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Title:
METHOD FOR PREPARING HIGHLY PURE DOXORUBICIN
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/079300
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for preparing highly pure doxorubicin. The method comprises the following steps: (1) chromatographing a prepurified doxorubicin solution by using macroporous resin, pre-washing the chromatographed system by using an acidic low concentration aqueous organic solvent, and performing elution by using an acidic high concentration aqueous organic solvent; (2) performing chromatographic separation on eluted components by using a preparative column, so that a highly pure doxorubicin component can be obtained, and the doxorubicin can, if needed, be separated from the aqueous solution by using conventional concentration and crystallization methods in the prior art. The method of the present invention has the advantages such as the process is simple, the yield is high, the cost is low, and the environmental pollution is less. The content of the prepared doxorubicin is greater than 99.5%, the content of each impurity is controlled to be lower than 0.10%, and the USP and EP standards are met.

Inventors:
CHEN HUA (CN)
LI ZHIQIANG (CN)
ZHENG LINGHUI (CN)
LU SHUYI (CN)
YAN WEI (CN)
CHEN FENG (CN)
WANG LINGPING (CN)
BAI HUA (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/085989
Publication Date:
May 30, 2014
Filing Date:
October 25, 2013
Export Citation:
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Assignee:
ZHEJIANG HISUN PHARM CO LTD (CN)
International Classes:
C07H15/252; C07H1/06
Foreign References:
CN103087124A2013-05-08
US4861870A1989-08-29
US4360664A1982-11-23
US20070004653A12007-01-04
Attorney, Agent or Firm:
BOSS & YOUNG PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (CN)
北京邦信阳专利商标代理有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求

1. 一种制备高纯度阿霉素的方法, 其特征在于, 所述方法包括如下步驟: ( 1 )将预提纯的阿霉素溶液经大孔吸附树脂层析分离, 收集阿霉素组分;

( 2 )将步骤(1 ) 中得到的阿霉素组分用常规方法除去有机溶剂, 再经过制 备柱层析分离, 得到高纯度的阿霉素溶液; 以及

( 3 )任选地, 将步骤(2 ) 中得到的高纯度阿霉素溶液进行浓缩和析晶, 制 得阿霉素晶体。

2. 根据权利要求 1的方法, 其中步驟( 1 )所述大孔吸附树脂层析先采用酸 性低浓度的有机溶剂水溶液作为预洗液, 预洗, 再用酸性高浓度的有机溶剂水溶 液作为洗脱液, 洗脱, 从而收集阿霉素组分。

3. 根据权利要求 2的方法, 其中步骤(2 )所述制备柱层析采用酸性有机溶 剂的水溶液作为流动相, 洗脱样品, 分段收集含阿霉素的组分, 从而得到高纯度 的阿霉素溶液。

4. 根据权利要求 2或 3的方法, 其中步骤( 1 )所述预提纯的阿霉素溶液是 通过以下方法制备得到的:

a) .将阿霉素发酵液,用酸调 pH值为酸性,过滤,得到预提纯的阿霉素溶液; 或

b) .将阿霉素粗品溶于水和 /或有机溶剂, 得到预提纯的阿霉素溶液, 其中所 述的有机溶剂选自曱醇、 乙醇、 丙酮、 或它们的混合液。

5. 根据权利要求 4的方法, 其中方法 a)中调 pH值采用的酸选自盐酸、硫酸 或草酸; 所述 pH值为 0.5 ~ 3.0, 优选 1.0 ~ 2.5。

6. 根据权利要求 1-3中任意一项的方法, 其中步骤(1 ) 中所述大孔吸附树 脂为聚苯乙烯类树脂, 优选 HP20、 XAD1180, XAD1600, H41、 H60、 CG161、 HP20SS、 HZ20SS、 XAD-4、 SP207或 SP825树脂。

7. 根据权利要求 2或 3的方法, 其中步骤(1) 中, 所述预洗液中有机溶剂 的浓度为 10~30% (V/V); 所述洗脱液中有机溶剂浓度为 40~70% (V/V); 所 述预洗液和洗脱液中的酸选自盐酸、 硫酸、 乙酸或磷酸; 所述预洗液和洗脱液的 H值为 1.5 ~ 4.5, 优选 2.0 ~3.5; 所述预洗液和洗脱液中有机溶剂优选自中等极 性的有机溶剂, 更优选曱醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇或乙腈。

8. 根据权利要求 1-3中任意一项的方法, 其中步骤(2) 中, 所述制备柱层 析使用的制备柱为动态轴向压缩制备柱, 其中动态轴向压缩制备柱的直径为 50mm - 1000mm,优选直径为 50mm、 100mm、 200mm ^ 300mm、 500mm、 600mm 或 800mm的动态轴向压缩制备柱;所述的制备柱层析使用的制备柱的填料为 C18、 C8、 C3、 聚苯乙烯类或聚曱基丙烯酸酯类。

9. 根据权利要求 3的方法, 其中步骤(2)中, 所述流动相中有机溶剂的浓 度为 40 ~ 60% ( VV ); 所述流动相中的酸选自乙酸、 盐酸或磷酸; 所述流动相的 pH值为 2.5~3.5; 所述流动相中有机溶剂优选自中等极性的有机溶剂,更优选曱 醇、 乙醇、 乙腈、 异丙醇或丙酮。

10. 根据权利要求 1-3 中任意一项的方法, 其中步骤(2) 中所述制备柱层 析, 其中进入制备柱的阿霉素的浓度为 10~100mg/ml。

11.根据权利要求 1-3中任意一项的方法,其中步骤(2)中所述制备柱层析, 其中制备柱的进料量为 5 ~ 50g阿霉素 /Kg填料。

12. 一种根据权利要求 1-3中任意一项的方法制备得到的阿霉素, 其色谱含 量达 99.5%以上, 单个杂质含量在 0.10%以下。

Description:
一种制备高纯度阿霉素的方法 技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤抗生素的制备方法, 具体而言, 本发明涉及一种制 备高纯度阿霉素的方法。 背景技术

阿霉素是蒽环类抗生素(如阿霉素 柔红霉素、 表阿霉素)的一种, 是最 广泛应用的抗肿瘤药物之一。 它能使 DNA的双螺旋链解开, 改变 DNA的模 板性质, 阻止和干扰 DNA聚合酶, 抑制 DNA的合成和 RNA的合成, 从而阻 止细胞分裂(抑制核酸合成)。 阿霉素主要用于治疗急慢性白血病、 恶性淋巴 瘤、 胃癌、 肺癌、 膀胱癌、 软组织肉瘤、 乳腺癌、 网状细胞肉瘤、 恶性畸胎瘤 等恶性肿瘤疾病。 其结构如式 I所示。

式 I

1974年, US 3,803,124公开了阿霉素可由发酵产物柔红霉素通 过化学半合 成而制得。 意大利的法玛西雅厄普约翰公司在 CN1147835A中公开了一种由柔 红霉素通过酶法转化制备阿霉素的方法。 目前, 以柔红霉素为中间体半合成是 工业化生产阿霉素的方法。但是, 化学合成方法存在产品质量不稳定、环境污 染大、 生产成本高、 不符合 EHS要求等问题。 CN 102363755A公开了一种能够 通过一步发酵法生产阿霉素的链霉菌 ( Streptomyces sp.H323 , 保藏编号为 CGMCC NO.4827 ), 其阿霉素发酵单位达到工业化生产要求。

目前,以柔红霉素为前体通过半合成或生物转 化得到的阿霉素作为起始原 料, 进行分离纯化制备阿霉素的研究比较多。 US4,861,870将半合成或生物转 化得到的阿霉素作为起始原料, 起始阿霉素色傳含量为 70 ~ 80%, 通过离子交 换树脂吸附, 用有机溶剂的酸水溶液洗脱, 再通过大孔吸附树脂层析, 然后用 有机溶剂的微酸水溶液洗脱,最后通过结晶方 式得到阿霉素成品。该方法制备 的阿霉素成品, 色 i瞽含量仅为 98%, 单个杂质含量高达 1.5%, 远远达不到 EP、 USP标准(色谱含量要求 99%以上, 单个杂质含量低于 0.10% ), 且该工艺中的 阿霉素原料来源要先通半合成或生物转化, 工艺繁销, 成本高、 周期长、 收率 低、 不适宜产业化。 所以, 寻找一种简单而且能够制备高纯度阿霉素的纯 化方 法显得十分重要。

随着制药、生物化工等行业的迅速发展,制备 型液相色谱分离技术得到越 来越广泛的开发和应用, 已成为分离和纯化复杂混合物的重要方法,尤 其适用 于制备组分复杂、 副产物多、 单个杂质难分离的生物发酵、 生物转化产品。 动 态轴向压缩 (DAC )制备技术具有多方面的优越性, 因而得到了更为深入的 研究和发展。 DAC的核心技术是通过活塞的上下运动来装柱、 维持柱压和卸 柱,活塞周边配备了特殊设计的密封圈能容许 活塞上下自由滑动, 同进又能保 持高的密封压。活塞运动和压力维持靠的是液 压, 液压动力比轴向压缩柱的弹 簧动力更稳定, 更均勾。 这些技术使得它具有成本低、 寿命长、 柱效高、 对称 性和重复性好的特点, 可以装填直径范围大( 50mm ~ 1000mm ) , 且保持与 分析柱相当的分离效果。但目前为止, 尚未发现有任何文献报道采用制备色谱 分离技术, 特别是 DAC制备技术分离纯化阿霉素产品。 本发明在吸附色谱分 离的基 上, 进一步釆用制备色谱技术, 得到的阿霉素产品纯度高, 符合 EP 和 USP的标准, 而且本发明工艺操作简单, 生产成本低, 收率高, 完全适合工 业化生产。 发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高纯度阿霉素 的方法,该方法包括如下步 骤:

( 1 )将预提纯的阿霉素溶液经大孔吸附树脂层析 离, 收集阿霉素组分;

( 2 )将步骤(1 ) 中得到的阿霉素组分用常规方法除去有机溶剂 , 再经过 制备柱层析分离, 得到高纯度的阿霉素溶液; 以及

( 3 )任选地, 将步骤(2 ) 中得到的高纯度阿霉素溶液进行浓缩和析晶制 得阿霉素晶体。

其中, 步骤(1 )所述大孔吸附树脂层析先采用酸性的低浓度 有机溶剂 水溶液作为预洗液, 预洗, 再用酸性的高浓度的有机溶剂水溶液作为洗脱 液, 洗脱, 从而收集阿霉素组分;

其中, 步驟(2 )所述制备柱层析釆用酸性的有机溶剂的水溶 作为流动 相, 洗脱样品, 分段收集含阿霉素的组分, 即可得高纯度的阿霉素溶液;

其中, 步骤(1 )所述预提纯的阿霉素溶液是通过以下方法制 得到的: a) .将阿霉素发酵液, 用酸调 pH值为酸性, 过滤, 得到预提纯的阿霉素 溶液; 该阿霉素发酵液可采用 CN102363755A公开的方法, 利用链霉菌

( Streptomyces sp.H323,保藏编号为 CGMCC NO.4827 )发酵制备得到;其中, 阿霉素发酵液采用盐酸、硫酸或草酸调 pH值为酸性,所述的 pH值优选为 0.5 ~ 3.0, 更优选 1.0 ~ 2.5;

b) .将阿霉素粗品溶于水和 /或有机溶剂, 得到预提纯的阿霉素溶液, 其中 所述的有机溶剂选自曱醇、 乙醇、 丙酮、 或它们的混合液; 阿霉素粗品可采用 US3803124公开的由柔红霉素化学半合成法制备得 到的,或采用 CN1147835A 公开的由柔红霉素生物转化法制备得到。

其中, 步骤(1 )所述的大孔吸附树脂层析分离步骤包括吸附 预洗、 洗 脱三个过程。

在优选的实施方案中,其中所述的大孔吸附树 脂优选聚苯乙烯类树脂, 更 优选 HP20、 XAD1180, XAD1600, H41、 H60、 CG161、 HP20SS , HZ20SS、 XAD-4、 SP207或 SP825树脂,更优选 HP20、 HZ20SS :^01180或8卩207树脂。

在优选的实施方案中,其中所述的大孔吸附树 脂层析分离的预洗过程釆用 酸性的低浓度的有机溶剂水溶液作为预洗液进 行预洗,其中预洗液中有机溶剂 的浓度优选为 10 ~ 30% ( V/V )。 预洗过程以基本不洗出有效成分为准。

在优选的实施方案中,其中所述的大孔吸附树 脂层析分离的洗脱过程使用 酸性的高浓度的有机溶剂水溶液作为洗脱液进 行洗脱,其中洗脱液中有机溶剂 的浓度优选为 40 ~ 70% ( V/V )。

在优选的实施方案中, 其中步骤(1 )所述的预洗液和洗脱液中有机溶剂 优选包括但不限于中等极性的有机溶剂, 更优选甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇或 乙腈, 最优选乙醇或丙酮。

在优选的实施方案中, 其中步骤(1 ) 中所述的预洗液和洗脱液中的酸优 选盐酸、 硫酸、 乙酸或磚酸, 所述的预洗液和洗脱液的 pH值优选为 1.5 ~ 4.5, 更优选 2.0 ~ 3.5。 ' 在优选的实施方案中, 其中步骤(2 ) 中所述的制备柱层析使用的制备柱 优选为动态轴向压缩制备柱, 其中动态轴向压缩制备柱的直径优选为 50mm ~ 1000mm, 更优选直径为 50mm、 100mm, 200mm、 300mm、 500mm、 600mm 或 800mm各系列动态轴向压缩制备柱。

在优选的实施方案中, 其中所述的制备柱层析使用的制备柱的填料优 选 C18、 C8、 C3、 聚苯乙烯类或聚曱基丙烯酸酯类, 更优选 C18或 C8。

在优选的实施方案中,其中所述制备柱的填料 颗粒的粒径优选 5μηι、 10μΐΏ 或 50μηι。

在优选的实施方案中,其中所述制备柱层析优 选采用酸性的有机溶剂的水 溶液作为流动相洗脱样品。 其中流动相中有机溶剂的浓度优选为 40 ~ 60% ( V/V ); 其中所述的流动相中有机溶剂优选包括但不限 于中等极性的有机溶 剂, 更优选曱醇、 乙醇、 乙腈、 异丙醇、 丙酮, 最优选为曱醇、 乙腈; 其中所 述的流动相中的酸优选乙酸、 盐酸或磷酸; 其中所述的流动相的 pH值优选为 2.5 ~ 3.5。

在优选的实施方案中, 其中步骤(2 ) 中所述制备柱层折, 其中进入制备 柱的阿霉素的浓度为 10 ~ 100mg/ml, 优选 50 ~ 80mg/mL

在优选的实施方案中, 其中步骤(2 ) 中所述制备柱层析, 其中制备柱的 进料量为 5 - 50g阿霉素 /Kg填料, 优选 10 ~ 20g阿霉素 /Kg填料。 本发明测定阿霉素含量及色谱纯度的方法采用 高效液相色谱法,具体方法 如下:

色谱柱: C18柱, 5μηι, 4.6 250mm;

流动相: 緩冲液:乙腈:甲醇 =500:500:60;

緩冲液: 取十二烷基硫酸钠 1.44g和磷酸 0.68ml溶于 500ml超纯水中; 流速: 1.35ml/min;

检测波长: 254mn;

进样量: 10μ1。

采用本发明所述的工艺制备得到的阿霉素产品 , 经高效液相色谱法检测, 阿霉素的色傳含量可达 99.5%以上, 单个杂质的色傳含量在 0.10%以下, 产品 符合 EP、 USP标准。

相对现有技术, 本发明具有以下优点:

阿霉素发酵液成分复杂、 副产物多、 单个杂质分离难度大, 本发明先采用 吸附色潘柱分离,接着采用制备色 i普柱进一步分离纯化, 特别是采用动态轴向 压缩 (DAC ) 制备分离技术, 很好的结解决了这个难题。 现有技术, 如 US4,861,870公开的阿霉素提纯方法, 制备得到的阿霉素纯度只有 98%左右, 杂盾含量高达 1.5%, 不符合 EP、 USP的标准, 而采用本发明的方法, 制备得到 的阿霉素色谱含量在 99.5%以上, 单杂含量在 0.10%以下, 满足 EP、 USP的标 准, 而且本发明的方法工艺操作筒单, 生产成本低, 收率高, 非常适合工业化 生产。 附图说明:

图 1 : 实施例 1阿霉素发酵液的 HPLC色谱图

图 2: 实施例 10制备得到的阿霉素洗脱液的 HPLC色谱图

图 3: 实施例 18阿霉素过制备柱后收集的目标组分的 HPLC色谱图 图 4: 实施例 12制备得到的高纯度阿霉素的 1H NMR图谱

图 5: 实施例 12制备得到的高纯度阿霉素的 13 C NMR图谱

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该 理解的是, 本发明实施例所 述的制备方法仅仅是用于说明本发明, 而不是对本发明的限制。在本发明的构 思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于 本发明要求保护的范围。 具体实施方式

实施例 1

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N的盐酸调 pH为 1.0进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过滤, 得预提纯的溶液 1650升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 1000g, 色 i普含量 为 16%。预提纯的溶液用 100升 HP20树脂吸附,吸附完毕后,用 300升 10%( V/V ) 的乙醇水溶液,并用盐酸调 pH值为 2.0作为预洗液,预洗,再用 400升 50%( V/V ) 的乙醇水溶液, 用盐酸调 pH值为 2.0作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 300 升。 所得洗脱液中含阿霉素 800g, 色 含量为 79%。

实施例 2

阿霉素发酵液 2000升, 加草酸调 pH为 2.5进行酸化, 酸化 3小时后, 离心机 过滤,得预提纯的溶液 1700升,经 HPLC检测,含阿霉素 850g,色语含量为 18%。 预提纯的溶液用 80升 XAD1180树脂吸附, 吸附完毕后, 用 240升 20% ( V/V ) 的丙酮水溶液,并用乙酸调 pH为 3.5作为预洗液,预洗,再用 320升 40% ( V/V ) 的丙酮水溶液, 并用乙酸调 pH为 3.5作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 240 升。 所得洗脱液中含阿霉素 680g, 色 i普含量为 80%。

实施例 3

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N盐酸调 pH为 3.0进行酸化, 酸化 3小时后, 陶 瓷膜过滤,再经纳滤,得预提纯的溶液 3000升,经 HPLC检测,含阿霉素 800g, 色语含量为 15%。预提純的溶液用 80升 H41树脂吸附,吸附完毕后,用 240升 30% ( V/V ) 的曱醇水溶液, 并用硫酸调 pH为 1.5作为预洗液, 预洗, 再用 320升 70%(V/V)的曱醇水溶液, 并用硫酸调 pH为 1.5作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗 脱液 250升。 所得洗脱液中含阿霉素 600g, 色錯含量为 74%。

实施例 4

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N的硫酸调 pH为 0.5进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过滤, 得预提纯的溶液 1800升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 750g, 色谱含量 为 19%。预提纯的溶液用 60升 H60树脂吸附,吸附完毕后,用 180升 25% ( V/V ) 的异丙醇水溶液,并用磷酸调 pH为 4.5作为预洗液,预洗,再用 240升 55%( V/V ) 的异丙醇水溶液, 并用磷酸调 pH为 4.5作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 200 升。 所得洗脱液中含阿霉素 580g, 色谱含量为 74.5%。

实施例 5

阿霉素发酵液 2000升, 加草酸调 pH为 2.0进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过 滤, 得预提纯的溶液 1850L, 经 HPLC检测, 含阿霉素 900g, 色语含量为 17%。 预提纯的溶液用 80升 CG161树脂吸附, 吸附完毕后, 用 240升 30% ( V/V )的乙 腈水溶液, 并用盐酸调 pH为 4.0作为预洗液, 预洗, 再用 320升 60% ( V/V ) 的 乙腈水溶液, 并用盐酸调 pH为 4.0作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 260升。 所得洗脱液中含阿霉素 700g, 色谱含量为 76%。

实施例 6

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N的盐酸调 pH为 1.0进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过滤, 得预提純的溶液 1750升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 880g, 色傳含量 为 20%。 预提纯的溶液用 80升 XAD1600树脂吸附, 吸附完毕后, 用 240升 20% ( V/V )的丙酮水溶液,并用乙酸调 pH为 3.0作为预洗液,预洗,再用 300升 45% ( V/V ) 的丙酮水溶液, 并用乙酸调 pH为 3.0作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗 脱液 200升。 所得洗脱液中含阿霉素 660g, 色倕含量为 76.5%。

实施例 7

阿霉素发酵液 2000升, 加草酸调 pH为 2.5进行酸化, 酸化 3小时后, 离心机 过滤,得预提纯的溶液 1800升,经 HPLC检测,含阿霉素 1050g,色谱含量为 18%。 预提纯的溶液用 100升 XAD-4树脂吸附, 吸附完毕后, 用 300升 30% ( V/V )的 曱醇水溶液, 并用磷酸调 pH为 1.8作为预洗液, 预洗, 再用 450升 65% ( V/V ) 的曱醇水溶液, 并用磷酸调 pH为 1.8作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 350 升。 所得洗脱液中含阿霉素 790g, 色语含量为 75%。

实施例 8

阿霉素发酵液 2000升, 力 P IN盐酸调 pH为 3.0进行酸化, 酸化 3小时后, 陶 瓷膜过滤,再经纳滤,得预提纯的溶液 3500升,经 HPLC检测,含阿霉素 950g, 色 i普含量为 17%。预提纯的溶液用 100升 HP20SS树脂吸附,吸附完毕后,用 300 升 30% ( V/V )的异丙醇水溶液, 并用乙酸调 pH为 3.8作为预洗液, 预洗, 再用 400升 60% ( V/V )的异丙醇水溶液, 并用乙酸调 pH为 3.8作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 300升。 所得洗脱液中含阿霉素 710g, 色谱含量为 77%。

实施例 9

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N的硫酸调 pH为 0.5进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过滤, 得预提纯的溶液 1600升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 780g, 色傅含量 为 15%。预提纯的溶液用 80升 SP825树脂吸附,吸附完毕后,用 240升 30%( V/V ) 的乙腈水溶液,并用硫酸调 pH为 2.8作为预洗液,预洗,再用 320升 65% ( V/V ) 的乙腈水溶液, 并用硫酸调 pH为 2.8作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗脱液 240 升。 所得洗脱液中含阿霉素 585g, 色谱含量为 73%。

实施例 10

阿霉素发酵液 2000升, 加草酸调 pH为 2.0进行酸化, 酸化 3小时后, 板框过 滤,得预提纯的溶液 1750L,经 HPLC检测,含阿霉素 1100g, 色倕含量为 18%。 预提纯的溶液用 100升 HZ20SS树脂吸附, 吸附完毕后, 用 300升 25% ( V/V )的 乙醇水溶液, 并用乙酸调 pH为 2.5作为预洗液, 预洗, 再用 400升 55% ( V/V ) 的, 并用乙酸调 pH为 2.5作为洗脱液, 洗脱, 收集令格洗脱液 300升。 所得洗脱 液中含阿霉素 880g, 色 i普含量为 81%。

实施例 11

阿霉素发酵液 2000升, 加 1N盐酸调 pH为 3.0进行酸化, g交化 3小时后, 陶瓷 膜过滤, 再经纳滤, 得预提纯的溶液 1800升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 1150g, 色錯含量为 19%。 预提纯的溶液用 100升 SP207树脂吸附, 吸附完毕后, 用 300 升 30% ( V/V )的丙酮水溶液,并用盐酸调 pH为 3.2作为预洗液,预洗,再用 380 升 60% ( V/V )丙酮水溶液, 并用盐酸调 pH为 3.2作为洗脱液, 洗脱, 收集合格 洗脱液 250升。 所得洗脱液中含阿霉素 920g, 色语含量为 80%。

实施例 12

按实施例 1的方法处理发酵液 2000升,得到洗脱液 250升, 洗脱液中含阿霉 素 700g, 色谱含量为 79%。 减压浓缩洗脱液得到 14升浓缩液, 浓缩液浓度为 50mg/ml。浓缩液过制备柱,制备柱柱型号为 DAC300,填料采用 Kromasil ΙΟμηι C18 , 装柱总量 13Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 15g/Kg填料, 即 195g阿霉 素(进样速度 760mg/s, 进样时间 4.3min ), 采用 60% ( V/V )的曱醇水溶液, 并用乙酸调 pH为 2.5作为流动相, 洗脱流速 2500ml/min, 按照每针接样试验, 总结出接样方式为:每个主峰从电压上升到 150mv后的 4min开始收集目标组分, 直至电压降到 lOOmv结束, 共收集合格的目标组分 250L, 经 HPLC检测, 含阿 霉素 420g, 单个最大杂质色谱含量 0.07%, 阿霉素色 i普含量 99.7%。 收集的目 标组分减压浓缩至 2.1升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 8.4升丙酮 ( 4倍体积)搅 拌析晶 2h, 过滤、 干燥, 得固体的高纯度阿霉素 402g。

实施例 13

按实施例 2的方法处理发酵液 2000升,得到洗脱液 180升, 洗脱液中含阿霉 素 500g, 色谱含量为 80%。 减压浓缩洗脱液得到 6.2升浓缩液, 浓缩液浓度为 80mg/ml„浓缩液过制备柱,制备柱柱型号为 DAC200,填料采用 Kromasil ΙΟμιτι C18,装柱总量 6Kg,装柱高度 25cm,单次上样量 10g/Kg填料, 即 60g阿霉素 (进 样速度 250mg/s , 进样时间 4.0min) , 采用 55% ( V/V ) 的乙腈水溶液, 并用盐 酸调 pH为 3.0作为流动相, 洗脱流速 1200ml/min, 共收集合格的目标组分 150 升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 300g, 单个最大杂质色谱含量 0.08%, 阿霉素色 傳含量 99.6%。 收集的目标组分减压浓缩至 1.5升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 6 升异丙醇(4倍体积)搅拌析晶 2h, 过滤、干燥,得固体的高純度阿霉素 240g。 实施例 14

按实施例 3的方法处理发酵液 2000升,得到洗脱液 100升, 洗脱液中含阿霉 素 250g, 色语含量为 74%。 减压浓缩洗脱液得到 8.3升浓缩液, 浓缩液浓度为 30mg/mL浓缩液过制备柱,制备柱柱型号 DAC100,填料采用 Bakerbond ΙΟμηι C18, 装柱总量 1.5Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 5g/Kg填料, 即 7.5g阿霉素 (进样速度 30mg/s, 进样时间 4.2min), 采用 40% ( V/V )的丙酮水溶液, 并用磷 酸调 pH为 3.5作为流动相, 洗脫流速 300ml/min, 共收集合格的目标组分 80升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 140g, 单个最大杂质色谱含量 0.07%, 阿霉素色谱含 量 99.7%。 收集的目标组分减压浓缩至 700毫升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 2.8 升乙醇(4倍体积)搅拌析晶 2h, 过滤、 干燥, 得固体的高纯度阿霉素 115g。 实施例 15

按实施例 4的方法处理发酵液 2000升,得到洗脱液 300升, 洗脱液中含阿霉 素 1000g, 色傳含量为 74.5%。 减压浓缩洗脱液得到 10升浓缩液, 浓缩液浓度为 lOOmg/ml,浓缩液过制备柱,制备柱柱型号为 DAC300,填料采用 Kromasil ΙΟμηι C8, 装柱总量 13Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 50g/Kg填料, 即 650g阿霉素 (进样速度 2550mg/s, 进样时间 4.2min ), 采用 50% ( V/V )的乙醇水溶液, 并 用乙酸调 pH为 3.0作为流动相 , 洗脱流速 2500ml/min, 共收集合格的目标组分 200升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 550g, 单个最大杂质色语含量 0.09%, 阿霉素 色谱含量 99.5%。 收集的目标组分减压浓缩至 2.75升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 11升乙腈(4倍体积)搅拌析晶 2h,过滤、干燥,得固体的高纯度阿霉素 500g。 实施例 16

按实施例 5的方法处理发酵液 2000升, 得到洗脱液 150升, 洗脱液中含阿霉 素 400g, 色谱含量为 76%。 减压浓缩洗脱液得到 40升浓缩液, 浓缩液浓度为 lOmg/mL浓缩液过制备柱,制备柱柱型号为 DAC200,填料采用 Kromasil ΙΟμιη C18, 装柱总量 6Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 20g/Kg填料, 即 120g阿霉素 (进样速度 500mg/s , 进样时间 4.0min ) , 采用 50% ( V/V ) 的异丙醇水溶液, 并用碑酸调 pH为 3.0作为流动相, 洗脱流速 1200ml/min, 共收集合格的目标组 分 120升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 220g, 单个最大杂质色谱含量 0.08%, 阿霉 素色 i脊含量 99.6%。 收集的目标组分减压浓缩至 1.1升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 4.4升曱醇( 4倍体积)搅拌析晶 2h,过滤、干燥,得固体的高纯度阿霉素 200g。 实施例 17

按实施例 6的方法处理发酵液 2000升,得到洗脱液 120升, 洗脱液中含阿霉 素 300g, 色谱含量为 76.5%。 减压浓缩洗脱液得到 500毫升浓缩液, 浓缩液浓度 为 60mg/ml。 浓缩液过制备柱, 制备柱柱型号 DAC100 , 填料采用 Bakerbond ΙΟμιη C18, 装柱总量 1.5Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 30g/Kg填料, 即 45g 阿霉素(进样速度 180mg/s, 进样时间 4.2min ), 采用 55% ( V/V ) 的乙腈水溶 液, 并用盐酸调 pH为 3.5作为流动相, 洗脱流速 300ml/min, 共收集合格的目标 组分 100升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 165g, 单个最大杂质色语含量 0.08%, 阿 霉素色谱含量 99.6%。 收集的目标组分减压浓缩至 825毫升, 浓缩液浓度 200mg/ml, 加 3.3升丙酮( 4倍体积)搅拌析晶 2h, 过滤、、 干燥, 得固体的高纯 度阿霉素 145g。

实施例 18

按实施例 10的方法处理发酵液 2000升, 得到洗脱液 320升, 洗脱液中含阿 霉素 llOOg, 色谱含量为 81%。 减压浓缩洗脱液得到 55升浓缩液, 浓缩液浓度 为 20mg/ml, 浓缩液过制备柱, 制备柱柱型号为 DAC300 , 填料采用 Kromasil ΙΟμηι C8, 装柱总量 13Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 20g/Kg填料, 即 260g 阿霉素(进样速度 1050mg/s, 进样时间 4.2min ), 采用 45% ( V/V )的丙 δ同水溶 液, 并用盐酸调 ρΗ为 2.5作为流动相, 洗脱流速 2500ml/min, 共收集合格的目 标组分 300升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 880g, 单个最大杂质色谱含量 0.05%, 阿霉素色 i "含量 99.8%。

实施例 19

按实施例 11的方法处理发酵液 2000升, 得到洗脱液 200升, 洗脱液中含阿 霉素 600g, 色傳含量为 80%。 减压浓缩洗脱液得到 12升浓缩液, 浓缩液浓度为 50mg/ml。浓缩液过制备柱,制备柱柱型号为 DAC200,填料采用 Kromasil ΙΟμηι C18, 装柱总量 6Kg, 装柱高度 25cm, 单次上样量 30g/Kg填料, 即 180g阿霉素 (进样速度 750mg/s, 进样时间 4.0min ), 釆用 55% ( V/V ) 的甲醇水溶液, 并 用磷酸调 pH为 2.5作为流动相。 洗脱流速 1200ml/min, 共收集合格的目标组分 150升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 360g, 单个最大杂质色傳含量 0.04%, 阿霉素 色谱含量 99.9%。

实施例 20

参考 US3803124公开的由柔红霉素化学半合成法制备得 到的阿霉素粗品 1500g溶于 100升无离子水, 得到预提純的阿霉素溶液, 经 HPLC检测, 含阿霉 素 1000g, 色谱纯度 78% ( V/V )。

预提纯的阿霉素溶液用 100升 H41树脂吸附, 吸附完毕后, 用 300升 30% ( V/V ) 的甲醇水溶液, 并用盐酸调 pH为 2.5作为预洗液, 预洗, 再用 300升 70%(V/V)的曱醇水溶液, 并用盐酸调 pH为 2.5作为洗脱液, 洗脱, 收集合格洗 脱液 200升。 所得洗脱液中含阿霉素 800g, 色谱含量为 97%。

减压浓缩洗脱液得到 20升浓缩液, 浓缩液浓度为 40mg/ml, 浓缩液过制备 柱, 制备柱柱型号为 DAC300, 填料采用 Kromasil 10μιη Ο8, 装柱总量 13Kg, 装柱高度 25cm,单次上样量 30g/Kg填料, 即 290g阿霉素(进样速度 1100mg/s, 进样时间 4.4min ), 釆用 45% ( V/V ) 的丙 ί同水溶液, 并用盐酸调 pH为 2.5作为 流动相, 洗脱流速 2500ml/min, 共收集合格的目标组分 300升, 经 HPLC检测, 含阿霉素 640g, 单个最大杂质色谱含量 0.05%, 阿霉素色谱含量 99.7%。