本发明涉及一种多肽药物的制备方法， 尤其涉及醋酸阿托西班的制备方法。

背景技术

阿托西班， 英文名: Atosiban, 阿托西班是一个九肽， 肽链中包含三个非天然氨基酸 D-Tyr(Et),Mpa和 Orn及一对在 Mpa与 Cys之间成环的二硫键,其结构式：

c[Mpa-D-Tyr(Et)-IIe-Thr-Asn-Cys]-Pro-Om-Gly-NH

阿托西班是一种可以直接与催产素竞争催产素 受体， 抑制催产素和催产素受体结 合，从而直接抑制催产素作用于子宫，抑制子 宫收縮； 也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作 用， 阻断第二信使的生成以及 Ca ²⁺ 的活动， 从而间接抑制子宫对催产素的反应， 使子 宫收縮得到抑制。

目前国内外均有报道关于阿托西班合成工艺方 法； 国内最近也用相关报道,采用固 相氧化,简化了工艺,但所得粗品纯度低,收率不 高， 应用价值不高。 国外关于阿托西班合 成工艺的报道， 大多是采用 Boc固相合成路线，液氨切肽， 再采用液相氧化,纯化得醋酸 阿托西班,其操作复杂， 产生大量三废，不利于工业生产,见专利 US4504469。

发明内容

本发明提出了一条较适当的路线，使用合成线 性阿托西班，且通过液相氧化得到阿 托西班， 该方法解决了线性阿托西班难溶问题,最大可� �的縮小了反应体积及减少了反 应时间 ，该方法收率高,易工业化。

为实现上述目的， 本发明采取以下技术方案： 一种制备醋酸阿托西班的方法， 包括以下步骤：

合成获得线性阿托西班；

将线性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用氨水调 节 pH,加入 H ₂ 0 ₂ 氧化， 过滤,纯化， 转盐,得到醋酸阿托西班。

所述的 "合成获得"， 是指液相合成法或固相合成法获得线性阿托西 班。 优选固相 合成法， 由 Fmoc-Gly -OH和合适替代度的氨基树脂出发， 然后采用逐一偶联的方式合 成得到线性阿托西班- 树脂； 然后用 TFA和 H ₂ 0混合的裂解液将线性阿托西班- 树脂 加入进行裂解切割， 沉淀得到线性阿托西班； 其中， 氨基树脂优选 Rink amide树脂,其 替代度优选为 0.4mmol/g — 1.0mmol/g。所述固相合成法采用的偶联剂包括 DIC/HOBt、 PyBOP/HOBt、 HATU/HOBt或 HBTU/HOBt， 优选 DIC/HOBt。 实验发现， 本发明的偶 联剂能够明显提高反应速率，同时 DIC/HOBt偶联体系极大的降低生产成本。 其中 "/" 表示"和"的含义。所述裂解切割线性阿托西班- 树脂是由线性阿托西班- 树脂经过体 积比为 TFA:H ₂ 0=95:5 的混合裂解液切割。 裂解液用量是每克线性阿托西班-树脂用 10- 15ml的裂解液。

线性肽氧化可采用液相氧化或固相氧化，传统 的液相反应体积大,时间长，不易操作; 固相氧化一般采用碘氧化,固相法可以操作方� �， 但易产生三废。

本发明采用了 H ₂ 0 ₂ 为氧化剂的液相氧化， 本发明直接简化了生产工艺， 最大可能 的减少了反应体积及氧化时间。

将得到的线性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用 氨水调节 ΙΉ值,加入 H ₂ 0 ₂ 氧化后过 滤,再经过纯化、 转盐， 冻干得到醋酸阿托西班。

液相氧化采用乙腈的水溶液， 乙腈占的体积的 5%-15%,优选 10%。 线性阿托西班 不易溶于水中，采用水为溶剂时反应体积大,� �发明采用乙腈的水溶液极大的提高了线 性阿托西班的溶解度，可以使反应体积减半。

液相氧化采用线性阿托西班浓度为 0.01-0.03g/ml,优选 0.02g/ml。 线性阿托西班浓 度直接影响氧化时多聚体的产生,浓度小于 O.Olg/ml给工业化带了操作上的不方便,浓度 大于 0.03g/ml时,发现性肽分子间发生聚合,并且不易� �滤。

液相氧化采用 ¾0 ₂ 为氧化剂， ¾0 ₂ 用量与线性阿托西班的摩尔比为 2-8， 即氧化 剂 ¾0 ₂ 用量是线性阿托西班摩尔数的 2至 8倍,优选 5倍。 实验证明适量的 H ₂ 0 ₂ 可以 加快氧化速度，并减少聚合物的产生。

液相氧化采用 H ₂ 0 ₂ 为氧化剂， 反应时间在 5-60分钟， 优选 30分钟。 实验发现, 在氧化时间小于 5分钟,线性肽还有大量未氧化成环肽,而氧化时 间大于 60分钟,则发现 部分线性肽之间成环,形成聚合物。本发明的� �化时间优选 30分钟,粗品纯度大于 85%。

液相氧化采用 H ₂ 0 ₂ 为氧化剂， 反应温度在 10°C— 40°C。 优选 25°C。 实验发现反 应温度低于 10°C时,氧化反应收率不及 50%,而反应温度大于 40°C时,发现氨基酸极易发 生消旋，产生难以分离的杂质肽。本发明的氧 化反应温度优选为 25°C,在减少了氨基酸消 旋的同时,还提高了氧化收率及反应速率。

液相氧化采用 30%的氨水调节溶液 ΡΗ,ΡΗ值范围在 8-9。

液相氧化完毕后直接后硅藻土过滤后再经滤液 膜过滤,滤液用制备型反相 HPLC(C18或 C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿托西班。

本发明采用了 H ₂ 0 ₂ 液相氧化线性阿托西班,避免了传统的液� �氧化带来操作上的 繁琐,并提高 20%-30%的氧化收率。 本发明工艺具有反应操作简单、 原料投入少、 成本 低、 收率较高等特点并且大幅度的减少了粗品不溶 物的产生， 反应的合成收率可达 , 具有可观的经济实用价值。 本发明中涉及的縮写具有以下含义：

Fmoc-:¾ "甲氧幾基

Gly:甘氨酸

Orn:鸟氨酸

Pro:脯氨酸，

Cys:半胱氨酸

Asn:天冬酰胺

Thn苏氨酸

He:异亮氨酸

Tyn酪氨酸

Mpa:巯基丙酸

Boc:叔丁氧羰基

Trt:三苯甲基 tBu:叔丁基

Et:乙基

HOBt: 1-羟基苯并三氮唑 DIC: 二异丙基碳二亚胺 TFA:三氟乙酸

PyBOP:六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯垸基磷

HBTU: 苯并三氮唑 -N， N， N，， N，-四甲脲六氟磷酸酯 H ₂ 0 _2: 双氧水

DMF:N,N-二甲基甲酰胺

DCM:二氯甲烷 具体实施方式

实施例 1、 线性阿托西班肽树脂制备

①将 6.25g Rink Amide树脂 （替代度 =0.8mmol/g) 于反应瓶中， 加入 DMF洗涤 两次，再用 DMF溶胀 30分钟。用 30-40ml 20 DBLK脱除 Rink Amide树脂的 Fmoc 保护基， 脱除完毕用 DMF洗涤 4次， DCM洗涤 2次， 并用茚三酮检测法进行检测， 树脂呈红褐色。

②称取 4.46g Fmoc-Gly-OH和 2.43g HOBt, 加入适量 DMF 禾卩 3.05ml DIC， 溶 解，加入反应瓶中，反应 2h，并用茚三酮检测法进行检测树脂呈阴性,结 束反应， DMF 洗涤 4次, DCM洗涤 2次,假若树脂呈阳性则重复上面縮合反应直到� ��应呈阴性。

③ 依 次 偶 联 Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-IIe-OH, Fmoc-D-Tyr(ET)-OH, Mpa(Trt)-OH。

实施例 2、 线性阿托西班肽树脂的切割

将实施例 1中得到的线性阿托西班肽树脂,用 30ml甲醇洗涤 3次,干燥， 将得到的干 燥树脂加入到 150ml的体积比为 TFA:H ₂ 0=95:5的混合液中,在 25°C下反应 2小时， 过 滤， 树脂用少量三氟乙酸洗涤 3次， 合并滤液， 将滤液倒入 1500ml冰乙醚中， 静置 2 小时， 离心分离出线性阿托西班， 洗涤 3 次， 置于真空干燥器干燥得线性阿托西班 5.15g,MS:995.3, HPLC:91.5%,含量 65.5%,合成收率 68%。

实施例 3、 线性阿托西班肽树脂的氧化

将实施例 2中得到的线性阿托西班溶解在 250ml的 5%乙腈的水溶液中，用 30%的 氨水调节 pH在 8-9,滴加 0.60g H ₂ O ₂ ,在 25°C下反应 10分钟，用 HPLC监测， HPLC:75.6 , 反应结束后过滤，滤液用制备型反相 HPLC(C18或 C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿 托西 iff ,得 2.85g,MS:994.5,HPLC:99.4 。

实施例 4、 线性阿托西班肽树脂的氧化

将实施例 2中得到的线性阿托西班溶解在 250ml的 10%乙腈的水溶液中， 用 30% 的氨水调节 pH 在 8-9,滴加 0.85g H ₂ 0 ₂ ,在 25 °C下反应 30 分钟，用 HPLC 监测， HPLC:89.5 , 反应结束后过滤，滤液用制备型反相 HPLC(C18或 C8柱)进行纯化,转盐, 冻干得醋酸阿托西班，得 3.01g,MS:994.5,HPLC:99.6%。

实施例 5、 线性阿托西班肽树脂的氧化

将上述实施例 2中得到的线性阿托西班溶解在 250ml的 10%乙腈的水溶液中， 用 30%的氨水调节 pH在 8-9,滴加 0.85g H ₂ 0 ₂ ,在 25°C下反应 60 分钟，用 HPLC 监测， HPLC:83.5 , 反应结束后过滤，滤液用制备型反相 HPLC(C18或 C8柱)进行纯化,转盐, 冻干得醋酸阿托西班，得 2.95g,MS:994.5,HPLC:99.4%。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本 发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本 发明的保护范围。