本发明属于天然药物化学领域， 具体涉及一种苯并吡喃化合物的制备方法和抗 肺纤 维化的用途。

背景技术

目前， 关于苯并吡喃 benzopyran类化合物， 即厦门霉素， 已有一些文献报道， 如 日文专禾 U [Kawamura, N.； Tsuj i, E.； Watanabe, Y.； Tsuchihashi, K.； Takako, T. Benzopyran derivatives, their manufacture with Streptomyces species, and their use for treatment of asthma and rheumatoid arthritis. Dai ichi Seiyaku Co. , Ltd.； Mercian Corp.： Kyoto, Japan, 7 March 2000. ] 禾口文献 [Xu, M. J.； Liu, X. J.； Zhao, Y. L.； Liu, D.； Xu, Z. H.； Lang, X. M.； Ao， P.； Lin, W. H.； Yang, S. L.； Zhang, Z. G.； Xu, J. , Identification and characterization of an anti-f ibrotic benzopyran compound isolated from mangrove-derived Streptomyces xiamenensis. Mar Drugs 2012, 10， （3)， 639—54; Liu, X. J.； Xu, M. J.； Fan, S. T.； Wu, Z.； Li, J.； Yang, X. M.； Wang, Y. H.； Xu, J.； Zhang, Z. G.， Xiamenmycin attenuates hypertrophic scars by suppressing local inflammation and the effects of mechanical stress. Invest Derma tol 2013, 133， （5)， 1351—60· ] 中， 曾报道了 厦门霉素的提取分离和结构鉴定， 并报道了其具有抗炎、 抗纤维化活性和抗增生性瘢痕 活性的报道。

基因工程菌株 CGMCC No. 5675 为携带利福霉素和链霉素抗性的 Streptomyces xiamenensis,未见从该菌株中分离得到苯并吡喃类 化合物的文献报道。由于厦门霉素 C (本发明的苯并吡喃化合物的俗称）相比厦门� �素本身， 失去了氨基酸侧链， 为新颖结 构化合物。首次对该化合物的抗肺纤维化活性 进行测定，发现优于已知化合物厦门霉素。 发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制正常人肺成纤 维细胞的增殖能力更强、抗肺纤维化 活性更高的苯并吡喃化合物的制备方法和抗肺 纤维化的用途。本发明首次发现基因工程 菌株 -厦门链霉菌 Streptomyces xiamenensis) CGMCC No. 5675的提取物中能够产生 该苯并吡喃化合物。

所述厦门链霉菌 iStreptomyces xiamenensis 已于 2011年 12月 29日递交 CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西 路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所， 菌种保藏编号为 CGMCC No. 5675。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面， 本发明涉及一种苯并吡喃化合物， 其结构式如下式 （ I ) 所示：

( I )； 其中， Rl选自氢、 C1〜C4垸基、 各种氨基酸 去掉氨基部分后余下的基团中的一种， R2选自氢、 C1〜C4垸基、 各种氨基酸去掉氨基 部分后余下的基团中的一种， R3选自氢、 C1〜C4垸基中的一种， n为 1〜4中任一整数。

优选地， R1选自氢或者甲基， R2选自氢或者甲基， R3选自氢或者甲基， n=l或 2。 优选地， 所述苯并吡喃化合物的结构式如下式 （Π)所示：

(Π)。

第二方面， 本发明涉及一种上述的苯并吡喃化合物的制备 方法， 厦门链霉菌 ( Strep tomyces xiamenensis) CGMCC No. 5675的发酵液经提取， 分离， 纯化， 制得所 述苯并吡喃化合物。

优选地， 所述方法具体包括如下步骤：

A、 所述厦门链霉菌 (.Streptomyces xiamenensis) CGMCC No. 5675进行液体发酵 培养， 发酵液经提取， 浓缩， 得总提物；

B、 以氯仿-甲醇为洗脱剂， 所述总提物经硅胶柱层析梯度洗脱； 所述梯度洗脱采用 的氯仿与甲醇的体积比依次为 100:1、 70:1、 60:1、 50:1、 30:1、 15:1、 10:1、 5:1、 2:1、 1:1; 流速为 15 秒 /滴， 每个洗脱流份分别接收 200毫升；

C、 以甲醇为洗脱剂， 将所述步骤 B中氯仿与甲醇的体积比为 15:1时洗脱得到的组 分凝胶柱层析分离， 流速为 70〜90 秒 /滴， 纯化， 即得所述苯并吡喃化合物。

优选地， 步骤 C还包括： 将所述氯仿与甲醇的体积比为 15:1的洗脱组分的相邻组 分进行高效液相色谱分析， 以所述苯并吡喃化合物在 206nm， 260nm的紫外吸收为准， 合并具有相同吸收的组分； 合并后的组分继续纯化， 即得所述苯并吡喃化合物。

优选地， 步骤 A中， 所述提取具体为： 发酵液离心后上清液用乙酸乙酯萃取， 残渣 用等体积的混合溶剂提取， 合并所述上清液的萃取液和残渣的提取液， 即可； 所述混合 溶剂是体积比为 80 : 15 : 5的乙酸乙酯、 甲醇、 甲酸的混合物。

优选地， 步骤 C中， 所述纯化具体为： 将洗脱下来的组分收集， 用高效液相进行纯 化， 以乙腈 /水溶液为流动相， 洗脱梯度为乙腈与水的体积比在 35分钟内由 45 : 55变成 55 : 45。

第三方面，本发明还涉及一种前述的苯并吡喃 化合物在制备抗肺纤维化药物中的用 途。

优选地， 所述抗肺纤维化药物用于治疗急性呼吸窘迫综 合征、 急性间质性肺炎或特 发性肺纤维化慢性型的急性恶化症。

第四方面， 本发明还涉及一种抗肺纤维化药物组合物， 其中含有前述的苯并吡喃化 合物， 或者其药学上可接受的酸或碱的盐， 或者溶剂化合物作为有效成分。

优选地， 所述药物组合物为口服制剂或注射制剂。

本发明具有如下的有益效果：

1、 本发明是从基因工程菌株 -厦门链霉菌 Streptomyces xia垂 ensis CGMCC No. 5675的提取物制得苯并吡喃化合物， 且药物成分天然；

2、 本发明的苯并吡喃化合物具有可抑制正常人肺 成纤维细胞的增殖和活力， 其抗 纤维化活性的有效浓度高达 15 g/ml， 且毒性较低；

3、 现有抗纤维化药物多为激素类， 长期使用具有很大的副作用， 而本发明的苯并 吡喃化合物是区别于激素类药物的活性小分子 ， 具有良好的市场应用和推广前景。 附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作 的详细描述， 本发明的其它特 征、 目的和优点将会变得更明显：

图 1为本发明的苯并吡喃化合物-厦门霉素 C的结构图；

图 2为在苯并吡喃化合物-厦门霉素 C抑制人肺成纤维细胞增殖实验中的 CCK-8试 剂染色后的定量示意图。

图 3为在厦门霉素抑制人肺成纤维细胞增殖实验� �的 CCK-8试剂染色后的定量示意 图。 具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细 说明。 以下实施例将有助于本领域的 技术人员进一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 应当指出的是， 对本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进。 这些 都属于本发明的保护范围。

实施例 1、 苯并吡喃化合物的分离精制

耳又 S. xiamenensis M6菌株 (即厦门链霉菌 ( Streptomyces xiamenensis) CGMCC No. 5675) 进行液体发酵培养 （30升）， 7天， 离心后上清液用乙酸乙酯萃取 3次， 残渣用 等体积的乙酸乙酯： 甲醇： 甲酸 =80: 15： 5 (体积比） 的混合溶剂提取 3次， 每次 12 小时。 将提取液合并， 浓缩， 得总提物 13.4克。 取总提取物用适量氯仿-甲醇混合溶剂 溶解后加 10克 200-300 目硅胶 G (青岛海洋化工集团公司产品） 拌样， 上到装填有 50 克正相硅胶玻璃减压柱上， 以氯仿 -甲醇 〔100:1， 70:1， 60:1， 50:1， 30:1， 15:1， 10:1， 5:1， 2:1， 1:1， （体积比） 至甲醇〕 梯度洗脱， 流速为 15 秒 /滴， 150〜100 毫升 /瓶接 收，洗脱溶剂的极性通过提高氯仿中甲醇的用 量来梯度递增，每个洗脱流份分别接收 200 毫升， 根据薄层层析检测合并流份。 取氯仿-甲醇体积比为 15:1的组分继续用凝胶柱层 析进行分离， 采用 S印 hadex LH-20为填料， 甲醇为洗脱剂， 流速为 70〜90 秒 /滴， 5〜 6 毫升 /管 接收， 将得到的组分进行合并后， 采用高效液相进行分离， 采用乙腈 /水溶 液为流动相， 洗脱梯度为 45%乙腈-水溶液在 35分钟内变成 55%乙腈-水溶液（体积比）， 采用半制备 C18色谱柱， 得化合物 1。 然后将除氯仿-甲醇体积比为 15:1的组分外的其 余组分（尤其是氯仿-甲醇体积比为 15:1对应的洗脱组分的相邻组分）进行高效液� �色 谱分析， 以该化合物在 206nm， 260 nm的紫外吸收为准， 合并具有相同吸收的组分。 最 后， 将合并后的组分同样采用高效液相进行纯化， 采用乙腈 /水溶液为洗脱剂， 洗脱梯 度为 45%乙腈-水溶液在 35分钟内变成 55%乙腈-水溶液 （体积比）， 采用半制备 C18色 谱柱， 该步骤为关键步骤， 由于厦门霉素 C与其类似物厦门霉素的色谱特点非常相似， 因此分离具有难度， 须采用如上半制备高效液相的方法才能得到纯 品。 得到如图 1所示 的苯并吡喃化合物 （化合物 1， 厦门霉素 C) 1.5毫克。

化合物 1 的理化性质： 黄色无定型粉末； [ct ] ²⁶ _D +28.45° (c 0.0034， MeOH)； UV (MeOH) λ _ΜΧ = 206, 260 nm; CD (c 0.0024, MeOH) Δ ε ₂₀₁ +12.3, Δ ε ₂₀₂ +9.6, Δ ε +8.0， Δ ε ₄ +7.1， Δ ε ₂₁₃ · ₆ +0.14， Δ ε ₂₁₇ —1· 2， Δ ε ₂₄₅ · ₂ +2.0， Δ ε ₂₅₉ . ₈ + 3.14， Δ ε ₂₈₃ +0.03; ¾ and ¹³ C匪 R data, see Table 2; HRESIMS m/z 290.1768 [M + H] ⁺ ， (calcd C ₁₇ H ₂₄ N0 ₃ ， m/z 290. 1756 )， 288. 1610 [M (calcd for C ₁₇ H ₂₂ N0 ₃ 2073 ).

表 1

化合物 1

δ„ (/ in Hz) δ c, type HMBC相关

1

2 79.7 C

3 3.74， dd (7.4， 5.2) 66.3， CH 4a, 2, 9， 15

2.66， dd (17.3， 7.4) 8a, 5， 4a, 2, 3， 6

4 31.3， CH ₂

2.93， dd (17.3， 5.2)

4a 120.4， C

5 7.63, d (1.8) 130.2, CH 7， 8a, 4， 1' 6 126.3， C

7 7.60, dd (8.4, 1.8) 127.4， CH 5， 8a, 1' 8 74, d (8. 116.5， CH 4a, 8a, 6

8a 156.0, C

9 1. 59， m 38.0， CH ₂ 11， 12, 2, 3， 10 2. 10, m 21.6， CH ₂ 11， 12, 2, 9 11 10, t (7. 124.8， CH 13， 10， 14， 12 131.3, C

13 1. 56， s 18.0， CH ₃ 11， 12, 14 14 1. 63， s 25.9， CH ₃ 11， 12, 13 15 1. 16， s 18.8， CH ₃

1' 168.0, C

2'

3'

4'

5'

6'

本表 1信号归属基于 DEPT、 ¾-¾ COSY, HMQC及 HMBC图谱解析结果。 碳信号的多 重度利用 DEPT方法确定并分别用 C (单重峰）、 CH (二重峰）、 CH ₂ (三重峰)和 CH ₃ (四 重峰)表示。

实施例 2、 苯并吡喃化合物抑制人肺成纤维细胞的增殖和 活力实验

材料如下：

细胞： 人肺成纤维细胞 （human lung fibroblasts, WI26 药物： 由上述实

施例得到的化合物 1 (厦门霉素 C)， 化合物 2 (厦门霉素） 其 中， 采用化合物 1的为药物处理实验组， 采用化合物 2为药物处理对比组。

方法： 将生长至 70-80%融合之 WI26细胞 0. 25%胰酶消化后接种于 96孔板， 每孔 1 X 10 ³ 个细胞。 24小时后换液并加药， 药物处理实验组化合物 1终浓度为 15 g/ml， 溶 剂 DMS0浓度为 1/1000， 对照组为 DMS0, 终浓度为 1/1000。 药物处理对比组化合物 2 终浓度为 30 μ _δ /πι1 , 溶剂 DMS0浓度为 1/1000， 对照组为 DMS0, 终浓度为 1/1000。 加 药 0， 1， 2 , 3， 4， 5， 6天后分别测量细胞活力。 测量方法为， 吸出培养基， 每孔加入 完全培养基 100 μΐ及 CCK-8试剂 10 μ1， 培养箱孵育 60分钟后酶标仪测量光吸收值， 波长为 450nm。 实验重复 3次。

实验结果如图 2所示， 由附图可得知： 化合物 1能够抑制人肺成纤维细胞的增殖。 当给药量为 15 g/ml , 给药一天后， 给药组与对照组相比具有显著性的差异， 抑制率 达到 13. 8%。 给药六天后， 抑制率为 38%。 因此， 本发明的苯并吡喃化合物可用于制备 抗肺纤维化药物。 实验组与对比组相比， 化合物 1的有效浓度降低一倍， 同时抑制率比 化合物 2提高近 10%， 因此活性大大优于已知化合物。 此外， 从化合物 1对于人肺成纤 维细胞的增殖抑制效果的时间曲线上判断， 化合物 1与厦门霉素均具有低毒性的特点。 通过改变侧链的结构， 使得化合物 1的活性提升而毒性相对较低， 属于本领域的难点。 根据化合物 1的活性实验结果， 本领域技术人员可知， 对该化合物 1氨基进行修饰产生 的化合物以及 n指代的碳链加长形成的化合物（SP : 权 1限定的化合物）也必然具有相 当的活性。

对比组实验结果如图 3所示， 由附图可得知： 化合物 2虽然能够抑制人肺成纤维细 胞的增殖。 但药量为 30 g/ml , 给药一天后， 给药组与对照组相比具有显著性的差异 抑制率达到 10%。 给药六天后， 抑制率为 28. 5%。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。 需要理解的是， 本发明并不局限于上述特 定实施方式， 本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出 各种变形或修改， 这并不影 响本发明的实质内容。 中謁 H生物菌种保藏管理委、¾会

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