本发明涉及一种融合蛋白， 具体地说是一种结核分枝杆菌融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的 构建、 表达和纯化方法， 以及该融合蛋白在结核亚单位疫苗中的应用。

背景技术

结核病是全球传播范围最广、 持续时间最久、 危害最为严重的传染病。 自上世纪 80年 代以来结核病死灰复燃， 发病率和死亡率据各类传染病首位和第二位。 据估计， 每年有 2百 万人死于结核病感染； 更为严重的是每年有大约 20亿人处于结核分支杆菌感染的潜伏期， 其 中有 5-10%潜伏期结转变成活动期结核。 我国是结核病高负担的国家之一， 发病率约达到全 国总人口的 1%。。 由于细菌变异， 部分结核病患者使用常规化学药物治疗不能治 愈， 持续排 菌， 对个人健康和公共卫生造成了极大的威胁。 因此， 研制和开发抗结核疫苗尤其是针对休 眠期结核的疫苗是控制结核病的重要途径。

目前研制成功的唯一的结核病疫苗——卡介苗 （BCG)， 虽然已在全球范围内广泛使用， 然而不同研究显示， BCG在不同人群中的保护性不稳定， 尤其是对成人肺结核的保护效率介 于 0-80%不等。 现阶段进行研究的结核病疫苗主要有以下几种 ： （1 ) 重组 BCG; (2 ) 结核杆 菌减毒活疫苗； （3 ) 结核亚单位疫苗。 其中结核亚单位疫苗包括蛋白疫苗、 DNA疫苗和以病 毒为载体的疫苗三种形式， 其中蛋白疫苗因成份明确、 相对安全， 更易于被人们接受。

大量研究表明， 利用基因工程技术将具有不同优势的单个结核 菌保护性抗原进行重组， 可构建成具有较强免疫原性和更好保护效应的 融合蛋白。 因此， 抗原选择是构建结核亚单位 疫苗的首要步骤之一。

发明内容

本发明的目的在于构建并表达纯化融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3， 针对结核分枝杆菌各生 长期的免疫应答， 尤其是对休眠状态细菌建立有效的免疫应答， 并且提高单个抗原的保护效 果； 融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3 ( MH ) 和佐剂 （DDA+TDM ) 混合作为结核亚单位疫苗， 能 诱导较强的 Thl型细胞免疫为主的细胞免疫反应和体液免疫 反应，具有较好的动物保护效果， 作为后期临床研究尤其是针对休眠期结核的候 选亚单位疫苗。

本发明所选用的结核杆菌抗原 Mtbl0.4、 Hspl6.3均有较强的免疫保护性，分别主要表达 于生长期和休眠期且具有不同的免疫优势。 两抗原主要特性如下： （l ) Mtbl0.4: Mtbl0.4抗 原是结核分支杆菌早期分泌性蛋白， 属于 ESA T-6 蛋白家族， 该家族包括 ESAT-6, CFP-10, TBI 0.4, TB10.3等蛋白。 相关研究证明 Mtbl0.4抗原是重要的结核分枝杆菌免疫保护性� �原， 是理想的构件结核疫苗的候选抗原。 Mtbl0.4抗原对 BCG接种的健康者和结核分枝杆菌感染 的患者均可诱导强烈的细胞及体液免疫反应， 与 ESAT-6 抗原相比是更好的结核疫苗候选抗 原。 将其免疫小鼠， 可获得明显的特异性体液和细胞免疫反应， 此外小鼠在用气雾攻击结核 杆菌 H37Rv毒株后，可获得接近 BCG的免疫保护效果。 （2 ) Hspl6.3: 是热休克蛋白 （Hsp) 的一种， 在细菌休眠期和缺氧环境下高表达， 对于结核菌在巨噬细胞内的持续存在起重要作 用。 Hspl6.3能够激起 Thl型细胞反应,刺激高水平的 IF -γ的分泌。 在健康的与肺结核密切 接触的家人 （80%) 和医务工作者 （90%) 中， 具有较高比例的 HspX T细胞刺激活性， 比例

说

明显高于普通人群 （50%), 提示 Hspl6.3抗原具有免疫保护作用。

本发明的技术方案为- 书

结核分枝杆菌融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的构建、 表达和纯化方法为：

首先，将 Mtbl0.4和 Hspl6.3基因进行 PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中 , 构建重组载体；

然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋 白 Mtbl0.4-Hspl6.3;

最后根据融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的分子量、 电荷和亲和力进行纯化， 通过纯化得到 融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3。

所述的融合蛋白 Mtbl0.4- Hspl6.3的构建方法包括以下步骤：

( 1) 根据 GenBank中 H37Rv中的 Mtbl0.4和 Hspl6.3的基因序列， 设计引物；

( 2) PCR扩增 Mtbl0.4基因： 由于 Mtbl0.4基因后面要融合 Hspl6.3, 所以设计引物时 把 MtblO.4终止信号去掉； 以结核杆菌标准毒株 DNA为模板， 用 5'端特异性引物 Mtbl0.4F 和 3'端引物 Mtbl0.4R扩增 Mtbl0.4全基因序列；

PCR反应条件： 96°C预变性 lmin,98°C变性 10s,54°C复性 15s, 72°C延伸 30s, 30个循环； 72°C延伸 lOmin; PCR产物经胶回收试剂盒纯化进行纯化。

( 3 )构建重组质粒 MtblO.4- pET-30a(+): 用 Nde I和 Sac I双酶切纯化后 Mtbl0.4基因 和质粒 pET30a， 在 T4连接酶的作用下将两者进行连接， 转化入 E.Coli DH5a中， 构建重组 质粒 Mtbl0.4-pET-30a(+)， PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。

(4 ) PCR扩增 Hspl6.3基因：以结核杆菌标准毒株 DNA为模板，用 Hspl6.3F和 Hspl6.3R 扩增 Hspl6.3基因片段；

PCR反应条件： 96°C预变性 lmin,98°C变性 10s， 55°C复性 20s， 72°C延伸 30s， 30个循 环； 72°C延伸 lOmin; PCR产物经胶回收试剂盒纯化；

( 5 ) 构建重组质粒 Mtbl0.4-Hspx- pET-30a(+): 用 Sac I禾卩 Hindlll双酶切纯化后 Hspx 基因和重组质粒 Mtbl0.4-pET-30a(+)， 分别纯化后用 T4 连接酶进行连接， 转化入 E.Coli DH5a, 克隆构建重组质粒 Mtbl0.4-Hspx- pET-30a(+); PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。

所述的融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的表达方法包括以下步骤：

( 1 ) 从以上 E.Coli 的 _P ET30a-Mtbl0.4-Hspl6.3 ( DH5a ) 提取重组质粒 pET30a- Mtbl0.4-Hspl6.3 , 转化入 E.Coli BL21(DE3)中， PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定 （北京 华大基因科技完成测序）， 即为保存菌种 pET30a- Mtbl0.4-Hspl6.3 (BL21 );

( 2 ) 活化表达 MH蛋白的 E.coli BL-21菌体， 取 Ιπι 活化后菌体加入 200mlLB培养基

说

中震荡培养 3h lOmim至 OD 600nm达到〜 0.6; 加入 IPTG(1.0mmol/L)100ul; 25°C诱导振荡培 养 12h; 4°C 10000rpm/min离心 lOmin收集菌体书； 菌体重悬于 PB缓冲液 （Na ₂ HP0 ₄ '12H ₂ 0 20mMol L, Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 0 20m ol L, pH7.4 ) lOml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌 lh(180~200 W, 超声 4s 停 5s); lOOOOrpm/min离心 20min 后分别收集上清和沉淀， 将上清和沉淀分别进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 经 SDS-PAGE电泳分析， 与 BL21空菌相比， 分子量在 26.7 D左 右有明显的特异蛋白表达条带， 以上清形式表达为主， 沉淀中蛋白很少。

所述的融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的纯化方法包括以下步骤：

( 1) 配制以下缓冲液： I液 20mM PB (pH7.4 ) _; II液 20mM PB+1M NaCl (pH7.4 ); ΙΠ液 20mM PB+2 M NaCl (pH7.4 ); 缓冲液均用 0.45um滤器过滤除菌；

(2) 大量表达融合蛋白 MH， 收集的菌体重悬于 20mM PB缓冲液中， 冰浴下超声破碎 lh左右， 4°C/10，000rpm离心 lOmin, 离心后收集含 MH蛋白的上清； 上清用 0.45um滤器过 滤除菌；

( 3 ) 第一步纯化： 离子交换层析。 选用强阴离子交换柱 Q介质进行纯化， 收集不同梯 度洗脱液进行 SDS-PAGE分析得初步纯化物；

(4 ) 第二步纯化： 疏水层析。 经过离子交换层析初步纯化后的蛋白， 加入等体积的 III 液,使蛋白含高盐上柱。 选用 Butyl HP柱进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行 SDS-PAGE分 析得二步纯化物；

( 5 ) 第三步纯化： 凝胶过滤层析。 将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的 蛋白， 选用 superdex prep grade 柱进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行 SDS-PAGE分析得最终纯化 物；

(6 ) 将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使 用。 说 明 书 上述结核分枝杆菌融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3应用在结核亚单位疫苗中。

本发明的优点在于： 本发明利用基因工程技术， 成功构建、 表达和纯化了不带有任何标 签的结核分枝杆菌融合蛋白 TB10.4-Ag85B，解决了融合蛋白所带有的标签会影 响到动物实验 以及更进一步的临床学试验的后续问题， 并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白 得到 了有效的纯化， 此蛋白可诱导较强的细胞和体液免疫应答并具 有一定的动物保护效应， 有望 成为临床结核病预防和治疗的候选疫苗； 该融合蛋白疫苗可诱导动物较强的细胞和体液 免疫 反应； 通过动物攻毒实验表明， 该疫苗在 BCG免疫基础上， 具有加强免疫作用， 可提高和延 长 BCG的保护效果； 且该疫苗无明显毒副作用。

附图说明

图 1在大肠杆菌中表达纯化蛋白 MH ( Mr 为 26.7 x 10 ³ ) ( 1.蛋白 Maker, 2.纯化前的 MH， 3.第一步纯化后的蛋白 MH， 4.第二步纯化后的蛋白 MH， 5.第三步步纯化后的蛋白）；

图 2脾细胞分泌 IFN-r水平 (A: 抗原 Hspl6.3刺激脾细胞， B _: PPD刺激脾细胞）； 图 3结核抗原 Hps6.3特异性抗体水平 （A: 抗体 IgGl， B: 抗体 IgG2b);

图 4分泌 IFN-r因子的脾细胞数量（A:细胞用 Mtbl0.4抗原的 CD8 T细胞表位刺激， B: 细胞用 Hxp6.3蛋白进行刺激， C: 细胞用 PPD进行刺激， *表示实验组与 PBS、 BCG组进行 统计学分析时 P值小于 0.05 ); '

图 5分泌 IL-17因子的脾细胞数量（A:细胞用 MtblO.4抗原的 CD8 T 细胞表位刺激， B: 细胞用 Hxp6.3蛋白进行刺激，*表示实验组与 PBS、BCG组进行统计学分析时 P值小于 0.05 ); 图 6结核抗原 Hps6.3特异性抗体水平（A:抗体 IgGl， B:抗体 IgG2b， C:抗体 IgG2c )； 图 7 融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3对 BCG初免动物的保护效果 （结果用肺和脾的 CFU数 的对数表示，每组小鼠数量大于等于 6只，数据用方差分析方法和 SPSS13.0软件进行统计）。 具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解， 此处所描述的优选实施例仅用于说明 和解释本发明， 并不用于限定本发明。 一、 结核分枝杆菌融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3的构建、 表达和纯化

首先，将 Mtbl0.4和 Hspl6.3基因进行 PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中 ， 构建重组载体； 然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋 白 Mtbl0.4-Hspl6.3; 最后根据 融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3 的分子量、 电荷和亲和力进行纯化， 通过纯化得到融合蛋白 Mtbl0.4-Hspl6.3 , 具体步骤如下： 说 明 书

1、 融合蛋白 Mtbl0.4- Hspl6.3 ( MH) 的构建：

( 1 ) 根据 GenBank 中 H37Rv 中的 Mtbl0.4 ( Rv0288, 相对分子量 Mr为 10.4 10 ³ 96 AA) 和 Hspl6.3 (Rv2301 , 相对分子量 Mr为 16.3 0 ³ ， 144 AA) 的基因序列， 设计 4对 引物， 分别为：

Mtbl0.4F GTGCATATGTCGCAAATCATGTACAACTA (Nde l )

Mtbl0.4R ATAGAGCTCGCCGCCCCATTT ( Sac I )

Hspx F ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGG

TGATTATGGCCACCACCCTTC (Sac I )

Hspx R ACAAAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG (Hindffl)

(2) PCR扩增 Mtbl0.4基因： 由于 Mtbl0.4基因后面要融合 Hspl6.3， 所以设计引物时 把 Mtbl0.4终止信号去掉， 以结核杆菌标准毒株 （H37Rv) DNA为模板， 用 5'端特异性引物 Mtbl0.4F和 3'端引物 Mtbl0.4R扩增 ΜΛ0.4全基因序列; PCR反应条件: 96°C预变性 lmin， 98°C变性 10s,54°C复性 15s, 72°C延伸 30s， 30个循环; 72°C延伸 lOmin; PCR产物经胶回收 试剂盒纯化进行纯化。

(3 ) 构建重组质粒 Mtbl0.4- pET-30a(+): 用 Nde I和 Sac I双酶切纯化后 Mtbl0.4基因 和质粒 pET30a， 在 T4连接酶的作用下将两者进行连接， 转化入 E.Coli DH5a中， 构建重组 质粒 Mtbl0.4-pET-30a(+;>， PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。 （见鉴定结果序列表）

(4 ) PCR扩增 Hspl6.3基因： 以结核杆菌标准毒株（H37Rv) DNA为模板，用 Hspl6.3F 和 Hspl6.3R扩增 Hspl6.3基因片段； PCR反应条件： 96°C预变性 lmin,98°C变性 10s， 55 °C 复性 20s, 72°C延伸 30s, 30个循环； 72°C延伸 10min。 PCR产物经胶回收试剂盒纯化。

( 5 ) 构建重组质粒 Mtbl0.4-Hspx- pET-30a(+): 用 Sac I和 Hindlll双酶切纯化后 Hspx 基因和重组质粒 Mtbl0.4-pET-30a(+)， 分别纯化后用 T4 连接酶进行连接， 转化入 E.Coli DH5a， 克隆构建重组质粒 Mtbl0.4-Hspx- pET-30a(+)。 PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。

(见鉴定结果序列表）

2、 MH蛋白 （分子量为 26.7 x 103 ) 的表达 （见氨基酸序列表）

( 1 ) 从以上 E.Coli 中的 pET30a-Mtbl0.4-Hspl6.3 ( DH5a ) 提取重组质粒 pET30a- Mtbl0.4-Hspl6.3 , 转化入 E.Coli BL21(DE3)中， PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定 （北京 华大基因科技完成测序）， 即为保存菌种 pET30a- Mtbl0.4-Hspl6.3 ( BL21 )。

(2 ) 活化表达 MH蛋白的 E.coli BL-21菌体， 取 lml活化后菌体加入 200mlLB培养基 中震荡培养 3hl0mim至 OD600nm达到约 0.6; 加入 IPTG(1.0mmol/L)100ul; 25 °C诱导振荡培 说 明 书 养 12h; 4°C 10000rpm/min离心 lOmin收集菌体； 菌体重悬于 PB缓冲液 （Na ₂ HP0 ₄ '12H ₂ 0 20mMol/L, Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 020mMol/L, _P H7.4) lOml/g湿菌， 冰浴下超声破碎细菌 lh(180〜 200 W, 超声 4s 停 5s); lOOOOrpm/min离心 20min 后分别收集上清和沉淀， 将上清和沉淀分 别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 经 SDS-PAGE电泳分析， 与 BL21空菌相比， 分子量在 26.7 D 左右有明显的特异蛋白表达条带， 以上清形式表达为主， 沉淀中蛋白很少。 （见蛋白表达结果 序列表）。

3.MH蛋白 （分子量为 26.7χ10 ³ ) 的纯化

(1) 配制以下缓冲液： I液 20mM PB (pH7.4); II液 20mM PB+1M NaCl (pH7.4); III液 20mM PB+2M NaCl (pH7.4); 缓冲液均用 0.45um滤器过滤除菌；

(2) 大量表达融合蛋白 MH， 收集的菌体重悬于 20mMPB缓冲液中， 冰浴下超声破碎 lh左右， 4°C/10,000rpm离心 lOmin, 离心后收集含 MH蛋白的上清； 上清用 0.45um滤器过 滤除菌；

(3) 第一步纯化： 离子交换层析； 选用季钹基交联琼脂糖高柱效介质 （Q Sepherose High Performance) (注： 强阴离子交换柱） 进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯 酰胺凝胶 （SDS-PAGE) 分析得初步纯化物；

(4) 第二步纯化： 疏水层析； 经过离子交换层析初步纯化后的蛋白， 加入等体 积的 III液， 使蛋白含高盐上柱，选用丁基交联琼脂糖高柱 效介质 (Butyl Sepherose High Performance)进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶

(SDS-PAGE) 电泳分析得二步纯化物；

(5)第三歩纯化： 凝胶过滤层析； 将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的 蛋白， 选用凝胶过滤介质 Superdex 75 pre grade (superdex为交联琼脂糖和葡萄糖的符合填料； 分离 范围为： 3000〜70000)进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行聚丙炼酷胺凝胶（SDS -PAGE) 电泳分析得最终纯化物； （纯化结果见附图 1)

(6) 将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使 用。 二、 融合蛋白 MH免疫活性检测方法 说 明 书

1 实验材料: MH蛋白； Hspl6.4蛋白、己二酸二癸酯（DDA)、海藻糖二霉� ��酸月旨 ( TDM ); 卡介苗 （BCG)、 磷酸盐缓冲液 （PBS );

2 实验动物： C57BL/6小鼠；

3 实验动物分组 （共四组）：

A: PBS;

B: BCG;

C: MH+DDA+TDM;

D: Hspl6.3+DDA+TDM;

4制备蛋白和佐剂混合疫苗：

将融合蛋白 Mtbl 0.4-Hspx(MH)和 Hspl 6.3蛋白分别用用 PBS稀释到 0.2mg/ml; DDA和 TDM用氯仿-甲醇溶液（氯仿： 甲醇 =9: 1 )溶解，氮气吹干（使氯仿-甲醇溶液挥发完全� ��、 用低温冷冻干燥仪将吹干后的薄膜过夜干燥成 粉末状， PBS 重悬粉末 (DDA 终浓度为 5mg/ml,TDM终浓度为 lmg/ml)， 60 °C 水浴 20分钟溶解粉末， 冷却到室温待用。 将溶 解好的蛋白、 DDA、 TDM按 2: 1： 1比例混合均匀即可使用。

5免疫动物：

第 1周用制备好的混合疫苗 (MH+DDA+TDM和 Hspl 6.3+DDA+TDM)腹股沟皮下免疫实 验组动物一次 （200μ1/只）， 同时免疫对照组 PBS和 BCG组 （5 x l0 ⁶ CFU /只）； 实验组动物初 次免疫后分别在第 3、6周用制备好的混合疫苗腹股沟皮下相同剂� ��加强免疫动物 ( 200μ1/只）。 6 免疫指标测定方法

( 1 ) 细胞免疫检测

应用 ELISA方法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针� ��特异性抗原分泌 IFN-γ和 IL-17 的水平。 小鼠末次免疫 6W后无菌分离脾脏淋巴细胞， 特异性抗原和脾细胞在 24板中共同孵 育 68小时后， 收集细胞培养上清， 用 ELISA计数检测脾脏淋巴细胞在 Hspl6.3蛋白， PPD 蛋白刺激后 IFN-γ的表达。 具体歩骤： 无菌摘除脾脏， 研磨后经 200 目尼龙网过滤， 用淋巴 细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细 胞加入到 24孔细胞培养板中，终浓度为 5χ 10 ⁶ ， 分别给予 Hspl6.3蛋白（10ug/ml)， PPD蛋白（10ug/ml)刺激。在 37°C、 5%C0 ₂ 条件下共同孵育 68时后， 收集细胞培养上清。将细胞培养上清加入到 96孔 ELISA板中， lOOul/孔， 按 ELISA 说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色、 终止反应、酶标仪读板、根据标准曲线求的 IFN-r 的数值 （pg/ml )。

结果显示： PBS、 BCG、 MH+DDA+TDM H+DDA+TDM四组结果进行比较， 重组 MH 说 明 书 蛋白与 DDA和 TDM佐剂结合组， 在 Hspl6.3蛋白， PPD蛋白刺激后， 脾细胞分泌 IFN-γ的 水平明显高于 PBS组和 BCG 组， 具有明显统计学差异 (PO.05); 与单个抗原 H+DDA+TDM 组相比无明显统计学差异 (P>0.05)， 表明可产生相同水平的 IFN-r。 结果证明本发明的融合蛋 白与佐剂 DDA和 TDM混合后可引起较强的细胞免疫反应，保留了 单个抗原 Hspl6.3的免疫原 性。 （结果见附图 2-A、 2-B )

( 2 ) 体液免疫反应

用 ELISA法检测小鼠血清抗体表达水平。 用 Hspl6.3(5ug/ml)包被 96孔板 （ΙΟΟμΙ/well) 4°C过夜； 用 PBST溶液 300μ1Ανε11洗板 5次 x lmin /次； 从 1： 100 幵始至 1： 25600 ( IgG2b 和 IgG2c) 或从 1： 1600开始到 1： 509600 ( IgGl ), 加入对倍稀释的血清样品， 37°C放置 1 h。洗板后，加入 200μ1/\νε11的 1： 15000稀释的兔抗鼠 IgGl、 1： 10000稀释的兔抗鼠 IgG2b、 1： 5000稀释的兔抗鼠 IgG2c， 37°C放置 lh。 洗板后， 加入 ΙΟΟμΙ/well TMB显色液， 室温避 光反应 15分钟显色后， 加入 50μ1/\ν _ε 11终止液 (2Ν的 H ₂ S0 ₄ )终止反应； 在 450nm检测 OD 值。

结果显示： PBS、 BCG、 MH+DDA+TDM> H+DDA+TDM四组结果进行比较， 重组 MH 蛋白与 DDA和 TDM佐剂结合组，针对抗原 Hpsl 6.3所产生的特异性抗体 IgGl、I _g Gb和 IgGc 的水平明显高于 PBS、 BCG和单个抗原 H+DDA+TDM组。

此结果显示本发明的融合蛋白可刺激机体产生 抗原 Hspl6.3特异性抗体， 具有较强的体 液免疫反应， 说明抗原融合后保留了原单个抗原 Hspl6.3 的免疫原性。 （结果见附图 3-A、 3-B、 3-C )

三、 加强 BCG效应及保护力评价

1 实验材料： MH蛋白； 己二酸二癸酯 （DDA)、 海藻糖二霉菌酸脂 （TDM); 卡介苗

( BCG )、 磷酸盐缓冲液 （PBS );

2 实验动物： C57BL/6小鼠；

3 实验动物分组 （共三组）：

A: PBS

B: BCG

C: BCG/MH+DDA+TDM

4制备疫苗：

将融合蛋白 Mtb0.4-Hspx(MH)用 PBS稀释到 0.2mg/ml; DDA和 TDM用氯仿-甲醇溶液 (氯仿： 甲醇 =9: 1 ) 溶解， 氮气吹干 （使氯仿-甲醇溶液挥发完全）、 用低温冷冻干燥仪 说 明 书

. 将吹干后的薄膜过夜干燥成粉末状， PBS重悬粉末 (DDA终浓度为 5mg/ml，TDM终浓度 为 lmg/ml)， 60°C 水浴 20分钟溶解粉末， 冷却到室温待用。 将溶解好的蛋白、 DDA、 TDM按 2: 1： 1比例混合均匀即可使用。

免疫动物：

第 1周卡介苗 （BCG) 5x l0 ⁶ CFU腹股沟皮下免疫动物一次； 卡介苗 （BCG) 初次免疫 后分别在第 12、 14周用制备好的蛋白疫苗腹股沟皮下免疫动物 （200μ1/只）。

、 免疫指标测定方法

小鼠最后一次蛋白、 苗免疫 6周后分别进行细胞免疫和体液免疫检测。

( 1 ) 细胞免疫检测

应用 ELISPOT方法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别� �对特异性抗原分泌 IFN-γ和 IL-17的水平。 IFN-γ和 IL-17的分泌水平与结核病的保护性免疫反应成� ��相。最后一次免疫 小鼠 6周后无菌分离脾脏淋巴细胞， 应用酶联免疫斑点实验（ELISPOT)技术检测脾脏� ��巴 细胞在 Mtbl0.4 CD8+ T cell抗原表位， Hspl6.3蛋白， PPD蛋白刺激后 IFN-γ和 IL-17的表 达。

具体步骤： 96孔板预先用 IFN-γ抗体和 IL-17抗体包被过夜，无菌摘除脾脏，研磨后经 200 目尼龙网过滤， 用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。 将分离出的淋巴细胞加入 96孔 ELISPOT 板中， 终浓度为 5x 106/空， 分别给予 bl0.4 CD8+ T cell 抗原表位 ( 5ug/ml ), HSP16.3蛋 白（10ug/ml)， PPD 蛋白（10ug/ml)刺激。 在 37°C、 5%C0 ₂ 条件下共同孵育 48 小时后， 按 ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂， 洗板、 显色， 计数斑点数。

结果显示： PBS 、BCG 、 BCG/MH+DDA+TDM 三组结果进行比较重组 MH蛋白与 DDA 和 TDM佐剂结合组， 在 Mtbl0.4 CD8+ T cell抗原表位， HSP16.3蛋白， PPD蛋白刺激后， 脾细胞分泌 IFN-γ和 IL-17的水平明显高于 PBS组和 BCG 组。结果证明丰发明的融合蛋白 与佐剂 DDA和 TDM混合后可引起较强的细胞免疫反应。（见附 图 4-A、 4-B、 4-C、附图 5-A、 5-B )

(2 ) 体液免疫反应

用 ELISA法检测小鼠血清抗体表达水平。 -用 Hspl ⁶ , ( ⁵ u§/ml)^被 孔 , .GiQQi^lAyell ) 4°C过夜， 用 PBST溶液 300μ1Ανε11洗板 5次 x lmin/次， 从 1： 100 开始至 1： 25600 ( IgG2b 和 IgG2c ) 或从 1： 1600幵始到 1： 509600 ( IgGl )，、加入对倍稀释的血清样品， 37°C放置 1 h。洗板后，加入 200μ1Ανε11的 1： 15000稀释的兔抗鼠 IgGl、 1： 10000稀释的兔抗鼠 IgG2b、 1： 5000稀释的兔抗鼠 IgQ .c, 37°C放置 lh。 洗板后， 加入 ΙΟΟμΙ/well TMB显色液，，室温避 说 明 书

光反应 15分钟显色后， 加入 50μ1Λνε11终止液 (2Ν的 H2S04)终止反应； 在 450nm检测 OD 值。

结果显示： PBS、 BCG、 BCG/MH+DDA+TDM三组结果进行比较，重组 MH蛋白与 DDA 和 TDM佐剂结合组， Hpsl6.3所产生的特异性抗体 IgGl、IgGb和 IgGc的水平明显高于 PBS 和 BCG 组。 此结果表明本发明的融合蛋白可刺激机体产生 较强的体液免疫反应。 （见附图 6-A、 6-B、 6-C )

7、 攻毒后免疫小鼠组织的结核菌载量

具体步骤： 给每组小鼠攻击等量的结核菌毒株 H37Rv后 6周， 解剖所有的小鼠， 计算肺 脏中结核菌的数量， 用来评价本专利的融合蛋白 MH的动物保护效果。

结果显示，在小鼠肺脏中， BCG/MH+DDA+TDM组的结核菌量明显少于 PBS组（P=0.00) 和 BCG组 （P=0.069 )。 （细菌载量结果见附图 7 )

最后应说明的是： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修 ¾， 或者 分技术特征进. 等 替^。，凡奄本发 明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围 之内。