【명세서】

【발명의 명칭】

2-히드록시 감마 부티로락톤 또는 2, 4-디히드록시 -부티레이트 의 제조 방법

【기술분야】

본 발명은 2-hydroxy gamma butyro lactone (HGBL) 및 이의 전구체인 2 , 4-d i hydr oxybut ano i c acid 제조를 위하여 homoserine 생산을 중간단계로 하는 새롭게 제시된 생물합성 경로 및 이 경로를 가지는 유전자 재조합 균주를 제시한다. 2번 위치에 수산화기가 치환된 HGBL의 경우 포토레지스트를 위한 수지， 의약품 원료 및 금속 표면의 코팅을 위한 재료로 이용될 수 있는 중요한 중간체이다.

【배경기술】

미국특허 4,994,597 및 5,087,751 (I匪 e)은 3,4—디히드록시부티르산 유도체를 발표한다. 이러한 산 제조방법은 금속시안화물과 3 ,4-디히드록시 부틸 클로라이드의 반웅과 가수분해가 관련된 본 발명과 구별된다. 상기 산은 ₃ -히드록시부티로락톤의 중간물질이다.

(S)-3-히드록시부티로락톤은 콜레스테를 강하약， (S)-카르니틴， 안티 HIV 프로테아제 억제약， 광범위한 항생제를 포함한 다양한 약품의 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다.

(R)-3-히드록시부티로락톤 또는 (R)-3,4-디히드록시 부티르산 감마 락톤은 다양한 약품 중간물질 제조용 핵심 4-탄소 중간물질이다. 또한 이것은 건강식품 첨가제 및 강장제 보층물， 다양한 신경 시스템 및 대사 장애의 치료를 포함한 여러 용도에 사용되는 성분 및 천연 발생 비타민인 1-카르니틴으로 전환될 수 있다. 카르니틴 시장은 수백톤 규모이다. 이것은 d 및 1 형태의 순수분리 제품으로 제조된다. 그러나 아직까지 상업적 가치가 있는 직접 합성루트는 없다.

(S)-3-히드록시부티로락톤은 Hollingsworth 공정으로 제조될 수 있다 (미국특허 5,374,773). (R)-3-히드록시부티로락톤은 4-연결 L-핵소스를 갖는 출발물질을 사용할 필요가 있으므로 상기 공정으로 제조될 수 없다. 이러한 물질은 알려져 있지 않다. 일반적인 락톤 제조방법은 다음 특허로 알려져 있다:

U, .S. Patent No. 3 ,024 _; ,250 to Klein et al . ,

U, .S. Patent No. 3 _; ,868, ,370 to Smith,

U. .S. Patent No. 3 _; ,997 _; ,569 to Powel 1 -,

U. .S. Patent No. A. ,105, ,674 to De Thomas et al .

U. ,s. Patent No. 4 _: ,155 _: ,919 to Ramioui lie et al

U, ,s. Patent No. 4 _; ,772„ ,729 to Rao,

U. ,s. Patent No. _, . ,940, ,805 to Fisher et al . ,

U. ,s. Patent No. 5 _; ,292, ,939 to Hoi 1 ingsworth,

U. ,s. Patent No. 5, ,319, ,110 to Hoi 1 ingsworth,

U. ,s. Patent No. 5, ,374, ,773 to Hoi 1 ingsworth,

U. ,s. Patent No. 5, ,502, ,217 to Fuchikami et al .

이들 특허는 다양한 락톤 제조 공정을 발표한다. 그러나 이들 모두는

2-hydroxy 위치의 gammabutyrolactone의 제조 공정에 대해서는 언급하지 않고 있다.

【발명의 상세한 설명】

[기술적 과제】

본 발명은 글루코스를 탄소원으로 사용하여 2번 위치 탄소에 광학활성을 갖는 2，4-디히드록시-부틸레이트(2，4- 1 (1 « 13 6) 또는 2-히드록시 -감마 -부티로락톤 (2-hydroxy gamma butyrolactone)을 생산하는 미생물에 하기 (1) 내지 (4) 중 선택된 하나 이상의 단계를 수행하여 상기 미생물을 변이시키는 단계를 포함하는, 2， 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 2- 히드록시 -감마 -부티로락톤 생산 미생물 변이체의 제조 방법을 제공한다.

(1) ptsG, eda, adhE, pflB, lysA, thrBC, metA, Lad, IdhA, 및 /c ?유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 결실， 또는 acs, ppc, 및 metL유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현， 또는 이들 모두를 수행하는 단계，

(2) epd, dxs, 및 pdxj유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시키는 단계 ,

(3) Ipc녜 ducA중 하나 이상의 유전자의 과발현시키는 단계， 및 (4) kgtP, dsdx, 및 ac 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 결실시키는 단계.

또한 본 발명은 2， 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 2-히드록시-감마- 부티로락톤을 생산하는 미생물의 게놈 (genome)에 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나 이상의 유전자 변이가 도입된， 2, 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 2-히드록시 -감마 -부티로락톤 생산 미생물 변이체를 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 미생물 변이체를 배양하는 단계를 포함하는， 2-히드록시 감마 부티로락톤 (2-hydroxy gamma butyrolactone) 또는 2,4- 디히드록시 부틸레이트 (2,4-dihydroxy butanoic acid)의 생산방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 싱기 미생물 변이체 또는 그 배양물을 포함하는， 2- 히드록시 감마 부티로락톤 (2-hydroxy gamma butyrolactone) 또는 2，4- 디히드록시 부틸레이트 (2,4-dihydroxy butanoic acid)의 생산용 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진

트랜스아미네이즈 변이효소， 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 트랜스아미네이즈 변이효소， 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 트랜스아미네이즈 변이효소를 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진， L- 히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진, L-히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소를 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진， D- 히드록시— 2-옥소 -리덕테이즈 변이효소， 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진， D-히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진， 락토네이즈 변이효소를 제공한다.

【기술적 해결방법】

homoserine으로부터 생합성하는 경로를 통하여 광학활성을 갖는 순수 이성질체 흑은 2가지 이성질체가 흔합된 2ᅳ hydroxy ga隱 a butyrolactone과 혹은 이의 전구체인 2,4-dihydroxy butanoic acid를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일 예가 도 1에 모식적으로 예시되어 있다.

일 예에서， 상기 생산 방법은， 2-hydroxy gamma butyrolactone의 전구체인 2,4-dihydroxy butanoic acid를 광학 활성 순수 이성질체 흑은 이들의 흔합물인 상태로 생산하는 하는 경우 2,4-dihydroxy butanoic acid를 분리정제한 후 화학적인 방법으로 광학 활성 순수 이성질체 혹은 이들의 흔합물인 상태로 최종 2— hydroxy gamma butyrolactone를 생산하는 방법일 수 있다.

상기 생산 방법은 homoserine의 알파 위치 아민기를 제거하는 단계를 포함할 수 있으며， 상기 homoserine의 알파 위치 아민기 제거를 위해 사용되는 효소는 deaminase, dehydrogenase, transaminase로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 예에서， 상기 생산 방법은 homoserine으로부터 amino기를 받는 amino acceptor로서 a -ketoglutarate ( a_KG)를 사용하는 것을 특징으로 하는 transaminase를 사용하는 것일 수 있다.

또한 상기 생산 방법은 상기 α-KG로부터 생산되는 glutamic acid로부터 amino acceptor인 a— KG를 재생함과 동시에 homoserine 생합성 전구체인 aspartic acid의 생산을 위해 aspartate transaminase를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 경로를 포함할 수 있다.

다른 예에서， 상기 생산 방법은 도 1에 제시한 반웅 경로 중 4- hydr oxy-2-ox-but ano i c acid의 2번 탄소에 결합된 산소를 stereo-specific 하게 흑은 non-specific 하게 환원시켜 hydroxy기로 전환하는 효소로는 L- lactate dehydrogenase와 D-lactate dehydrogenase , 흑은 이들의 흔합 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 경로를 포함할 수 있다.

다른 예는， 도 1에 제시한 paraoxonase는 인간유래로 lactonase 활성을 갖는 유전자 (P0N1)를 변이시켜 사용하며 homoserine으로부터 광학활성 2-hydroxy gamma butyrolactone을 생산하도록 제작된 균주의 periplasm에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 균주를 제공한다. 상기 균주는 homoserine 과생산 특성을 갖는 homoserine 과생산 균주일 수 있다. 다른 예는, 도 1에 보여주는 경로를 통해 homoserine으로부터 2번 위치 탄소에 광학활성을 갖는 2-hydroxy gamma butyrolactone 및 이의 유기산 전구체인 전구체인 2,4-dihydroxy butanoic acid를 효율적으로 생산하기 위하여， 도 4에 제시한 것과 같이， 당으로부터 homoserine을 효율적으로 생산하도록 제작된 유전자 변이 균주를 제공한다. 상기 균주는 homoserine 과생산 특성을 갖는 homoserine 과생산 균주일 수 있다.

상기 변이 균주를 제작하는 미생물로는 대장균, 효모 코리네균 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물이 사용될 수 있다.

상기 미생물은 다음과 같은 방법들 중에서 선택된 하나 이상을 개별적으로 흑은 조합하여 사용함으로써 개량된 것을 특징으로 하는 미생물일 수 있다:

l.phosphoenol pyruvate (PEP)를 oxaloacetic acid (0AA)로 효율적으로 전환하는 phosphoenol pyruvate carboxylase (ppc) 유전자의 과발현;

2. 발효 중 생성되는 acetate를 acetyl CoA로 전환하여 미생물이 다시 사용할 수 있도록 도와주는 acetyl-CoA synthase (acc) 유전자의 과발현;

3. lyoxylate shunt의 활성을 높이기 위해 glyoxylate shunt 유전자 발현을 억재하는 iclR유전자의 제거 ;

4. Apspartic acid의 aspartyl phosphate 전환 효율을 높이기 위해 apspartate kinase의 활성을 향상시킴. apspartate kinase를 coding 하는 thrABC 유전자의 발현을 향상시키기 위해 isoleucine에 의해 작동하는 thrABC operon의 riboswitch를 제거하고 또한 promoter의 세기를 올려줌. 더 나아가 apspartate kinase 효소가 threonine과 lysine에 의해 feedback inhibition을 받는 것을 방지하기 위해 feedback inhibition을 받지 않도록 변이된 효소를 발현시키도록 함;

5. lysine 생산을 제거하기 위해 diaminopimelate decarboxylase를 coding 하는 lysA을 제거 ;

6. methionine 생산을 제거하기 위해 homoserine succinyltransferase를 coding 하는 metA유전자를 제거;

7. 생산된 homoserine이 homoserine phosphate로 전환되지 않도톡 homoserine kinase를 coding하는 thrB유전자를 제거 . 상기 제작된 homoserine 과생산 균주에 앞서 설명한 생산 방법의 경로가 도입되어 당으로부터 2번 위치 탄소에 광학활성을 갖는 2-hydroxy gamma butyro 1 act ne과 혹은 이의 전구체인 2, 4-di hydroxy butanoic ' acid를 생산하도록 제작된 균주가 제공된다. 이 때， 상기 균주는 transaminase의 활성을 증대시키기 위하여 transaminase와 cofactor인 pyridoxal-5 '- phosphate 의 생합성이 촉진되도록 vitamin B6 생합성 경로를 강화시킨 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 제작된 균주는 당으로부터 homoserine 을 거쳐 생합성된 2,4- dihydroxybutanoic acid를 세포 밖으로 빨리 분비시키기 위하여， 2,4- dihydroxybutanoic acid의 세포막 전달 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하는 균주일 수 있다.

또한， 앞서 설명한 균주를 배양하여 배양액으로부터 광학활성을 갖는 순수한 이성질체 흑은 2가지 이성질체가 흔합된 2-hydroxy gamma butyro lactone 및 /또는 이의 전구체인 2, 4-di hydroxy butanoic acid를 생산하는 방법이 제공된다.

상기 방법은， 2-hydroxy ga隱 a butyro lactone 및 /또는 이의 전구체인 2, 4-di hydroxy butanoic acid를 효과적으로 생산하기 위하여， 질소원으로 yeast extract와 암모늄 염을 첨가하는 것은 물론 본 균주가 특별히 필요로 하는 아미노산， 즉 methionine, lysine, threonine, 그리고 isoleucine을 적절히 첨가하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 배양은 생물 반웅기를 이용한 고농도 2-hydroxy gamma butyrolactone 및 /또는 이의 전구체인 2,4— dihydroxy butanoic acid 생산을 위해 유가식으로 발효 중간에 당과， methionine, lysine, threonine, 및 isoleucine로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 흔합물 (예컨대， methionine, lysine, threonine, 및 isoleucine의 흔합물)을 첨가하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명은 글루코스를 탄소원으로 사용하여 광학적으로 순수한 2,4- 디히드록시 -부틸레이트 (2,4-dihydroxybutyrate) 또는 2—히드록시-감마— 부티로락톤 (2-hydroxy gamma butyro lactone)을 생산하는 미생물에 하기 (1) 내지 (4) 중 선택된 하나 이상의 단계를 수행하여 상기 미생물을 변이시키는 단계를 포함하는， 2 , 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 2_히드록시- 감마 -부티로락톤 생산 미생물 변이체의 제조 방법을 제공한다.

( 1) ptsG, eda, adhE, pflB, lysA, thrB, metA, Lad, IdhA, 및 iclR 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 결실， 또는 acs,

PPC 및 metL유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현， 또는 이들 모두를 수행하는 단계，

(2) epd, dxs, 및 ρ τ유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시키는 단계，

(3) lpd및 ckicA중 하나 이상의 유전자의 과발현시키는 단계， 및

(4) kgtP, dsdx, 및 aci 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 결실시키는 단계.

상기 탄소원은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나,

글루코스 (Glucose)인 것이 적절하다.

상기 "광학적으로 순수" 란 용어는 (2S)-2 , 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 (2R)- 2， 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 (2S)— 2-히드록시 감마 부티로락톤 또는 (2R)-2-히드록시 감마 부티로락톤 각각의 광학 순도가 90% 내지 100% , 바람직하게는 95% 내지 100%， 더욱 바람직하게는 97% 내지 100% , 예를 들어 99% 내지 100%인 것을 의미한다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 2， 4-디히드록시 -부틸레이트 (2， 4- dihydroxybutyrate) 또는 2—히드록시一감마—부티로락톤 (2— hydroxy gamma butyrol actone)을 생산하는 미생물은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나， 대장균 0?. coli) , 효모 (Yeast ) , 및 코리네박테리움 (Corynebacter i um) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 밌으며， 바람직하게는 대장균일 수 있다.

일 구체예에 따르면， 상기 미생물을 변이시키기 위해 ( 1 ) 내지 (4) 중 선택된 하나 이상의 단계를 수행하는 것은 동시 또는 순차적으로 수행할 수 있고， 반드시 각 단계를 시계열적 순서로 수행해야 하는 것은 아니며， ( 1) 내지 (4)의 변이 순서는 임의로 결정해 수행할 수 있고 두 개 이상의 단계를 동시에 수행하고 나머지 단계를 순차로 수행할 수도 있다. 바람직하게는， 상기 미생물을 변이시키는 단계는 ) 단계， 및 (2) 내지 (4) 단계 중 선택된 하나 이상의 단계를 포함해 수행할 수 있으며， 가장 바람직하게는

(1) 내지 (4) 단계를 전부 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 lysA, thrBC, metA는 미생물 내에서 중간체인 호모세린의 축적을 증가시키기 위해， 라이신， 메티오닌 및 트레오닌 생산 경로를 억제를 목적으로 제거하는 것이다. 구체적으로 각각 호모세린 산 염기성 효소를 코딩하는 유전자인 Diaminopimelate decboxylase를 코딩하는 lysA, Homoser inesuccinyl Transferase 를 코딩하는 metk, 그리고 Homoser ine Kinase 및 Threonine Synthase를 코딩하는 thrBC 중 어느 하나 이상을 제거할 수 있다,

상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 MiA, adhE, ；？/ 유전자는 부산물인 젖산， 에탄을， 포름산 등의 생산을 막기 위해 제거하는 것일 수 있다. 상기 유전자들의 제거는 부산물 생성을 막고 homoserine으로 가는 탄소 flux를 증가시킨다,

상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 /cH?유전자는 아세테이트 재이용을 촉진하는 방법의 하나인 glyoxylate shunt의 활성을 제고하기 위하여 제거하는 것으로, 제거 방법은 통상적인 방법을 사용할 수 있으나， 바람직하게는 pop-in pop-out 방법으로 제거할 수 있다.

상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 ptsG 유전자는 포도당 대사의 overflow metabolism을 제거하고 포도당의 세포막 전달에 phosphoenol pyruvate (PEP)가 사용되는 것을 막기 위해 제거하는 것일 수 있다. 이 경우 포도당은 GalP 등 다른 전달 단백질에 의해 세포내로 이송되며 Carbon Catabol ite Repression의 방지， overflow metabolism에 의한 부산물 생성 방지 등을 기대할 수 있다. 상기 유전자의 제거 방법은 통상적인 방법을 사용할 수 있으나， 바람직하게는 MAGE 방법으로 제거할 수 있다.

상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 eda 유전자는 KHG/KDG aldolase를 coding 하는 유전자로， 이 유전자가 제거될 경우 ED 경로가 제거되므로 EMP(Embden-Meyerhof-Parnas pathway) 경로의 이용이 촉진되고 또한 oxaloacetate 로의 탄소 flux를 을려줄 수 있다. 상기 유전자의 제거 방법은 통상적인 방법을 사용할 수 있으나， 바람직하게는 MAGE 방법을 사용할 수 있다.

상기 (1) 단계에서 제거가능한 유전자 중 lacl 유전자는 Lac 프로모터 활용 (promoter utilization)을 위해 lacl 억제제를 제거하는 것으로 상기 유전자의 제거 방법은 통상적인 방법을 사용할 수 있으나， 바람직하게는 MAGE 방법을 사용할 수 있다.

상기 (1) 단계에서 유전자의 과발현은 통상의 방법을 사용할 수 있다. 예를들어 미생물 세포에 유전자가 포함된 백터를 다량 도입하거나， 과발현 프로모터 치환 등의 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로 , 상기 (1) 단계에서 3CS 유전자의 과발현은 아세트산 (acetic acid)의 생산을 최소화하기 위하여 acs 유전자의 발현을 증대시키는 것일 수 있다. pta-ack 및 poxB 유전자의 결실도 가능하지만 이들 유전자의 결실 특히 유전자의 결실이 세포성장에 나쁜 영향을 주는 경우가 많아 이를 배제하였다.

acs 유전자의 발현을 증대시키는 방법은 관련업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 제한없이 사용할 수 있지만， 바람직하게는 3CS 발현 유전자의 프로모터를 유전자 과발현 프로모터로 바꾸어줄 수 있으며， lac 프로모터， tac 프로모터， trc 프로모터 등을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 re프로모터로 치환하는 것이 적절하다.

상기 (1) 단계에서 ppc 유전자의 과발현은 acetate 생성을 막고 호모세린으로의 탄소 flux를 향상시키기 위하여 anapl erotic 경로의 핵심 효소인 phosphoenol pyruvate carboxylase를 coding 하는 ppc 유전자의 발현을 증가시키기 위한 것으로， 통상적인 유전자 발현 증가방법을 사용할 수 있으며， ppc 유전자의 프로모터를 유전자 과발현 프로모터로 바꾸어줄 수 있고， 바람직하게는 기존 프로모터를 synthetic promoter 8 (서열번호: 23， TTTCAATTTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA ) 로 치환해 발현을 증가시킬 수 있다. 이를 위해 pop-in pop-out 방법을 사용할 수 있다.

상기 (1) 단계에서 metL 유전자의 과발현은 호모세린 생산 경로의 bottleneck으로 알려진 aspartic acid 이후 경로를 최적화하기 위한 것이다. 호모세린 생산에서 3개의 aspartate kinase, 즉 AKI， AKII, AKIII 이 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며， 이 중 AKII, AKIII 두 개의 효소만이 높은 homoserine 농도에서 좋은 활성을 보인다고 알려져 있고， ΑΚΠ 및 AKIII 중에서 ΑΚΠ는 aspartate kinase 와 serine dehydrogenase 활성을 동시에 가지고 있어 ΑΚΙΠ 보다는 좀 더 유리하다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 변이균주는 AKII 효소를 coding 하는 metL 유전자를 과발현 시킬 수 있다.

상기 metL유전자의 과발현 방법은 통상의 방법을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 medium copy plasmid인 pUCPK plasmid를 이용하여 과발현시킬 수 있다. 이 때 metL^ 발현 크기를 조절하기 위해 lac promoter 와 trc promoter 두 가지를 사용할 수 있다.

상기 결실키기거나 과발현시키는 유전자를 표 1에 정리해 나타냈다. 본 발명의 일 구체예에 따르면， 상기 (1) 단계는 ptsG, eda, adhE, pflB, lysA, thrB, etA, Lac I, IdhA, 및 /c/?유전자 전부를 결실시키고， acs, ppc, 및 metL유전자 전부를 과발현시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 상기 (2) 단계는 Vitamin B6 생산 증가를 위해 수행하는 것으로， 대장균의 경우 PLP(Pyridoxal— 5-Phosphate)는 DXP(l-deoxy-D-xylulose 5— phosphate) 의존 경로를 통해 생합성되며， PLP생합성 속도는 epd, dxs, pdxJ 유전자 등이 코딩하는 단백질에 의해 조절된다. 따라서， PLP 생합성 속도를 향상시키기 위하여 이 세 유전자중 하나 이상을 과발현 시킬 수 있다. 과발현 방법은 통상의 방법을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 기존 프로모터를 합성 프로모터 9 (표 5)로 치환하는 것이 적절하며， Pop— in pop-out 방법을 사용할 수 있다. 이 때 사용가능한 프라이머 (primer)를 표 14에 나타냈다.

바람직하게는, 상기 (2) 단계는 epd, dxs, 및 pdxj유전자 전부를 과발현시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 예에 있어서， 상기 (3) 단계에서 ldp, ifcu^의 발현양 증가는 2，4-디히드록시 -부틸레이트 (DHB)의 세포 외 이송속도를 증대시키기 위해 수행하는 것으로, 유기산 막 이송 단백질， 특히 l act i c aci d 와 저분자량의 carboxyl i c aci d 이송 단백질 중 query로 사용하여 importer 및 exporter를 선정한 후， 이들 중 가장 가능성이 높은 2개의 exporter인 ldp 및 /또는 dcuA 단백질의 발현양을 증가시키는 것이다.

이들 단백질의 발현 증가 방법은 통상의 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로모터 (promoter )를 치환할 수 있고， 막 단백질의 과량 발현은 세포성장에 방해가 되므로 중간 세기의 합성 프로모터인 SP5(Synthet i c promoter 5) 등을 사용하는 것이 바람직하다.

바람직하게는， 상기 (3) 단계는 lpd, 및 ducA유전자 전부를

과발현시킬 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서， 상기 (4) 단계는 2 4-디히드록시- 부틸레이트 (DHB)의 세포 내 재도입을 억제하기 위해 수행하는 것으로 importer 로 가장 가능성이 높을 것으로 예상되는 3개의 막 단백질을 암호화하는 유전자인 kgtP, dsdx 및 actP중 어느 하나 이상을 제거할 수 있다. 이 때 사용할 수 있는 프라이머 (pr imer ) 서열을 표 18에 나타냈다. 바람직하게는， 상기 (4) 단계는 kgtP, dsdx, 및 ac ⁵ 유전자 전부를 제거시킬 수 있다.

상기 ( 1)단계를 사용해 제조한 변이균주를 표 2(EcWl 내지 EcW13)에， 상기 ( 1)단계 및 (2)단계까지 수행해 제조한 변이균주를 표 15(EcW13 내지 EcW16)에， 상기 ( 1 )단계， (2)단계， (3)단계 또는 /및 (4)단계까지 수행해 제조한 변이균주를 표 19(EcW16 내지 EcW20)에 정리해 나타냈다.

본 발명의 일 예에 따르면， 상기 미생물 변이체 제조방법은 호모세린으로부터 4-히드록시—2-옥소-부틸레이트 (4— hydroxy-2-οχο- butyrate)의 전환을 촉진하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 전환을 촉진하는 단계란， 호모세린 (homoser ine)의 알파 위치 아민기를 제거해 4-히드록시 -2-옥소-부틸레이트의 전환을 촉진하는 것을 의미하며， 구체적으로， 트랜스아미네이즈 ( transaminase)를 처리하여 호모세린 (homoser ine)의 알파 위치 아민기를 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 트랜스아미네이즈는 이를 암호화하는 유전자가 포함된 백터를 미생물에 다량 도입해 형질전환하거나， 트랜스아미네이즈를 암호화하는 유전자의 프로모터를 과발현 프로모터로 치환시키는 방법 등을 사용할 수 있다.

상기 트랜스아미네이즈는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나， 피루브산 (pyruvate)을 아미노기 어셉터 (acceptor )로 사용하는 효소일 수 있으며， 구체적으로 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 효소， 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 효소， 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 효소， 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 13의 아미노산 서열로 아루어진 효소 또는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 효소 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며， 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 미생물 변이체 제조방법은 4- 히드록시 -2-옥소-부틸레이트를 2 , 4-디히드록시-부틸레이트로 전환을 촉진하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 ₂ , 4-디히드록시-부틸레이트로의 전환을 촉진하는 단계는 4- 히드록시 -2-옥소-부틸레이트의 2번 탄소에 위치한 케톤 (ketone)기의 환원을 촉진시키는 것을 의미한다. 4-히드록시 -2-옥소-부틸레이트를 환원시키는 리덕테이즈를 암호화하는 유전자가 포함된 백터를 미생물에 다량 도입해 형질전환하거나, 리덕테이즈를 암호화하는 유전자의 프로모터를 과발현 프로모터로 치환시키는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 상기 환원반웅에 의해 제조되는 2，4- 디히드록시—부틸레이트는. 순수 광학이성질체인 (2S)— 2 , 4—디히드록시- 부틸레이트 및 (2R)-2 , 4-디히드록시-부틸레이트로 이루어진 군에서 선택된 하나이상일 수 있고， 라세미체， 광학이성질체 흔합물을 제조할 수도 있으며，

(2S)-2 ,4-디히드록시 -부틸레이트 또는 (2R)-2 , 4-디히드록시—부틸레이트 각각의 100% 순수한 단일 화합물을 제조할 수 있다. 상기 2 , 4-디히드록시- 부틸레이트의 광학이성질체 종류는 화합물의 활용용도에 따라 적의 선택해 제조할 수 있다.

(2S)-2 , 4-디히드록시-부틸레이트의 전환을 촉진하기 위해서 L- 히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 (L-hydroxy-2-oxo-reductase) 를 과발현하고， (2R)-2 , 4-디히드록시-부틸레이트로의 전환을 촉진하기 위해 D-히드록시 -2- 옥소—리덕테이즈 (D-hydroxy-2-oxo-reductase)를 과발현할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 예에 따르면， 상기 L-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 효소， 서열번호

17의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 효소 또는 /및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있다. 상기 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며， 상기 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 상기 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 일 예에 따르면， 상기 D-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈는 서열번호 19의.아미노산 서열로 이루어진 효소， 서열번호

20의 아미노산 서열로 이루어진 효소 , 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며 바람직하게는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 호소， 또는 /및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 포함할 수 있다. 상기 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며， 상기 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 상기 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 방법은 2， 4-디히드록시- 부틸레이트에 락톤화를 촉진하여 2-히드록시-감마-부티로락톤의 생산을 촉진하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 락톤화의 촉진은 락토네이즈 ( l actonase)의 발현을 촉진하여 수행되는 것일 수 있으며， 상기 발현 촉진 방법은 락토네이즈 유전자를 포함하는 백터를 과량 세포에 도입해 락토네이즈 양을 증가시키거나 락토네이즈 유전자를 발현하는 프로모터를 과발현 프로모터를 치환하는 등 다양한 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는， 상기 락톤화의 촉진은 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 락토네이즈 ( l actonase)의 발현을 촉진하여 수행되는 것일 수 있으며， 상기 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 락토네이즈를 암호화하는 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 생성되는 2-히드록시—감마-부티로락톤은 순수한 광학적 이성질체인 (2S)-2-히드록시 감마 부티로락톤 및 (2R)-2 ^: 히드록시 감마 부티로락톤으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 ( _2S) - ₂ -히드록시 감마 부티로락톤 또는 _{( 2R)} - ₂ _히드록시 감마 부티로락톤일 수 있다.

상기 방법에 의해 생산된 (2S)-2-히드록시 감마 부티로락톤 또는

(2R)-2-히드록시 감마 부티로락톤은 광학 순도가 90% 내지 100%， 바람직하게는 95% 내지 100%， 더욱 바람직하게는 99% 내지 100%일 수 있다. 본 발명의 일 예에 따르면， 상기 2， 4-디히드록시 -부틸레이트 또는 2- 히드록시-감마-부티로락톤을 생산하는 미생물의 게놈 (genome)에 ( 1) 내지 (4) 중 어느 하나 이상의 유전자 변이가 도입된， 2，4—디히드록시- 부틸레이트 또는 2-히드록시 -감마 -부티로락톤 생산 미생물 변이체를 제공할 수 있다.

( 1) ptsG, eda, adhE, pflB, lysA, thrBZ , met A, Lad, IdhA, 및 /c/y?유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 결실， 또는 acs, ppc, 및 metL유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현， 또는 이들 모두를 수행하는 단계;

(2) epd, dxs, 및 pdxi 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 과발현,

(3) Idp및 ducA중 하나 이상의 유전자의 과발현，

(4) kgtP, dsdx, 및 ac尸유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 결실.

본 발의 일 예에 따르면， 상기 미생물 변이체는 바람직하게는 pt s , eda , l ad , thrB , metA , lysA , adhE , pf IB , IdhA , 및 i c lR 유전자가 결실되고， _acs 유전자를 과발현， 및 ppc 유전자가 과별현된 미생물 변이체를 제조할 수 있다. 상기 미생물 변이체는 표 15에 나타낸 EcW13 균주일 수 있으며， 바람직하게는 기탁번호 KCCM12281P의 균주일 수 있다. 본 발의 또다른 일 예에 따르면， 상기 미생물 변이체는 2 , 4- 디히드록시 -부틸레이트 또는 2-히드록시-감마-부티로락톤을 생산하는 미생물의 게놈 (genome)에서， ptsG, eda, adhE, pflB, lysA, thrBC, metA, Lac I, IdhA, iclR, kgtP, dsd, 및 aci 유전자가 결실되고, acs, ppc, metL, epd, dxs, pdxj, Idp, 및 ciucA 유전자가 과발현된， 미생물 변이체를 제조할 수 있으면， 상기 미생물 변이체는 하기 실시예에서 실험한 EcW20 균주로 기탁번호 KCCM12282P 의 균주일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 상기 미생물 변이체는 하기 ( 1) 내지 (4) 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 백터를 추가로 포함할 수 있다.

( 1) 서열번호 13의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자, 서열번호 14의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자， 및 서열번호 15의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 트랜스아미네이즈 변이효소 암호화 유전자，

(2) 서열번호 17의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 18의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 L-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소 암호화 유전자， (3) 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 21의 아미노산열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 D-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소 암호화 유전자， 및

(4) 서열번호 22의 아미노산서열로 이루어진 락톤네이즈 효소를 암호화하는 유전자.

서열번호 13의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며， 서열번호 14의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 서열번호 15의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며,

서열번호 17의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 서열번호 18의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며， ^'

서열번호 19의 아미노산열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고， 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면， 상기 미생물 변이체는 호모세린, 4- 히드록시 -2-옥소 부티레이트， 2 , 4-디히드록시-부틸레이트， 및 2-히드록시- 감마-부티로락톤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 과량 생산하는 것인， 미생물 변이체일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 앞서 설명한 상기 미생물 변이체를 배양하는 단계를 포함하는， 2-히드록시 감마 부티로락톤 (2-hydroxy gamma butyrolactone) 또는 2 ,4-디히드록시 부틸레이트 (2 , 4-dihydroxy butanoi c acid)의 생산방법을 제공한다.

상기 생산방법에 사용하는 상기 미생물 변이체는 하기 ( 1) 내지 (4) 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 백터를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

(1) 서열번호 13의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 14의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 트랜스아미네이즈 변이효소 암호화 유전자,

(2) 서열번호 17의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 18의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 L-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소 암호화 유전자，

(3) 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 21의 아미노산열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 D-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소 암호화 유전자, 및

(4) 서열번호 22의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자.

본 발명의 일 구체예에 따르면， 상기 생산방법에서 배양하는 단계는 질소원으로 효모 추출물 및 암모늄 염을 포함하는 배지에서 수행하는 것일 수 있다.

또 다른 일 예에 따르면， 상기 배양하는 단계 이후에， 당과 메티오닌 (methionine) , 라이신 ( lysine) , 트레오닌 (threonine)， 및 이소류신 ( i soleucine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 유가식으로 발효하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 더 나아가 발효단계에서 순수 광학 이성질체인 (2S)-2 , 4-디히드록시 부틸레이트 또는 (2R)-2 , 4-디히드록시 부틸레이트를 생산한 후， pH 1.0 내지 3.0， 바람직하게는 pH 1.0 내지 2.0 범위로 낮추는 화학적 변화단계를 거쳐 순수한 (2S)_2-히드록시 -감마 -부티로락톤 또는 (2R)-2-히드록시-감마- 부티로락톤으로 전환할 수 있다.

예를 들어， (2S)-2 , 4-디히드록시 부틸레이트를 생산한 후， pH를 1.0 내지 3.0으로 낮추어 광학순도가 95% 내지 100%， 바람직하게는 97% 내지 100%인 (2S)-2-히드록시-감마-부티로락톤를 얻을 수 있으며， (2R)-2 , 4- 디히드록시 부틸레이트를 생산한 후 pH를 1.0 내지 3.0으로 낮추어 광학순도가 95% 내지 100%, 바람직하게는 97% 내지 100%인 (2R)-2- 히드록시-감마-부티로락톤을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 예는， 상기에서 설명한 미생물 변이체 또는 그 배양물을 포함하는， 2-히드록시 감마 부티로락톤 (2-hydroxy ga隱 a butyro lactone) 또는 2 , 4-디히드록시 부틸레이트 (2 ,4-dihydroxy butanoi c acid)의 생산용 조성물을 제공한다.

상기 미생물 변이체는 하기 ( 1) 내지 (4) 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 백터를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

( 1) 서열번호 13의 아미노산으로 이루어진 효소를 암호화하는 염기서열로 이루어진 유전자 및 서열번호 14의 아미노산으로 이루어진 효소를 암호화하는 염기서열로 이루어진 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 트랜스아미네이즈 변이효소 암호화 유전자，

(2) 서열번호 17의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 18의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 L-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소암호화 유전자，

(3) 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자 및 서열번호 21의 아미노산열로 이루어진 효소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 D-히드록시 -2-옥소- 리덕테이즈 변이효소 암호화 유전자， 및

(4) 서열번호 22의 아미노산서열로 이루어진 락토네이즈 효소를 암호화하는 유전자.

본 발명의 일 예는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 트랜스아미네이즈 변이효소를 제공한다. 상기 트랜스아미네이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 트랜스아미네이즈 변이효소를 제공한다. 상기 트랜스아미네이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 트랜스아미네이즈 변이효소를 제공한다. 상기 트랜스아미네이즈 변이효소 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 일 예는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 L- 히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소를 제공한다. 상기 L-히드록시 -2- 옥소 -리덕테이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 L- 히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소를 제공한다. 상기 L-히드록시 -2- 옥소 -리덕테이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 20의 아미노산서열로 이루어진 D- 히드록시 -2-옥소—리덕테이즈 변이효소를 제공한다. 상기 D-히드록시 -2- 옥소 -리덕테이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 D- 히드록시 -2-옥소 -리덕테이즈 변이효소를 제공한다. 상기 D-히드록시 -2- 옥소 -리덕테이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 10의

염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 락토네이즈 변이효소를 제공한다. 상기 락토네이즈 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

[발명의 효과】

본 발명은 2-hydroxy gamma butyro l actone (HGBL) 및 이의 전구체인 2, 4-dihydroxybutanoi c aci d 를 과발현하는 변이 균주 및 이를 이용한 2- hydroxy gamma butyro l ac tone (HGBL) 및 이의 전구체인 2，4- dihydroxybutanoi c acid을 다량 생산하는 방법을 제공한다. 또한， 본 발명의 변이체와 변이효소를 이용할 경우， 2-히드록시-감마-부티로락톤을 (R) 또는 (S) 형태의 순수한 광학이성질체로 제조할 수 있다. 상기 이성질체로서 이들 화합물은 제약, 농약， 조미료 및 향료의 중간물질 외에 특히 반도체용 포토레지스트， 금속 표면의 코팅재료의 중간체로서 특히 유용하게 웅용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 homoser ine 으로부터 광학적으로 순수한 2— hydroxy gamma butyro lactone 및 이의 유기산 전구체인 2,4-dihydroxybutanoic acid를 생합성하는 신규 생합성 경로를 제시하고 있다.

도 2는 homoser ine 으로부터 homoser ine dehydrogenase를 이용하여 4-hydroxy-2-oxo-butanoate를 생합성하는 경로를 제시하고 있다.

도 3은 homoser ine 으로부터 homoser ine transaminase 및 aspartate transaminase를 이용하여 4一 hydroxy— 2— oxo— butanoate를 생합성하는 경로를 제시하고 있다.

도 4는 포도당을 이용하여 homoser ine을 대량으로 생산하기 위한 균주 개량 전략， 그리고 이로부터 2-hydroxy gamma butyrolactone 및 이의 전구체인 2,4-dihydroxybutanoic acid를 생합성하는 전략을 제시하고 있다. 도 5는 표 5에 기재된 유전자 발현 향상이나 조절을 위해 합성한 합성 프로모터 (synthetic promoter)의 상대 활성을 GFP를 이용해 측정한 결과를 나타낸다.

도 6a는 TA1, TA2, TA3, TA6 효소를 생산하는 균주 파쇄엑 전체를 denaturing 조건에서 전기영동한 결과로, TA^ TA2, TA3, 및 TA6 4 종류는 insoluble 한 형태로만 효소가 생성됨을 나타낸다.

도 6b는 TA4, TA5, TA7, YA8, TA9, TAIO, TAll, TA12, TA13, TA14 및

TA15 등 총 11종 효소를 생산하는 균주의 파쇄액을 원심분리하여 상등액을 얻고 상등액 내 존재하는 단백질을 denaturing 조건에서 전기영동한 결과로 TA4, TA5, TA7, YA8ᅳ TA9, TAIO, TAll, TA12, TA13, TA14 및 TA15 효소가 soluble 한 상태로 얻어진다는 것을 보여준다.

도 7a는 soluble 한 형태로 발현된 11종의 트랜스아미네이즈 효소 증

TA4, TA5, TAIO, TAll, TA15 등 5개의 효소만이 호모세린 (homoser ine)에 대하여 활성을 나타내었고 이 중 TA4가 가장 높은 활성을 가진다는 것을 나타낸다.

도 7b는 호모세린에 대하여 가장 높은 활성을 나타낸 TA4 효소를 affinity chromatography로 순수분리하여 정제한 결과를 전기영동한 결과이다.

도 8은 Transaminase 스크리닝을 위한 reporter 균주의 성능 확인 결과를 보여준다. E. coli BL21 (DE3) 야생균주와 pET— TA4 유전자 재조합 플라스미드를 갖는 reporter 균주를 각각 소량 (0.5 mM)의 메티오닌과 트레오닌 그리고 10 mM의 homoserine이 포함된 배지에서 배양하였다. TA4 효소 발현 플라스미드를 갖는 reporter 균주가 플라스미드를 갖지않는 야생균주에 비해 빠른 성장을 보였고 IPTG 첨가량이 높은 경우， 즉 0.5 mM을 첨가한 경우보다 1.0 mM을 첨가했을 때 균주 성장 속도가 증가하였다. 즉 TA4 효소가 존재할 때 homoserine이 세포성장을 위한 질소원으로사용된다는 것을보여준다.

도 9는 대장균 내 존재하는 아스파르트산 아미노산 전이효소 (PDB ID : 1ASM)와 TA4효소의 아미노산서열을 비교한 결과이다.

도 10은 대장균 아스파르트산 아미노산 전이효소 (PDB ID : 1ASM)의 크리스탈 구조를 주형으로 사용하여， 상동성 모델링을 통해 TA4의 3차원 구조를 구축하고， PYM0L뷰어 (http : //www .pymo 1 . org)를 사용하여 확인한 단백질 구조를 나타낸다.

도 11은 대장균 아스파르트산 아미노산 전이효소 ( 1ASM) 구조에서 말레산의 카르복실산 (아스파르트산 잔기의 카르복실산)과상호작용을 하고 있는 4개의 아미노산 ( I lel7 , Gly38 , Asnl94 , Arg386)을 확인하고， 이와 비교한 TA4모델 구조를 통해서 TA4효소 내 아스파르트산 잔기의

카르복실산과 상호작용을 할 것으로 예상되는 4개의 아미노산 (Lysl4 , Gly40 Asnl78 , Try364)을 선정해 나타낸 것이다.

도 12는 TA4-1 내지 TA4-6의 변이 효소의 활성을 나타낸다. 이중 TA4-1은 Y364Q, TA4-2는 N174D의 아미노산서열 변이를 갖고 있으며 높은 활성을 보여 주었다. TA4-6는 TA4-1 및 TA4-2가 갖는 변이를 모두 갖는 효소로 가장높은 활성인 20 U/mg protein의 활성을 나타내었다.

도 13은 표 9에 나타낸 8가지의 LDH효소의 효소활성을 pyruvate 와 0HB를 기질로사용하여 분석한 결과를 나타낸다.

도 14는 대장균 락트산 탈수소효소의 크리스탈 구조 (PDB ID : 2G8Y)를 주형으로 사용하여， 상동성 모델링을 통해 Ae_ldhA의 3차원 구조를 구축한 결과로， Ae_ldhA 모델은 M0E(Molecular Operating Environment )를 사용하여 제작했으며， PR0CHECK 및 ProSA 온라인 구조 분석을 통해 평가 및 PYM0L뷰어 (http://w丽. pymol.org)를 사용하여 확인한 단백질 구조를 나타낸 것이다.

도 15a는 Ae_ldhA 변이체 디자인을 위해 피부르산과 HOB 구조 (Pubchem Database)의 구조를 Ae_ld l의 효소 활성 위치에 Triangular Matching 방법을 사용하여 도킹 시물레이션 (docking simulation)을 한 후， 이를 이용하여 효소의 아미노산 잔기와 피부르산과의 상호작용올 검토한 결과를 나타낸다.

도 15b는 도킹 시뮬레이션 (docking simulation)을 이용하여 효소의 아미노산 잔기와 HOB와의 상호작용을 검토한 결과를 나타낸다.

도 16은 site-directed mutagenesis로 얻은 Ae_ldhA 변이체 효소의 활성을 NADH의 산화 정도를 340nm의 흡광도에서 관찰해 측정한 결과를 나타낸다. 변이 효소의 활성을 야생 효소의 활성과 비교하여 상대 활성으로 나타내었다. 효소의 활성 (specific activity; 1U)은 1분 동안 1 μη)1의 NADH를 NAD로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

도 17은 표 12에 나타낸 9가지의 균주 내 (D)-lactate dehydrogenase 효소활성을 pyruvate 와 0HB를 기질로 사용하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 18은 PDB databank에 나와있는 Lb-LDH 효소의 결정구조를 이용하여 engineering 해야 할 아미노산 잔기를 나타낸 것이다.

도 19는 OHB D-reductase 효소의 변이체 효소의 활성을 NADH의 산화 정도를 340nm의 흡광도에서 관찰해 측정한 결과를 나타내며， 효소의 활성 (specific activity; 1U)은 1분 동안 1 um이의 NADH를 NAD+로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 변이 효소의 활성을 야생 효소의 활성과 비교하여 상대 활성으로 나타내었다.

도 20a는 대장균에서 PLP가 생합성되는 DXP 의존 경로에 작용하는 생합성 유전자의 구조를 나타낸다.

도 20b는 대장균에서 PLP가 생합성되는 DXP 의존 경로의 생합성 경로를 나타낸다. 대사산물의 약어는 다음과 같다. G6P; glusoe-6- phosphate; E4P, erythrose-4-phosphate； GA3P, g 1 ycer a 1 dehyde-3- phosphate ; 4PE , 4-phospho-D-erythronate； 3P4K, 3ᅳ hydroxyᅳ 4_ pho s phohydr oxy- alpha-ketobutyrate ; 4PT, 4ᅳ phosphohydroxyᅳ Lᅳ threonine； 2A3B, 3ᅳ hydroxyᅳ l_amin으 acetone phosphate ; DXS, deoxyxylulose-5- phosphate . 이탤릭체는 효소이름을 나타낸다: EPD, erythrose-4-phosphate dehydrogenase； PdxB , 4-phospho-D-erythronate； SerC , 3-phosphoser ine aminotransferas； PdxA, 4-phosphohydroxy-L-threonine dehydrogenase ; PdxJ , PNP synthase ; Dxs , 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase； PdhH, PNP oxidase .

도 21은 L-form DHB를 생산하는데 사용된 플라스미드 지도로 트랜스아미네이즈로는 TA4-1을， 그리고 락테이즈 디하드로지네이즈로는 ldh-2와 ldh-8을 각각사용한 경우를 나타낸 것이다.

도 22는 플라스크 배양을 통한 L-DHB 생산 결과로， 유전자 재조합 pBAD_TA4-l_LDH2 (pDHB-L)플라스미드가 도입된 EcW20(pDHB-L) 균주를 다양한 arabinose 농도에서 배양한 후 생성된 DHB의 농도 (g/L)를 측정했다. 'Control ' 은 pBAD_TA4-l_LDH2 (pDHB—L)플라스미드를 갖지 않는 EcW20균주를 나타낸다.

도 23은 플라스크 배양을 통한 D-DHB 생산 결과로， 유전자 재조합 pBAD_TA4-l_LDH8 (pDHB-D)플라스미드가 도입된 EcW20(pDHB_D) 균주를 다양한 arabinose 농도에서 배양한 후 생성된 DNB의 농도 (g/L)를 측정했다. 'Control ' 은 pBAD_TA4-l_LDH8 (pDHB-D)플라스미드를 갖지 않는 EcW20 균주를 나타낸다.

도 24a는 L— form 2 , 4-dihydroxybutyr i c acid 생산을 위한 EcW20(pDHB-L) 균주의 유가식 생물반웅기 실험결과를 나타낸다.

도 24b는 D-form 2 , 4-dihydroxybutyr i c acid 생산을 위한 EcW20(pDHB-D) 균주의 유가식 생물반웅기 실험결과를 나타낸다.

도 25는 2，4— dihydroxybutyr i c acid를 HGBL로 전환하는데 필요한 락토네이즈를 발현하는 pACYC_Ponl 플라스미드 맵을 보여준다. 과 (G3C9) 유전자는 tac promoter 에 의해 발현되고 생산된 단백질이 세포막으로 이동하는데 필요한 lead sequence를 갖도록 제작되었다.

도 26a는 L-DHB 와 HGBL 생산을 위하여 생물반응기 2단 배양을 실시한 결과로， Glucose를 기질로 사용했을 때， 시간에 따라 생성되는 L- form의 2 , 4-DHB와 HGBL의 생산량 및 Biomass를 나타낸 것이다.

도 26b는 D-DHB 와 HGBL 생산을 위하여 생물반웅기 2단 배양을 실시한 결과로， Glucose를 기질로 사용했을 때， 시간에 따라 생성되는 D- form의 2 , 4-DHB와 HGBL의 생산량 및 Biomass를 나타낸 것이다. D-HGBL의 생산량은 0. 1 g/L 이하로 매우 낮게 나타났으며， 이는 Ponl 효소의 활성이 2 , 4-DHB에 대하여 매우 낮았기 때문이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

호모세린 (homoser ine)으로부터 2-히드록시 감마 부티로락톤 (2- hydroxy gamma butyrolactone)을 생합성하기 총 3개의 단계로 이루어진 신규 생합성 경로를 도 1에서 제안하였다. 구체적으로 각 단계의 반응은 다음과 같다.

Step 1： 호모세린 내 알파 위치 아민 제거 반웅

Step 2 : 환원 반응 (2번 탄소에 결합된 산소 환원)

Step 3： 락톤화 반웅 (Lactoni zat ion)

상기 첫번째 반응은 호모세린 디아미네이즈 (homoser ine deaminase) 또는 호모세린 트랜스아미네이즈 (homoser ine transaminase) 효소에 의해 촉매될 수 있으며， 호모세린 디아미네이즈에 의한 반웅은 도 2에

나타냈으며， 호모세린 트랜스아미네이즈에 의한 반웅은 도 3에 각각 나타냈다.

도 2에 제시한 아미노산의 알파 위치 아민기를 제거하는 효소로는 글루타메이트 (glutamate)에 높은 활성을 보이는 글루타메이트

디아미네이즈 (glutamate deaminase ; dehydrogenase) , 그리고

세린 (ser ine)에 높은 활성을 보이는 세린 디아미네이즈 (ser ine deaminase) , 그리고 활성이 매우 낮지만 다른 많은 아미노산들에 조금씩 활성을 보이는 아미노산 산화효소 (amino acid oxidase)를 사용할 수 있으며 도 2의 반웅에는 이 효소들을 직접 사용하거나 또는 높은 활성을 갖도록 변이시킨 후 사용할 수 있다.

도 3에 제시한 transaminat ion 반응에는 변이를 통해 homoser ine에 대해 활성을 갖도록 제작된 변이 alanine aminotransferase를 비롯하여 이와 유사한 amino transferase를 사용할 수 있다. 또한

homoser ine으로부터 amino기를 받는 amino acceptor로는 a-ketoglutarate

(α-KG)를 사용할 수 있으며 (transaminase 반웅에서 α-KG/glutamic acid pair가 이 목적으로 가장 널리 사용됨)， α-KG로부터 생산되는 glutamic acid로부터 amino acceptor인 oHCG를 재생함과 동시에 homoser ine 생합성 전구체인 aspart ic acid의 생산을 위해 aspartate transaminase를 동入 1에 사용하는 것이 바람직하다.

도 1에 제시한 두 번째 단계 반응의 효소로는 L— lactate

dehydrogenase와 D- lactate dehydrogenase를 사용할 수 있다. 사용하는 효소에 따라 히드록시기는 (R) 혹은 (S) 형태로 2번 위치 탄소에 결합하게 되고 이에 따라 최종 얻어지는 2-hydroxy gamma butyro lactone의 구조도

(R) 혹은 (S) 형태의 isomer가 얻어지게 된다.

도 1에 제시한 paraoxonase는 인간유래로 lactonase 활성을 갖는 유전자 (P0N1)를 변이시켜 사용할 수 있으며 P0N1의 반웅이 가역적이고 산성 pH에서만 lactone을 생산할 수 있으므로 세포질이 아닌 periplasm에서 발현시키는 것이 바람직하다.

도 1에 보여주는 경로를 통해 homoser ine 으로부터 2-hydroxy gamma butyrolactone 및 이의 유기산 전구체를 효율적으로 생산하려면 도면 4에 제시한 것과 같이 당으로부터 homoser ine올 효율적으로 생산하는 유전자 변이 미생물을 개발하여야 한다. 이 미생물로는 대장균을 우선적으로 이용할 수 있으나， 그 외에 효모， 코리네균 등 다양한 미생물을 이용할 수 있다. 이 숙주 세포는 다음과 같은 방법을 개별적으로 혹은 조합하여 사용함으로써 개량될 수 있다.

1. phosphoenol pyruvate (PEP)를 oxaloacetic acid (0AA)로 효율적으로 전환하는 phosphoenol pyruvate carboxylase ippc) 유전자의 과발현;

2. 발효 중 생성되는 acetate를 acetyl CoA로 전환하여 미생물이 다시 사용할 수 있도록 도와주는 acetyl-CoA synthase iacc) 유전자의 과발현；

3. glyoxylate shunt의 활성을 높이기 위해 glyoxylate shunt 유전자 발현을 억재하는 /c/ 유전자의 제거 ;

4. Oxaloacetate에서 asprtic acid로의 전환 효율을 높여주기 위하여 aspartate transaminase의 과발현;

5. Apspart ic aci d의 aspartyl phosphate 전환 효율을 높이기 위해 apspartate kinase의 활성을 향상시킴. apspartate kinase를 coding 하는 iAr ¾:유전자의 발현을 향상시키기 위해 isoleucine에 의해 작동하는

operon의 riboswitch를 제거하고 또한 promoter의 세기를 올려줌. 더 나아가 apspartate kinase 효소가 threonine과 lysine에 의해 feedback inhibition을 받는.것을 방지하기 위해 변이된 효소를 발현시키도록 함;

6. lysine 생산을 제거하기 위해 diaminopimelate dcarboxylase를 coding 하는 /ya4을 제거 ;

7. methionine 생산을 제거하기 위해 homoserine

succinyl trans ferase-9- coding 하는 met A유전자를.제거;

8. 생산된 homoserine이 homoserine phosphate로 전환되지 않도록 homoserine kinase를 coding하는 유전자를 제거 .

Homoserine≤ 생산이 활성화 되면 homoserine을 4一 hydroxy— 2— oxo_ butanoic acid (HOB)로 전환하기 위하여 도면 2에 제시된 deaminase 효소 또는 도면 3에 제시된 transaminase 효소를 coding 하는 유전자를

발현人！킨다. 더 나아가 transaminase의 cofactor인 pyr i doxa 1 -5 ' -phosphat e (vitamin B6의 일종임)의 생합성을 촉진하기 위해 vitamine B6 생합성 경로를 강화시킨 균주를 사용하는 것이 좋다.

더 나아가 homoserine으로부터 HOB가 효율적으로 생합성 되도록 조작한 균주는 추가적으로 homoserine dehydrogenase 및 혹은 P0N1을 발현시켜 2,4— di hydroxy— butanoic acid (dHBA)와 2-hydroxy gamma butyro lactone (HGBL)을 생산할 수 있다. 일반적으로 P0N1올 사용하여 dHBA를 HGBL로 전환하는 생물학적 반웅은 효율이 낮으므로 dHBA를

생물학적으로 생산한 후 분리 정제하여 화학적으로 HGBL로 전환할 수도 있다. 이 경우 미생물 내에서 생산된 dHBA를 세포 밖으로 빨리 분비시키기 위하여 dHBA의 막 전달 단백질을 과발현 시키는 것이 바람직하다.

이렇게 도 4에서 제안하는 homoserine 생합성 경로가 강화된 균주에 도 1에서 제안한 homoserine의 전환을 통해 dHBA나 HGBL이 생산되도록 조작된 미생물을 당을 주된 탄소원으로 하여 배양하면 목적산물인 dHBA와 HGBL을 생산할 수 있다. 이때 미생물의 효율적인 배양과 목적 산물의 효율적인 생산을 위해 배지 내에 질소원으로 yeast extract와 암모늄 염을 첨가하는 것은 물론 본 균주가 특별히 필요로 하는 아미노산， 즉

methionine, lysine, threonine, 그리고 isoleucine을 적절히 첨가할 필요가 있다. 또한 생물 반웅기를 이용한 고농도 생산에서는 유가식으로 발효 중간 중간에 당과 아미노산 흔합물을 적절히 첨가해 주는 것이

바람직하다.

도 4는 포도당을 이용하여 homoserine을 대량으로 생산하기 위한 균주 개량 전략, 그리고 이로부터 2-hydroxy gamma butyro lactone 및 이의 전구체인 2,4-dihydroxybutanoic acid를 생합성하는 전략을 모식적으로 보여준다. 도 4에서， 녹색 화살표는 강화해야하는 반웅， 붉은색 화살표는 효소의 생산이나 효소 활성을 억제하는 기작， 살구색 X표는 억제 반웅의 제거 혹은 유전자 제거의 표시， 이탤릭체 작은 글씨는 조작 대상 유전자를 각각 나타낸다.

이하 구체적인 실시예를 설명한다. 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 호모세린 (homoserine) 생산균주의 제작

(1) 호모세린 (Homoserine) 경로는 aspartate 계열의 아미노산을 합성하는 것으로 잘 알려져 있다. 호모세린의 축적을 증가시키기 위해， 라이신 (lys), 메티오닌 (met) 및 트레오닌 (thr) 생산 경로를 제거하였다. 구체적으로 라이신 생합성의 마지막 단계 효소， 즉， 디아미노피멜레이트 디카르복실라제 (diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 lysA, 호모세린숙시닐트랜스퍼라제 (homoserinesuccinyl transferase)를 코딩하는 metA, 그리고 호모세린 카이네이즈 (homoserine kinase) 및 트레오닌 합성효소 (threonine synthase)를 코딩하는 thrB( 제거하였다 (표 1).

(2) 또한 부산물인 젖산， 에탄올， 포름산 등의 생산을 막기 위해 ldhA, adhE, pflB 유전자를 제거하였다. 이들 유전자를 제거함으로써， 부산물의 생성을 막고 호모세린으로 가는 탄소 flux를 증가시키고자 하였다. (3) 다음으로， 아세트산의 생산을 최소화하기 위하여 acs 유전자의 발현을 증대시켰다. Acs의 발현을 증대시키기 위해， acs 발현 유전자 프로모터를 trc 프로모터로 바꾸었다.

(4) 아세테이트 재이용을 촉진하는 방법의 하나로 glyoxylate shunt의 활성을 제고하기 위하여 negative regulator인 유전자를 pop- in pop-out 방법으로 제거하였다.

(5) acetate 생성을 막고 homoser ine으로의 탄소 flux를 향상시키기 위하여 anapl erotic 경로의 핵심 효소인 phosphoenol pyruvate carboxylase를 coding 하는 ppc유전자의 발현을 합성프로모터 8(Synthetic promoter 8: SP8) (서열번호 23: mCMmMTCATCCG( TCGTATMTGTGTGGA)를 사용하여 증가시켰다. 이를 위해 ppc 유전자의 promoter를 pop-in pop-out 방법으로 synthetic promoter 8로 치환하였다.

(6) 포도당 대사의 overflow metabolism을 제거하고 포도당의 세포막 전달에 phosphoenol pyruvate (PEP)가 사용되는 것을 막기 위해， ptsG 유전자를 MAGE 방법으로 제거하였다. 이 경우 포도당은 GalP 등 다른 전달 단백질에 의해 세포내로 이송되며 Carbon Cat abolite Repression의 방지， overflow metabolism에 의한 부산물 생성 방지 등의 효과를 기대할 수 있다.

(7) EMP 경로를 이용하는 해당경로에서 oxaloacetate 로의 탄소 flux를 올려 주기 위하여 KHG/KDG aldolase를 coding 하는 eda 유전자를 결실시켜 ED 경로를 제거하였다. MAGE 방법을 사용하였다.

(8) 마지막으로， 호모세린 생산 경로의 bottleneck으로 알려진 aspartic acid 이후 경로를 최적화하였다. 호모세린 생산에서 3개의 aspartate kinase, 즉 AKI, AKII, AKIII 가 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며， 이중 AKII, ΑΚΠΙ 두개의 효소만이 높은 호모세린 농도에서 우수한 활성을 보인다. 또한， ΑΚΠ 및 ΑΚΙΠ 중에서 ΑΚΠ는 aspartate kinase 와 serine dehydrogenase 활성을 동시에 가지고 있어 ΑΚΙΠ 보다는 좀더 유리하다고 알려져 있다. 따라서 이번 균주 개발에서는 ΑΚΠ 효소를 coding하는 metL 유전 ]·를 medium copy plasmid인 pUCPK plasmid를 이용하여 과발현시켰다. 이 때 metL^\ 발현 크기를 조절하기 위해 lac promoter 와 trc promoter 두 가지를 사용하였다. 아래 표 1에 호모세린을 과발현시키기 위해 제거 (deletion), 치환 (substitution) 또는 과발현 (overexpression)한 경쟁경로 유전자와 제거 목적， 제거 방법올 나타냈다.

[표 1]

대장균인 W3110 균주 및 BL2KDE3)은 Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에서 구입하였다. 대장균 TOPIO 균주는 플라스미드의 cloning 과 유지에 사용하였다. 유전자 제거에는 multiplex automated genome engineering (MAGE) 기법과 pop- in pop-out 방법을 사용하였다. 본 발명자들이 개발한 Homoserine 과생산 변이 대장균주의 종류 ^■ 아래 표 2에 나타냈다.

[표 2]

유전체 분리 kit는 Promega (Madison, WI， USA)에서 구매하였다. High-f idel ity pfu-a 중합효소는 Invitrogen (Seoul , Korea) 에서 구입하였다. DNA 절단효소 및 DNA 개량효소는 New England Bio-LAb (Beverly, MA, USA)에서 구매하였다. Miniprep 및 DNA gel extraction kit은 Cosmotech (Seoul , Korea)에서 구입하였다. 유전자 증폭 등에 사용된 primer 는 Macrogene (Seoul, Korea)에서 합성하였다. 효모추출물， 트립톤， 트립케이스 soy broth, 펩톤 등은 Difco (Bee ton-Dickinson, NJ, USA)사에서 구입하였다. 그 외 시약과 효소는 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.

1-1 MAGE 방법을 이용한 유전자 결실 및 치환

MAGE (Multiplex Automated Genome Engineering) 방법은 in vivo genome editing에 매우 강력한 to 이다. 이 방법에서는 target이 되는 염색체에 해당하는 single-stranded DNA (ssDNA)를 바로 engineering 하려는 균주에 도입하게 된다. 여러 site를 대상으로 할 경우， ssDNA 여러 종류를 일시에 또는 순차적으로 도밉할 수도 있다.

본 실험에서는 recombinase 역할을 하는 beta-단백질을 pSIM5 플라스미드에 도입하고 이를 electroporation 방법으로 대장균에 넣어 주었다. 합성 ssDNA 올리고는 제거하려는 염색체 target 유전자 서열과 겹치는 homology arm, 즉 5 '-terminal homolgy arm과 3' terminal homology arm이 존재하도록 제작하였다 (표 3). 세포 내에서 염색체와 homology를 갖는 oligo 들은 염색체 복제기간에 target 유전자의 lagging strand와 결합하고 homologous recombinat ion을 통해 target 유전자에 변이를 일으킨다.

MAGE 실험을 위해 한천 고체 배지에서 자라는 single colony를 따서 섭씨 30도， LB+Qn 배지에서 12시간 배양하였다. 이후 이 배양액 100 microliter를 새로운 LB+Cm 배지에 옮기고 섭씨 30도에서 0.6 0D (600 nm)가 될 때까지 배양하였다. 이후 culture tube를 15분간 섭씨 42도에서 방치하였다가 30 분간 얼음물 속에 넣었다. 이 후 준비된 competent cell을 4 ^° C, 5000 rpm에서 10분간 원심분리하고 차가운 증류수로 3차례 세척하였다. 그리고 세포 pellet을 10% glycerol 용액 100 mL에 현탁시켰다. 이후 ssDNA oligo 50 uM을 세포현탁액과 흔합하고 이를 elctro cuvette에 넣은 후 electroporation 시켰다. 이 후 이 흔합액을 배양 tube에 옮기고 5 mL의 LB를 첨가하고 섭씨 30도에서 3시간 배양하였다 (1 차 cycle). 이러한 과정을 6-10 회 반복한 후 (6-10 cycles) 100 uL의 세포배양액을 agar pl ate에 도말하고 밤새 배양하였다. 생성된 colony 들을 PCR 방법으로 스크리닝하고 유전자가 결실된 변이주들을 확인， 확보하였다.

아래 표 3에는 유전자 제거 또는 클로닝에 사용한 프라이머의 종류를 나타냈다.

[표 3]

Apta_FP gacca cgtcagccttggcgtgatccgtgcaatggaacgcaaaTAActcagccgcgtaccggtggc g

34 atgcgcccgatcagactacg

Apta_RP cgtagtctgatcgggcgcatcgccaccggtacgcggctgagTTAtttgcgttccattgca cggatca

35 cgccaaggctgacgctggtc

ᅀ pta— seq Ggcgt t cgtctgagcgt tttc 36 _FP

Apta_seq Ggattcttgcagcttcgcc

37 _RP

AackA_FP gaaatttgccatcatcgatgcagtaaatggtgaagagtaccttTGAaagcacgtatcaaa tggaaaa

38 t gacggcaat aaacaggaagc

ᅀ ackA一 RP gcttcctgtttattgccgtccattttccatttgatacgtgcttTCAaaggtactcttcac catttac

39 tgcatcgatgatggcaaatttc

AackA_se Tctggtttagccgaatgtttcc

40 q_FP

AackA_se Atgt cagttcttctaccgg

41 q_RP

AldhA_RP gcaacaggtgaacgagt cctt tggctttgagct gaat tttt tTAActgccaatggctgcgaagcgg

42 tatgtattttcgtaaacgatg

AldhA_se Tt t tccggtgtcagcggg

43 q_FP

AldhA— se Gactttctgctgacgg

44 q_RP

AadhE_RP gtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactcaagagcaaTAAct ctgcagatgctcgaat

45 cccactcgcgaaaatggccgttg

ᅀ adhE_se Ggagc tgtat gcggc ttt aac

46 q_FP

AadhE_se Gtagacaaaatcttccgcgccg

47 q_RP

ApflB_RP ccaaaggtgactggcagaatgaagtaaacgtccgtgacttcattTAAagtccttcctggc tggcgct

48 actgaagcgaccaccaccctg ApflB_se Tgcagagaagtgaactgtgcc

49 q_FP

ApflB_se Cagaaaaactacactccgtacg

50 q_RP

ᅀ iclR— FP Cccggcttgttgcgccagttccgtgagtgccacactgccattcagccacgcgttaaagac tgaacct

51 gtccagtcgctggtgcggtggc

ᅀ iclR_RP Gccaccgcaccagcgactggacaggttcagtctttaacgcgtggctgaatggcagtgtgg cactcac

52 ggaactggcgcaacaagccggg

AiclR_se Gcgcgtttgggcgagatc

53 q_FP

ᅀ iclR_se Ctgaaattactggagtgg

54 q_RP

AlysA_FP ggctttctgtgcaaagcgcaccacatcaaactgtttcagcgctgTTAgacccacaccggg cagccaa

55 attcagcgggcaaacgcagcag

AlysA_RP ctgctgcgtttgcccgctgaatttggctgcccggtgtgggtcTAAcagcgctgaaacagt ttgatgt

56 ggtgcgct t tgcacagaaagcc

ᅀ lysA_se Cctgtt ccagatgggcat aat c

57 q_FP

MysA— se . Gggtctacgat cgcaaat tattcg

58 q_RP

AthrB_RP cttatcggcaaagcgtccgaggttgttgagactgaatgtctctgTTAtgcaccatcaaca ggtgtca

59 ccgccgccccgagcacatcaaac

AthrB_se Tt get cggagatgt agtcacgg

60 q_FP

ᅀ thrB— se Gcgat actgcgccggtaaaat ag

61 q_RP

AmetA_FP Gaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctggttaattaacctgatgccga agaagat

62 tgaaactgaaaatcagtttctg

AmetA_RP Cagaaactgattttcagtttcaatcttcttcggcatcaggttaattaaccagacgcacga gaagttg

63 tcatcacaaagacgttttcttc AmetA_se Ctggt caggaaat t cgt ccac

64 q_FP

AmetA_se Cgaatcaacgctgccggaaag

65 q_RP

AlacI_RP cttatcagaccgtt tcccgcgtggtgaaccaggccagccacgttTGAcgatggcggagctgaattac 66 attcccaaccgcgtggcacaac

Alacl_se Gatatttatgccagccagcc 67 q_FP

ᅀ lacl_se Ccacgt 11 c t gcgaaaacgcggg 68 q_RP

Primer for gene deletion using Pop- in Pop-out method

US-Ptrc-acs- gtttaatcggtacccggggatcgcggccgccgcgcccttcctgccagtcaattttc 69 FP

US-Ptrc-acs- Cttttaagaaggagatatacatatgagccaaattcacaaacacacc

70 RP

Ptrc-acs-FP Ggtgtgtttgtgaatttggctcatatgtatatctccttcttaaaag 71

Ptrc-acs-RP Cggcgtgcgtttatttttatccttgtcatcgactgcacggtgcaccaatgc 72

DS-Ptrc-acs- Gcattggtgcaccgtgcagtcgatgacaaggataaaaataaacgcacgccg

73 FP

DS-Ptrc-acs- Gggcgcgcgccat tct ccggt cgactctagat catgccgt catcccac

74 RP

US-ldhA-FP At cgcggccgc tgtctgtttt cggt c 75

US-ldhA-RP Ctggagaaagtcttatgtaatcttgccgctcccc 76

DS-ldhA-FP Ggggagcggcaagattacataagactttctccag 77

DS-ldhA-RP Ct agaggatcccaagcagaat caagt tctaccg 78

Gn-ldhA-FP Gatggtacggcgattgggatg 79

Gn-ldhA-RP Gccagggagaaaaaatcag 80

US-iclR-FP Ctgcgcggacgctgaggatcccggtgatcccgtcctctcacg 81

US-iclR-RP Ttcgaaccccagagtcccgcctgccgctcgtaggtcctg 82

DS-iclR-FP Gcaggacct acgagcggcaggcgggac t ctggggt t cgaaatg 83 DS-iclR-RP Tgcctgcaggtcgactctagattatttgttaactgttaattgtccttgttc 84

Gn-iclR-FP Ctgaacagcaggtcgtcc 85

Gn-iclR-RP Gcgtcgaaaccttcgatg 86

1-2. Pop-in pop-out 방법에 의한 유전자 결실 또는 유전자 치환 ldhA 및 iclR유전자를 제거하기 위해 sacB-Km 카세트를 갖는 pKOV 플라스미드를 사용하였다 (표 4). 구체적으로， target 유전자의 upstream과 downstream region 600-700 bp 를 갖는 fragment를 E. col i W3110 염색체로부터 해당 primer를 사용하여 PCR 증폭하였다 (표 3). 이 fragment의 sequence를 확인한 早 Gene Art Seamless Cloning and Assembly Kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 pKOV plasmid에 삽입하였다. 이 후 E. col i 3110 에 recombinant pKOV lasmid 를 도입하고 homology recombination을 통해 해당 유전자를 결실시켰으며, 설탕 배지 배양을 통해 pKOV plasmid를 제거하였다. 최종적으로 PCR 방법으로 스크리닝하고 유전자가 결실된 변이주들을 확인， 확보하였다.

1-3. 유전자 조작에 사용된 플라스미드 제작

Pop- in pop-out 혹은 MAGE 방법에 의한 유전자 결실， 프로모터 치환， 유전자 과발현 등에 사용한 플라스미드를 아래 표 4에 나타냈다. 유전자 재조합 플라스미드를 제작하기 위하여 먼저 target 유전자의 open reading frame (0RF)를 PCR 증폭하고 적절한 primer (표 3)를 사용하여 overlap 증폭하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA fragment를 제한 효소로 자르고 해당 플라스미드， 즉 pUCPK, _P ET-T7p, pBbAlk, _P Trc-99a 등에 cloning 하였다. 이 후 이 plasmid를 해당 host 균주에 도입하였다.

[표 4]

Plasmid Description Source

pSIM5 MAGE, β recombinant protein, Cm25 Addgene, USA pUCPK Overexpression, lac promoter , medium copy, K50 Addgene, USA ET Over express km, T7 promoter , high copy, K50 Addgene, USA pBbAlk■ Overexpression, trc promoter , medium copy, K50 Addgene, USA pTrc一 99a Overexpression, trc promoter , low copy, K50 Addgene, USA pKOV Pop ^" in-Pop out , Cm25 Addgene , USA p iCPK-wetl Ptrc-metL Thi s study

1-4. 유전자 발현에 사용되는 합성 프로모터 라이브러리 제작 및 활성측정

유전자 발현 향상이나 조절을 위해 다수의 프로모터를 사용하였다. 동일한 서열을 갖는프로모터의 경우 유전자 불안정성을 크게 증가시키므 서로 다른 서열의 합성 프로모터 (synthet i c promoters) 라이브러리를 구축하였다 (표 5) . 또한 이들의 상대 활성올 GFP를 이용하여 측정하였다 (도 5) . 총 9개의 프로모터를 합성하고 선정하였으며， 이들의 활성은 대략 4배 정도 범위를 가지고 있었다.

[표 5]

실시예 2: 호모세린의 아미노기 제거를 위한 트랜스아미네이즈 (TA) 효소의 스크리닝 및 변이효소 제작

2-1. 트랜스아미네이즈 (TA) 효소의 스크리닝

효소의 확보

트랜스아미네이즈 (TA) 효소는 생명체 내에서 중요한 역할을 담당하고 오랫동안 다양하게 연구되어 왔지만 homoser ine에 특이적인 TA 효소는 생체 내 역할이 없기 때문에 아직 밝혀지지 않았다. 일반적으로 많은 효소들이 생물학적 기질과 유사한 화합물에 대해 활성을 가지고 있으므로 이미 알려진 TA 효소 중 aspatate transaminase, alanine transaminase, branched chain transaminase and aromatic transaminase 중에서 17개를 선택하여 호모세린에 대한 활성을 조사했다 (표 6). 이들 효소는 E. coli, Enterobacter spp.， Baci 1 lus subti lis, Mesorhizobium lot i , Agrobacterium tumef aciens, Pseudomonas denitri f icans , P. put i da and P. //i/oresce2s ^' 등으로부터 확보하였다:

asp aspatate P. AGI228 F:

AT transaminase denitrific 91.1 t tcagaat t caaaagat ctttt aagaaggagat at 124

.ans acatatgctcggacccggcg

tcgagtttggatcctcagcgattctggtgcgcg 125 aro acromat ic P. AGI229 F:

AT transaminase denitrific 71.1 gtggtggtggtggtggtgctcgagcagtttcaggc 126 ans gcagcgc

R:

aacttt aagaaggagat at acatatgatgagcaag 127 ttctggagtccc

aro acromat ic P. AUM683 F:

AT transaminase fluorescen 13.1 gtggtggtggtggtggtgctcgaggagttcgccga 128 s gggc

R:

act tt aagaaggagat at acat at gat gagtaaat 129 tctggagcccg 효소의 생산

E. coli BL2KDE3) 숙주에서 표 6의 효소를 발현하였다. LB medium을 사용하였고 plasmid의 유지와 보존을 위해 kanamycin 50 mg/L 를 사용하였다. 발현 백터로는 pET 그리고 프로모터로 T7을 사용하였다. TA 유전자의 cloning을 위해 coding sequence는 해당 미생물의 genomic DNA로부터 증폭하였고 pET vector에 His-tag (C 말단)를 포함하도록 하여 seamless cloning 및 assembly kit ( Invitrogen)을 사용하여 E. coli Top 10 균주에 cloning 하였다. 얻어진 TA 유전자 종류에 따라 plasmid는 pET/TAi (i = 1 ~ 17) 로 명명하였고 sequence를 확인한 후 (Macrogen, Seoul Korea) 효소 생산 균주인 E. coli BL21 (DE3)에 도입하였다.

[표 τ_

Gene Enzyme Source Acc. No. pET/TAi aspAT Aspatate transaminase M. loti ANN59010.1 ΓΑ1 aspAT Aspatate transaminase M. loti ANN57047.1 ΓΑ2 asp AT Aspatate transaminase A. tumefaciens ACM26415.1 ΓΑ3 aspAT Aspatate transaminase B. subtil is AQR85543.1 ΓΑ4 aspAT Aspatate transaminase E. col i AVI 55449.1 ΓΑ5 bcAT branched chain D. mccartyi AQY72500.1 ΓΑ6

transaminase

bcAT branched chain E. col i AVI53929.1 ΓΑ7

transaminase

bcAT branched chain E. spp A0L13801.1 ΓΑ8

transaminase

aroAT acromat ic transaminase E. col i AUV21492.1 ΓΑ9 aroAT acromat ic transaminase E. col i AVI54196.1 TA10 alaAT alanine transaminase P. den i tr ifi cans AGI 22743.1 TA11 alaAT alanine transaminase P. put i da AE015451.2 TA12 alaC alanine transaminase E. col i AAN66442.1 TA13 alaC alanine transaminase E. col i AAN66442.1 TA14

A140P-Y275D

aspAT ' aspatate transaminase P. denitr i ficans AGI22891.1 TA15 aroAT acromat ic transaminase P. den i tr ifi cans AGI 22971.1 TA16 aroAT acromat ic transaminase P. fluorescens AUM68313.1 TA17 효소생산을 위해 TA를 생산하는 재조합 균주는 50 mg/L kanamycin을 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. 액체부피 20 mL, 250 mL 플라스크를 사용하였고 20 ^° C, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 세포농도가 0.6 0D (600 nm)에 도달했을 때 0.1 mM의 IPTG를 inducer로 첨가하였고 그 이후 10시간 동안 추가로 배양하였다. 그 이후 세포를 원심분리 (10,000 g, 10 분)하고 100 mM 인산 완층용액 (pH 7.0)으로 세척하고 binding 완층용액 (20 mM 인산 완층용액， 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole)에 현탁하였다. 이 후 세포 » Sonicator로 파쇄하고 원심분리하여 미파쇄부분과 고형분을 제거하고 용액부분만 모아서 세포활성과 SDS-PAGE 를 이용한 단백질 분석에 이용하였다.

효소의 순수분리는 Ni-NTA-HP resin 충진컬럼 (17-5248-01; GE

Healthcare, Sweden)을을 이용하여 이루어졌다. 앞서 얻은 미생물 파쇄 용액부분을 모아 컬럼에 넣어 정제한 후 효소 용액을 얻었다. 이후 용액에 포함된 salt를 제거하기 위해 10 kDa cut-off membrane을 사용하여 dialysis 시켰다. 얻어진 효소는 denaturing 흑은 non—naturing 조건에서 전기 영동하였다 (도 6a 및 6b). 그리고 glycerol 이 20% 되도록 첨가한 후 - 80 ^° C에 보관하였다.

효소의 활성측정

호모세린에 대한 활성은 각각 pyruvate 와 2— oxoglutarate를 amine 받게로써 사용하여 측정하였다:

(i ) Homoserine + pyruvate 2-oxo-4-hydroxybutyr i c acid + alanine

(ii)Homoserine + 2-oxoglutarate <→ 2_oxo_4ᅳ hydroxybutyr ic acid + glutamate

생성물인 알라닌 (alanine) 또는 글루타메이트 (glutamate)의 생산이나 반응물인 피루빈산 (pyruvate), 2-옥소글루타레이트 (2-oxoglutarate)의 소모를 통해 효소활성을 측정할 수 있었다. 모든 효소에서 2- oxoglutarate를 받게로 사용한 경우 효소 활성이 관찰되지 않았기에 (i)의 반웅， 즉 pyruvate를 받게로 하는 반웅을 이용해 TA 활성을 조사하였다. 생성물인 alanine은 0PA로 수식한 후 HPLC로 측정하였다.

TA 활성 측정을 위해 50 mM 인산 완충용액 (pH 7.0)， 0.1 mM cofactor pyridoxal phosphate (PLP) , 10 mM homoserine, 그리고 적당량의 TA 효소가 포함되도록 반웅 용액을 제조하였다. 이 용액을 약 5분간 37°C에서 incubation 한 후 10 mM의 pyruvate를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응 10분 후 12 mM의 과염소산 (per chloric acid)을 첨가하여 반웅을 중단시키고 10,000g에서 5분간 원심분리하였다. 이후 5 uL sample을 취하여 12.5 μ!의 OPA 용액 (25 mg OPA, 50 yL 2-mercaptoethanol , pH 9.5 0.5 mM 포화 sodium borate 용액， 4.5 mL methanol)과 흔합하고 상온에서 incubation 한 후 filter 정제하였다. 0PA 에 의해 변형된 alanine은 Zorbax eclipse XBD- C18 column을 장착한 HPLC로 정량 분석하였다. 0PA로 수식된 Alanine derivative는 10.5 분의 retention time을 가지고 있었고 338 nm DAD detector로 분석하였다. 단백질 정량은 Bradford 법으로 bovine serum albumin을 standard로 행하였다. 분석은 3회 시행하였고 평균값을 나타내었다.

도 6a에 의하면 TAl, TA2, TA3, 및 TA6 4 종류는 insoluble form으로 생성되었기에， 활성 측정에 이용하지 않았다. 다른 효소 중에서는 5개 (TA4, TA5, TA10, TA11, TA15) 만이 호모세린 (homoserine)에 대하여 활성을 나타냈다. 이들을 affinity chromatography로 순수분리하여 활성을 측정하였다 (도 7a). TA4가 가장 높은 활성， 즉 3 U/mg protein 의 활성을 보여 주었다.

2-2 TA4의 효소 엔지니어링

TA4 효소가 가장 높은 활성을 나타냈기에， 이 효소를 변이시켜 활성이 증가된 효소를 획득하였다. 먼저 변이 효소 library 를 구축하고 이를 세포성장과 관련된 high throughput screening (HTS) 방법을 이용하여 높은 활성의 효소 변이체를 확보하였다.

Reporter 균주의 개발 및 조사

호모세린 트랜스아미네이즈 (Homoserine transaminase)는 피루브산 (pyruvate)을 알라닌 (alanine)으로 바꾸어 주며 alanine의 아미노기는 alanine transaminase 에 의해 다른 아미노산을 생산하는데 이용된다. 즉， 호모세린은 세포성장의 유일한 질소원으로 사용될 수 있으며， 이 경우 세포성장 속도는 본 발명자들이 개발하려는 homoserine transaminase의 활성에 따라 달라질 수 있다.

이 전략을 조사하기 위하여 pET-TA4 유전자 재조합 플라스미드를 갖는 E. coli BL21 (DE3) 균주를 IPTG 농도를 달리하여 배양하였다 (도 8). TA4 유전자의 발현은 T7 프로모터에 의해 조절되고 TA4 효소의 활성은 IPTG 농도로 조절할 수 있기 때문이다. 질소원이 배제된 M9 minimal medium을 사용하였고， 질소원으로 10 mM의 호모세린， 그리고 미생물 성장을 유도하기 위해 소량 (0.5 mM)의 트레오닌과 메티오닌을 각각 첨가하였다. 도 8 에 나타난 바와 같이， TA4 효소를 갖는 유전자 재조합 균주가 높은 성장 속도를 보여 주었고 그 정도는 IPTG 첨가량이 높을 때 예를 들어， 1.0 mM일 때 가장 분명히 나타났다. 즉 호모세린을 질소원으로 사용하는 균주를 통해 호모세린 TA의 screening이 가능함을 확인하였다.

TA4효소 라이브러리 제작

대장균 아스파르트산 아미노산전이효소 (PDB ID: 1ASM)의 크리스탈 구조를 주형으로 사용하여， 상동성 모델링을 통해 TA4의 3차원 구조를 구축하였다. 상기 1ASM의 구조와 서열은 https : //www. rcsb.org/structure/lASM을 참고하였다. 1ASM 구조는 조효소로 인산피리독살 (p _yr idoxal-5' -phosphate : PLP)을， 기질의 유사체로 말레산 (maleic acid)를 갖고 있다. 이 모델은 M0E(Molecular Operat ing Environment )를 사용해 제작했으며， PROCHECK 및 ProSA 온라인 구조 분석을 통해 평가하였다. PYM0L뷰어 (http : //www.pymo 1 . org)를 사용하여 단백질 구조를 확인하였다 (도 10) .

1ASM 구조로부터 말레산의 카르복실산 (아스파르트산 잔기의 카르복실산)과 상호작용을 하고 있는 4개의 아미노산 ( I lel7 , Gly38 , Asnl94, Ar _g 386)을 확인하였고ᅳ TA4 모델 구조를 통해서 아스파르트산 잔기의 카르복실산과 상호작용을 할 것으로 예상되는 4개의 아미노산 (Lysl4, Gly40, Asnl78 , Try364)를 선정하였다 (도 11) .

도 10과 도 11의 정보를 이용하여 TA4 효소 mutant l ibrary를 구축하였다. 아스파르트산 잔기의 카르복실산과 상호작용을 할 것으로 예상되는 TA4의 4개의 아미노산 (Lysl4, Gly40 , Asnl78 , Try364)을 에셈블리 PCR 방법으로 무작위로 변형시켜 TA4 라이브러리를 제작하였다. 이 때， _P ET30b/TA4 플라스미드를 주형으로 사용하였으며，ᅳ 사용한 프라이머를 표 8에 나타냈다. 제한효소 Xbal 및 Xhol 부위를 이용하여， 프라이머 1 및 2 로부터의 PCR 산물을 pET30b 플라스미드에 클로닝하였다. 생성된 TA4 라이브러리를 대장균 Ε ⁾ Η10 로 형질전환시켰고， 플라스미드를 분리정제하였다. 아래 표 8은 TA4 변이효소 라이브러리 제작에 사용한 프라이머 서열을 나타낸다.

아래 프라이머 서열 중 알파벳 m, n, k 의 의미는 다음과 같다.

m: a (Adenine, 아데닌) 또는 c (Cytosine, 시토신)

n: a (Adenine, 아데닌) 또는 g(Guanine, 구아닌) 또는 c (Cytosine,시토신) 또는 t (thymine, 티민)

k: g(Guanine, 구아닌) 또는 t(thymine, 티민)

[표 8]

TA4 효소 라이브러리 스크리닝 및 우수 효소 개발

제작된 라이브러리를 대장균 BL2 DE3)로 형질전환시킨 후， 50 mL LB 배지에서 밤새 배양하였다. 이후 cell pellet을 원심분리하여 얻고 이를 100 mM 인산 완층용액으로 3번 세척한 후 20 mM homoserine을 질소원으로 갖는 M9 최소배지 (50 um/mL kanamycin 포함)에 0D 0.05가 되도록 접종하였다. 이 후. 37Ϊ：， 200 rpm에서 3시간 배양하고 0.05 mM IPTG를 첨가하여 TA4 효소를 induction 시켰다. 0D 값이 0.5가 되었을 때 배양액을 100 배 희석하여 다시 배양하였다. 이와 같은 배양 -희석 cycle을 10회 반복한 후 배양액을 50 ug/mL kanamycin이 포함된 LB 한천배지에 스프레딩하고 잘 자라는 콜로니 50개를 취하여 M9 배지에서 순수 배양하였다. 이 후 이들의 유전자 서열을 조사한 결과 총 5가지 mutants를 얻었으며， 이들을 각각 TA4— 1 내지 TA4-5로 명명하였다.

다음으로， 얻은 효소를 affinity chromatography로 순수분리하여 측정하였으며， 최종적으로 2개의 TA4 변이체 (TA4-1, TA4-2)가 높은 활성을 보였고， 특히 TA4-1는 야생형 (wildtype)에 비해 5배 가량 높은 15 U/mg protein 활성을 나타냈다. TA4-1은 Y364Q, TA4-2는 N178D의 아미노산 서열 변이를 갖고 있다 (도 12). 이 결과는 model ling을 통해 얻어진 결과, 즉 Y364 및 N178은 1ASM의 N194, R386과 잘 align 되었다는 사실과 함께 호모세린과 interaction 하는 site의 중요성을 보여 준다.

다음으로 TA4— 1과 TA4-2 효소가 갖는 변이를 모두 갖는 TA4-6 효소를 site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 제작하였다. TA4-6 효소는 가장 높은 활성， 20 U/mg protein을 나타내었다.

이후 실험에는 가장 활성이 좋은 TA4-1과 TA4-6 변이체를 사용하였다. 실시예 3: 2-Qxo-4-hydr oxy butyr i c acid (0HB)의 (2S)-L-reductase 효소의 스크리닝 및 변이효소 제작

3-1. 0HB L-reductase 효소의 스크리닝

0HB L-reductase 효소의 확보

0HB는 prochiral 화합물로 환원되면 2번 위치에 L (2S) 또는 D (2R) 히드록시기를 갖는 2,4-dihydroxy butyric acid (DHB)로 전환된다. 0HB reductase는 2— hydroxy acid dehydrogenase에 속하며 여기에는 lactate dehydrogenase (ECl.1.1.27, ECl.1.1.28), ma late dehydrogenase (ECl.1.1.37, ECl.1.1.82, ECl.1.1.299) 그리고 branched chain (D), (L)- 2-hydroxyacid dehydrogenase (ECl.l.l. 272, ECl.1.1.345) 등이 잘 알려져 있다. 먼저 L— form isomer를 생산하기 위하여 Alcal igeneseutrophus H16, Cupriavidus basi lensis , Achromobacter xylosoxidans , Burkholderiaglumae , Escherichia fergusoni i , Escherichia col i , Lactobaci 1 lusmal i 및 Escherichia coli K-12 등으로부터 0HB에 대해 활성이 높을 것으로 예상되는 (L)-lactate dehydrogenase 효소들을 선정하였다 (표 9). OHB 2S— reductase 효소 screening을 위한 (L)— l actate dehydrogenase 후보 효소들을 표 9에 나타냈다.

[표 9]

Gene Source Acc . n Pr imer sequence (FP/RP) 서열

0. 번호 l act ate dehdydr Alcal ige YP 725 ATAACATATGAAGATCTCCCTCACCAGCGC 140 ogemses i IdhO) nes 182. 1 TAATAGGATCCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGGCCG 141 eutrophu TGGGGACGGCCACGTTG

s (Ae)

ma l ate/L- Cupriavi WP 043 ATAACATATGAAGATAACACTGCAATC 142 l actate dehydro dus 344208. 1 TAATAGGATCCTCAGTGGTGATGATGGTGATGGCCCG 143 genase ( 1 dhᅳ 2) basi lens CCGGCAGTGCCACGCCAAGTTC

is(Cb)

mal ate/L- Achromob WP 006 ATAACATATGAAGATCTCCATTACCCAAG . 144 l actate dehydro acter 389860. 1 TAATAGGATCCTCAGTGGTGATGATGGTGATGAGGCA genase ( ldh ^~ 2) xylosoxi ACGCGTCAGC 145 dans (Ax)

ma l ate/L- Burkhold YP 002 ATAACATATGCAGATATCCCTCGACGATG 146 l actate dehydro eria 909484. 1 TAATAGGATCCCTAGTGGTGATGATGGTGATGGGCCC genase ( ldh-2) glumae(B GTGCGGCCGGCGGCACCACGCCGAGTTCGTC 147 g)

mal ate/L- Escheric WP 002 ATAACATATGTATGGGTACAGATACCTTC . 148 l actate dehydro hi a 431747. 1 TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGATGCT genase ( ldhᅳ 2) ferguson GATTCCTGAGGATGTAAC 149 ii (Ef)

D-2- Escheric WP024240 ATAACATATGATGTCATTACAAATTGCTG 150 hydroxyac id deh hi a 865. 1 TAATAGGATCCTCAGTGGTGATGATGGTGATGTCCAG ydrogenase ( ldh一 coli (Ec) CTAATGCTGATTCCTG 151 2) D-2- Lactobac WP 003 ATAACATATGACAAGAATAATTGCTTATCATG 152 hydroxyac id deh illus 689565. 1 TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGTTCTC

153 ydrogenase ( ldM) mali(Lm) CCTTGAAACTTATTTCATGTG

D- Escheric NP 415 ATAACATATGA CTCGCCGTTTATAG 154 l act at e dehydro hi a col i 898. 1 TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGAACCA genase( IdhA) K- GTTCGTTCGGGCAG 155

12(Eck) 선정된 효소들의 아미노산서열을 비교한 결과， 대개 44-66%의 높은 유사성을 보였다. 그러나 eutrophus, L.mali그리고 E. coli유래 효소는 낮은 유사성을 보였다.

0HB L-reductase 효소의 생산 및 활성 측정

효소발현을 위해 E. coli BL2KDE3) star 균주를 숙주균주로 이용하였으며， 클로닝과 폴라스미드 보존을 위해서는 E. coli DH5a 균주를 숙주로 이용하였다. kanamycin 50 pg/mL이 포함된 LB medium을 일반적인 배양과 클로닝 후 재조합 균주 배양에 사용하였다. 유전자 발현 및 효소 생산을 위해 pET 플라스미드와 T7 프로모터를 사용하였다. Ldh 유전자는 PCR 증폭하였고 이 때 C 말단에 Hi s-tag을 붙여 주었다. PCR fragment는 pET vector (표 10)에 넣은 후 E. coli DH5a 균주에 클로닝하고 유전자 서열을 확인한 후 E. coli BL2KDE3) star에 도입하였다. Ldh 유전자의 soluble expression을 촉진하기 위해 Chaperon 을 발현하는 pG-Tf2 플라스미드를 추가로 도입해 주었다.

LDH 효소 생산을 위해 유전자 재조합 BL21(pET-Xx-LDH, Xx는 표 9에 나오는 LDH 유전자를 가진 플라스미드) 균주를 50 ug/mL kanamycin을 포함하는 LB 배지에서 호기적으로 배양하였다. 배양온도는 30 ^° C , 교반속도는 100 rpm 이었고 1 L 플라스크에 250 mL 배지를 넣어 주었다. 세포농도가 0.5 0D에 도달했을 때, 0. 1 mM의 IPTG를 첨가하고 추가적으로 10시간 배양하였다. 이 후 세포를 원심분리하고 25 mM 인산 완층용액 (pH 7.0)으로 3번 세척한 후 binding buf fer (20 mM pH 7.0 인산 완층용액， 0.5 M NaCl , 10 mM imidazol e)에 현탁한 후 soni cator를 이용하여 파쇄하였다. 세포 파쇄액은 4 ^° C, 25,000 g 에서 30분 원심분리하여 비용해성 부분을 제거하고 용해성 부분을 모아 효소 활성 분석이나 추가적인 효소분리에 이용하였다.

LDH 효소활성은 pyruvate 와 0HB를 기질로 사용하여 분석하였다. 0HB는 상업적으로 구입할 수 없으므로 homoserine으로부터 합성하였다. 즉， 125 mM homoserine 용액을 pH 7.8, 100 mL Tris 완층용액으로 제조하고 1.25 U/raL의 snake venom (L)— amino acid oxidase 효소와 4400 U/mL의 catalase 효소와 흔합한 후 37 ^° C에서 90분간 반웅시켰다. 이 후 반웅액을 Ultracentrifugal filter (10 kDa, Amicon)필터로 여과하여 0HB를 얻었다. 효소 활성 측정을 위해 효소 반웅액은 60 mM Hepes buffer (pH 7.0), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ , 5 mM f ructose-1 , 6-bi sphosphate , 적당량의 효소 등을 흔합하여 제조하고 37 ^° C에서 2분간 incubation 하였다. 이 후 0.1 mM의 NAD(P)H 와 적당량의 0HB 흑은 pyruvate를 첨가하여 반웅을 개시하였다. 효소 활성은 NAD(P)H의 감소 속도와 extinction coefficient를 이용하여 계산하였다.

아래 표 10에는 OHB L-reductase 스크리닝을 위한 플라스미드를 기재하였다.

[표 10]

pET-Ef-LDH pET containing LDH from Escherichia fergusoni i Thi s study pET-Ec-LDH pET containing LDH from Escherichia col i Thi s study pET-Lm-LDH pET containing LDH from Lactobacillus mali Thi s study pET-LDHAl pET containing mutant enzyme LDH I48S from Thi s study

Al cali genes eutrophus

PET-LDHA2 pET containing mutant enzyme LDH I48T from Thi s study

Al cali genes eutrophus

PET-LDHA3 pET containing mutant enzyme LDH I48N from Thi s study

Al cali genes eutrophus

PET-LDHA4 pET containing mutant enzyme LDH I48D from Thi s study

Alcal i genes eutrophus

PET-LDHA5 pET containing mutant enzyme LDH I48 from Thi s study

Alcal i genes eutrophus 대부분의 효소들은 pyruvate에 높은 활성을 가지고 있었고 그에 비해 0HB에는 낮은 활성을 보였다 (도 13) . pyruvate를 기질로 할 경우 Ec/Eck— LDH 가 6 umol /mg protein/min 로 가장 높은 활성을 나타내었다. 0HB에 대해서는 Ae-LDH가 1.8 umol/mg protein/min의 가장 높은 활성을 보였다. 따라서 Ae-LDH를 선택하여 0HB에 높은 활성을 갖는 변이 효소를 제작하였다.

OHB L-reductase 효소의 생성물의 광학활성 측정

Ae-LDH가 생성하는 DHB 2번 위치 hydroxy 기가 (R) 혹은 (S) 중 어느 것인지 알아보기 위해 광학활성을 갖는 HPLC와 color imetr i c 분석 ki t을 사용하여 분석하였다. 먼저 생성된 l actate에 대하여 HPIX 분석을 실시하였다. Agi lent 사의 chi ral column (EC 250/4 NUCLEOSIL Chiral-1 , Germany)을 사용하였고 분석온도은 35 ^° C , 이동상으로는 0.2 mM CuS0 ₄ 그리고 f low rate는 0.5 ml mirf ¹ 이었다. 이 조건에서 L-lactate는 약 7.3 분에， 그리고 D-Lactate는 약 9.0분에 peak가 나타났다. Ae-LDH에 의해 생성된 lactate는 모두 L-form으로 나타났다. 또한 상업적으로 판매되는 lactate 분석 kit (BioVision, CA, USA)으로 확인하였으며 역시 생성되는 lactate는 L—form으로 확인되었다.

0HB의 환원반웅에 의해 생성되는 DHB에 대해서도 2번 위치 0H기의 chirality를 조사하였다. 그러나 DHB의 경우 상업제품이 없고 더 나아가 광학적으로 순수한 화합물은 구할 수 없었다. 그리하여 2번 위치 0H 기가 R-form 및 S_form으로 섞여있는 racemic 2ᅳ hydroxy gamma butyrolactone (HGBL)를 구입 (Sigma-Aldrich, MO, USA)하여 화학적으로 분해시켜 racemic DHB를 합성하였다. 합성 방법은 다음과 같았다.

Racemic HGBL을 metahn 에 녹인 후 동일 당량의 NaOH를 첨가하고 상온에서 18시간 반응시켰다. 그리고 진공여과 후 건조시켰다. NMR로 확인한 결과 100% 전환이 확인되었다.

lactate의 chirality 분석에 사용된 동일한 chiral column을 사용하였을 때 HGBL로부터 합성된 DHB는 2개의 HPLC peak를 9.9분 및 11.3분에 보여주었다. lactate 의 경우 L-form이 D-form보다 먼저 나타났으므로 DHB의 경우도 L-form이 먼저 나타날 것으로 예상되었다. HGBL로부터 합성된 racemic DHB를 colorimetr ic 방법으로 분석한 결과 L- form과 D-form이 약 1:1의 비율로 얻어졌다. lactate assay kit은 원래 lactate를 분석하도록 고안되어 있으나 DHB와 lactate 간의 화학적 구조 유사성으로 인해 DHB의 chirality도 분석되는 것으로 추정했다. Ae-LDH와 반응시킨 0HB 생성물에 대해 DHB 분석을 chiral column과 colorimetric 분석 kit을 이용하여 동시에 실시하였다. HPIX 분석의 경우 하나의 peak만 얻어졌고 retention time은 L-form으로 추정되는 9.9분 시간대에 나타났다. 또한 colorimetric 분석에서도 L-form 만 얻어졌다. 따라서 Ae-LDH와의 반웅으로 얻어진 DHB는 광학적으로 순수한 L-form 혹은 (S)-form isomer로 확인했다.

3-2. site-directed mutagenesis를 이용한 0HB Lᅳ reductase 효소의 변이체 개발

먼저 대장균 락트산탈수소효소의 크리스탈 구조 (PDB ID: 2G8Y)를 주형으로 사용하여， 상동성 모델링을 통해 Ae_ldhA의 3차원 구조를

구축하였다. Ae_ldhA모델은 M0E(Molecular Operating Environment )를 사용하여 제작했으며， PR0CHECK 및 ProSA 온라인 구조 분석을 통해

평가하였다. PYM0L뷰어 (http://www.pymol.org)를 사용하여 단백질 구조를 확인하였다 (도 14).

Ae_ldhA 변이체 디자인을 위해 피부르산과 HOB 구조 (Pubchem Database)의 구조를 Ae_ldhAl의 효소 활성 위치에 Triangular Matching 방법을 사용하여 도킹 시뮬레이션 (docking simulation)을 하였고， 이를 이용하여 효소의 아미노산 잔기와 피부르산 및 HOB와의 상호작용을 검토하였다 (도 15).

도킹 시뮬레이션 결과를 바탕으로 Ile48 위치가 피부르산의 메틸 그룹 또는 HOB의 히드록시 에틸 그룹과의 상호작용에 중요한 역할을 할 수 있다고 가정하였고， 이를 친수성 (Ser, Thr, Asn) 또는 전하를 띄는 아미노산 (Asp, Lys)으로 치환하였다.. H0B가 피부르산보다 크기 때문에 치환되는 아미노산을 동일 종류 중에 작은 잔기를 갖는 아미노산으로 한정하였다.

Ile48 위치의 mutation은 site directed mutagenesis kit을 이용하여 수행하였다. 아래 표 11은 Ae-LdhA의 site directed mutagenesis 에 사용된 primer 서열을 보여준다. 변이된 Ae_ldhA을 발현하는 플라스미드 (pET24ma_ Ae-ldh0, 참고문헌 : Zhang et al . "NADH-dependent lactate dehydrogenase from A leal i genes eutrophus H16 reduces 2-oxoadi ate to 2- hydroxyadipate" Biotechnology and Bioprocess Engineering, 19: 1048- 1057 (2014))를 pET plasmid에 클로닝 한 후 서열을 확인 (Macrogen, Seoul , Korea)하고 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 발현하였다. 세포 파쇄액에 존재하는 효소는 Ni-NTA 레진을 사용하여 정제하고 10 kDa molecular cutoff membrane을 이용하여 염을 제거하였다. 이후 Ultra-15 30K centrifugal filter (Amicon, Merck Mi 11 ipore Co. , Darmstadt , Germany)로 다시 한 번 여과한 후 -80 ^° C에 보관하였다.

[표 11] LDH1_RP cgagggcggtgcggtagt tgggcagactcgacaggccgtggctgatatag 157

LDH2_FP ctatatcagccacggcctgtcgactctgcccaactaccgcaccgccctcg 158

LDH2— RP cgagggcggtgcggtagt tgggcagagtcgacaggccgtggctgatatag 159

LDH3_FP ctatatcagccacggcctgtcgaatctgcccaactaccgcaccgccctcg 160

LDH3_RP cgagggcggtgcggtagt tgggcagat tcgacaggccgtggctgatatag 161

LDH4_FP ctatatcagccacggcctgtcggacctgcccaactaccgcaccgccctcg 162 ^'

LDH4_RP cgagggcggtgcggtagt tgggcaggtccgacaggccgtggctgatatag 163

LDH5_FP ctatatcagccacggcctgtcgaatctgcccaactaccgcaccgccctcg 164

LDH5_RP cgagggcggtgcggtagttgggcagat tcgacaggccgtggctgatatag 165 효소의 활성은 NADH의 산화 정도를 340nm의 흡광도를 관찰함으로 측정하였고， 효소의 활성 (speci f i c act ivi ty; 1U)은 1분 동안 1 ymol의 NADH를 NAD로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 변이체 효소는 모두 pyruvate 와 0HB에 대하여 감소된 활성을 보여 주었다. I48K 효소는 pyruvate 에 대하여 5배 이상 감소된 활성을 보여 주었고 다른 효소들은 0.8-3배 감소한 활성을 보여 주었다 (도 16) . 0HB에 대한 활성도 대부분 감소하였다. 그러나 I48T (LDH2)의 경우 pyruvate에 대해서는 약 50% 정도의 활성이 감소하였으나 ΟΗΒί 대하여는 미미하지만 약간 증가된 활성을 보였다. 즉 pyruvate 대비 0HB에 대한 선택성이 2배 이상 증가한 것으로 나타났다. 향후 실험에서는 LDH2를 선택하였다.

실시예 4: 2-0xo-4-hydroxy butyric acid (OHB)의 (2R)-D-reductase 효소의 스크리닝 및 변이효소 제작

4-1. OHB D-reductase 효소의 스크리닝

OHB D-reductase 효소의 확보

L-reductase의 경우를 참고하여 D- lactate dehydrogenase 를 대상으로 OHB 2R-reductase 효소를 스크리닝 하였다. E. coli, Pediococcus acidi lact ici , Pseudomonas aeruginosa , Leuconostoc mesenteroides cremoris, Lactobaci 1 lus bulgaricus, L. jensenii , Oenococcus oenii , L. i ant arum, L. reuteri and L. casei 등으로부터 OHB에 대해 활성이 높을 것으로 예상되는 (D)-lactate dehydrogenase 효소들을 선정하였다 (표 12) . 표 12에는 OHB D-reductase 효소 screening dehydrogenase후보 효소들을 나타냈다.

[표 12]

enases

( IdhD)

D- Lactobaci 1 lus ZP_03974 ATAACATATGAAAGGAATGGGAAAAC 176 ^' l actate reuteri 385. 1 TAATAGGATCCTCAGTGGTGATGATGGTGATGCATTCT dehydrog TATTTCATTTCGTG

177 enases

( IdhD)

D- Leuconostoc me ZP_03913 ATAACATATGAAGATTTTTGCTTACG 178 l actate sent ero ides 173. 1

TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGATATTC

dehydrog cremoris

AACAGCAATAGCTGG

179 enases

{ IdhD)

D一 Oenococcus oen ZP_01544 ATAACATATGAAAATTTATGCTTATG 180 l actate i 962. 1 TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGGAATTT dehydrog AACGAGATTCTTGTCTC

181 enases

{ IdhD)

D- Lactobaci 1 lus CAI 96942 AT CATATGACTAAMTTTTTGCTTAC 182 l actate delbruecki i . 1

TAATAGGATCCTTAGTGGTGATGATGGTGATGGAAACT

dehydrog subsp.

CCAGTTAAGGTTGGC

183 enases bulgaricus

{ IdhD)

OHB D-reductase 효소의 생산 및 활성 측정

L-LDH의 경우와 마찬가지로 효소발현을 위해 E. coli BL2KDE3) star 균주를 숙주균주로 이용하였고 클로닝과 플라스미드 보존을 위해서는 E. coli DH5a 균주를 숙주로 이용하였다. kanamycin 50 ug/mL이 포함된 LB medium을 일반적인 배양과 클로닝 후 재조합 균주 배양에 사용하였다. 유전자 발현 및 효소 생산을 위해 pET 플라스미드와 T7 프로모터를 사용하였다. Ldh 유전자는 아래 표 10에 있는 pr imer를 사용하여 PCR 증폭하였고 이 때 C 말단에 Hi s-tag을 붙여 주었다. PCR fragment는 pET vector에 넣은 후 E. coli DH5a 균주에 클로닝하고 유전자 서열을 확인한 후 E. coli BL2KDE3) star에 도입하였다. Ldh 유전자의 solubl e express ion을 촉진하기 위해 Chaperon 을 발현하는 pG-Tf2 플라스미드를 추가로 도입해 주었다.

D-LDH 효소 생산을 위해 유전자 재조합 BL21(pET-Xx-LDH) 균주를 50 Ug/mL kanamycin을 포함하는 LB 배지에서 호기적으로 배양하였다. 배양온도는 30 ^Q C , 교반속도는 100 rpm 이었고 1 L 플라스크에 250 mL 배지를 넣어 주었다. 세포농도가 0.5 0D에 도달했을 때, 0. 1 mM의 IPTG를 첨가하고 추가적으로 10시간쾌양하였다. 이 후 세포를 원심분리하고 25 mM 인산 완층용액 (pH 7.0)으로 3번 세척한 후 binding buf fer (20 mM pH 7.0 인산 완층용액， 0.5 M NaCl , 10 mM imi dazol e)에 현탁한 후 soni cator를 이용하여 파쇄하였다. 세포 파쇄액은 41：， 25 , 000 g 에서 30분 원심분리하여 비용해성 부분을 제거하고 용해성 부분을 모아 효소 활성 분석이나 추가적인 효소분리에 이용하였다.

D-LDH 효소활성은 L-LDH의 경우와 동일한 방법으로 측정하였다. pyruvate 와 0HB를 기질로 사용하여 분석하였다. L-LDH와 마찬가지로 대부분의 효소들은 pyruvate에 3-10배 높은 활성을 가지고 있었고 그에 비해 0HB에는 낮은 활성을 보였다 (도 17) . L-LDH와 비교할 때 D-LDH의 활성은 전반적으로 3-5배 낮았다. Lb-LDH 및 Lp-LDH 가 가장 높은 2.2 umol/mg protein/min 의 활성을 보였다. 0HB에 대해서는 Lb—LDH가 0.8 umol /mg protein/min의 가장 높은 활성을 보였다. pyruvate 와 0HB에 대한 선택도는 약 1 : 0.2 수준이었다. Lb-LDH를 선택하여 0HB에 높은 활성을 갖는 D-reductase 변이 효소를 제작하였다.

OHB D-reductase 효소의 생성물의 광학활성 측정

Lb-LDH가 생성하는 DHB 2번 위치 hydroxy 기가 (R) 혹은 (S) 중 어느 것인지 알아보기 위해 광학활성을 갖는 HPLC와 color imetr i c 분석 ki t을 사용하여 분석하였다. Lb-LDH와 반응시킨 0HB 생성물의 HPLC 분석의 경우 하나의 peak만 얻어졌고 retent ion t ime은 D— form으로 추정되는 11.3분 시간대에 나타났다. 또한 color imetr i c 분석에서도 D-form 만 얻어졌다. 따라서 Lb-LDH와의 반웅으로 얻어진 DHB는 광학적으로 순수한 D-form 흑은 (R)-form isomer로 확인하였다.

4-2. site-directed mutagenesis를 이용한 0HB D-reductase 효소의 변이체 개발

PDB databank에 나와있는 Lb-LDH 효소의 결정구조를 이용하여 engineering 해야 할 아미노산 잔기를 확인하였다 (도 18). 즉 피루브산과의 docking을 통해 His296, Arg235, Glu264 둥 3개의 잔기가 피루브산과의 반웅 활성부위에 존재하고 추가적으로 두 개의 hydrophobic 아미노산 잔기인 Val78과 TyrlOl이 활성부위 주위에 존재하는 것을 확인하였다. 이러한 hydrophobic 잔기들은 0HB와의 반응에 방해요인으로 작용할 가능성이 크므로 이들을 (크기가 작은) hydrophilic 아미노 잔기 (Ser, Thr, Asn, Asp, Lys)로 바꾸어 주었다.

Mutation은 site directed mutagenesis kit을 이용하여 수행하였다. 표 13는 Lb-LDH의 site-directed mutagenesis에 사용한 primer 염기서열을 나타낸다. 변이된 Lb-LDH를 발현하는 플라스미드를 pET plasmid에 클로닝한 후 서열을 확인 (Macrogen, Seoul , Korea)하고 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 발현하였다. 세포 파쇄액에 존재하는 효소는 Ni-NTA 레진을 사용하여 정제하고 10 kDa molecular cutoff membrane을 이용하여 염을 제거하였다. 이후 Ultra-15 30K centrifugal filter (Am icon, Merck Millipore Co. , Darmstadt, Germany)로 다시 한 번 여과한 후 -80 ^° C에 보관하였다.

아래 표 13에는 Lb-LDH의 site— directed mutagenesis에 사용한 primer 염기서열을 나타냈다.

[표 13]

Pr imers 염기서열 서열번호

LDH6_FP cat cactaagatgagcctgcgtaactccggtgt tgacaacatcgacatggct 184

LDH6_RP tagccatgtcgatgttgtcaacaccggagt tacgcaggctcatcttagtgatg 185

LDH7_FP cat cactaagatgagcctgcgtaacaacggtgt tgacaacatcgacatggcta 186

LDH7_RP tagccatgtcgatgttgtcaacaccgttgt tacgcaggctcatcttagtgatg 187

LDH8_FP cat cactaagatgagcctgcgtaacaccggtgt tgacaacatcgacatggcta 188 LDH8_RP tagccatgtcgatgttgtcaacaccggtgttacgcaggctcatcttagtgatg 189

LDH9_FP catcactaagatgagcctgcgtaacgacggtgttgacaacatcgacatggcta 190

LDH9— RP tagccatgtcgatgttgtcaacaccgtcgttacgcaggctcatcttagtgatg 191

LDH10_FP catcactaagatgagcctgcgtaacaagggtgttgacaacatcgacatggcta 192

LDH10— RP tagccatgtcgatgttgtcaacacccttgttacgcaggctcatcttagtgatg 193 효소의 활성은 NADH의 산화 정도를 340nm의 흡광도를 관찰해 측정하였고， 효소의 활성 (specific activity; 1U)은 1분 동안 1 n 의 NADH를 NAD+로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 변이체 효소는 모두 pyruvate 와 0HB에 대하여 감소된 활성을 나타냈다. 이들 중 V78D (LDH-9)는 pyruvate에 대하여 거의 4배 가량 감소한 활성을 보여주었다. 가장 우수한 효소는 V78T (LDH-8) 로 나타났으며， pyruvate에 대해서는 약 45% 활성이 감소한 반면 HOB에 대해서는 약 10% 활성이 증가한 것으로 나타났다 (도 19). 향후 실험에서는 OHB D-reductase 효소로 V78T (LDH-8)를 선택하였다.

실시예 5: DHB (2,4-dihydroxybutyric acid) 생산용균주의 제작

DHB의 최적 생산을 위해서는 트랜스아미네이즈 및 OHB reductase가 최적발현되어야 한다. 또한 TA활성의 증가에는 TA 효소 자체의 발현은 물론 TA 반웅의 cofactor인 pyr idoxal-5-phosphate (PLP)， 즉 비타민 B6 생합성이 증대 되어야 한다. 더 나아가 DHB의 세포외 이송속도가 증가되어야 한다. 이를 위해 앞서 실시예 1에서 homoserine 생산을 위해 제작된 균주를 추가적으로 변형시켜 DHB 생산 균주를 제작하였다.

5-1. Vitamin B6 생산 증가

대장균의 경우 PLP는 DXP 의존 경로를 통해 생합성되며, 이 경우 PLP생합성 속도는 epd, dxs, pdxJ 유전자 등이 코딩하는 단백질에 의해 조절된다고 알려져 있다 (도 20). PLP 생합성 속도를 향상시키기 위하여 이 세 유전자의 프로모터를 합성 프로모터 5 (표 5)로 치환하였으며， Pop-in pop-out 방법을 사용하였다. 사용한 primer를 아래 표 14에 나타냈다. 표 14은 비타민 B6 생합성을 증가시키기 위하여 epd, dxs ^' , pdxJ 유전자의 발현을 증대시키기 위해 사용된 프라이머 염기서열을 나타낸다. 결과적으로 PLP 생합성이 강화된 3개의 균주를 얻을 수 있었다 (표

[표 14]

Primer 염기서열 서열번 s 호 us- atctaagcggccgcggaattatgcaattcgtggtac 194

Psp5一

epd-FP

us- aaaaaatttatttgctttcgcatctttttgtacctataagtgtggaatgaccgtacgcgt agcgataa 195

Psp5- atg

epd-RP

Psp5- gccagtttagtatcgacc 196 epd-FP

Psp5- acaaaagcatgatcctgttgaagatgcg 197 epd-RP

DS- catttatcgctacgcgtacggtcattccacacttataggtacaaaaagatgcgaaagcaa ataaattt 198

Psp5- ttttc

epd-FP

DS- tagtaatctagaggagttggcatctttctgcgatttc 199

Psp5- epd-RP

us- atctaagcggccgctcgacatttcattgtcgttgag 200

Psp5- dxs-FP

us- caaaaaatttatttgctttcgcatct ttttgtacctataagtgtggaatgagttttgatattgccaaa 201

Psp5- tac

dxs-RP

Psp5- gtaaagcttaccggaaagcagctgt 202 dsx-FP

Psp5- agcaactcgaagcctgcgttaag 203 [표 15]

상기 EcW13 균주는 2018년 06월 22일자로 대한민국 서울시 서대문구에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12281P를 수여받았으며， 상기 EcW20 균주는 2018년 06월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12282P를 수여받았습니다.

5-2. DHB 세포막 이송 단백질의 발현 조절

DHB의 세포외 이송속도를 증대시키기 위하여 이송단백질 후보를 먼저 스크리닝 (screening) 하였다. 알려진 유기산 막 이송 단백질， 특히 lactic acid 와 저분자량의 carboxylic acid 이송 단백질을 query로 사용하여 importer 및 exporter를 선정하였다. 표 16에는 2,4-DHB exporter 후보로 선정된 단백질 목록을 나타냈으며， 표 17에는 2,4-DHB importer 후보로 선정된 단백질 목록을 나타냈다.

[표 16]

Protein Names Gene

MFS type transporter YhjX

Probable formate transporter focA

Lactate premease lldp

Inner membrane metabolite transporter yhjE

C4-dicarboxylate transporter dcuA

C4一 dicarboxylate transporter dcuB C4-dicarboxylate transporter dcuC

[표 17]

이들 중 가장 가능성이 높은 2개의 exporter, 즉 ldp, (fcuA의 발현양을 합성 promoter를 이용하여 높여 주었다. 막 단백질의 과량 발현은 세포성장에 방해가 되므로 중간 세기의 합성 프로모터인 SP5를 사용하였다. 또한 importer 로 가장 가능성이 높을 것으로 예상되는 3개의 막 단백질， kgtP, dsdx, actP : 제거했다 . Transporter engineering 에 ^Λ 1 "용한 primer 서열을 표 18에 나타내었다.

[표 18]

Primer 염기서열 서열번

(과발현 호 )

us- atctaagcggccgcgattggaatgcccatcgcac 212

Psp4- lldp-FP

US— ttgacaat taat cat ccggctcgtaattt atgtggaatgaat etc tggcaacaaaactacg 213 Psp4- lldp-RP Psp5- ccatctgaccaatctcaaagctgt 214 lldp-FP

Psp5- t tgtgaacaaagcacctggtcgcg 215 lldp-RP

DS- t ccacat aaat t acgagccggat at t aat tgt caattggt agggccaat tcttgtg 216

Psp4- lldp-FP

DS- tagtaatct agagaaagaagt cgaaaaaaacgaaat c 217

Psp4- lldp-RP

us- atctaagcggccgcgttgatgattgcatagataacc 218

Psp4- ducA-FP

us- ttgacaattaatcatccggctcgtaatttatgtggaatgcaggttgctggcggtctggac tatctg 219

Psp4- gttc

ducA - RP

Psp4- ccatctgaccaatctcaaagctgt 220 ducA-FP

Psp4- t tgtgaacaaagcacctggtcgcg 221 ducA-RP

DS- t ccacat aaattacgagccggatgattaattgtcaatgttttttaacaagttgatattagattg 222 Psp4- ducA - FP

DS- tagtaatct agagaaagaagt cgaaaaaaacgaaat c 223 Psp4- ducA - RP Pr imers 염기서열

(제거)

us- atctaagcggccgcggtatccagcgacgat t t tagcg

224 dsdx-FP

US— gtacgtctctt tgcgct tacatatctcacctt cccctg

225 dsdx-RP

G-dsdx gcgtgtaaagtcacctaatgc

226 -FP

G-dsdx gggcatcagcagacatatg

227 -RP

DS- caggggaaggt gagat atgt aagcgcaaagagacgt ac

228 dsdx-FP

DS- tagtaatctagacgctcataatgccgattgataac

229 dsdx-RP

us- atctaagcggccgcggagctgatccgcgagcatac

230 kgtP-FP

us- acggcaggagacataatggcatgtagtgacgggtcagttgccagac

kgtP 一 231 RP

G- kgtP tggcgtctggatctggaaaacg .

232 -FP

G- kgtP tgtgtaagcgcagcgatgc

233 -RP

DS— gtctggcaactgacccgtcactacatgccat tatgtctcctgccgt

kgtP - 234 FP

DS- ta t agt aatct agagaagc tgt t t t ggcggatga

235 kgtP-RP

US一 atctaagcggccgcct tatct t tat taaggtaaac

236 actP-FP us- agtcctgcatgaggtacaagcatcatgtaatctctccccttccccggtcgtctg actP - 237 RP

G- actP ctgtgggat t tcgatagtat

238 -FP

G- actP agcaacctgggcgatacctcgac

239 -RP

DS- c agacgaccggggaaggggagagat t aca t ga t gc 11 gt ac c t c at gcaggac t 240 actP - FP

DS- tagtaatct agaaagc tgct t aagagaagcag 241 actP-RP 최종적으로 transporter와 PLP 생합성 경로가 변화된 DHB 생산 숙주 균주 대장균이 아래 표 19과 같이 얻어졌다.

[표 19] .

실시예 6: 광학적으로순수한 S-form 또는 L-form 2, 4-디히드록시 부티르산 (2,4-dihydroxybutyric acid, S-흑은 R-DHB) 생산균주의 제작및 발효 6-1. DHB의 생산을 위한 유전자 재조합 플라스미드 제작

PET-TA4-1과 LDH를 발현하는 플라스미드 (pET-LDHA2 또는 pET- LDHD3)를 이용하여 TA4-1 효소와 OHB reductase 효소를 동시에 발현하는 유전자 재조합 플라스미드를 제작하였다. 각각의 유전자 절편을 PCR증폭한 후 overlap 하고 pBAD plasmid의 Ndel 및 EcoRI site에 ligation 해 주었다. 두 개의 새로운 플라스미드， 즉 L-form DHB를 위한 pBAD_TA4-l_LDHA2 (이후 pDHB-L로 명명) 플라스미드와 D— form DHB를 위한 pBAD_TA4— 1_LDHD3 (이후 pDHB-D로 명명) 플라스미드를 얻었다. 이 두 플라스미드에서는 TA4-1과 0HB reductase 유전자가 동시에 polycistronic 하게 전사되도록 아라비노우즈에 의해.유도되는 프로모터 아래 클로닝하였다 (도 21).

6-2. DHB 생산

DHB 생산을 위하여 실시예 1에서 개발된 homoserine 생산 균주에 DHB생산 경로 플라스미드 pDHB-L 및 pDHB-D를 각각 도입하였다. 사용한 homoserine 생산균주는 EcW20(표 19 참고)로 10개의 유전자 결실 pts, Aeda, Mac I, AthrB, AmetA, MysA, AadhE, ApfJB, MdhA, 과 2개의 프로모터 치환 (APacs: :Pirc), A ppc- -PSP8) , 그리고 metL 유전자를 과발현하기 위한 플라스미드 pUCPK-P rd»e 를 가지고 있었다. 더 나아가， 이 균주는 PLP 과생산을 위한 생산 경로 핵심 효소 발현 강화， importer 막단백질의 제거， exporter 막단백의 발현 강화 등이 추가적으로 도입되었다. EcW20 균주에 DHB생산 경로 플라스미드 pDHB— L 혹은 pDHB-D가 도입된 균주를 각각 EcW20(pDHB-L) 및 EcW20(pDHB_D)으로 명명하였다.

먼저 pDHBL이 도입된 EcW20(pDHB-L) 균주를 통해 L—DHB생산을 조사하였다. EcW20(pDHB-L) 균주를 50 mL 배지 부피로 250 mL 플라스크에서 200 rpm으로 교반하면서 호기조건에서 배양하였다. 포도당을 탄소원으로 하는 TPM2 배지 (yeast extract, 2 g; MgS0 ₄ 7_H ₂ 0, 2 g; KH ₂ P0 ₄ , 2 g; (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 10 g; L-methionine, 0.2 g; L-lysine, 0.2g; L-Threonine, 0.2 g ； L-isoleucine, 0.05 g; trace metal solution, 10 ml)를 사용하였다ᅳ 포도당농도는 10 g/L, Kanamycin과 ampicillin은 각각 50 mg/L로 첨가하였다. Arabinose는 배양 3시간 후 0 - 1 g/L 범위에서 농도를 달리하면서 첨가해 주었다.

도 22에 나타낸 바와 같이， DHB 생산 플라스미드를 갖지 않는 EcW20 균주는 DHB를 전혀 생산하지 않았다. DHB 생산 플라스미드를 갖는 EcW20 균주의 경우 arabinose 첨가량에 따라 DHB의 생산량이 변하였다. 즉， arabinose를 첨가하지 않은 경우 0.005 g/L의 소량이 얻어진데 비해 0.5 g/L의 농도로 첨가한 경우 0.33 g/L로 가장 많은 양이 얻어졌다. 더 높은 1 g/L의 arabinose가 첨가된 경우 세포성장， 포도당 소모 등이 저하되었고 DHB 생산도 0. 19 g/L로 낮아졌다. 이는 DHB 생산 경로 효소의 과발현에 따른 부작용으로 판단된다. 생산된 DHB는 모두 L-form으로 나타났다.

동일한 방법으로 pDHBD 가 도입된 EcW20(pDHB-D) 균주를 통해 D- DHB생산을 조사하였다. L-DHB 의 경우와 마찬가지로 DHB 생산 플라스미드를 갖지 _. 않는 EcW20 균주는 DHB를 전혀 생산하지 않았다. Ec 20(pDHB-D) 균주의 경우 arabinose 첨가량에 따라 DHB의 생산량이 변하였다. 즉， arabinose를 첨가하지 않은 경우 0.005 g/L의 소량이 얻어진데 비해 0.5 g/L의 농도로 첨가한 경우 0.20 g/L로 가장 많은 양이 얻어졌다. 더 높은 1 g/L의 arabinose가 첨가된 경우 세포성장， 포도당 소모 등이 저하되었고 DHB 생산도 0. 17 g/L로 낮아졌다. 이는 DHB 생산 경로 효소의 과발현에 따른 부작용으로 판단되었다. 생산된 DHB는 모두 D-form으로 나타났다. 전반적으로 L-DHB 보다 낮은 양의 D-DHB가 생성되었다. 그 이유는 재조합 균주 제작에 사용된 LdhD 효소의 활성이 LdM 활성보다 낮기 때문으로 확인했다. (도 22)

EcW20(pDHB-L) 및 EcW20(pDHB_D) 균주를 이용하여 생물반응기 실험을 실시하였다 (도 24a) . 반웅기 부피는 3 L , 그리고 초기 배지 부피는 1 L 였다. 플라스크실험과 동일한 TPM2 배지를 사용하였고 발효 중 포도당을 적당한 수준으로 첨가시켜 주었다. 호기 조건을 유지하기 위하여 1 wm의 속도로 공기를 주입하였고 교반속도는 500 - 900 rpm 사이에서 적절히 조절하였다. Arabinose는 6시간 배양 후 0.5 g/되도록 첨가하였다. 세포는 초기부터 18시간까지 성장하였다. DHB 생산은 9 시간부터 시작되어 배양이 끝난 48시간까지 지속시켰다. 도 24a 및 24b에서 검은 동그라미 기호의 실선은 세포농도를 의미하며， 흰색 동그라미 기호의 점선은 생성물인 DHB를 의미하고， 역삼각형 기호의 점선은 포도당 농도를 의미한다.

그 결과， 으 DHB와 L-DHB의 경우 세포성장， 생성물 생산， 최종농도 등에서 차이가 났다. 즉 L-DHB의 경우 최종 세포 농도는 10 g/L 이었고 최종 L-DHB 농도는 20 g/L이었다. 이에 비해 D-DHB의 경우 최종 세포 농도는 8 g/L 이었고 최종 L-DHB 농도는 14 g/L이었다.

실시예 7: 2-hydroxy gamma butyro lactone (HGBL) 생산균주의 제작 및 발효

7-1 HGBL의 생산홀 위한 유전자 재조합 플라스미드 및 재조합 균주의 제작

DHB를 HGBL로 전환하기 위해서는 l act onase 효소가 필요하다. 락토네이즈 효소로 paraoxonase가 사용되었으며， 이 효소는 칼슘을 필요로 하고 여러 기질에 대하여 활성을 가지고 있다. 이 효소반응은 산성 범위에서 최적이므로 세포막이나 per ipl asmi c space에서 발현하는 것이 필요하다. 또 이 효소가 동물유래이므로 미생물 발현을 위해서는 적절한 변이가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 ponl 유전자 변이체 (G3C9)를 사용하고 또한 N—말단에 s ignal sequence를 부착하여 per ip l asmi c space에 발현되도록 하였다. 먼저 ponl(G3C9) 유전자를 합성한 후 PCR 증폭 (FP , tagacacatatggct aaactgacagcg ; RP , t acat act cgagt t acagct cacagt aaagagc 111 g ) s-f Jl 낮은 copy 수를 갖는 pACYC- Duet 플라스미드에 클로닝하였다. ponl(G3C9) 의 발현에는 t ac 프로모터를 사용하였다 (도 18) . 이 플라스미드를 pACYC_Ponl으로 명명하였다.

얻어진 Ponl pl asmi d를 앞서 얻은 2개의 균주 즉 L-DHB와 D-DHB를 생산하기 위한 균주에 각각 도입하였다. 이 경우 DHB의 세포외 이송 속도를 높이는 것이 바람직하지 않으므로 숙주세포로 EcW16이 사용하였고 (표 19)， homoser ine에서 DHB를 생산하기 위한 플라스미드는 앞서 DHB생산의 경우와 동일하게 pDHB-L 및 pDHB-D를 사용하였다 (도 21) . 그리고 이들 균주를 각각 EcW16(pHGBL-L) , EcW16(pHGBL-D)라고 명명하였다. 7-2 HGBL의 생산을 생물반웅기 운전

HGBL 생산을 위하여 2단 배양을 실시하였다. 먼저 1단 배양에서 DHB를 생산한 후 2단에서 pH를 낮추어 HGBL을 생산하였다. 한천배지에서 단일 균주를 얻은 후， LB 배지를 이용하여 starter culture를 시행하였다. 그리고 앞서 기술한 바와 같이 TPM2 배지를 이용하여 seed culture를 실시하였다. 본 배양은 지수성장기에 있는 seed culture 세포를 접종하여 TPM2 배지에서 실시하였다.

L-DHB의 경우 48시간 1단 배양 동안 약 16 g/L의 DHB가 생산되었다. 세포 농도나 포도당의 소모 속도도 L-DHB의 생산을 위한 발효에 비해 감소하였다. transporter의 engineering 부재， ponl 발현을 위한 플라스미드 도입과 추가적인 단백질， 특히 ponl 막 단백질의 생산이 그 원인으로 추정되었다.

D-DHB 의 경우 48시간 1단 배양 동안 약 9 g/L의 DHB가 생산되었다. 세포 농도나 포도당의 소모 속도도 D-DHB의 생산을 위한 발효에 비해 감소하였다. ponl 발현을 위한 플라스미드 도입과 추가적인 단백질， 특히 ponl 막 단백질의 생산이 그 원인으로 추정되었다. 또한 L-DHB가 D-DHB보다 높은 농도로 얻어졌는데 이는 앞서 설명한 바와 같이 2-oxo-reductase의 활성이 L-form이 D-form에 비해 현저히 높았기 때문으로 추정된다.

이후 생산된 DHB를 HGBL로 전환하기 위하여 염산용액을 이용하여 배양액의 pH를 6.2로 낮추고 배양을 계속 하였다. 그 결과 L-HGBL의 경우 약 24시간의 추가 배양을 통해 약 5 g/L의 락톤을 얻을 수 있었다. 대부분의 DHB는 HGBL로 전환되지 않고 남아 있었다 (도 26a) .

한편 D-HGBL을 얻기 ^' 위해 동일한 실험을 실시하였다 (도 26b) 즉 48시간 1단 배양 후 24시간 2단 배양을 pH 6.2에서 실시하였다. L-HGBL의 경우와는 달리 0.3 g/L의 아주 낮은 농도만 얻어졌다. 그 이유는 사용한 ponl 효소가 L-form 의 DHB에만 활성이 있게 때문으로 추정되었다.

화학적 반웅을 통해 2 ,4—di hydroxy butyr ic acid를 Lactone으로 전환시켜 보았다. 이 경우 도 23 및 도 24에서 보여준 1단 배양이 끝난 배지를 원심분리하여 세포를 제거하고 배양액에 염산용액을 가하여 pH를 1.0까지 떨어뜨렸다. 그리고 10시간 정치반웅 시켰다. 이 경우 L— DHB와 D- DHB 모두 약 50%가 lactone으로 전환되었다. 그 결과 L-HGBL은 약 9 g/L 그리고 D— HGBL은 약 6 g/L가 얻어졌다. 이로 미루어 DHB의 에스테르화 반응은 D-form, L-form 모두 산촉매 화학 반웅을 이용하는 것이 ponl 효소를 이용하는 것보다 효율적임을 알 수 있었다.

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