barra gris control con Rosiglitazona (RGZ) 1 μπι. (como un agonista conocido).

L: presenta al eje de las ordenadas, el cual corresponde al promedio +SD de la actividad relativa de PPARy. Figura 8/10

Esta figura presenta la acción de un antagonista de PPARy sobre la actividad transcripcional inducida por extracto de Alga.

En el eje de las abscisas (X) se presentan los siguientes tratamientos celulares:

Xa: Control DMSO

Xb: Control pre-incubado con T0070907, inhibidor específico de PPARy

Xc: células tratadas con RZG [Ι μπι]

Xd: T0070907+RZG[^m]

Xe: Extracto de alga 50 | g/ml]

Xf: T0070907+ Extracto de alga 50 | g/ml]. En el eje de las ordenadas (Y) los valores corresponden al promedio ±SD de la actividad relativa (Luciferasa/p-gal) expresados en veces de activación respecto al control.

Los resultados representan a lo menos tres experimentos independientes.

Figura 9/10

El primer gráfico de la Figura 9/10 presenta la determinación de Glucosa plasmática en ratones LFD (dieta baja en hidratos de carbono) y HFD (dieta alta en hidratos de carbono), posteriores al tratamiento con extracto de Alga.

El gráfico muestra en el eje de las abscisas (N) lo siguiente:

Na: barra control de Ratones con dieta LFD

Nb: Ratones con dieta Aceite de Maíz HFD

Nc: Ratones con dieta Aceite de Maíz y posterior tratamiento con extracto de Alga 90 [mg/kg]

Nd: Ratones con dieta Aceite de Maíz y posterior tratamiento con extracto de Alga 300 [mg/kg]

Ne: Ratones con RZG 5[mg/kg].

El gráfico muestra en el eje de las ordenadas (Ñ) muestra los valores sanguíneos de glucosa en mg/dl. Los valores corresponden a un "n" de 10 ratones por grupo. Se determinaron las diferencias significativas en el grupo HFD respecto su control tratado con aceite de Maíz.

El segundo gráfico de la Figura 9/10 presenta la determinación de Insulina plasmática en ratones LFD (dieta baja en hidratos de carbono) y HFD (dieta alta en hidratos de carbono), posteriores al tratamiento con extracto de Alga.

El gráfico muestra en el eje de las abscisas (O) lo siguiente: Oa: barra control de Ratones con dieta LFD

Ob: Ratones con dieta Aceite de Maíz HFD

Oc: Ratones con dieta Aceite de Maíz y posterior tratamiento con extracto de Alga 90 [mg/kg]

Od: Ratones con dieta Aceite de Maíz y posterior tratamiento con extracto de Alga 300 [mg/kg]

Oe: Ratones con RZG 5 [mg/kg]. El gráfico muestra en el eje de las ordenadas (P) muestra los valores sanguíneos de

Insulina plasmática en ng/ml.

Los valores corresponden a un "n" de 10 ratones por grupo. Se determinaron las diferencias significativas en el grupo HFD respecto su control tratado con aceite de Maíz.

Figura 10/10

La presente figura muestra el efecto neuro-recuperador de la oleorresina en el volumen de infarto cerebral en un modelo en rata.

Z) es el eje de las abscisas, en el cual se presentan los diferentes tratamientos:

Zl) Presenta un control solo con vehículo

Z2) Presenta el tratamiento con RZG (Roziglitazona)

Z3) Presenta el tratamiento con la oleorresina

AA) presenta el eje de las ordenadas en donde se mide el procentaje de volumen de infarto cerebral.

El efecto de la droga Rosiglitazona (RGZ, réplicas experimentales: 7) y de la oleoresina (réplicas experimentales: 8) sobre el porcentaje de volumen de infarto cerebral ipsilateral luego de 21 días de generada la lesión. El tratamiento para ambas drogas fue suministrado desde un día antes a la cirugía por 5 días consecutivos. Se muestran diferencias significativas entre el grupo tratado con vehículo (réplicas experimentales: 5) y los grupos tratados con las distintas drogas. Sobre cada columna se observa un corte representativo del tamaño de infarto en color gris. Ejemplo de Aplicación

Preparación de un extracto oleoso de alga roía de acuerdo a nuestra invención

El siguiente es un ejemplo del proceso productivo:

Se tomaron lOKg de alga, son lavados con PBS (pH 7,4) a 4°C y guardados en bolsas de 1 KG al vacío a -20° los cuales se pueden guardar por largos períodos.

Luego se descongelan bolsas que contiene lKg de alga a 4°C . El alga se vuelve a lavar brevemente en PBS (pH 7,4) a 4°C según protocolo e inmediatamente es secada manualmente en una centrífuga de verduras.

El alga se pasa a un recipiente frío y rápidamente se toman porciones de alga de aproximadamente 100 grs y se colocan sobre una superficie de picado donde son cortada finamente con cuchillo hasta apreciar trocitos entre 1 a 3 mm. Este procedimiento se adecúa según la experticia del operario para que no demore más de 10 min totales, si bien el alga se mantiene siempre en un recipiente frío. El alga picada fue depositada en placas de petril de 150 mm diámetro en una cantidad aproximada de 50 grs. por placa, para inmediatamente ser refrigeradas a -20°C, por aproximadamente 3 hrs. Este procedimiento se repitió para los 10 kg de alga congelada inicialmente.

Las placas correspondiente al picado de 1 Kg de alga fueron colocadas en el liofilizador (según protocolo) por 24 hrs y el alga deshidratada fue pesada y guardada en bolsas al vacío a -20C° (estas se pueden guardar por largos períodos). Finalizado el procesamiento del total de alga se obtuvo una cantidad promedio de 850 grs de alga liofilizada provenientes de 10 Kg de alga. Esto corresponde a un 8,5 % de materia seca obtenida desde alga fresca. Para la obtención de la oleoresina se tomaron 200 grs de alga liofílizada congelada y se llevaron a t° ambiente por 40 min. Luego de ello fue molida finamente en una moledora de café profesional hasta alcanzar un polvo fino (partícula promedio de 1/2 mm). Este polvo fue colocado en matraces erlenmayer de 500 mi con tapa esmerilada. Se depositaron 50 grs de polvo de alga por matraz y a cada uno se le agregó 180 mi de diclorometano. Estos fueron saturados con una atmósfera de gas nitrógeno y sellados con su tapa y parafilm. Los matraces se colocaron el un shaker (agitador), con una agitación de 350 rmp, a 34°C, por un período de 30 minutos. Finalizada la extracción por agitación, se retiraron los matraces y se dejaron decantar por 10 minutos a t° mbiente. Posteriormente se filtraron con embudo Bcühner con filtro de vidrio sinterizado y papel Whitman N°l . La fase líquida fue es recibida en un matraz redondo de 1 lt. La fase sólida se volvió a resuspender en ahora en 150 mi de dicloromentano, repitiéndose el procedimiento de extracción anterior por una segunda vez y se realizó un segundo filtrado de los matraces con alga y solvente.

La fase líquida total contenida en al matraz redondo fue colocada en un rota-vapor a 37-39°C por aproximadamente 30 min, retirando gran parte del solvente dejando una pequeña cantidad para ser trasvasijado a un matraz redondo de vidrio más pequeño y previamente pesado (de 150 mi) el cual fue secado bajo gas nitrógeno, siendo pesado cada media hora hasta alcanzar peso constante (aproximadamente 70 a 90 min totales). Luego el extracto casi sin solvente fue resuspendido en un volumen mínimo de ciclohexano y fue congelad por lhr a -80°C, siendo inmediatamente después liofilizado por un período de 24 hrs. Finalizado el período de liofilización el matraz conteniendo la oleoresina fue pesado nuevamente registrando el peso total y final de extracto obtenido. En el caso de los 200 grs de extracto extraído se obtuvo una cantidad de 1,28 grs de oleoresina, correspondiendo a un 0,64 % del peso inicial extraído. Finalmente este fue guardado bajo atmósfera de argón, siendo sellado y almacenado a -20°C para su uso posterior.

Resultados experimentales

Descripción del protocolo de transfecciones celulares Protocolo general de los ensayos de transfección celular para estudiar la actividad transcripcional de PPARy

PPARy posee la capacidad de activar la actividad transcripcional de diversos genes. Esto lo realiza uniéndose a una secuencia consenso de nucleótidos en la región promotora de dichos genes, la cual se denomina PPRE (elemento de respuesta a proliferadores peroxisomales). Este elemento se ha incorporado a la región promotora de un plásmidos reportero que contiene el gen de luciferasa. Con éste realizaron transfecciones celulares, que nos permitieron si la incubación de las células con nuestro compuesto de alga era capaz de activar a PPARy y por consiguiente unirse al PPRE presente en el reportero, activando la transcripción del gen luciferasa.

Principios del ensayo: Este ensayo contempla una transfección con un vector reportero que contiene el gen de luciferasa proveniente de Photinus puralis bajo el control del promotor de timidina quinasa y tres secuencias en tándem provenientes de el PPRE del gen AOX (Acil Co-enzima Oxidasa) de rata ó PPRE-tk-Luc (Figura 2). Al final del ensayo se determina la luminiscencia emitida por la proteína luciferasa al reaccionar con un sustrato. Esto refleja la cantidad de proteína luciferasa traducida por la célula debido a la inducción transcipcional del plásmido mediante la unión de PPARy. Debido a que diversos tipos celulares presentan una variación en la expresión de PPARy y con el objetivo de visualizar adecuadamente el efecto de PPARy, adicionalmente se sobre expresó PPARy mediante la co-transfección de un plásmido que contiene el gen de PPARy junto a un promotor fuerte de cytomegalovirus ó pCMV-PPARy (Figura 2). En células que sobre expresan establemente PPARy como es el caso de las células PC 12 clon gamma 14 (PC12-yl4) caracterizadas por nuestro laboratorio, solo se requiere de una transfección simple con el vector PPRE-tk-Luc. Adicionalmente los diferentes tipos celulares se transfectaron con un receptor que contiene el gen de β-galactosidasa de E.coli bajo el promotor fuerte de cytomegalovirus, el que se cuantifica por la reacción de la proteína con un sustrato. Su actividad se utiliza como control interno de la transfección y permite corregir la variación de los valores de luciferasa por variaciones en la eficiencia de transfección celular. El plásmido utilizado se describe en la figura 2/10. Especificaciones del ensayo:

Co-transfección de células CHO con plásmido para PPARy y el reportero PPREx3-tkLuc:

Los ensayos se realizaron de la siguiente forma: se sembraron las células en placas de cultivo de 24 pocilios y bajo medio DMEM completo, incubándose hasta alcanzar 70% de confluencia. Se realizó una co-transfección en medio de cultivo sin antibiótico ni antimicótico, según se describe a continuación para un pocilio. Se preparó una solución de 50ul/pocillo de opti-PRO conteniendo O^g del plásmido PPARy, O^g de plásmido PPREx3-tk-Luc, 0.075 μg de plásmido pCMVp (β-gal) y O.^g de plasmado Tk-luc. Adicionalmente 1 μΐ de lipofectanina (LipofectAMINE 200, GIBCO BRL, USA) se diluyo en 48μ1 de opti-PRO dejándola 5 min. Finalmente ambas soluciones se unen y se incuban por 20 min., antes de ser agregada a las células. Por cada pocilio se remplazó el medio de cultivo completo por 400 μΐ de medio DMEM con 0.5% de SFB, luego de lo cual se agregan 100 μΐ de la mezcla de lipofectamina con los plásmidos y se dejaron transfectar por un período de 6 horas en la estufa de cultivo. Finalizado ese periodo las células son lavadas y luego mantenidas en medio DMEM 2% SFB durante la adición e incubación con los diferentes tratamientos por 16 horas. Una vez finalizado los tratamientos, se aspiró el medio de cultivo y las células fueron lavadas con PBS lx frío, luego de lo cual se añadió lOOul de solución de lisis del kit de luciferasa (Luciferase Assay System El 500, Pomega Corp, USA) en cada pocilio, pipeteando repetidas veces para lograr la lisis y homogenización de las células. El Usado fue traspasado a tubo eprendorf y se centrifugó a 12.000 rpm por 5 min. Del sobrenadante se separaron 20μ1 para determinar la Luciferasa y 50 μΐ para determinar la actividad β-galactosidasa (β-galactosidase Enzime Assay System, Pomega Corp, USA ). Los resultados corresponden al cálculo de la actividad relativa, Luciferasa/ -gal que se expresa en las gráficas como las veces de activación ó aumento de los tratamientos respecto al basal (DMSO). Transfección de células PC 12- γ!4 con el reportero PPREx3-tkLuc:

Se utilizaron células PC12-yl4, las cuales sobre expresan establemente PPARy, por lo que solamente fueron trasfectadas con el gen reportero PPRE-tk-Luc. Las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios, con lOOxlO ⁵ células/pocilio, en medio completo y se dejaron hasta el día siguiente, alcanzando 70% de confluencia. Brevemente se describe la transfección por pocilio. Se preparó una solución de 50ul/pocillo de opti-PRO conteniendo O^g de PPREx3-tk-Luc, 0.075 μg de pCMVp. Adicionalmente Ιμΐ de lipofectanina se diluyo en 48μ1 de opti-PRO dejándola 5 min. Finalmente ambas soluciones se unen y se incuban por 20 min. Antes de ser agregada a las células. Por cada pocilio se remplazó el medio de cultivo completo por 400 μΐ de medio RPMI con 0.5% de HS (horse serum), luego de lo cual se agregan 100 μΐ de la mezcla de lipofectamina con los plásmidos, dejándose incubar 16 hrs. Finalizada la transfección se iniciaron los tratamientos, los que se realizaron en medio RPMI con 2% de HS. Una vez finalizado los tratamientos el protocolo de determinación sigue igual a lo visto anteriormente.

En las gráficas del los estudios transcripcionales se expresan los resultados como veces de activación ó actividad relativa de Luciferasa/ -Gal respecto al su Control: Esto quiere decir que en el eje de las ordenadas el control toma un valor de 1 y sube consecutivamente 1, 2, 3, etc....).

Experimento 1 (descrito en Figura 3/10)

Comparación entre extracto de alga fresca sin daño (AF) y alga tratada en ultraturrex con PBS (ATPBS).

Con la finalidad de corroborar que es necesaria la inducción de un daño del alga previamente al proceso de extracción, buscando la generación de compuestos activos, nosotros comparamos los extractos lipidíeos obtenidos desde alga fresca entera sin daño y alga molida con ultraturrex en PBS. Especificaciones del Ensayo descrito en la figura 3/10

Co-transfección de células CHO con plásmido para PPARy y el reportero PPREx3-tkLuc: Las células se co-transfectaron con una batería de plásmidos para sobre expresar transitoriamente PPRAy (plásmido vCMV-PPARy) y el gen reportero Luciferasa (plásmido PPREx3-tk-Luc). Adicionalmente se transfectó el plásmido de β-galactosidasa (plásmido pCMVp). Los ensayos se realizaron de la siguiente forma: se sembraron las células a una concentración de 100x10 ⁵ cel/pocillo, en placas de cultivo de 24 pocilios y bajo medio DMEM completo, incubándose por durante 16 hrs, y alcanzando 70-80% de confluencia. Se realizó una co-transfección en medio de cultivo sin antibiótico ni antimicótico, según se describe a continuación para un pocilio. Se preparó una solución de 50ul/pocillo de opti-PRO conteniendo 0^g del plásmido PPARy, 0^g de plásmido PPREx3-tk-Luc, 0.075 μg de plásmido pCMVp (β-gal) y 0.14μg de plasmado Tk-luc. Adicionalmente Ιμΐ de lipofectanina (LipofectAMINE 200, GIBCO BRL, USA) se diluyo en 48μ1 de opti-PRO dejándola 5 min. Finalmente ambas soluciones se unen y se incuban por 20 min., antes de ser agregada a las células. Por cada pocilio se remplazó el medio de cultivo completo por 400 μΐ de medio DMEM con 0.5% de SFB, luego de lo cual se agregan 100 μΐ de la mezcla de lipofectamina con los plásmidos y se dejaron transfectar por un período de 6 horas en la estufa de cultivo. Finalizado ese periodo las células son lavadas y luego mantenidas en medio DMEM 2% SFB durante la adición e incubación con los diferentes tratamientos por 16 horas. Los tratamientos fueron: DMSO 0.02%, el control positivo Rosiglitazona [luM] y extracto de alga fresca (AF) y alga dañada con ultraturrex en PBS (ATPBS) ambas a 40 | ig/ml]. Una vez finalizado los tratamientos, se aspiró el medio de cultivo y las células fueron lavadas con PBS lx frío, luego de lo cual se añadió lOOul de solución de lisis del kit de luciferasa (Luciferase Assay System El 500, Pomega Corp, USA) en cada pocilio, pipeteando repetidas veces para lograr la lisis y homogenización de las células. El lisado fue traspasado a tubo eprendorf y se centrifugó a 12.000 rpm por 5 min. Del sobrenadante se separaron 20μ1 para determinar la Luciferasa y 50 μΐ para determinar la actividad β-galactosidasa (β-galactosidase Enzime Assay System, Pomega Corp, USA). Los resultados corresponden al cálculo de la actividad relativa, Luciferasa/p-gal que se expresa en las gráficas como las veces de activación ó aumento de los tratamientos respecto al basal (DMSO). Comentario de los resultados:

Nuestros resultados indican que el extracto de alga AF y ATPBS inducen significativamente la actividad relativa de Luciferasa en 1.39 y 1.93 veces la actividad del control. Sin embargo el extracto ATPBS fue un 28% superior a AF, lo que indica un incremento significativo (p<0.001) de actividad debido al daño ejercido con ultraturex. Como era de esperar RZG el control positivo de PPARy incrementó de hasta 2,5 veces el control (p<0.001). Experimento 2 (descrito en Figura 4/10)

Comparación entre extracto de alga tratada en ultraturrax con PBS (ATPBS) y el alga picada manualmente con cuchillo (AP). Con la finalidad comparar los extractos de alga obtenido mediante dos protocolos de generación de daño, uno bajo medio líquido y picado con ultraturrex (ATPBS) y el otro picando el alga manualmente con cuchillo en seco y expuesto al aire (AP) (según protocolo del ejemplo N°l), se realizó un ensayo de actividad transcripcional de PPARy en células PC12-yl4, las cuales sobre expresan establemente PPARy y fueron trasfectadas con el gen reportero PPRE-tk-Luc.

Especificaciones del Ensayo descrito en la figura 4/10:

Transfección de células PC12- γ!4 con el reportero PPREx3-tkLuc:

Se utilizaron células PC 12-Y14, las cuales sobre expresan establemente PPARy, por lo que solamente fueron trasfectadas con el gen reportero PPRE-tk-Luc. Las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios, con lOOxlO ⁵ células/pocilio, en medio completo y se dejaron hasta el día siguiente, alcanzando 80 de confluencia. Brevemente se describe la transfección por pocilio. Se preparó una solución de 50ul/pocillo de opti-PRO conteniendo 0^g de PPREx3-tk-Luc, 0.075 μg de pCMVp. Adicionalmente Ι μΐ de lipofectanina (LipofectAMINE 200, GIBCO BRL, USA) se diluyo en 48μ1 de opti-PRO dejándola 5 min. Finalmente ambas soluciones se unen y se incuban por 20 min. Antes de ser agregada a las células. Por cada pocilio se remplazó el medio de cultivo completo por 400 μΐ de medio RPMI con 0.5% de HS (horse serum), luego de lo cual se agregan 100 μΐ de la mezcla de lipofectamina con los plásmidos, dejándose incubar 16 hrs. Finalizada la transfección se iniciaron los tratamientos, los que se realizaron en medio RPMI con 2% de HS. Los tratamientos fueron, DMSO 0.02%, Rosiglitazona [1 μΜ] y el extracto de alga ATPBS y AP en concentraciones de 50 y 100 |^g/ml] cada una de ellas, los que se mantuvieron por 16 hrs. Una vez finalizado los tratamientos, se aspiró el medio de cultivo y las células fueron lavadas con PBS lx frío, luego de lo cual se añadió lOOul de solución de lisis del kit de luciferasa (Luciferase Assay System El 500, Pomega Corp, USA) en cada pocilio, pipeteando repetidas veces para lograr la lisis y homogenización de las células. El Usado fue traspasado a tubo eprendorf y se centrifugó a 12.000 rpm por 5 min. Del sobrenadante se separaron 20μ1 para determinar la Luciferasa y 50 μΐ para determinar la actividad β-galactosidasa (β-galactosidase Enzime Assay System, Pomega Corp, USA).

Comentario de los resultados:

Nuestros resultados indican que el extracto de alga ATPBS y AP inducen significativamente la actividad de Luciferasa respecto al control. Se aprecia que la concentración de 100 μg/ml] alcanza un incremento de 1.5 para ATPBS y 2.6 para AP (p<0.001), siendo esta última un 42% superior. Ello indica que el picado manual controlado genera una mejor producción de activadores de PPARy que el picado con ultraturrex y PBS. Como era de esperar RZG el control positivo de PPARy incrementó de hasta 2,5 veces el control (p<0.001)

Integración Experimental 3 (descrita en Figura 5/10)

Diferencia porcentual en la capacidad de activar PPARy entre los extractos provenientes de los protocolos de procesamiento del alga (AF v/s ATPBS v/s AP)

Con el objetivo de comparar la diferencia en la magnitud de aumento de la actividad PPARy, entre los tres protocolos de procesamiento del alga, se realizó un ejercicio que consideró el control positivo RZG de cada estudio como el 100% de la activación. Luego se determino la diferencia porcentual de los tratamientos respecto a este control. Con este valor se pudo determinar la diferencia porcentual entre los tratamientos. Se compararon los tratamientos AF (alga fresca) v/s ATPBS (alga molida lavada con PVS) y ATPBS v/s AP (alga picada), para posteriormente graficarlos.

Si se considera la diferencia porcentual de los estudios de CHO y PC12yl4 que se puede presentar de la siguiente manera: En el caso de las células CHO se obtuvieron los valores en veces de activación de:

RZG: 2,5

AF: 1,39

ATPBS: 1,93

Si se toman las veces de activación de RZG como el 100%, se puede apreciar que AF es un 55,6% y ATPBS un 77,2% del valor de RZG. La diferencia entre ellos es de un 21,6%.

Por otro lado, para el caso de las células con PC12yl4, si los valores en veces de activación con las concentraciones mayores es de:

RZG: 4,4

ATPBS: 1,5

AP: 2,6

Haciendo el mismo ejercicio presentado previamente, con su respectivo valor de RZG, la diferencia entre los tratamientos con alga es de un 25%.

Por lo tanto, se tiene que ATPBS es un 21,6% mayor que AF y que AP es un 25% mayor que ATPBS con lo cual se presenta en la figura 5/10.

Los protocolos de preparación del alga molida y picada se describen a continuación: a) Alga Tratada con Ultraturrex en PBS: Se coloco una cantidad de alga secada con PBS manteniendo la proporción 1 :0,5 Alga/PBS, se colocaron en frascos y se procesan con ultraturrax (6 pulsos de 15 seg con pausas de 30 seg entre cada pulso), seguido a ello se incubaron por 10 min 4°C, y posteriormente se congelaron para su liofílización. Este procesamiento constituye una reacción en ambiente líquido isotónico y con pH regulado que podría asemejar a las condiciones de reacción del alga frente a daño en el ambiente marino. b) Alga Tratada con cuchillo (sin PBS): Se toma una cantidad de alga secada y se pica manual o automáticamente con cuchillas de acero inoxidable de medio golpe a temperatura ambiente (20-24°C), en trocitos entre 1 a 3 mm. Al estar en descongelación, el alga se comporta como un semi-sólido mejorando su presentación para ser picada. Este proceso constituye una reacción en ambiente húmedo del alga frente al daño expuesta al aire. Comentario de los resultados:

En la gráfica se aprecia una clara diferencia porcentual en la capacidad de activar PPARy entre los diferentes procesamientos del alga. El extracto proveniente de ATPBS es un 21,6% mayor que AF, mientras que AP es un 25% mayor que ATPBS. Esto muestra claramente que el mejor sistema de procesamiento de alga lo constituye el proceso que inicia con un picado del alga manual con cuchillo correspondiente a nuestro proceso inventivo.

Experimento 4 (descrito en Figura 6/10) Comparación de extracción con diferentes solventes

Con el fin de comparar el uso de solventes con diferente polaridad en la eficiencia de recuperación de actividad transcripcional de PPARy en la oleorresina se usaron iguales peso de alga liofilizada y se extrajeron con los mismos volumen y procedimiento general descrito anteriormente en ejemplo de aplicación en la preparación de la oleorresina. Posteriormente se midió la actividad transcripcional de los diferentes extracto para PPARy los que se expresan como actividad relativa al control (sin adiciones) como barras + D.S. En el eje de las ordenadas, expresado numéricamente se presenta la actividad transcripcional relativa de PPARy.

En el eje de las ordenadas están las diferentes pruebas extractivas con diferentes solventes, a) Control (sin adiciones);

b) Diclorometano;

c) Etil acetato;

d) Hexano;

e) Methanol Comentario de los resultados

Los resultados muestran que el solvente más efectivo en la extracción de una preparación activa es el diclorometano. Experimento 5 (Descrito en Figura 7/10)

Estabilidad de la actividad transcripcional de PPARY en la oleorresina almacenada baio Argón a -20° La oleoresina fue congelada a -20° C por 0,4,6 y 9 semanas en atmósfera de argón determinándose luego la actividad transcripcional (50 μg/ml; barras negras; ctr: solo solvente) de PPARydeterminado. Como control positivo (barras blancas) se determinó la actividad en ausencia (ctr) y presencia de Rosiglitazone (RGZ) 1 μπι. Comentario de los resultados

El experimento muestra que no hay pérdida de actividad transcripcional de PPARy luego de hasta 9 semanas de almacenamiento a -20° em urna atmósfera inerte. Experimento 6 (Descrito en Figura 8/10)

Extracto de Alga induce la activación de la transcripción del reportero PPRE(3x)-tk- Luc de manera PPARy dependiente:

El elemento de respuesta a proliferadotes peroxisomales (PPRE) es una secuencia consenso que eventualmente puede unir a otras isoformas de los PPAR, por lo que nosotros debíamos verificar si la respuesta observada con nuestro extracto de alga dependía exclusivamente de la activación de PPARy y no de otra isoforma del receptor ó de alguna interferencia celular. Por lo tanto decidimos confirmar nuestro resultado utilizando en nuestro ensayo un antagonista selectivo de PPARy que inhibe completamente la actividad transcripcional del receptor, lo cual nos permitiría corroborar que los efectos del extracto de alga son exclusivamente dependientes de la activación de PPARy. Principios del ensayo:

Para este ensayo utilizamos una línea celular que sobre expresa constitutivamente PPARy, denominadas PC12-yl4, las cuales solo se transfectan con el sistema de reportero (PPRE-tk-Luc). Previo a iniciar el tratamiento algunos puntos experimentales son preincubados con el antagonista selectivo de PPARy, con lo cual se inhibe la acción de este receptor y como consecuencia disminuye drásticamente los valores relativos de luciferasa detectados.

Especificaciones del ensayo:

Transfección de células PC12- yl4 con el reportero PPREx3-tkLuc: Las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios, con 100x10 ⁵ células/pocilio, en medio completo y se dejaron hasta el día siguiente, alcanzando 80 de confluencia. Brevemente se describe la transfección por pocilio. Se preparó una solución de 50ul/pocillo de opti-PRO conteniendo 0^g de PPREx3-tk-Luc, 0.075 μg de pCMVp. Adicionalmente Ιμΐ de lipofectanina (LipofectAMINE 200, GIBCO BRL, USA) se diluyo en 48μ1 de opti-PRO dejándola 5 min. Finalmente ambas soluciones se unen y se incuban por 20 min. antes de ser agregada a las células. Por cada pocilio se remplazó el medio de cultivo completo por 400 μΐ de medio RPMI con 0.5% de HS, luego de lo cual se agregan 100 μΐ de la mezcla de lipofectamina con los plásmidos, dejándose incubar 16 hrs. Finalizada la transfección se iniciaron los tratamientos, los que se realizaron en medio RPMI con 2% de HS. Dos grupos de tratamientos se utilizaron, en uno de ellos las cuales las células fueron pre-tratadas con el antagonista de PPARy T0070907 [10μΜ] por 1 hr., y otras células se incubaron sin el antagonista. Los tratamientos fueron, DMSO 0.02%, Rosiglitazona [1 μΜ] y el extracto de alga en 50 [mg/ml], los que se mantuvieron por 16 hrs. Una vez finalizado los tratamientos, se aspiró el medio de cultivo y las células fueron lavadas con PBS lx frío, luego de lo cual se añadió lOOul de solución de lisis del kit de luciferasa (Luciferase Assay System E1500, Pomega Corp, USA) en cada pocilio, pipeteando repetidas veces para lograr la lisis y homogenización de las células. El Usado fue traspasado a tubo eprendorf y se centrifugó a 12.000 rpm por 5 min. Del sobrenadante se separaron 20μ1 para determinar la Luciferasa y 50 μΐ para determinar la actividad β-galactosidasa (β-galactosidase Enzime Assay System, Pomega Corp, USA).

Comentario de los Resultados:

Los resultados muestran un dramático efecto del antagonista. En las células sin la presencia del inhibidor, tanto el extracto de alga como RZG aumentan significativamente la actividad de la luciferasa en 2.7 y 4.8 veces respectivamente como era de esperar de acuerdo a los resultados anteriores. En presencia del inhibidor, el efecto del alga es bloqueado totalmente, llegando incluso a valores inferiores que el basal. En el caso de la RZG bloquea su acción en un 70% aproximadamente, lo que se condice con su acción específica y potente sobre PPARy. Estos resultados nos confirman que los efectos de nuestro extracto dependen exclusivamente de la activación específica de PPARy, corroborando los ensayos de co- transfección anteriormente descritos.

Experimento 7 (Descrito en Figura 9/10)

Recuperación de la sensibilidad a la insulina en ratones alimentados con dietas ricas en grasas, luego del tratamiento con extracto de Alga Los activadores sintéticos de PPARy son reconocidos por inducir una recuperación de la sensibilidad a la insulina en pacientes diabéticos o resistentes a la insulina. Para determinar si nuestro extracto de Alga originaba una recuperación de la sensibilidad a la insulina, se realizó un ensayo donde se administró nuestro extracto a ratones con resistencia a la insulina. Para analizar el efecto de nuestro extracto se determinaron los valores de glucosa e insulina plasmática.

Principios del ensayo:

La cepa de ratones C57B1/6J presentan una mayor susceptibilidad a desarrollar resistencia a la insulina debido a una alimentación con exceso de ingesta calórica. La alimentación de ellos con dietas ricas en grasas (High Fat Diet=HFD) por un período de 12 semanas genera una condición patológica con u incremento de los valores sanguíneos de Glucosa e Insulina. Se conoce que la administración de RZG genera una disminución de estos valores indicando una recuperación de la sensibilidad a la insulina. Nosotros utilizamos este modelo experimental para probar y comparar los efectos de nuestro extracto de alga.

Especificaciones del Ensayo:

Estudio presentado en la figura 6/10 en ratones resistente a la insulina: 50 ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad, desde Jackson Laboratory, fueron separados al azar y mantenidos de 3 ó 4 ratones por caja. Adicionalmente los ratones fueron separados en dos grupos de alimentación. 10 ratones se alimentaron con dieta comercial Low Fat Diet (LFD), la que contiene 10% de Kcal en base materia grasa animal, mientras que 40 ratones fueron alimentados con dieta High Fat Diet (HFD), que contiene 60% de Kcal en base a materia grasa animal. Los ratones se alimentaron ad libitum y fueron pesados 3 veces por semanas durante todo es estudio. Luego de 12 semanas alimentación con las dietas LFD y HFD, se obtuvo una muestra de sangre de cada ratón para determinar los parámetros sanguíneos de Glucosa e Insulina. Estas determinaciones nos indicaron que los ratones alimentados con dieta HFD presentaban características concordantes con resistencia a la insulina. En este momento se iniciaron los tratamientos, los que fueron administrados una vez al día mediante gavage (sondaje gastro-esofágico), por un período de 30 días. Para ello se tomaron 10 ratones por grupo de tratamiento, tal como sigue: A) como control de dieta normal ó ratón sano, se trataron ratones LFD tratados con el vehículo Corn Oil (aceite de maíz); B) como control de ratón resistente a la insulina, se trataron ratones HFD con Corn Oil; C) ratones HFD tratados con RZG 5mg/kg como control positivo; D) Ratones HFD tratados con extracto de alga a 90 mg/kg (en una mezcla 1 :3 con Corn Oil), y E) ratones HFD tratados con extracto de alga a 300 mg/kg (en una mezcla 1 : 1 con Corn Oil). El volumen diario administrado fue de aproximadamente 50 μΐ. Luego de finalizado el tratamiento se obtuvo una nueva muestra de sangre mediante punción del seno submandibular, para determinar los valores sanguíneos mencionados y evaluar la recuperación de la sensibilidad a la insulina.

Determinación de los parámetros sanguíneos: a) Para la determinación de Glucosa Plasmática se utilizó un kit comercial basado en la siguiente reacción:

glucosa oxidasa

glucosa + 02 + H20 ► ácido glucónico + H202

peroxidasa

2 H202 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato 1 quinoniminaroja

Los volúmenes de reacción originales se modificaron para hacerlo en multiplacas de 96 pocilios, utilizando poco volumen de muestra. De cada muestra se utilizó un total de 6 μΐ, distribuidos en tres pocilios con 2 μΐ por pocilio. A cada pocilio se le agregó 300 μΐ de reactivo enzimático a 25°C y se incubo por 20 min a temperatura ambiente. La medición espectrofotométrica se realizó a 490 nm en un lector ELISA. b) Para la Insulina Plasmática se utilizó el protocolo incluido en el kit de ELISA para insulina, el cual se explica brevemente a continuación: Se utilizaron multiplacas de 96 pocilios que vienen previamente recubiertas con el anticuerpo primario (Mouse monoclonal anti-insulin). De cada muestra se agregó 5μ1 utilizaron por triplicado, y lo mismo ocurrió para cada uno de los estándares, luego de lo cual adicionó 75 μΐ de solución de trabajo con el anticuerpo conjugado (HRP-monoclonal anti-insulin antibody) a cada pocilio y se incubo por 2 hrs a temperatura ambiente. Posteriormente los pocilios se lavaron 6 veces con buffer de lavado y se agregó 100 μΐ de sutrato TMB (tetrametilbenzidina), incubando 30 min a temperatura ambiente. Finalmente se agregó 100 μΐ de solución de detención de reacción. Las microplacas se leyeron a 450 nm. Comentarios de los resultados:

El análisis de los parámetros sanguíneos finalizado el período de tratamientos, muestra que los ratones con la dieta HFD controles (Corn Oil), mantienen un incremento estadísticamente significativo de la glicemia respecto a los controles de la dieta LFD, similar a lo visto previo al inicio de los tratamientos (datos no mostrados). En el grupo de los ratones del grupo HFD tratados con 300 [mg/kg] del extracto de Alga, se indujo una completa recuperación de los niveles de de glucosa sanguínea (pO.001), alcanzando a los niveles de los ratones controles LFD sin resistencia a la insulina. La RZG también tuvo un efecto positivo disminuyendo la glicemia (p<0.05), si bien la recuperación solo fue la mitad de lo encontrado con el extracto de alga. En el caso del alga a concentraciones menores (90 mg/kg), este es casi idéntico al de la RZG, estando cerca de la significancia estadística (p<0.06). En cualquier caso podemos corroborar que nuestro extracto de alga tiene un efecto claramente beneficioso en la recuperación de los niveles normales de glucosa sanguínea. Al evaluar la insulina plasmática, los ratones controles HFD mantuvieron niveles altos respecto a su contraparte LFD al igual que lo ocurrido con la glicemia. Se observo además que en los ratones HFD tratados con el extracto de alga a una concentración de 90 [mg/kg] ya indujo una disminución significativas de la Insulina (p<0.05), observando su máximo efecto a 300 [mg/kg] (p<0.01), llegando a valores cercanos al 50% de las concentraciones encontradas en el grupo control HFD resistente a la insulina. Por otra parte el ligando sintético de PPARy (RZG), también generó la disminución de Insulina (p>0.001), alcanzando prácticamente a los niveles de los ratones con controles LFD.

Como conclusión se puede apreciar que el extracto en un período muy breve de tratamiento y en ratones resistentes a la insulina alimentados con dieta rica en grasa, induce una recuperación de los valores sanguíneos encontrados en los ratones alimentados con dieta normal. Debido a las condiciones experimentales consideramos que es un efecto muy significativo de nuestro extracto en la condición de resistencia a la insulina. Es muy posible que estos efectos puedan tener relación con la capacidad del extracto de alga para activar el receptor nuclear PPARy, similar a lo que ocurre con los ligandos sintéticos como la RGZ, si bien aún no ha sido confirmado experimentalmente por nosotros.

Experimento 8 (descrito en Figura 10/10)

Efecto neuro-protector de la oleorresina en el volumen de infarto cerebral en un modelo en rata.

Descripción Experimental

Las ratas de cada grupo experimental fueron puestas en cambio de ciclo de luz invertido de 12:12 horas durante las 2 primeras semanas de mantención. Los animales fueron tratados con Rosiglitazona, oleoresina y Vehículo (aceite de maíz) 24 horas antes de realizado el infarto cerebral focal por 5 días consecutivos a través de la técnica de Gavage (sonda gástrica). Se utilizaron 500 μΐ de volumen para cada tratamiento y una dosis de 2,5mg/kg/día para la Rosiglitazona y 800mg/kg/día para oleoresina. Los grupos experimentales fueron los siguiente: Grupo 1: Ratas sin infarto tratadas con vehículo (n8), Grupo 2: Ratas con infarto tratadas con vehículo (n5), Grupo 3: Ratas con infarto tratadas con Rosiglitazona (n7), Grupo 4: Ratas con infarto tratadas con oleoresina (n8).

El procedimiento quirúrgico para la lesión cerebral se realizó con el vasoconstrictor endotelin-1 (Et-1) aplicado de forma local. Se utilizó el anestésico en gas isoflurano en dos etapas. La primera de estas fue la etapa de inducción, la cual fue realizada en una cámara de acrílico con una solución gaseosa de 4% de isoflurano en oxígeno medicinal (99,5% de 02) mezclado con aire y suministrado a 6 SCFH ("standard cubic feet per hours") por 4 minutos. Luego de esto, los animales sedados fueron colocados en el aparato estereotáxico con una dosis de mantención de 1-2% de isoflurano disuelto en oxígeno medicinal (99,5% de 02) mezclado con aire y suministrado a 6 SCFH. El periodo de mantención fue según los requerimientos de las cirugías. Las inyecciones de Et-1 (400 pmol/ul en solución salina 0.9%), correspondientes a la región de la corteza motora primaria y a la región de la corteza somatosensorial, se realizaron en las coordenadas estereotáxicas referentes a bregma: antero- posterior (AP) + 0,0; medio lateral (ML) 2,5; dorso-ventral (DV) -2,1 y AP +2,3; ML 2,5; DV -1,9, con una aguja Hamilton de 28G acoplada a una jeringa Hamilton de 10 μΐ en un sistema de inyección automático (KdScientifíc, modelo KDS-310-plus, Helliston, USA). El microinyector fue ajustado para realizar inyecciones a una velocidad de 0.25μ1/ηιίη en dos inyecciones consecutivas de 50μ1 con 1 minuto de espera entre cada una. Ambas regiones fueron inyectadas de la misma manera, esperando 2 minutos con la aguja dentro del cerebro y subiendo 0, 1 mm antes de proceder a inyectar. Para evitar que la solución salga luego de la inyección se esperaron 3 minutos antes de retirar la aguja de la región inyectada.

Al día 5 los animales fueron sacrificados y se procedió a la extracción del cerebro de la cavidad craniana. Los cerebros fueron rebanados en secciones coronales de 2mm y teñidos con la tinción vital TTC (2,3,4-triphenyltetrazolium cloride) por inmersión a 37°C durante 30 minutos en oscuridad, mantenidas 24 horas en sacarosa 20% disuelta en buffer fosfato salino (PBS) 0,1 M, pH 7,4 y fijadas en paraformaldehído al 4% disuelto en PBS durante 24 horas. Posteriormente, los cerebros fueron congelados en nitrógeno líquido y criopreservados a - 80°C. Las secciones teñidas con TTC fueron escaneadas y analizadas usando el programa Image J (NIH, Bethesda), para luego determinar el porcentaje al que corresponde el área de la región infartada con respecto al área total del hemisferio ipsilateral. El porcentaje del volumen infartado se obtiene sumando el área infartada (Ai) de cada corte, dividiendo el resultado por la suma del área total del hemisferio infartado (A) y multiplicando el cociente por cien [(∑Ain)*2mm/(∑An)*2mm]* 100.

Comentarios de los resultados Los resultados muestran que la oleoresina a la dosis usada disminuye el área infartada en forma tan eficiente como la rosiglitazona, uno de los agonistas más potentes de PPARy

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