MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA FORMA CRISTALINA ANIDRA DE HIDRAZONA DERIVADA DA ISONIAZIDA, POLIMORFO CRISTALINO DA FORMA ANIDRA PRODUZIDO, USO DO MESMO PARA O TRATAMENTO DAS DOENÇAS DE ALZHEIMER, PARKINSON E OUTRAS DESORDENS NEURODEGENERATIVAS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito ao método de preparação da forma cristalina anidra de hidrazona (8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoílhidrazona) derivada da isoniazida, polimorfo produzido e uso do mesmo para o tratamento das doenças de Alzheimer e Parkinson, dentre outras e composição farmacêutica.

Histórico da Invenção

Com o aumento geral da expectativa de vida registrado nos últimos tempos, em especial em países desenvolvidos, tem-se observado o prevalecimento de certas doenças neurodegenerativas. A doença de Alzheimer (DA), inicialmente caracterizada em 1906 pelo neuropatologista alemão Alóis Alzheimer, é uma das doenças neurodegenerativas em destaque atualmente, sendo a mais comum delas. É uma doença primariamente relacionada à idade e a causa mais comum de demência em pessoas idosas. A demência é caracterizada pela progressiva perda de memória e das funções cognitivas, dentre outros critérios de diagnóstico, sendo os mais usados atualmente aqueles presentes no Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders e aqueles da National Institute of Neurological and Communicative Disorders Association.

A afecção tem duas classificações gerais: 1) de acometimento tardio, que ocorre com maior incidência por volta dos 60 anos de idade e 2) de acometimento precoce, ocorrendo ao redor dos 40 anos. Nos EUA e Grã- Bretanha, ela representa cerca de 50% dos casos de demência, sendo estimado que corresponda à quarta causa de mortes de idosos nestes países. Considerando o ponto de vista neuropatológico, são observados nos indivíduos com DA atrofia cortical difusa, a presença de placas senis e novelos neurofibrilares, degeneração neurovascular, bem como perda neuronal.

Essas placas senis se caracterizam, principalmente, pela presença de depósitos fibrilares do peptídeo β-amilóide (Αβ), formado por.aprox., 40 resíduos de aminoácidos. Tem sido verificada grande concentração de íons metálicos fisiológicos, como Zn ²⁺ e Cu ²⁺ , nessas placas, o que é considerado indicativo de que a interação de Αβ com esses biometais encontra-se no cerne dos eventos que levam à agregação e toxicidade desse peptídeo. O íon férrico, por sua vez, também tem sido relacionado à agregação de emaranhados neurofibrilares, além de ter contribuição para os processos oxidativos que ocorrem nas células nervosas do organismo.

Algo similar ocorre no Mal de Parkinson com a proteína a-Sinucleína.

As drogas já aprovadas para o tratamento da DA visam combater os déficits associados à redução da função cerebral e se incluem em duas classes: os inibidores da acetilcolinesterase e os inibidores dos receptores do tipo NMDA (A/-Metil-D-Aspartato). Tais drogas parecem atuar no aumento da permanência da função cognitiva, entretanto, não são capazes de impedir a progressão da doença, sendo, portanto, importante o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos que detenham o avanço do quadro de neurodegeneração, bem como, na medida do possível, promovam a sua regressão.

Nesse sentido, uma abordagem interessante seria a obtenção de compostos que possam inibir, de forma específica, interações metal-proteína anormais. Essa classe de drogas é conhecida como MPACs (compostos atenuantes das interações metal-proteína) e se relacionam com a repartição e normalização da distribuição de íons metálicos fisiológicos.

Um exemplo clássico é o clioquinol (CQ ou PBT1), substância pertencente ao grupo das 8-hidroxiquinolinas, que, no entanto, foi abandonada devido a certos efeitos colaterais indesejados, como a neuropatia mielo-óptica subaguda.

Estrutura do clioquinol (5-cloro-7-iodo-8-hidroxiquinolina).

Estado da Arte

O composto 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoílhidrazona(INHHQ) foi primeiramente relatado em uma série de artigos publicados em 2009, nos quais suas interações com alguns íons de terras raras, a saber, disprósio(lll), európio(lll), hólmio(lll), neodímio(lll) e itérbio(lll) foram examinadas. Os complexos de érbio(lll) e térbio(lll) foram relatados em 2010, enquanto que o composto de samário(lll) foi descrito em 2011. Nos estudos, esses complexos de terras raras, e não o próprio ligante INHHQ, foram apontados como potenciais drogas anticâncer, uma vez que se ligam ao DNA por meio de um mecanismo de intercalação, além de ter propriedades anti-oxidantes, apresentando efeitos de eliminação de radicais livres hidroxila e superóxido. Embora o método de preparação descrito pelos autores, Liu e Yang, seja semelhante ao utilizado por nosso grupo, alguns detalhes experimentais são diferentes. Principalmente, o uso de catálise ácida (gotas de ácido clorídrico concentrado) nos permitiu diminuir o tempo de refluxo da reação para 1 h. Por outro lado, e mais importante ainda, a utilização de álcool metílico PA ACS (99,8%) na etapa de recristalização, ao invés da mistura metanol:água 80:20 usada pelos autores chineses, permitiu a obtenção da forma cristalina anidra do composto, a qual é completamente inédita. Embora não seja explicitado nos artigos originais, os dados levam a crer que os autores chineses trabalharam com uma forma hidratada de INHHQ, diferente da sintetizada por nós, o que é evidenciado pelas grandes diferenças observadas nas temperaturas de fusão e espectros vibracionais (FTIR e Raman) das amostras. Além disso, é nova a aplicação de INHHQ no tratamento de doenças neurodegenerativas.

A forma cristalina anidra aqui descrita é completamente caracterizada pelo seu ponto de fusão, análise elementar, estrutura cristalina (DRX por monocristal), difratograma de raios X da amostra policristalina e espectros vibracionais.

Breve Descrição das Figuras

A invenção será ilustrada em referência às figuras em anexo, que representam:

- Figura 1 : Representação ORTEP do composto INHHQ, mostrando o esquema de identificação dos átomos constituintes;

- Figura 2: Série de visões em perspectiva do empacotamento cristalino de INHHQ, mostrando: (a) a rede de ligações de hidrogénio, (b) as interações de empilhamento π - π e do tipo 01-H12 e (c) o empacotamento cristalino 3D ao longo do eixo cristalográfico a;

- Figura 3: Difratogramas simulado e experimental para o composto INHHQ;

- Figura 4: Estrutura calculada por DFT como sendo a mais estável na fase gás (Conf.5). Nível de teoria B3LYP/6-311 + G (d,p);

- Figura 5: Espectros FTIR (acima) e Raman (abaixo) de INHHQ;

- Figura 6: Espectros bidimensionais de RMN de ¹ H x ¹⁵ N mostrando que a adição de 4 equivalentes de INHHQ a uma mistura contendo o peptídeo Apeum equivalente de Zn(ll) leva à recuperação parcial da intensidade de todos os sinais de Αβ, o que pode ser considerado um indicativo de que a hidrazona INHHQ enfraquece a interação Ζη(ΙΙ)-Αβ;

- Figura 7: Espectros de RMN de hidrogénio mostrando que o acréscimo de 4 equivalentes de INHHQa uma mistura contendo -Sinucleína e um equivalente de Cu(ll)/Cu(l) leva à recuperação da posição inicial dos sinais das metioninas, ponto de interação do cobre com a α-Sinucleína, o que pode ser considerado um indicativo de que a hidrazona INHHQ enfraquece a interação entre Cu(ll) ou Cu(l) e a proteína -Sinucleína. Descrição da Invenção

Na procura por novos MPACs, mais eficazes e seguros para os pacientes, uma hidrazona derivada do agente micobactericida isoniazida (INH) foi produzida, caracterizada na sua forma cristalina anidra e testada de forma satisfatória na modulação, in vitro, das interações entre a proteína α-Sinucleína ou o peptídeo β-amilóide com os metais fisiológicos cobre e zinco, o que pode ter um grande impacto no tratamento das doenças de Alzheimer e Parkinson.

Descrição Detalhada da Invenção

Na procura por novos MPACs, mais eficazes e seguros para os pacientes, a isonicotinoíl hidrazona da 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído (INHHQ), uma hidrazona derivada do agente micobactericida isoniazida (INH), foi produzida, completamente caracterizada na forma cristalina anidra e testada com sucesso na modulação, in vitro, das interações entre a α-Sinucleína ou o peptídeo Αβ com os metais fisiológicos cobre e zinco, o que pode levar a aplicações no tratamento das doenças de Alzheimer e Parkinson, dentre outras desordens neuro degenerativas (como, por exemplo, a doença de Huntington).

Estrutura da INHHQ (8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotionoílhidrazona).

Ligada à porção 8-hidroxiquinolina característica do CQ, INHHQ também contém o medicamento micobactericida isoniazida (INH), resultando em um ligante potencialmente interessante capaz de coordenar íons metálicos de importância biológica por meio de seus vários sítios N/O-doadores. Além disso, ligar duas moléculas que possuem, individualmente, determinada atividade, formando uma única espécie, tem sido uma abordagem atraente no desenvolvimento racional de fármacos, já que a conjugação de duas atividades pode ser esperada da molécula híbrida. Além disso, hidrazonas derivadas da isoniazida são bem conhecidas como agentes quelantes de ferro. Contudo, tanto quanto sabemos, não há estudos na literatura envolvendo a coordenação de INHHQ a qualquer metal de transição.

No contexto do tratamento da DA e Mal de Parkinson, as capacidades de coordenação deste ligante a metais de transição essenciais (como cobre, zinco e ferro) deve ser mais bem compreendidas. Como primeira abordagem a este problema, apresentamos os resultados obtidos de um estudo espectroscópico vibracional (FTIR/Raman) e estrutural, via difração de raios X em monocristal e policristais, da 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoíl hidrazona, obtida através do processo aqui descrito e reivindicado, incluindo a estrutura cristalina da forma anidra de INHHQ, espectros vibracionais e uma atribuição total dos mesmos com o auxílio de métodos computacionais baseados na Teoria do Funcional de Densidade (DFT).

Método de Preparaçãoda forma Cristalina Anidra do Composto

8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoílhidrazona

A 25,0mL de solução etanólica de 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído (1 ,04 g; 6,0 mmol), foram adicionados, gota a gota, 25,0ml_ de solução etanólica de isoniazida (0,82 g; 6,0 mmol). Foram também acrescentadas 2 gotas de ácido clorídrico concentrado, como catalisador para a reação. Após refluxo de 1 h, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e o precipitado amarelo formado foi filtrado e seco a vácuo. A seguir, foi feita a recristalização, a quente, do produto obtido em metanol PA ACS (99,8%). Um sólido cristalino amarelo-claro foi obtido, após resfriamento, e seco à temperatura ambiente. Após alguns dias, monocristais da substância foram isolados a partir do líquido-mãe.

Rendimento total do processo: 0,98 g (56%).

Caracterização: p.f.: 246-249X. Análise elementar: calculado para C16H12O2N4: C, 65,7%; H, 4,1%; N, 19,2% - encontrado: C, 66,3%; H, 4,1%; N, 19,4.%.

Principais bandas no IV (KBr, cm ^"1 ): 3396 (v OH); 3183 (v NH); 1656 (v C=O +β NH); 1647 (v C=N do grupo azometino); 1556 (v C=N e v C=C do anel quinolínico) e 1545 (v C=C e v C=N do anel piridínico).

Análise por difração de raios X

A difração de raios X (DRX) foi realizada utilizando-se um cristal apropriado de INHHQ. A amostra foi medida em um difratômetro Enraf-NoniusKappa-CCD, com radiação Mo KQ (λ=0,71073 Á). Os parâmetros da célula unitária foram baseados em todas as reflexões. Os dados foram coletados à temperatura ambiente (293 K), utilizando-se o programa computacional Collect, sendo a integração e o escalonamento das reflexões realizados com o sistema Denzo - Scalepack de programas HKL. A estrutura cristalina foi resolvida pelo método direto com SHELXS-97 e os átomos, com exceção dos hidrogênios, refinados anisotropicamente por mínimos quadrados em F2 usando-se o programa SHELXL-97. Todos os átomos de hidrogénio aromáticos e do grupo hidroxila foram colocados nas posições calculadas (C-H: 0.98 Ã, O-H: 0.82 Â). Fatores de deslocamento foram tomados como U(H) _iso t=1 ,2/1 ,5 Uhost. Os átomos de H ligados ao carbono C7 e ao nitrogénio N2 foram localizados no mapa de diferença de Fourier e refinados livremente. Os programas computacionais ORTEP-3 e Mercury (versão 2.3) foram usados para desenhar as estruturas. Experimentos de difração de raios X por uma amostra policristalina de INHHQ foram efetuados em um equipamento Bruker D8 Discover XRD, utilizando-se tubo de raios X de cobre. Condições experimentais: 40 kV de tensão, 40 mA de corrente e 0,02 ⁰ de passo. A geometria Bragg-Brentano foi usada.

Análise espectroscópica

Os espectros de infravermelho (IR) foram obtidos em um espectrômetro Perkin- Elmer 2000 FT-IR, utilizando-se amostragem em pastilha de KBr. Por sua vez, os espectros Raman da amostra sólida foram medidos em um equipamento Perkin-Elmer 400 Station, usando a linha de 785 nm para excitação.

Cálculos DFT

A primeira etapa foi realizar uma pesquisa do espaço conformacional da 8- hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoíl hidrazona usando o método semi- empírico PM3, como implementado no software SPARTANO2, com o seguinte conjunto de parâmetros: Max-Confs = 100; window = 10 kcal mol ^"1 ; model = PM3. Um total de 12conformações diferentes foi encontrado. A conformação de menor de energia foi a de 41 ,387 kcal mol ^"1 . A partir desta distribuição, 5 conformações foram selecionadas para análise por DFT. Estas conformações serão chamadas, a partir de agora, de Conf. 1 a Conf. 5.

Após a seleção destas cinco conformações, uma otimização completa de geometria, sem restrições, usando-se os critérios de convergência padrão e cálculos de frequências vibracionais harmónicas, foi realizada em fase gás, para cada uma delas, empregando-se o pacote de programas Gaussian 03 Gauss. Os três parâmetros do potencial de correlação e troca sugerido por Becke, com as correlações local e não-local fornecidas por Lee, Yang e Parr (funcional B3LYP) foram escolhidos, com o conjunto de base de valência triple- zeta 6-311 + G (d,p). As contribuições térmicas para a energia livre de Gibbs e outras funções de estado foram calculadas a 298,15 K e 1 atm. As frequências vibracionais foram escalonadas por um fator de 0,9381 para uma melhor comparação com os dados experimentais.

Estrutura molecular

Análise cristalográfica

Os principais parâmetros do cristal usado, assim como dados das informações coletadas e parâmetros de refinamento estruturais encontram-se resumidos na Tabela 1. INHHQ cristaliza no sistema ortorrômbico, grupo espacial Pbca. A unidade assimétrica de INHHQ é mostrada na Fig. 1. O composto adota uma configuração (E) em relação à ligação C7=N3 do grupo hidrazônico. A molécula de INHHQ é quase plana no estado sólido (desvio rms = 0,2701° para todos os átomos, exceto H) e mostra uma ligação de H intramolecular envolvendo a hidroxila fenólica e o nitrogénio do grupo quinolínico: o doador O1-H interage com o receptor N4 [01 N4 = 2,689 A]. Neste processo, um pseudo-anel de cinco membros é formado. As distâncias e ângulos de ligação (Tabela 2) não são significativamente diferentes dos observados em compostos semelhantes. O empacotamento cristalino é mantido por ligações de H intermoleculares que envolvem o oxigénio da carbonila O2 (receptor) de uma molécula e o grupo N2-H da molécula seguinte [moderada N2 02' = 2,966 Á, código de simetria: (i) -x + ½, y - ½, z], ligando as moléculas de INHHQ em cadeias que correm em ziguezague (Fig. 2a). As moléculas na cadeia são interligadas por interações de empilhamento transversal π - π envolvendo os seus anéis quinolínicos. A distância centróide-centróide calculada é 3,8303(9) A. As cadeias adjacentes são interligadas por interações O1-H12 (Fig. 2b), sendo a distância H12- centróide (N4-C8-C9-C10-C11-C12) de 3,5339(17) A [código de simetria: -½ + x, y, ½ - z]. Como resultado desta última interação, colunas em ziguezague correm paralelas ao eixo cristalográfico a (Fig. 2c).

Tabela I.Seleçâo de dados cristalográficos para INHHQ

Fórmula empírica C16H12O2N4

Massa fórmula 292,30

Temperatura de coleta 293(2) K

Comprimento de onda 0,71073 A

Sistema cristalino Ortorrômbico

Grupo espacial Pbca

a = 17,0761 (4) A

Dimensões da cela unitária b = 8,25480(10) A

c = 19,3549(4) A

Volume da cela 2728,26(9) A ³

Z 8

p(calculada) 1 ,423 g cm ^"3

Coeficiente de absorção 0,098 mm ^"1

F(000) 1216

Tamanho do cristal utilizado 0,484 x 0,236 x 0,171 mm ³

Faixa de Θ utilizada na coleta 2,94 a 27,48°

"Index ranges" -22,19; -10, 10; -25,23

Reflexões coletadas 27142

Únicas 3100 [R ₍ int) = 0, 1 167]

"Completeness to Θ = 27,48 ^o " 99,0 %

Correção de absorção Nenhuma

Método de refinamento "Full-matrix least-squares on F ²

COLLECT, HKL Denzo and Scalepack,

Programas computacionais ³

SHELXS-97, SHELXL-97

"Data/restraints/parameters" 3100 / 0 / 208

"Goodness-of-fit on F ² " 1 ,042

índices R finais [1>2σ (1)] RT = 0,0517, wR ₂ = 0, 1188

índices R (todos os dados) Ri = 0,0968, wR ₂ = 0,1427

"Largest diff. peak and hole" 0,198 and -0,234 e A ^"3

"Usados para coleta de dados, processamento de dados, solução da estrutura e refinamento da estrutura respectivamente. Tabela 2.Principais distâncias e ângulos de ligação, experimentais e teóricos (Conf.5), para

INHHQ. O esquema de identificação cristalográfica dos átomos foi seguido

Experimental Calculado Experimental Calculado

Distâncias (A) Distâncias (A)

02-C6 1 ,2268(18) 1 ,211 N4-C12 1 ,362(2) 1 ,355

N2-C6 1 ,345(2) 1 ,388 N3-C7 ,270(2) 1 ,280

N2-N3 1 ,3862(18) 1 ,353 01-C13 1 ,358(2) 1 ,351

N4-C8 1 ,319(2) 1 ,325 N1-C1 1 ,333(2) 1 ,335

Ângulos (°) Ângulos (°)

C6-N2-N3 118,44(13) 120,9 N2-C6-C5 15,04(13) 114,0

C8-N4-C12 117,83(13) 118,6 C1-N1-C2 116,20(15) 117,2

C7-N3-N2 115,54(13) 117,4 01-C13-C12 118,65(15) 118,8

Angulosdiedro Angulosdiedro

s (°) s (°)

C8-C7-N3-N2 -177,63 179,7 N3-N2-C6-C5 -178,62 -178,6

C7-N3-N2-C6 -163,79 -175,4 N2-C6-C5-C3 144,93 -151 ,6

Adicionalmente, foi efetuada uma análise dos picos de difração do composto INHHQ, utilizando-se geometria Bragg-Brentano (Tabela 3). O objetivo final é o de caracterizar, inequivocamente, o polimorfo obtido. O difratograma simulado com base na estrutura cristalina (faixa 5<2Θ<70 °), assim como a sobreposição dos difratogramas experimental (vermelho) e simulado (azul), faixa 5<2Θ<60 ι °, podem ser observados na Fig. 3. Tabela 3.lnformações sobre os picos de difração de INHHQ para 2Θ variando de 10,5 a 70°

Distância

Plano (h,k,l) Multiplicidade interplanar (Â) 2 theta(°)

H k / m d

1 0 0 2 8,34877 10,58783

0 1 0 2 7,07920 12,49361

0 1 1 4 5,94931 14,87873

1 0 -2 2 5,93863 14,90564

1 -1 -1 4 5,50433 16,08920

0 0 2 2 5,48852 16,13588

1 1 0 4 5,39942 16,40394

1 -1 -2 4 4,54974 19,49495

1 1 1 4 4,37713 20,27167

2 0 -2 2 4,37659 20,27421

0 1 2 4 4,33757 20,45853

2 0 0 2 4,17439 21 ,26742

2 -1 -1 4 3,87923 22,90666

1 0 2 2 3,87110 22,95541

2 -1 -2 4 3,72262 23,88427

2 1 0 4 3,59579 24,73979

0 2 0 2 3,53960 25,13890

1 -1 -3 4 3,53090 25,20189

1 1 2 4 3,39646 26,21681

0 2 1 4 3,36879 26,43604

1 -2 -1 4 3,28146 27,15290

1 2 0 4 3,25881 27,34522

2 -1 -3 4 3,25355 27,39035

0 1 3 4 3,25049 27,41659

3 0 -2 2 3,08971 28,87348

2 1 1 4 3,08859 28,88417

1 -2 -2 4 3,04049 29,35123

1 0 -4 2 3,03231 29,43221

1 2 1 4 2,98732 29,88574

0 2 2 4 2,97465 30,01599

2 0 -4 2 2,96931 30,07124

3 -1 -2 4 2,83175 31 ,56923

2 -2 -1 4 2,81367 31 ,77739

3 -1 -1 4 2,78865 32,07025

1 -1 -4 4 2,78737 32,08534

2 0 2 2 2,78466 32, 737

3 0 0 2 2,78292 32,13796

2 -2 -2 4 2,75217 32,50702

0 0 4 2 2,74426 32,60332

2 -1 -4 4 2,73820 32,67747

2 2 0 4 2,69971 33,15667

3 -1 -3 4 2,69759 33,18355 1 3 4 2,69411 33,22766

-2 -3 4 2,67192 33,51166

2 2 4 2,61222 34,30092

0 -4 2 2,61018 34,32857

1 2 4 2,59139 34,58541

1 0 4 2,58999 34,60470

1 4 4 2,55873 35,04100

-2 -3 4 2,54551 35,22898

2 3 4 2,54404 35,24991

2 1 4 2,46414 36,43237

-1 -4 4 2,44902 36,66531

3 0 2 2,35973 38,10499

-2 -2 4 2,32767 38,65065

0 4 2 2,32176 38,75283

0 -2 2 2,31874 38,80530

1 1 4 2,31772 38,82317

3 1 4 2,30703 39,01032

-2 -1 4 2,30355 39,07167

-2 -4 4 2,30283 39,08438

-1 -5 4 2,30097 39,11728

-3 -1 4 2,27839 39,52090

-2 -4 4 2,27487 39,58469

-1 -5 4 2,27151 39,64563

3 0 4 2,27077 39,65907

-2 -3 4 2,25142 40,01449

2 3 4 2,24939 40,05204

1 4 4 2,20614 40,87197

-1 -2 4 2,20355 40,92216

-3 -2 4 2,19295 41 ,12888

2 2 4 2,18856 41 ,21509

0 -4 2 2,18829 41 ,22042

2 0 4 2,18772 41 ,23171

-1 -3 4 2,18705 41 ,24487

1 3 4 2, 8427 41 ,29979

3 1 4 2,17275 41 ,52890

2 4 4 2,16879 41 ,60831

-1 -5 4 2,16859 41 ,61228

3 2 4 2,16786 41 ,62688

-1 -1 4 2,13480 42,30230

0 2 2 2,13258 42,34844

-3 -1 4 2,10312 42,97079

-2 -4 4 2,10076 43,02150

1 5 4 2,09689 43,10495

-1 -4 4 2,09069 43,23919

0 0 2 2,08719 43,31522

-3 -2 4 2,07706 43,53728 3 0 4 2,05423 44,04625

1 2 4 2,04194 44,32549

-3 -3 4 2,04191 44,32613

0 -6 2 2,03690 44,44102

2 1 4 2,01612 44,92393

3 2 4 2,01489 44,95273

-2 -5 4 2,00506 45,18528

1 0 4 2,00199 45,25840

-2 -5 4 1,98548 45,65592

-3 -3 4 1,98380 45,69690

3 3 4 1,98310 45,71378

0 -6 2 1,97954 45,80066

0 -6 2 1,97817 45,83434

-1 -6 4 1,95748 46,34679

3 1 4 1,94455 46,67316

-1 -5 4 1 ,94222 46,73259

2 4 4 1,94138 46,75385

-2 -2 4 1,93962 46,79894

0 4 2 1,93555 46,90307

-2 -3 4 1,92834 47,08917

2 3 4 1,92643 47,13862

-2 -5 4 1,91564 47,42022

-1 -6 4 1,90641 47,66401

-1 -6 4 1,90518 47,69668

-2 -1 4 1,89223 48,04363

-3 -2 4 1,87535 48,50388

1 4 4 1,86703 48,73407

2 5 4 1,86568 48,77150

-3 -1 4 1 ,86266 48,85561

-3 -4 4 1,86228 48,86626

-2 -4 4 1,86131 48,89351

1 5 4 1,85776 48,99309

-3 -4 4 1,84740 49,28595

0 -2 2 1,83827 49,54725

1 1 4 1 ,83748 49,56990

-3 -3 4 1,83478 49,64793

3 3 4 1,83368 49,67962

0 -6 2 1,83168 49,73747

0 6 2 1,82951 49,80075

0 -4 2 1,82704 49,87241

2 2 4 1 ,82666 49,88361

3 2 4 1,80028 50,66584

3 0 4 1,79981 50,68000

2 0 4 1,79790 50,73774

-1 -3 4 1,79778 50,74113

1 3 4 1,79572 50,80350 3 4 4 1,78922 51,00132

-1 -2 4 1,77926 51,30747

-1 -6 4 1,77329 51,49295

1 6 4 1,77131 51,55465

4 0 2 1,76980 51,60187

-1 -4 4 1,76908 51,62454

-2 -6 4 1,76545 51,73845

-2 -5 4 1,75423 52,09423

-3 -4 4 1,75045 52,21513

4 1 4 1,74724 52,31836

-4 -1 4 1,73470 52,72556

4 0 4 1,73133 52,83614

-2 -6 4 1,72771 52,95534

-2 -6 4 ,72680 52,98560

-1 -1 4 1,71763 53,29042

0 2 2 1,71625 53,33669

3 1 4 1,70057 53,86813

-1 -5 4 1 ,69944 53,90672

2 4 4 ,69823 53,94829

-4 -2 4 1,69608 54,02211

-3 -5 4 1,69392 54,09682

2 5 4 1,69125 54,18921

-1 -7 4 1,69108 54,19489

4 1 4 ,68669 54,34788

4 2 4 1 ,68440 54,42786

-3 -5 4 1,68206 54,50961

-1 -7 4 1,68013 54,57753

2 1 4 1,67591 54,72649

0 0 2 1 ,66975 54,94516

1 2 4 1 ,66794 55,01012

3 4 4 1,65500 55,47716

-3 -2 4 1,65390 55,51703

-4 -1 4 1,65348 55,53225

-3 -3 4 1,64689 55,77391

3 3 4 1 ,64570 55,81771

-2 -3 4 1,64562 55,82063

0 -6 2 1 ,64485 55,84915

2 3 4 1,64404 55,87900

0 6 2 1,64248 55,93667

-4 -2 4 1,64073 56,00177

-3 -5 4 1,63896 56,06742

-1 -7 4 1,63562 56,19224

-2 -2 4 1,63138 56,35117

4 0 4 1,62941 56,42557

0 4 2 1,62858 56,45687

-2 -6 4 1 ,62677 56,52512 2 6 4 1 ,62525 56,58301

1 0 4 1,62516 56,58630

-3 -1 4 1 ,62423 56,62165

-2 -4 4 1,62352 56,64860

-4 -3 4 1 ,62324 56,65939

1 5 4 1 ,62060 56,76011

4 2 4 1,60956 57,18482

3 5 4 1,60734 57,27112

-1 -7 4 ,60639 57,30817

-3 -4 4 1 ,60455 57,38024

-1 -6 4 1,60217 57,47322

1 6 4 1,59998 57,55912

-4 -3 4 1,59358 57,81228

4 3 4 1,59322 57,82655

1 4 4 1,58712 58,06987

-2 -1 4 1,58349 58,21592

3 2 4 1,58219 58,26825

4 1 4 1,57302 58,64091

-2 -5 4 1,56920 58,79766

3 0 4 1,56339 59,03785

-2 -7 4 1,56261 59,07000

-2 -7 4 1,55396 59,43196

0 -4 2 1,54485 59,81773

2 2 4 1 ,54429 59,84161

-3 -6 4 1,54191 59,94356

-4 -2 4 1,53571 60,21080

-3 -5 4 1,53442 60,26657

1 7 4 1,53103 60,41363

-4 -1 4 1,52872 60,51473

-4 -4 4 1,52851 60,52394

0 -8 2 1,52498 60,67867

-4 -4 4 1 ,52025 60,88755

-2 -7 4 1,51854 60,96338

0 -2 2 1,51698 61,03271

-3 -6 4 1,51658 61,05053

1 1 4 1,51638 61,05931

0 -8 2 1,51616 61,06934

-3 -6 4 1,51596 61,07813

-4 -3 4 1,51319 61,20197

4 3 4 1,51257 61,22953

-1 -3 4 1,51024 61,33418

2 0 4 1,51016 61,33806

-1 -4 4 1,50933 61,37515

1 3 4 1,50872 61,40297

2 5 4 1,50649 61,50344

3 4 4 1 ,49652 61,95818 -2 -7 4 1 ,49506 62,02536

4 2 4 1 ,49366 62,09007

4 0 4 1,49339 62,10246

3 5 4 1,49174 62,17898

-2 -6 4 1,49166 62,18267

-1 -7 4 1,49157 62,18692

-1 -8 4 1,49078 62,22328

2 6 4 1,48989 62,26457

4 4 4 1,48733 62,38401

0 -8 2 1,48466 62,50882

-1 -2 4 1,48331 62,57221

-1 -8 4 1,48254 62,60831

3 1 4 1,48118 62,67218

-1 -5 4 1,48072 62,69367

2 4 4 1,47949 62,75186

-4 -4 4 1,46483 63,45251

0 -8 2 1 ,46062 63,65703

-3 -3 4 1,46015 63,67986

3 3 4 1,45904 63,73375

0 -6 2 1,45886 63,74255

0 6 2 1,45666 63,85023

-1 -8 4 1,45305 64,02798

-3 -2 4 1,45017 64,17003

-3 -6 4 1,44693 64,33096

3 6 4 1,44586 64,38455

-3 -4 4 1,44464 64,44527

4 1 4 1,43522 64,91979

2 7 4 1,43374 64,99512

-1 -1 4 1,43271 65,04772

0 2 2 1,43178 65,09530

-4 -5 4 1,43122 65,12385

-1 -8 4 1 ,43049 65,16140

-1 -6 4 1,42884 65,24586

1 6 4 1,42677 65,35220

-4 -5 4 1,42405 65,49281

2 1 4 1,42169 65,61510

-2 -3 4 1,41663 65,87928

-3 -1 4 1,41622 65,90063

-2 -4 4 1,41588 65,91867

5 0 2 1,41584 65,92052

2 3 4 1,41537 65,94542

1 5 4 1,41356 66,04055

4 4 4 1,40751 66,36081

-4 -2 4 1,40684 66,39668

-3 -5 4 1 ,40597 66,44291

0 -8 2 1,40574 66,45520 5 1 4 1,40421 66,53712

1 2 4 1,40336 66,58237

1 7 4 1,40288 66,60856

-4 -3 4 1,40251 66,62790

4 3 4 1,40178 66,66737

-3 -7 4 1,40123 66,69715

-2 -7 4 1,401 8 66,69978

-2 -8 4 1,40053 66,73479

-5 -1 4 1,39767 66,88894

-4 -5 4 1,39761 66,89248

5 0 4 1,39591 66,98464

-3 -7 4 1,39498 67,03543

-2 -2 4 1,39432 67,07096

-2 -8 4 1,39368 67,10576

0 4 2 1,39233 67,17963

-2 -5 4 1,39218 67,18803

0 0 2 1,39146 67,22715

-4 -1 4 1,38844 67,39312

3 2 4 1,38797 67,41877

-1 -8 4 1,37882 67,92709

4 5 4 1,37785 67,98154

-5 -2 4 1 ,37724 68,01559

-4 -4 4 1,37608 68,08057

5 1 4 1,37219 68,30019

0 8 2 1,37213 68,30382

5 2 4 1,37096 68,37016

-3 -7 4 1,36918 68,47118

-2 -8 4 1,36910 68,47589

1 4 4 1,36616 68,64389

1 0 4 1,36534 68,69093

3 0 4 1,36303 68,82355

4 2 4 1,36190 68,88850

-1 -7 4 1,36065 68,96085

3 5 4 1,36033 68,97921

-5 -1 4 1,35414 69,33989

-2 -1 4 1,35205 69,46230

-3 -7 4 1,35190 69,47100

-2 -8 4 1,35018 69,57237

4 0 4 1,34986 69,59140

-3 -6 4 1,34938 69,61938

-2 -6 4 1,34879 69,65417

3 6 4 1 ,34807 69,69667

-5 -2 4 1,34710 69,75419

1 8 4 1,34706 69,75684

2 6 4 1,34705 69,75717 Cálculos DFT em fase gás

A estrutura de INHHQ foi otimizada em fase gás, utilizando-se a metodologia DFT, nível de teoria B3LYP/6-311 + G (d,p).

Como descrito, um total de cinco conformações com a menor diferença de 5 energia PM3 foram selecionadas para realizar uma otimização DFT e cálculos de frequências. O isomerismo cis-trans foi contemplado neste tratamento. Os valores de energia encontrados para cada uma dessas estruturas indicaram que há, na verdade, apenas três conformações diferentes. O Conf. 5 é o que dá a menor energia livre (AG), quando comparado às outras conformações. No ⁾ entanto, as diferenças de energia entre as estruturas não são apreciáveis, especialmente entre a dos Conf. 1/2 em relação à do Conf. 5 (somente 0,06 kcal mol ^'1 ), indicando que, de fato, todas as cinco conformações são possíveis, particularmente a Conf. 5. Este última foi escolhida para a realização de estudos adicionais, mais aprofundados, por DFT (Fig. 4).

> Pode-se observar (Tabela 2) que há excelente acordo entre os parâmetros estruturais encontrados nos cálculos (Conf. 5) e a estrutura refinada de raios X e que, por sua vez, não existe significativa diferença entre as Figs. 1 e 4. A cristalografia mostra que o hidrogénio fenólico aponta na direção do nitrogénio quinolínico, visto que uma ligação de H envolvendo esses átomos é formada,

) gerando uma distância doador-receptor de 2,691 Á, em perfeito acordo com os dados de raios X (01 N4 = 2,689 Â).

Análise vibracional

Os espectros experimentais de FTIR e Raman de INHHQ no estado sólido são

> apresentados na Fig. 5. As frequências observadas e calculadas, bem como uma tentativa de atribuição das principais bandas, são dadas na Tabela 4. Tabela 4.Atribuição dos espectros FTIR e Raman de INHHQ (fator de escala: 0,9381)

Experimental (cm ^"1 ) Teórico (cm ^"1 ) Atribuiçãovibracional

B3LYP/6-311+G(d,p)

FTIRRaman Unscaled (cm ^" ') Scaled (cm ^'1 ) Intensidade IR

3396 m 3400 br 3662 3435 104,3584 v OH

3208 sh 3205 w -

3183 w - 3502 3285 5,5099 v NH

3148 sh - 3211/3205 3012/3007 1,8906/3,2991 v CH(Quin +Py)ip

3073sh 3081 w 3198 3000 9,2441 v CH(Quin)ip

30 ₅ 9 sh 3055 w 3185/3178 2988/2981 18,7464/9,9528 v CH(Quin + Py)op

3042 w - -

3028 sh 3030 w -

3016 w - -

- 2996 w -

2959 sh - -

2923 w - -

2852 w - 3048 2859 40,4835 vCH(Azomethine)

2835 sh - -

1656 s 1660 sh 1767 1658 350,6350 vC=0 + βΝΗ

v C=N(Azomethine) + v C=C(Quin)

1647 vs 1646 w 1673 1569 20,7477

+PC-OH v C=N(Azomethine) + v C=C(Quin)

1604 w 1603 vs 1659 1556 2,3397

+βΟ-ΟΗ

1595 w 1595 s 1634 1533 5,5690 v C=C(Quin)

1556 m 1555 w 1597 1498 18,4149 v C=N(Quin) + vC=C(Quin)

1545 m - 1630 1529 14,2312 v C=C(Py) + vC=N(Py)

1507 m 1507 w 1555 1459 371,3416 βΝΗ + pCH(Quin) 1490 w 1488 vw -

1465 m 1468 w 1541 1446 168,8474 Ring stretch(Quin) + βΟθΗ +β NH

1437 m 1435 s 1519 1425 6,8860 βΟΗ(Ργ)

1407 w - -

1394 sh 1396 m -

1371 w 1371 m 1495 1402 176,2051 β C-OH + β NH + β CH(Quin)

1330 m 1329 m - β CH(Quin + Azomethine) + v C=N(Quin)

1299 s 1304 m 1360 1276 34,4059

+ v C-OH β NH + β CH(Azomethine + Py)

1280 m 1279 sh 1347 1264 31,7632

+ β Ο-ΟΗ

1270 sh - -

1252 m 1252 s 1309 1228 15,0576 β CH(Quin + Azomethyne) + β C-OH

1232 m - 1284 1205 117,6910 v C-OH + β CH(Quin + Azomethine)

1217 w 1220 w 1278 1199 32,0853 v C=N(Py) + vC=C(Py) +β NH

1204 w 1204 v 1267 1189 56,8637 β CH(Azomethine + Quin) + β C-OH

1170 w 1 172 sh 1253 1175 303,5474 pCH(Py) + βΝΗ

1 156 m 1 156 m 1 172 1099 380,9402 v N-N + βΰΗ(Ρν + Quin)

1 136 w 1 133 1 112 1043 10,8679 UCH(Py)

1122sh - -

1 105 w 1 105 vw -

1090 w 1093 vw 1 109 1040 19,7634 βΰΗ^ + Quin)

1072 w 1076 w 1092 1024 9,3109 βΟΗ(Ρ )

- 1063 vw 1079 1012 1 1,9293 + δ ΝΝϋ

1044 v 1044 vw 1068 1002 1,6514 βΰΗ^ίη)

1007 vw - -

992 v 992 w 1010 947 1,7715 Ring breath(Py) vw - 1008 946 1,5921 yCH(Py)

vw 952 w 959 900 14,8080 yCH(Azomethine)

w 932 w 914 857 2,9777 ing-deformation(Quin + P ) w 897 vw - vw - - w 869 w 898 842 0,0665 YCH(Quin)

m 855 sh 880 826 11,8041 Ring-deformation(Quin + Py) m 835 vw 892 837 2,8606 yCH(Py)

812 vw 804 754 2,0048 γ C=C-C(Quin) + γ C=N-C(Quin) vw 780 w 789 740 5,7350 β C=C-C(Quin + Azomethine) s 768 vw 767 720 9,2858 rCH(Py)

m 720 m 734 689 18,7702 Ring-deformation(Quin) w 696 vw 763 716 38,2602 γ CH(Quin)

s - 719 674 19,3631 β C=N-C(Py) + β C=C-C(Quin) sh 668 w 698 655 2,0785 γ C=C-C(Quin) + β C=N-C(Py) w 657 w 693 650 58,0279 Ring-deformation(Py)

sh - 681 639 1,5003 Ring-deformation(Py)

vw - 627 588 2,3638 Ring-deformation(Quin) m - 604 567 90,9456 γ ΟΗ

w - - sh 553 w 588 552 10,5255 β C=C-C(Quin)

sh 533 vw ₅₅ 9 524 1,6705 β C=C-C(Quin) + γ NH w 523 vw 551 517 14,1393 YCH(Quin) + β C=C-C(Quin) + β C-OH w 485 w 539/534 506/501 16,0281/30,1104 γ NH + γ C=C-C(Quin)

Quin: anel quinolínico; Py: anel piridínico; vs: muito forte; s: forte; m: média; w: fraca, vw: muito fraca, br: larga; sh: ombro; ip: em fase; op: for a de fase; v: estiramento; β: deformação angular no plano; γ: deformação angular for a do plano. Vibração C=0 carbonílico

A absorção de v C=0, geralmente, é uma das mais representativas em um espectro de infravermelho e sua forte intensidade é bastante característica. Ela aparece em uma região espectral (1800-1600 cm ^"1 ) relativamente livre de outras vibrações. Por outro lado, este modo dá apenas absorções fracas ou muito fracas no Raman. Em nosso estudo, como esperado, a vibração v C=O origina uma das bandas mais fortes do espectro de infravermelho de INHHQ, a 1656 cm ^"1 , em excelente concordância com o valor calculado, de 1658 cm ^"1 (cálculos DFT mostram um acoplamento entre v C=O e vibrações β NH).

Este modo foi designado em 1663 cm ^"1 por Liu e Yang.

Vibrações C=N azometina

Os estiramentos C=N de grupos azometina mostram absorções próximas à do estiramento do grupo carbonílico. Este fato pode dificultar uma atribuição exata da banda. Por exemplo, as bandas de estiramento C=N de bases de Schiff alquiladas são encontradas geralmente na faixa de 1674-1649 cm ^"1 , dentro da região comum de absorção para o v C=O. Se conjugações da ligação C=N com grupos fenil existirem, a frequência de estiramento muda para 1650-1600 cm ^"1 . Neste trabalho, um par de frequências envolvendo as vibrações C=N do grupo azometino foram calculadas (1569 / 1556 cm ^"1 ), ambas acopladas às vibrações v C=C do anel quinolínico e, em menor extensão, ao v C-OH do fenol. Estes valores estão de acordo com as frequências experimentais observadas no infravermelho, em 1647 (vs) e 1604 (w) cm ^"1 , assim como no espectro Raman, em 1646 (w) e 1603 (vs) cm ^"1 , respectivamente.

Liu e Yang, no entanto, atribuíram este modo a uma única banda em 1613 cm ^'1 no espectro IR, que não foi observada em nosso estudo.

Estiramentos OH e NH

Os grupos OH e NH são muito característicos e suas vibrações de estiramento são observadas, em muitos casos, entre 3500 e 3300 cm ^"1 . Esta absorção, no entanto, é altamente influenciada pelo ambiente químico, principalmente quando os grupos OH ou NH estão envolvidos em ligação de hidrogénio. Isto pode ocorrer dentro da mesma molécula (ligações de H intramoleculares) ou com moléculas vizinhas (ligações de H intermoleculares). A presença de ligação de H intramolecular provoca uma diminuição da largura da banda e faz com que a sua posição não seja afetada por uma variação de concentração. No espectro IR de INHHQ, observamos uma banda fina de média intensidadea 3396 cm ^"1 , a qual foi atribuída a v OH. Uma absorção similar, em 3418 cm ^"1 , foi relatada por Krishnakumar e Ramasamy no espectro IR da 8-hidroxiquinolina. Por outro lado, uma ligação intermolecular de H geralmente conduz a um alargamento da banda, como pode ser visto, para INHHQ, no caso da absorção v NH (atribuída no FTIR a uma banda fraca em 3183 cm ^"1 ). Em estudo anterior sobre a 2-hidroxi-3-metoxibenzaldeído isonicotinoílhidrazona, publicado por nosso grupo de pesquisa, a vibração v NH foi observada como uma banda fraca localizada a 3157 cm ^"1 . Aqui, encontramos sérias discrepâncias a respeito das atribuições feitas por Liu e Yang, uma vez que estes autores atribuíram uma absorção de maior frequência (identificada por eles em 3576 cm ^"1 ) para o modo de estiramento NH, enquanto que a frequência mais baixa a 3193 cm ^'1 foi creditada ao v OH.

Vibrações C-OH fenol

Neste trabalho, o modo de estiramento C-OH foi atribuído à banda no IR de média intensidade em 1232 cm ^"1 . Essa vibração é inativa no Raman e teve sua frequência calculada como 1205 cm ^"1 . Um modo acoplado envolvendo esse estiramento foi também predito em 1276 cm ^"1 [experimental: 1299 (FTIR) e 1304 (Raman) cm ^"1 ].

Outra vibração importante relacionada ao grupo fenol é a deformação angular no plano, que aparece tipicamente na região de 1440-1260 cm ^"1 , atribuída a uma banda de fraca intensidade no espectro infravermelho de INHHQ (média no Raman) a 1371 cm ^"1 . Modos acoplados são observados no FTIR em 1465, 1280, 1252 e 1202 cm ^"1 . As frequências teóricas mostram boa concordância com os valores experimentais (Tabela 4). Estudos de atividade biológica

Este composto tem a habilidade, comprovada em experimentos de RMN uni- e bidimensionais, de competir com o peptídeo Ap(Fig. 6) ou com a proteína o Sinucleína (Fig. 7), alvos-chave, respectivamente, nas doenças de Alzheimer e Parkinson, por íons metálicos fisiológicos (tais como Zn ²⁺ , Cu ²⁺ e Cu ⁺ ) que, acredita-se, causam a sua precipitação e contribuem para o estresse oxidativo observado no cérebro dos pacientes vítimas destas desordens. O composto é de interesse porque não interage diretamente com o peptídeo Αβ e a a-Sinucleína, mas inibe a interação desses alvos com metais por um mecanismo que envolve, provavelmente, o sequestro destes últimos.

Análises farmacológicas in silico (estudos de fundamental importância para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, os quais têm como objetivo prever características farmacocinéticas de novas moléculas com possíveis ações farmacológicas) mostram que os parâmetros de Lipinski apresentados pelo composto INHHQ (Tabela 5), calculados via método 1 D-QSAR, estão em concordância com os valores ideais, sugerindo que essa substância é um ótimo candidato a novo fármaco, com boa absorção por via oral e permeabilidade celular. Os estudos também indicam que o composto possui características estruturais que lhe permitiriam atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), proporcionando assim ações terapêuticas no cérebro dos pacientes.

Tabela S.Parâmetros de Lipinski calculados para INHHQ, junto com valores de referência

Parâmetros INHHQ Ref. VO Ref. Abs. BHE

HBD 2 < 5 < 3

HBA 6 < 10 < 7

PM 292 < 500 < 400 log P 2,34 -1 a 5 -1 a 5 log D (pH = 7,4) 2,27 -1 a 5 -1 a 5 log S -3,36 -4 a 2 -A a 2

PSA 66,077 A ≤ 140 Â < 90 A

Ligações rotáveis 4 < 10 < 10

Além disso, tanto a molécula de INHHQ quanto os seus potenciais metabólitos se mostraram, em uma comparação teórica com fragmentos tóxicos de mais de 3000 fármacos comerciais, completamente atóxicos.

De fato, a injeção intraperitoneal de até 300 mg/kg do composto, utilizando-se como veículo solução salina 10% de DMSO, em ratos Wistar machos albinos (teste de toxicidade aguda) mostrou que INHHQ, aparentemente, não foi tóxica para os animais durante as 72 h de duração do experimento: nenhum animal morreu e não foram notadas alterações comportamentais nos ratos injetados. Além disso, após o sacrifício dos animais, não foram observadas anomalias macroscópicas durante a dissecção dos órgãos destes.