La présente invention concerne un procédé de préparation de facteur H humain recombinant dans une lignée cellulaire humaine, avec un rendement amélioré.

Le facteur H est une protéine plasmatique présente dans le plasma humain à un taux moyen de 500 mg/L. Il est produit principalement par les cellules du foie de façon constitutive, mais également produit localement par d'autres cellules, telles que les cellules épithéliales du pigment de la rétine, les cellules endothéliales, les plaquettes ou les cellules souches mésenchymateuses.

La fonction principale du facteur H est la régulation de l'activation de la voie alterne du complément. Le facteur H est impliqué dans cette régulation par trois mécanismes: (i) la régulation de l'activité du facteur I, qui permet l'inactivation de la protéine C3b (iC3b); (ii) l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne par compétition avec le facteur B pour la liaison au C3b ; (iii) l'accélération de la dissociation de la C3 convertase de la voie alterne (C3bBb) (decay accélération activity).

Le facteur H peut agir soit dans la phase fluide sanguine pour maintenir un niveau bas de molécules C3 activées (C3b), soit au niveau des surfaces cellulaires présentant des polyanions, tels que des glycosaminoglycanes, le sulfate d'héparane ou l'acide sialique, pour protéger les cellules hôtes vis-à-vis de la lyse cellulaire induite par l'activation du complément.

Le gène HFl ayant 102,494 paires de bases (pb) et 23 exons (NCBI RefSeq: NG_007259.1), est localisé dans le cluster de gènes RCA (regttlator of complément activaiion) sur le locus lq32, Chrl . En raison de l'épissage alternatif, deux ARNm sont transcrits à partir du gène HFl, l'un ayant 3696 pb et codant la protéine FH et l'autre ayant 1347 pb et codant la protéine FHL-1 (FH-like 1 protein).

La protéine facteur H (FH) (1213 aa, 155 kDa) est une glycoprotéine simple chaîne, constituée de 20 domaines répétés SCR (short consensus repeats) (également appelés CCP ou SHUSHI). La protéine FHL-1 (449 acides aminés, 42 kDa) possède les 7 premiers domaines SCR plus 4 acides aminés hydrophobes en C-terminal.

Naturellement, le facteur H (FH) humain présente un polymorphisme en position 402 de sa séquence en acides- aminés, caractérisé par la substitution d'une tyrosine (Y) par une histidine (H). Cette substitution elle-même résulte d'un remplacement de nucléotide au niveau du gène HFl, où un nucléotide T est remplacé par un C. Les domaines SCR sont présents dans de nombreuses protéines, telles que des protéines de la famille du FH (FHRl, FHR2, FHR3, FHR4), des protéines de la famille RCA (CRI, CR2, C4BP, CD55, CD46) ou des protéines de pathogènes (vaccinia virus,...)

Un domaine SCR est composé d'environ 60 acides aminés séparés par une courte séquence linker (3 - 8 acides aminés pour le FH humain). Les domaines SCR sont constitués principalement de brins beta et possèdent chacun deux ponts S-S répartis à chaque extrémité du domaine. Les analyses d'homologie de séquences montrent que 4 cystéines conservées sont impliquées dans la formation de deux ponts S-S intra-domaine et qu'un tryptophane (W) dans le domaine SCR est hautement conservé.

En raison du fort intérêt thérapeutique pharmacologique, de nombreuses études ont été effectuées dans les différents systèmes de production in vitro de protéine dans le but d'améliorer la productivité de facteur H humain recombinant Le facteur H humain recombinant a été produit dans le système de baculovirus (Sharma et Pangburn, Gene 1994, June 10 : 143 (2) : 301-2) et dans les cellules COS (Sanchez-Corral et al, Am. J. Hum. Genêt., 71 : 1285-1295, 2002). Plus récemment, le facteur H humain recombinant a été produit dans la mousse physcomitrella en photobioréacteur (Buttner-Mainik et al, Plant biotechnol. J.

2010 Aug 17) ainsi que dans la levure Pichia pastoris (Schmidt CQ et al, Protein Expr. Purif.

2011 Apr. 76(2) 254-63).

Malgré ces nombreux efforts, à ce jour, la productivité atteinte pour du facteur H humain recombinant n'est toujours pas satisfaisante pour un usage thérapeutique chez l'homme. Par conséquent, il existe toujours un grand besoin de développer une méthode de production de haute performance pour du facteur H humain.

L'un des buts de la présente invention est de proposer l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la production de facteur H humain recombinant.

L'un des autres buts de la présente invention est de mettre à disposition un procédé de préparation de facteur H humain recombinant.

La présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou une séquence ayant au moins 99%, notamment 99,4%, notamment 99,7% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1.

Une protéine représentée par une telle séquence peut être le variant Y402 ou le variant H402 du facteur H humain ou un autre variant de facteur H humain, tel qu'un variant mentionné dans le site internet htt ://wwvv.unipi t.org/ ^' uniprot/P08603.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 correspond au variant Y402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une tyrosine.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 13 correspond au variant H402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une histidine.

Cette lignée cellulaire peut être une lignée ne produisant pas de facteur H, une lignée produisant du facteur H en une quantité non détectable, ou une lignée produisant du facteur H endogène.

La quantité de facteur H endogène produite par une lignée cellulaire est déterminée par la méthode ELISA avec un couple d'anticorps judicieusement choisi qui permet de détecter des concentrations minimales de 5 ng/ml de Facteur H dans le surnageant cellulaire. Des kits commerciaux de dosage sont également disponibles (ex : Kit HK342 Hycult).

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine produisant du facteur H endogène, pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Par « une lignée produisant du facteur H », on entend une lignée cellulaire pour laquelle il est possible de détecter la présence de facteur H endogène dans le surnageant cellulaire par les méthodes classiques de détection de protéines tel que l'ELISA et le Western Blot. Certaines lignées cellulaires humaines, telles que la lignée cellulaire PER.C6® ou la ligne HEK 293F, produisent du facteur H humain par voie endogène. Cependant, la productivité de facteur H endogène par ces cellules est relativement faible ; elle est d'environ 70 μg/L pour la lignée cellulaire PER.C6®, au bout de 48H de culture, et d'environ 11 μg/L de facteur H sécrété dans le milieu de culture pour la lignée cellulaire HEK 293F après 7 jours de culture.

Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, avec un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement supérieur à 20 mg/L, ou à 30 mg/L, ou à 40 mg/L, ou à 50 mg/L, plus particulièrement supérieur à 60 mg/L, ou à 70 mg/L, ou à 80 mg/L, ou à 90 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.

Lorsque le mode de production utilisé pour produire du facteur H recombinant est un des modes suivants : « batch », « Fedbatch » ou «culture avec filtration-rétention» ou un mode qui dérive de l'un de ces 3 modes de production, on entend par « rendement » la quantité de facteur H recombinant produit par volume de milieu de culture final qui va être traité en postproduction (nommé également Downstream Process ou DSP).

Lorsque le mode de production utilisé pour produire du Facteur H recombinant est un mode «culture continu en perfusion » ou qui dérive de ce mode de production, on entend par « rendement » la quantité de facteur H produit par volume de milieu de culture contenue initialement dans l'enceinte de production.

Le mode de production « batch » est caractérisé par un volume constant. L'inoculum est ajouté au milieu et on laisse se dérouler la culture. La biomasse évolue selon la courbe de croissance caractéristique de la lignée utilisée pour la production. On intervient sur la vitesse de rotation, sur l'aération (02 et C02) ou encore l'ajustement du pH, mais aucun milieu nutritif n'est ajouté en cours de culture et rien n'est retiré.

A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de protéines recombinantes de 10 mg produit dans un milieu de culture de volume final d'un litre, qui est identique au volume initial, correspond à un rendement de production de 10 mg/L,

Le mode de production « Fedbatch » (culture dite alimentée) est caractérisé par un volume variable. La production se fait dans un premier temps sous forme d'un batch normal dans un volume donné. Du milieu frais est ensuite ajouté pour maintenir les cellules dans l'état souhaité (viabilité cellulaire stable, phase exponentielle, phase stationnaire). Il est possible d'adapter le « feed » pour ne jamais dépasser les valeurs limites souhaitées (exemple : concentration de glucose < 4 g/L).

La stratégie de « feed » dépend de la lignée utilisée pour la production. En phase exponentielle, la biomasse s'accumule rapidement, permettant d'accumuler également du produit très rapidement dans un volume réduit. En phase stationnaire la biomasse est maintenue constante permettant une accumulation progressive de produit dans un volume réduit.

A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 30 mg de facteur H recombinant produit dans 1,5 litre de volume final de milieu de culture, qui est initialement un litre, correspond à un rendement de production de 20 mg/L.

Le mode de production « culture avec fïltration-rétention » (connu aussi sous le terme de XD process) est caractérisé par un accroissement de la biomasse dans un volume constant. C'est un mode mixte en les modes batch et fed-batch pour lequel l'ajout du milieu frais est compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant sans le Facteur H recombinant qui va être retenu par l'intermédiaire d'une membrane de fîltration dont le seuil de coupure est inférieur à la taille de la protéine recombinante. Le surnageant retiré est éliminé. Le volume reste ainsi constant alors que la biomasse s'accumule rapidement permettant d'accumuler également du Facteur H recombinant.

A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 60 mg du facteur H recombinant produit dans un litre de volume final de milieu de culture, qui est identique au volume initial de milieu de culture, correspond à un rendement de production de 60 mg/L.

Le mode de production « culture avec perfusion » est caractérisé par un volume et une biomasse constants. Comme pour le mode fïltration-rétention, l'ajout du milieu frais est compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant mais dans ce mode de production le surnageant retiré contient le Facteur H recombinant et est donc conservé ce qui conduit à un volume final à traiter en DSP supérieur au volume initial sans accumulation de la protéine d'intérêt.

A titre d'exemple, une quantité finale de 90 mg du facteur H recombinant produit dans 10 litres de volume final de milieu de culture, qui est initialement un litre, correspond à un rendement de production de 90 mg/L. Avantageusement, les acides nucléiques codant respectivement le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 13, ont fait l'objet d'une optimisation de codons.

La présente invention est basée sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs que l'optimisation de codons de facteur H humain permet d'augmenter la productivité de facteur H humain recombinant dans plusieurs lignées cellulaires humaines.

L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés à pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourrait ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).

L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.

Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par :

(i) la séquence ID NO : 2,

(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut être calculé selon la formule suivante :

le nombre des résidus identiques x 100

le nombre des résidus de la séquence la plus courte

La séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence d'acide nucléique naturel codant le facteur H humain.

L'acide nucléique naturel codant le variant Y402 du facteur H humain est représenté par la séquence SEQ ID NO : 8.

L'acide nucléique naturel codant le variant H402 du facteur H humain est représenté par la séquence SEQ ID NO : 17.

Dans un autre mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant en outre un acide nucléique est choisi parmi :

- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou

- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou

- un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou

- un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 4 (PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4.

Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H humain peut être un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui sont sécrétées chez les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez l'homme comme ceux des immunoglobulines, de facteurs de croissance comme ΓΕΡΟ, des hormones comme l'insuline, d'enzymes comme le trypsinogène, de facteurs de la coagulation tel que la prothrombine.

La séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID NO : 5.

L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4 code un peptide signal artificiel.

La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de protéine recombinante dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de l'acide nucléique codant le précurseur de facteur H humain, comprenant l'acide nucléique codant le peptide signal et l'acide nucléique codant le facteur H humain, fait l'objet de l'optimisation de codons.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :

- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et

- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,

ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.

Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.

Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6.

La séquence SEQ ID NO: 6 correspond à une optimisation de codons du précurseur du facteur H humain qui comprend son peptide signal naturel.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :

- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et

- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14,

ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.

Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.

Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15.

Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique codant un précurseur de facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :

- un acide nucléique codant le facteur H humain et ayant fait l'objet de l'optimisation de codons, et

- un acide nucléique codant un peptide signal artificiel, qui ne correspond pas au peptide signal naturel de facteur H humain, mais peut conférer une capacité de sécrétion meilleure ou similaire à celle du peptide signal naturel du facteur H humain.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par:

- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et

- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,

ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.

Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7,

ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par :

- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et

- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14,

ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.

Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.

Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 24.

Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 8 peut être utilisé comme un contrôle de la productivité d'un acide nucléique optimisé codant le variant Y402 tel que décrit dans la présente invention. Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9.

Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou constitué par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, peut être utilisé comme un contrôle pour un acide nucléique optimisé codant le variant H402 tel que décrit dans la présente invention.

Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 18.

Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, le facteur H humain tel que défini ci-dessus est produit dans la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 293F.

La lignée cellulaire PER.C6® est issue de cellules rétinales primaires humaines dans lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène El A et le gène E1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral permet de conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par l'intermédiaire de la protéine E1B qui inhibe la p53. La protéine El A quand à elle a un tropisme pour le promoteur viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence génique qui sera insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être le Facteur H.

La lignée cellulaire PER.C6® produit, par voie endogène, à la fois le variant H402 du facteur H humain et le variant Y402.

La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, 7 ou 9.

La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.

La lignée cellulaire HEK 293F produit par voie endogène uniquement le variant Y402 de facteur H humain.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou 7.

La présente invention concerne également l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, telle que la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est un acide nucléique génomique comprenant des introns artificiels ou naturels de facteur H humain ou d'un autre gène humain et des exons naturels de facteur H humain.

La présente invention concerne également l'acide nucléique codant un facteur H humain recombinant, tel que le variant Y402 du facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou le facteur H variant H402 représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.

Les SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 13 ne contiennent pas la séquence correspondant à celle du peptide signal du Facteur H.

Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant ayant la séquence SEQ ID NO : 1, comprenant un acide nucléique représenté par :

(i) la séquence SEQ ID NO : 2, ou

(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant ou constitué par:

un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%>, notamment 90%o, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.

Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant ou constitué par:

un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et

un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.

Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou constitué par:

un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et

un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14.

Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou constitué par:

un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%), particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et

un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14.

Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 24.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 16 est constituée de la SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 19.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 21 est constituée de la SEQ ID NO : 4 et de la SEQ ID NO : 20.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 22 est constituée de la SEQ ID NO : 3 et de la SEQ ID NO : 20.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 23 est constituée de la SEQ ID NO : 3 et de la SEQ ID NO : 19.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence FH 402H optimisé 2.

Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 20 correspond à la séquence FH 402Y optimisé 2.

La présente invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant ou constitué par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet des cellules humaines, notamment transformées, produisant du facteur H recombinant humain avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des cellules humaines ayant un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus particulièrement à 50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des cellules humaines transformées par un vecteur tel que défini ci-dessus.

Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne des cellules humaines produisant du facteur H recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier, des cellules humaines de l'invention sont choisies parmi PER.C6® et HEK 293F.

Dans un mode de réalisation particulier, les cellules humaines de l'invention forment un clone cellulaire.

La présente invention concerne aussi un procédé de la préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée cellulaire humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de culture de ladite lignée cellulaire transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain.

Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du métier.

La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en œuvre par des techniques d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène gun) ou encore à l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des agents cationiques des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :

(i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,

(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir l'expression du facteur H dans le milieu de culture. Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux antibiotiques pour permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de cellules produisant de façon stable la protéine d'intérêt.

Dans un mode de réalisation plus particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :

(i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée,

(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir l'expression de facteur H dans le milieu de culture,

(iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et

(iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme recombinante du facteur H purifié à l'étape (iii).

La purification du facteur H humain est mise en œuvre par des techniques de chromatographie en une, deux ou plusieurs étapes. La purification en une étape peut-être une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'affinité (héparine, ligand du facteur H ou anticorps anti-facteur H). La purification en deux étapes peut-être une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne d'affinité ou une étape de de chromatographie sur colonne d'affinité suivi d'une une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. La purification en plus de deux étapes peut-être réalisé par une combinaison de ces différentes chromatographies. Une étape de diafîltration, d'ultrafîltration ou de gel filtration peut-être réalisée en complément. La pureté d'un produit après une telle purification peut atteindre 99% de produit purifié.

Plus particulièrement, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit acide nucléique comprenant :

(i) un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%>, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75 %, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,

ou

(ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant au moins 85%>, notamment 90%>, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et

- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%>, de préférence au moins 85%>, notamment 90%>, particulièrement 95%> d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.

Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :

(i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou

(ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.

Dans un mode de réalisation plus avantageux, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :

(i) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou

(ii) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.

La lignée cellulaire utilisée dans le procédé selon la présente invention peut être la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F.

La présente invention a également pour objectif de fournir un facteur H recombinant possédant une pureté supérieure à 90%> de préférence supérieure à 95%>.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique. L'activité biologique du facteur H humain plasmatique comprend la régulation de l'activité du facteur I, l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne et l'accélération de la dissociation de la C3 convertase.

Les méthodes pour déterminer les activités biologiques ci-dessus sont connues de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique pour accélérer la dissociation de la C3 convertase.

La quantité de C3 convertase dissociée peut être déterminée en fonction de la concentration de FH ajouté. L'IC50 est déterminée à partir de l'équation calculée pour une sigmoïde à pente variable.

Dans un autre mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain recombinant conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler l'activité du facteur I.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement un variant de facteur H humain recombinant en tant que substance active, ledit variant étant un variant mentionné dans le site internet http ://www.uniprot.org/uniprot/ P08603.

Particulièrement, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant Y402 de facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , sans le variant H402 de facteur H humain.

Le variant Y402 de facteur H humain recombinant peut être produit par la lignée cellulaire HEK 293F qui produit par voie endogène uniquement le variant Y402.

La production du variant Y402 recombinant peut être également mise en œuvre par la lignée cellulaire PER.C6® qui produit par voie endogène à la fois le variant Y402 et le variant H402, suivie par une purification ou une séparation qui permet de séparer le variant Y402 du variant H402. La lignée cellulaire PER.C6® peut également être modifiée pour ne pas produire par voie endogène le variant H402.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant H402 du facteur H humain, sans le variant Y402 représenté par la séquence SEQ ID NO : 1.

Le variant H402 du facteur H humain recombinant peut être produire par la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 293F. Une purification ou une séparation est nécessaire afin de séparer le variant H402 du variant Y402. Les lignées cellulaires PER.C6® et HEK 293F peuvent également être modifiées pour ne pas produire par voie endogène le variant Y402.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le variant H402 et le variant Y402 en tant que substance active.

Une composition pharmaceutique selon la présente invention comprend également un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant plus de 99,5% d'un variant de facteur H humain et moins de 0,5% d'un autre variant de facteur H humain.

La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après. Ces figures et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente invention.

Figures

Figure 1 signifie dosage de facteur H endogène dans les cellules PER.C6® et HEK

293F

Figure 2 signifie génération de pools stables PER.C6® exprimant de façon stable le facteur H recombinant (ici exemple pour le facteur H variant H402)

Figure 3 signifie cinétique de la production de facteur H recombinant (H402) dans les pools stables PER.C6® en mode batch.

Figure 4 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les cellules HEK 293F en mode batch pendant 7 jours.

Figure 5 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les pools stables PER.C6® en mode batch pendant 7 jours.

Figure 6A signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant des cellules PER.C6® et HEK 293F par SDS-PAGE

Figure 6B signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant des cellules PER.C6® et HEK 293F par Western Blot.

Figure 6C illustre la comparaison du profil électrophorétique du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK avec celui du facteur humain plasmatique purifié (lot LFB) en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie après traitement ou non par un agent réducteur (DTT). Figure 6D illustre l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique purifié (lot LFB) par Western Blot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-facteur H (The Binding Site, réf : PC030).

Figure 7A signifie Purification du Facteur H sur colonne Héparine suivi d'une étape de diafîltration.

Figure 7B illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie des étapes de purification en une étape de chromato graphie échangeuse de cations (SP-sepharose) du facteur H humain recombinant produit dans par les cellules PERC6. Le surnageant de départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du procédé de purification (pistes 3-7, piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 : fraction non retenue (FNA), piste 5 : lavage, piste 6 : eluât SPpiste 7 : eluât NaCl 2M) et le produit final (FH recombinant humain Y402) purifié, concentré et filtré (piste 8 : bande majoritaire à 120,6 kDa, 98,4%)) ont été déposés. Le produit final a également été déposé en conditions réductrices (piste 9 bande majoritaire à 143,5 kDa, 93,9%)). Les pistes 1 et 10 sont des témoins de masse.

Figure 7C illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie des étapes de purification en deux étapes de chromatographie échangeuse d'ions (SP-sepharose puis Q-sepharose) du facteur H humain recombinant produit dans par les cellules HEK. Le surnageant de départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du procédé de purification (pistes 3-7 et 10-14 : piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 : fraction non retenue (FNA) 1ère chromatographie, piste 5 : lavage 1ère chromatographie, piste 6 : eluât 1ère chromatographie, piste 7 : eluât NaCl 2M 1ère chromatographie, piste 10 : eluât 1ère chromatographie, piste 11 : fraction non retenu (FNA) 2ème chromatographie, piste 12 : lavage 2ème chromatographie, piste 13 : éluât 2ème chromatographie, piste 14 : eluât NaCl 2M 2ème chromatographie) et le produit final (FH recombinant humain Y402) purifié, concentré et filtré (piste 15) ont été déposés. Le produit final a également été déposé en conditions réductrices (piste 16). Les pistes 1, 8, 9 et 17 sont des témoins de masse.

Figure 8A signifie Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase en présence de surnageant (Sn) des cellules PER.C6® et HEK 293F contenant du facteur H humain recombinant (variant Y402 ou variant H402).

Figure 8B décrit Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du Facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PER.C6® et HEK 293F et du Facteur H humain plasmatique. Figure 9A et 9B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK par tamisage moléculaire. 95 μg du facteur H humain recombinant purifié produit dans PERC6 (Figure 9 A) et 50 μg du facteur H humain recombinant purifié produit dans HEK (Figure 9B) ont été injectés séparément sur une colonne de gel filtration (GE Healthcare, Superdex 200 10/300 GL, réf : 17-5175-01). Un pic majoritaire (99% et 97% respectivement pour PERC6 et HEK) d'une taille de 377-378 kDa correspondant au facteur H humain est observé.

Figure 10 A et 10B illustrent Pelectro focalisation par électrophorèse capillaire du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 (Figure 10A) et HEK (Figure 10B).

Figure 11A et 11B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK par électrophorèse capillaire en gel SDS en conditions non-réductrices (Figure 11 A) ou en conditions réductrices (Figure 11B).

Figures 12 A, 12B, 12C et 12D illustrent l'analyse de l'activité cofacteur du Facteur I (FI) des FH humains recombinants PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique formulé (FH form.) ou en tampons PBS IX (FH dess). 10μg de protéine C3b et 140ng de facteur I sont incubés à 37°C pendant 30min en présence de quantités croissantes de facteur H (50, 100, 250, 500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en SDS-PAGE afin de quantifier les bandes correspondants aux chaînes a' et β de la molécule C3b ainsi qu'aux fragments clivés a' 1 et a'2 de la chaîne '. Le pourcentage de molécules C3b inactivées est ensuite calculé par le rapport entre la quantité de chaînes a' clivées et la quantité totale de chaîne '.Figure 13 montre la courbe dose-réponse de l'inhibition de la lyse des globules rouges de mouton par le facteur H humain plasmatique (PB03 ou LP03) ou recombinant (PERC6 ou HEK).

Exemples

Exemple 1: Matériels et Méthodes

1.1 Optimisation de l'acide nucléique codant le facteur H humain

L'optimisation de séquence à été faite par l'algorithme du fournisseur de gène de synthèses avec optimisation pour Homo sapiens en évitant les sites de restrictions nécessaires au clonage moléculaire 1.2 Transfection des vecteurs pcDNA2001neo contenant les séquences du Facteur H dans les cellules PER.C6® pour générer des pools stables.

La transfection en pools stables est réalisée en parallèle avec le vecteur pcDNA2001neo vide (= sans séquence de Facteur H). Les transfections en pool stables sont effectuées selon le nouveau protocole décrit ci-dessous.

L'électroporation sera effectuée avec les vecteurs suivants:

MD1Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9.

MD2Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 6.

MD3Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.

MD1H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 18.

MD2H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 15

MD3H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 24.

- Pré-culture des cellules

Les cellules pour la transfection en pool stable, issues de la culture en suspension à partir de cellules en suspension stockées en cryotube dans du milieu sans sérum, sont des cellules PER.C6 SF adaptées en milieu Permab (Hyclone, ThermoFisher Scientifïc) et sous agitation. Elles ont été cultivées durant 3 semaines sous agitation à 125rpm.

Deux jours avant électroporation, les cellules sont passées en suspension à 5 ^E 5 cv/mL par un changement complet du milieu Permab. Le volume est adapté au nombre de cuvettes planifié lors de l'électroporation. Le jour de l'électroporation, la concentration cellulaire et la viabilité sont déterminées. Les cellules doivent être en phase exponentielle de croissance et avoir une viabilité supérieure à 90%.

Avant l'électroporation, le milieu Permab (3 mM L-Glutamine) est préchauffé à température ambiante.

- Electroporation

Les étapes suivantes sont effectuées dans 6 cuvettes :

Pré-aliquoter 60 mL dans un T150 et préchauffer à 37 °C (soit 10 mL par cuvette)

Les étapes suivantes sont effectuées dans chaque cuvette :

Centrifuger 6 ^E 6 cv à 300g durant 5 minutes et jeter le surnageant

Re-suspendre les cellules en agitant le tube un dizaine de fois

Ajouter 400 de milieu Permab (3 mM L-Glutamine) à température ambiante, sans laisser les cellules plus de 15 minutes.

- Ajouter 8 μg d'ADN dans un tube Eppendorf 1,5 mL stérile

- Ajouter délicatement 400 de suspension cellulaire sur les 8 μg d'ADN

Transférer la suspension ADN/Cellules dans une cuvette d'électroporation 4mm. Vérifier l'absence de bulles au fond de la cuvette.

Après avoir transféré la cuvette dans la chambre à électroporation, appliquer le programme suivant de BioRad Gene Puiser Xcell :

Voltage (v)

Durée de la pulsation (msec)

Nombre de pulsations

Intervalle de pulsations (sec)

Cuvette (mm)

Ecarter les amas blancs flottant en surface (débris cellulaires) et prélever délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette de 1 mL.Ajouter les cellules directement dans les 60 mL de milieu préchauffé à 37°C. Ne pas le faire au goutte à goutte afin d'éviter la formation de précipités.

Recommencer les étapes suivantes jusqu'à l'obtention des 6 cuvettes pour la génération du pool stable PER.C6®.

Sélection et génération d'un pool stable

48 heures après la transfection, l'efficacité de transfection est évaluée. La culture cellulaire est resuspendue et un comptage sur 1 mL est effectué. La concentration en cellules viables divisée par celle de départ (6E5 cv/mL) permet d'obtenir le pourcentage de recouvrement de la viabilité.

Un récipient à 5E5 cv/mL est ensemencé par changement total du milieu et ajout de Permab (3 mM L-Glutamine) et G418 à 125 μg/mL. La totalité des cellules est centrifugée à 300g pendant 5 min avant l'ajout du milieu de sélection.

Les cellules sont passées deux fois par semaine (le lundi et le vendredi) par renouvellement complet du milieu de sélection. Le volume et le contenant sont adaptés de manière à obtenir une concentration de 3E5 cv/mL à chaque passage. Après 2-3 semaines la viabilité cellulaire s'améliore. Lorsque celle-ci atteint environ 50 %, des cultures en conditions agitées peuvent être initiées. Dans ce cas, la concentration de départ est de 5E5 cv/mL. Lorsque la culture atteint plus de 85 % de viabilité, une cryoconservation est effectuée à 5E6 cv/ampoule.

Ensemencement de la culture en Batch pour production de Facteur H recombinant:

Le volume du récipient utilisé pour le Batch est de 250 ml avec un volume initial de travail de 30 ml. Tout changement de volume de récipient entraîne automatiquement une adaptation des volumes et valeurs énoncés dans ce protocole.

Les cellules sont ensemencées à une concentration de 1 ^E 6 cv/ml par renouvellement complet du milieu de culture. Les cellules sont incubées pendant 7 jours à une température de 36.5°C en agitation 125 rpm sans renouvellement ou ajout de milieu. Un prélèvement est réalisé tous les jours entre le 3 ^eme et 7 ^eme jour de culture afin de déterminer la viabilité, la densité cellulaire et la production de Facteur H recombinant.

Le 7 ^eme jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 μιη puis congelé à -20°C.

1.3: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production transitoire de Facteur H recombinant.

Pre-culture des cellules:

La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées à une concentration cellulaire de 7 ^E 5 vc/ml.

Transfection transitoire :

La densité cellulaire et la viabilité des cellules HEK 293F sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 30 ^E 6 cv/ml est centrifugé. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu de culture F17 (Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 °C.

Formation du complexe agent de transfection / ADN en rapport 2: 1 : L'agent de transfection (Fectine ou PEI) et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4 contenant une des séquences du Facteur H sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante:

- Ajout de 3(^g dADN dans 1 ml d'OptiMEM

- Ajout de 60 μΐ de Fectine ou 60 μΐ de PEI dans 1 ml d'OptiMEM.

Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée délicatement à celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées.

Les cellules sont alors incubées à 37°C en agitation à 125 rpm.

Témoin positif de transfection: un vecteur exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein) est également transfecté dans les mêmes conditions. 24h post-transfection l'efficacité de transfection est déterminée par microscopie à fluorescence (rapport nombre de cellules exprimant la GFP sur nombre total de cellules).

Témoin de croissance: des cellules HEK 293F sont transfectées dans les mêmes conditions mais en l'absence de vecteur d'expression. Ce témoin permet de déterminer la viabilité post-transfection et si il y a une toxicité lié à la production transitoire de la protéine exogène (le facteur H recombinant).

Production transitoire de facteur H:

Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou renouvellement de milieu de culture. La densité cellulaire et la viabilité est déterminé tous les jours entre le 5 ^eme et le 7 ^ème jour.

Le 7 ^eme jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 μιη puis congelé à -20°C.

1.4 Test de viabilité de cellules La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées à l'aide d'un automate analyse de culture cellulaire (Cedex, Innovatis - Roche Applied Science). La mesure de la viabilité est basée sur le comptage des cellules ayant incorporées du bleu trypan.

1.5 Caractérisation du facteur H humain recombinant

SDS-PAGE:

- Préparation des échantillons: l'équivalent de ^g de protéine est mélangé en vol/vol avec du tampon Laemli 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95°C afin de dénaturer les protéines.

Les protéines sont alors déposées dans les puits d'un gel linéaire 10 % Bis-Tris /Hcl pH 6.4. La migration est réalisée en présence d'un tampon MOPS (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7).Les protéines sont séparées à un voltage constant de 200 volts pendant 60 minutes.

Coloration au bleu de coomassie:

Après migration, le gel est lavé 3 fois 5minutes avec de l'eau distillée puis coloré avec une solution de bleu de coomassie durant la nuit. L'excès est éliminé par des lavages successifs avec de l'eau ditsillée. Une photo du gel est alors prise à l'aide d'un imageur.

Révélation par Western Blot:

Après migration, le gel est transféré dans un tampon contenant 40mM d'acide Amino- 6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8.

Sur un appareil de transfert semi-sec (TE77, Amersham Pharmacia), un sandwich est réalisé de l'anode vers la cathode de la façon suivante:

- 6 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 0.3M pH 10.4

- 3 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4

- 1 membrane de nitrocellulose (RPN 303E, GE Healtcare) pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4

- le gel pré-incubé dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8

- 9 papiers whatman pré-incubés dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8 Le transfert est réalisé à intensité constante de 0.8mA/cm ² de membrane pendant 60 minutes.

Après transfert, la membrane est saturée sur la nuit à 4°c dans un tampon PBS contenant 1% de BSA et 0.1% de tween20. La membrane est ensuite lavée avec de l'eau physiologique contenant 0.1 % de tween 20. Le facteur H est révélé à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-facteur H (MCA 508G, Serotec) à la concentration de 0^g/ml incubé à température ambiante pendant 60 minutes, suivi d'un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la Peroxidase à la concentration de 80ng/ml incubé à température ambiante pendant 60 minutes. Les protéines marquées sont alors révélées à l'aide d'un kit enzymatique de chimiluminescence et détectées à l'aide d'un imageur équipé d'un détecteur photonique.

1.6 Dosage de facteur H humain dans le milieu de culture par ELIS A

TAMPON ET SOLUTIONS:

1- Tampon de coating : PBS

Dissoudre le contenu d'un sachet de sels pour tampon PBS, pH 7.4 (Sigma : P-3813 ou sels de qualité équivalente) dans un litre d'eau PPL

2- Anticorps de coating: Immunoglobulines de mouton anti-Facteur H humain (The Binding Site - Réf : PC030

Extemporanément, diluer l'anticorps dans le tampon de coating pour obtenir une concentration comprise entre 3,5 et 5,5 μg/ml.

3 - Tampon de saturation: Tampon PBS - BSA 1 % (p/vol)

Pour une plaque, dissoudre 0,15 g de BSA (BSA : Sigma - Réf. : A7030 ou Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 001-000-162 ou une BSA de qualité

équivalente) dans 15 ml de tampon PBS.

4- Tampon de lavage: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol)

Ajouter 1 ml de Tween 20 à 1 litre de PBS.

5 - Tampon de dilution: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 % (p/vol) Tampon pour la dilution du standard, des échantillons à doser et de l'anticorps de révélation. Dissoudre le tampon de saturation au l/10ème en tampon de lavage. 6 - Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site, Réf. : RP030

Reprendre le lyophilisât par le volume d'eau PPI indiqué par le fournisseur et attendre 30 min, puis répartir en fractions aliquotes de 20μ1 et les congeler à -70°C.

Diluer le standard au l/7000ème (pour un std à 700 mg/L), pour obtenir une solution mère de 100 ng/ml, soit :

1ère prédilution au l/70ème : 5μ1 de Std + 345μ1 de tampon de dilution,

2ème prédilution au l/100ème : 5μ1 de la 1ère prédilution + 495 μΐ de tampon de dilution.

Puis diluer de ½ en ½ dans le tampon de dilution sur 7 points,

Le blanc est réalisé avec le tampon de dilution.

7 - Echantillons

Les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de celle du premier point de gamme. Puis diluer de ½ en ½ sur 8 points.

8- Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de souris purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC - Réf : MCA508G .

Extemporanément diluer l'anticorps dans le tampon de dilution au l/5000 ^eme , soit pour 1 plaque : 2 μΐ dans 10 ml de tampon de dilution.

9 - Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèyre anti-IgG de souris marquées à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 115-035-062).

Extemporanément diluer les anticorps dans le tampon de dilution au l/10000ème (l/50ème puis l/200ème) soit pour une plaque :

l/50ème : 2 μΐ dans 98 μΐ de tampon dilution, puis l/200ème : 50 μΐ dans 10 ml de tampon dilution.

10- Solution de révélation: TMB Kit

Mélanger extemporanément volume à volume la solution de substrat de la peroxydase (3,3 ^' ,5,5 ^' -tetramethylbenzidine) et la solution de peroxyde.

11- Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific, Ref : 0379D). MODE OPERATOIRE

Sensibilisation de la phase solide

Dans une plaque de microtitration, distribuer 100 μΐ par puits d'anticorps de coating dilué

Recouvrir d'une feuille adhésive.

Incuber une nuit à + 4° C et vider la plaque par retournement. Saturation de la phase solide

Distribuer 120 μΐ par puits de solution de saturation.

Recouvrir d'une feuille adhésive.

Incuber lh à 20° C.

Laver 3 fois en tampon de lavage. Capture de l'antigène

Distribuer 100 μΐ par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution du standard et des échantillons.

Recouvrir d'une feuille adhésive.

Incuber 1 heure 30 à 20° C.

Laver 5 fois en tampon de lavage. Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal

Distribuer 100 μΐ par puits de l'anticorps monoclonal.

Recouvrir d'une feuille adhésive.

Incuber 1 heure 30 à 20° C.

Laver 5 fois en tampon de lavage. Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase) Distribuer 100 μΐ par puits de l'anticorps de révélation.

Recouvrir d'une feuille adhésive.

Incuber 1 heure à 20° C.

Laver 5 fois en tampon de lavage. Réaction enzymatique Distribuer 100 μΐ par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps régulier et loin de toute lumière intense.

Incuber à température ambiante entre 5 - 15 minutes..

Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage.

Arrêt de la réaction

Distribuer 100 μΐ d'H2S04 4N par puits à intervalle de temps régulier.

Lire les densités optiques (DO) à 450 nm.

EXPLOITATION DES RESULTATS

La droite de régression linéaire de la courbe standard est définie par les couples (Log (DO à 450 nm-DO blanc), Log de la concentration de Facteur H en ng/ml).

Le résultat est la moyenne de tous les résultats obtenus pour un même échantillon dans la zone linéaire de la droite obtenu pour la gamme du standard.

1.7 Caractérisation du facteur H humain recombinant purifié

Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée PER.C6® est purifié par chromatographie échangeuse d'ions en une étape.

Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée HEK 293 est purifié par chromatographie échangeuse d'ions en deux étapes.

Les résultats de l'analyse en SDS-PAGE des étapes de purification du Facteur H recombinant produit par les cellules PER.C6® ou HEK 293 sont illustrés aux figures 7B et 7C.

La présence du facteur H humain recombinant purifié est révélée par gel SDS-PAGE qui est coloré par bleu de Coomassie et par Western blot selon la partie 1.5 décrite ci-dessus.

Les résultats de l'analyse du FH humain recombinant purifié par SDS-PAGE ou par Western-blot sont illustrés respectivement par les figures 6C et 6D.

Le facteur H humain recombinant ainsi purifié est analysé par tamisage moléculaire, par électrofocalisation en électrophorèse capillaire ou par électrophorèse capillaire en gel SDS selon les méthodes décrites ci-après.

Tamisage moléculaire

1.Mode opératoire

50 à 100 μg de facteur H humain recombinant sont injectés sur une colonne de gel filtration Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, réf : 17-5175-01) préalablement équilibrée en tampon PBSIX. La séparation est réalisée un débit constant de 0,4ml/min sur un appareil FPLC couplé à un détecteur UV (GE Healthcare, Akta Prime).

Le résultat de l'analyse par tamisage moléculaire est illustré par les figures 9 A et 9B.

2. Résultats

Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée cellulaire HEK 293F présente un pic majeur ayant un temps de rétention de 27,88 min qui correspond au FH (Fig. 9A)

Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée cellulaire PER.C6 présente un pic majeur ayant un temps de rétention de 27, 89 min qui correspond au FH et un pic mineur qui sort à 21,07 min correspondant à des formes agrégées du FH recombinant (Fig. 9B).

Electrofocalisation en électrophorèse capillaire

1 mode opératoire

La détermination des iso formes des FH recombinants est réalisée par électrophorèse capillaire en utilisant le kit Advanced cIEF Starter kit (Beckman Coulter, A80976) et l'appareil d' électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman Coulter).

75 μg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont dessalés par centrifugation sur Zeba Desalt Spin columns (Pierce), séchés au Speedvac à température ambiante puis repris par un volume d'eau ultra-pure de sorte à obtenir une concentration en protéine de 5 à 10 mg/ml.

10 μΐ chaque échantillon sont ensuite mélangés avec 240 de mix constitué de 200 μΐ d'urée 3M, 12 μΐ de Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes, 20 μΐ de stabiliseur cathodique, 2 μΐ de stabiliseur anodique et 2 μΐ de marqueurs de pi compris entre 4,1 et 10.

Les préparations d'échantillons sont injectés sur un capillaire eCAP™ (Beckman Coulter, 477441) en utilisant la méthode pré-programmée Basic pH Gradient Séparation Method met. Afin de vérifier la linéarité de la migration en fonction des pi, un mélange de 5 marqueurs (de pi 4,1 à 10) est injecté en début et en fin de séquence d'analyse.

2 Analyse des résultats et calcul des pl

Après intégration des pics de l'électrophérogramme le logiciel 32 Karat calcule automatiquement les valeurs de pl de l'échantillon. Le résultat est illustré aux figures 10A et 10B. L'analyse montre la présence de plusieurs iso formes dont le pi expérimental varie faiblement (entre 5.53 et 6.01 et entre 5.86 et 6.13 pour PERC6 et HEK respectivement) avec des valeurs proche du pi théorique du FH humain qui est de 6.12 (voir le tableau ci-après).

Electrophorèse capillaire en gel SDS :

1. Mode opératoire :

La détermination des masses moléculaires des FH recombinants est réalisée par électrophorèse capillaire en utilisant le SDS-MW Analysis kit (Beckman Coulter, 390953) et l'appareil d' électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman Coulter). 200 μg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont mélanger avec 150 μΐ de tampon échantillon (100 mM Tris-HCl pH 9,0, 1% SDS) et centrifugé sur Centricon YM- 10 (Millipore, PN 4205) à 4000 g pendant 10 min. L'opération est répétée 2 fois (ajout de 150 μΐ de tampon échantillon et centrifugation à 4000 g 5 min) puis le volume est compléter à 100 μΐ par du tampon échantillon.

Pour l'analyse en conditions non-réduites, 50 μΐ de l'échantillon sont prélevés et mélangés avec 45 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de standard interne 10 kD, 5 μΐ d'iodo-acétamide à 250 mM et chauffer à 70°C pendant 10 min. Pour l'analyse en conditions réduites, les 50 μΐ restants sont mélangés avec 45 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de standard interne 10 kD, 5 μΐ de 2-mercaptoéthanol et chauffés à 70°C pendant 10 min.

Une solution se standard de poids moléculaire est également préparée en mélangeant 85 μΐ de tampon échantillon, 2 μΐ de SDS-MW marqueur de taille (10 à 225 kD) et 5 μΐ de 2- mercaptoéthano 1. Les échantillons ainsi préparés sont analysés par injection sur un capillaire 50 μηι I.D. bare-fused silica 2 en utilisant la méthode pré-programmée SDS MW Conditioning- PA800 plus-met.

A partir de la courbe de calibration standard, le poids moléculaire des échantillons est déterminé par le logiciel 32 Karat. L'intégration des pics permet de calculer le pourcentage que représente chaque pic de l'échantillon.

2. Analyse des résultats :

A partir de la courbe de calibration du standard, le poids moléculaire des échantillons est déterminé à l'aide du logiciel 32 Karat. L'intégration des pics de permet de calculer les proportions de chaque pic de l'échantillon. Le résultat est illustré aux figures 11 A et 11B et le tableau ci-après.

Le profil électrophorétique montre la présence d'un pic très majoritaire (>95%) qui correspond au facteur H humain purifié et dont la taille est de 173 - 176 kDa en conditions non réductrices (Figure 11A) et de 143-148 kDa en conditions réductrices (Figure 11B).

HEK PER.C6

Conditions pM

16 29 66 173 48 176 non (kDa)

réductrices Aire% 0,5 0,6 1,2 97,7 0,3 99,7 pM

Conditions 16 36 66 145 46 143

(kDa)

réductrices

Aire% 0,8 0,6 1,0 95,6 1,3 98,7

1.8 Caractérisation de l'activité biologique du facteur H humain recombinant

1.8.1 Activité anti-C3 convertase (C3 convertase Decav-accelerating activitv) TAMPONS ET SOLUTIONS

Tampon de recouvrement

Tampon carbonate 0.1M - pH 9.6

Na2C03 : 5.3 g dans 500 ml d'eau PPI (pour préparations injectables) 0.1 M

NaHC03 : 4.2 g dans 500 ml d'eau PPI 0.1 M Ajouter 30 ml de la solution Na2C03 à 70 ml de la solution NaHC03 et ajuster éventuellement le pH à 9.6. Conserver à 4° C pendant 2 mois. Tampons de lavage

a) Tampon PBS pH 7.4 (Sigma) + Tween 20 0.1 % (= Tampon A)

Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml de tampon PBS pH 7.4.

Conserver à + 4° C (2 jours maximum).

b) Tampon phosphate de Sodium 10 mM , NaCl 25 mM , pH 7.2 ± 0.05 (= Tampon B) Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 1.56 g de NaH2P04, 2H20.

Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 3.58 g de Na2HP04,12 H20.

Ajouter environ 66 ml de la solution de Na2HP04 à 34 ml de la solution de NaH2P04. Ajuster le pH à 7.30. Ajouter le NaCl nécessaire pour obtenir une concentration finale à 25 mM. Ce tampon peut être conservé à 4°C pendant 1 mois.

Ce tampon sert de base pour les tampons de saturation, de dilution et de lavage.

Pour obtenir le tampon de lavage (= Tampon C) :

Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml du tampon B.

Conserver à + 4° C (2 jours maximum). Tampon de saturation

Préparer un volume suffisant à partir du tampon B. Ajouter 1 % de BSA (m/v).

Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Tampon de dilution D

Préparer le volume nécessaire avec du tampon B auquel on ajoute du Tween 20 à la concentration de 0.05 % et de la BSA à la concentration de 4 % (m/v) .

Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Tampon de dilution E

Préparer le tampon de dilution E à partir de PBS pH 7.4 auquel on ajoute 0.1 % de BSA (m/v).

Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. Solution de C12 20 mM, NaCl 25 mM Peser 0.475 g de C12 qsp 100ml d'une solution de NaCl 25 mM (conservation maximum de 3 mois à + 4° C). Tampon substrat

Tampon citrate 0.1 M + H202 30%.

Tampon citrate :

Dissoudre dans un litre d'eau PPI 29 g de citrate de sodium et 4.1 g d'acide citrique.

Ajuster si besoin le pH à 5.5.

Conserver à + 4° C pendant 3 mois maximum.

Ajouter extemporanément 10 μΐ de H202 30 % à 10 ml de tampon citrate le jour de son utilisation et conserver à l'abri de la lumière. Solution d'arrêt.

Solution d'acide sulfurique 4N (2M) a préparer ou prête à l'emploi.

Préparer un litre : 100 ml H2S04 18M + 900 ml d'eau PPL

Stocker à température ambiante pendant 6 mois maximum.

MODE OPERATOIRE

Recouvrement des plaques

Diluer le C3b dans le volume nécessaire à l'essai dans le tampon de recouvrement pour avoir une concentration finale à 2.5 μg/ml (10 ml pour une plaque de 96 puits). Ex : pour le lot D28449 à 1 mg/ml, diluer 25 μΐ dans 10 ml de tampon de tampon de recouvrement.

Distribuer 100 μΐ de la solution préparée dans chaque puits.

Recouvrir la plaque d'un adhésif.

Incuber la plaque l H à l H 15 à + 34° C puis une nuit à + 4° C.

Lavages

Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 μΐ de tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.

Vider par retournement.

Saturation

Distribuer 300 μΐ de tampon de saturation par puits.

Incuber 1 H à 1 H 15 à + 34° C.

Vider par retournement.

Etape de la génération de la convertase. Préparer la solution suivante (10 ml pour une plaque de 96 puits) :

- Solution de C12 20 mM, NaCl 25 mM : 750 μΐ (concentration finale C12 : 1.5 mM)

- Facteur B Calbiochem (1 mg/ml) : 40 μΐ (concentration finale : 4 μ§/ι 1)

- Facteur D Calbiochem (0.1 mg/ml) : 30 μΐ (concentration finale : 0.3 μg/ml)

- Tampon de dilution D : 9180 μΐ.

Déposer 100 μΐ / puits et incuber 2 heures à + 34° C.

Lavages.

Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.

Vider par retournement.

Préparation des gammes de facteur H.

Les gammes de facteur H sont faites à partir d'un pool plasma (ECQ 1) et d'un lot de référence ou de tout échantillon contenant du facteur H à doser. La concentration antigénique Elisa ou la DO 280 sert de base à l'établissement des gammes par des dilutions successives non indépendantes. Le choix de la méthode de dosage est la suivante :

- Technique en Elisa pour le Pool Plasma et les échantillons de pureté intermédiaire.

- Mesure de la DO 280 pour le lot de référence, un PV ou un produit final réhydraté.

- Incuber 32 à 34 minutes maximum à + 34° C.

Lavages

Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage 3.3.2 b). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.

Vider par retournement.

Incubation de l'anticorps anti-facteur B humain

Pour 10 ml de tampon de dilution E, ajouter 5 μΐ de l'anticorps anti-facteur B humain (Calbiochem réf. 341272) puis distribuer 100 μΐ/puits (dilution au 1/2000).

Incuber l H à l H 15 à 34° C

Lavages

Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 μΐ de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.

Vider par retournement.

Incubation de l'anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre marquée à la péroxydase. Les dilutions s'effectuent avec le tampon de dilution E :

- prédilution au 1/40 (10 μΐ d'anticorps + 390 μΐ de tampon) - dilution au 1/500 (20 μΐ de la prédilution + 9980 μΐ de tampon).

Distribuer 100 μΐ/puits et incuber à température ambiante pendant 25-30 mn à l'abri de la lumière.

Lavages.

Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 μΐ de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération.

Vider par retournement.

Réaction enzymatique.

Distribuer 100 μΐ de TMB par puits avec une pipette multicanaux, à intervalle régulier. Incuber la plaque 5 à 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière.

Arrêt de la réaction.

Distribuer 100 μΐ de la solution d'arrêt dans chaque puits, à intervalle régulier.

Lecture.

Lire extemporanément la plaque à 450 nm sur un lecteur de microplaque après une légère agitation.

EXPLOITATION DES RESULTATS.

Elimination des points aberrants.

Les valeurs d'absorbance obtenues en double pour chaque concentration de la gamme de facteur H pour la substance de référence, l'ECQ ou pour tout autre échantillon sont moyennées après élimination des valeurs aberrantes. Par exemple, pour les valeurs en duplicate des échantillons, de la substance de référence ou de l'ECQ, on accepte l'élimination d'un point par gamme et par niveau de concentration. Le choix du ou des points à éliminer permet d'améliorer la valeur du coefficient de corrélation (R2) et la précision de l'intervalle de confiance à 95 % de TEC 50 obtenu.

Utilisation du logiciel Prism (Logi Labo).

Ce logiciel permet de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable). L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :

Y : Bottom + ( Top -Bottom)/(l+10 ^A ((Log IC50-X)* Hillslope)

X est le logarithme de la concentration ^g/ml).

Y est la réponse (D.O).

Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente. La valeur moyenne d'absorbance de chaque dilution obtenue pour l'ECQ ou échantillon (gamme en double) est entrée dans la base de données pour chaque concentration correspondante.

L'analyse des données est agrémentée de la fonction « Runs test » qui permet d'estimer la déviation de l'essai par rapport au modèle choisi.

L'écart-type de l'IC50 est donné pour un intervalle de confiance de 95 %.

L'étude des courbes permet de visualiser l'ensemble des échantillons entre eux et de les comparer à l'ECQ.

Critères d'acceptation du dosage.

Le Δϋ.Ο de la gamme de tous les échantillons (référence et ECQ compris) doit être au minimum de 0.35. Toute valeur inférieure entraîne automatiquement le rejet de l'essai.

L'acceptation de cette condition permet ensuite de déterminer la valeur respective de leur IC50.

La valeur moyenne de l'IC50 du pool plasma est de 0.058 μg/ml.

Le dosage est valide avec une tolérance de deux écart-type ce qui donne une valeur moyenne de 0.058 ± 0.030 μg/ml. Tout nouvel ECQ doit être testé en parallèle de l'ancien sur au moins dix dosages afin d'en déterminer ses caractéristiques.

La moyenne des IC50 de la substance de référence et l'intervalle de confiance sont déterminés après la validation.

La valeur du coefficient de corrélation doit être au minimum de 0.99 pour chaque échantillon.

Le résultat pour le surnageant de culture PER.C6® ou HEK293F contenant du FH humain recombinant est illustré à la figure 8 A et le tableau ci-après.

Le résultat de l'activité du facteur H purifié est montré à la figure 8B et le tableau ci- après.

1.8.2 Activité cofacteur du Facteur I : Mode opératoire

L'activité co-facteur du FH est déterminée dans un test de clivage du C3b en phase liquide. Le C3b (l(^g) et le FI (140 ng) sont incubés seuls ou en présence de FH (250 ng) dans un volume de 100 μΐ en tampon imidazole 20 mM, NaCl 75 mM, pH 7,3 pendant 30 min à 37°C. La réaction est arrêtée par addition de tampon échantillon de Laemmli additionné de DTT puis les différents échantillons sont soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide comme décrit ci-dessus. Après coloration au bleu de Coomassie, les gels sont scannés et analyses par le logiciel Quantity-one pour déterminer les intensités relatives de chacune des bandes présentes dans chaque piste.

Tableau récapitulatif des mélanges réalisés

Résultats:

Le C3b a un poids moléculaire de 176 kDa et il est composé de 2 chaînes reliées par un pont disulfure: la chaîne a' de 101 kDa et la chaîne β de 75 kDa. La chaîne a' est clivée par le facteur I en 2 fragments appelés a'I (63 kDa) et a'2 (39 kDa), la chaîne β (75 kDa) reste inchangée.

Afin de pouvoir comparer les résultats obtenus, les intensités relatives sont normalisées par rapport à l'intensité de la bande β présente dans la piste du témoin C3b seul.

On calcule alors le pourcentage d'inactivation du C3b.par le rapport entre les chaînes a' clivées ((a' I + a'2)/2) et les chaînes a' totales : (α' + ((α' 1 + α'2)/2)) (Figure 12).

L'analyse des résultats présentés sur la figure 12D montre que les FH recombinants produits par les lignées PER.C6 et HEK 293F ont une activité co-facteur du FI similaire et que cette activité est comparable à celle du FH humain plasmatique.

Exemple 2: Construction de vecteur comprenant pCDNA2001néo-MDl

Le vecteur pCDNA2001néo-MDl comporte l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8, qui correspond à la séquence naturelle de ce facteur H humain.

Le vecteur pUC57-MDl envoyé par Genscript contient le gène de synthèse correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1, séquence naturelle du facteur H humain). La digestion du vecteur pUC57-MDl par les enzymes de restriction Notl et BamHI produit 2 fragments de 3000pb et 3700pb. Ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin.

Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restriction Notl et BamHI, qui produit 2 fragments de 25pb et de 5533pb. Après extraction par nucléospin et déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1) est inséré dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.

Après ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP 10.

L'insertion du fragment d'ADN correspondant à MD1 est vérifiée par PCR de Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'- CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3 ^* ) et MDl-lrev (SEQ ID NO : 11 5 ^* - GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3 ^* ), qui donne une bande de 758pb. Les clones bactériens positifs en PCR de criblage sont ensuite séquencés pour vérifier l'unité de transcription du facteur H contenue au sein du vecteur d'expression.

Exemple 3: Construction des vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néo- MD3 comprenant les séquences d'acides nucléiques du facteur H optimisé MD2 et MD3

Les vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néo-MD3 comportent respectivement l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 et la SEQ ID NO: 3, qui correspondent à la séquence optimisée de facteur H humain et la séquence optimisée du facteur H humain avec le peptide signal optimisé MB7.

Les vecteurs pUC57-MD2 et pUC57-MD3 envoyés par Genscript contiennent les gènes de synthèses correspondant respectivement à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 (MD2) et la SEQ ID NO: 3 (MD3). Ils sont digérés par les enzymes de restrictions Notl et BamHI, ce qui génère 2 fragments d'acide nucléique de 3000 et de 3700pb. Pour chaque vecteur, ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin.

Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restrictions Notl et BamHI, ce qui génère 2 fragments de 25 et de 5533pb. Après l'extraction par nucléospin et la déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à la séquence codante MD2 ou MD3 est insérée dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.

Après la ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP 10.

L'insertion de fragment de MD2 ou MD3 est vérifiée par PCR de Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5 ^* -CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG- 3 ^* )/MD2-lrev (SEQ ID NO : 12 5 ^* -TGTCACACTCGCGGTAGTTG-3 ^* ), qui donne une bande de 706pb.

Exemple 4: Génération de pools stables PER.C6® transfectés par pCDNA2001néo-MDl ou pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3. (figure 2).

Les cellules PER.C6® sont transfectées par le vecteur pCDNA2001néo-MDl ou le vecteur pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3 pour générer des pools stables selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (Exemple 1.2)

Il n'y pas de différence significative de viabilité entre les cellules transformées par différents vecteurs.

Exemple 5: Dosage par ELIS A du Facteur H recombinant (variants Y402 et H402) produits dans le surnageant de culture des cellules PER.C6® et HEK 293F (figures 3, 4 et 5).

Le surnageant de culture est préalablement dilué au l/500 ^eme , point à partir duquel une gamme de dilution est réalisée de ½ en ½ sur 8 points. Chaque point de la gamme et des échantillons à doser sont réalisés en duplicate. Le dosage est réalisé selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (exemple 1.6). Exemple 6: Caractérisation par SDS-PAGE et Western blot du facteur H recombinant présent dans le surnageant de culture ou purifié (variants Y402 et H402) (figures 6A, 6B et 7).

A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), un volume correspondant à ^g de facteur H recombinant est dilué au ½ dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95°C pendant 5 minutes puis déposé sur un gel linéaire de 10% polyacrylamide. Après migration, le gel est traité soit pour une coloration des protéines au bleu de coomassie soit pour un transfert sur membrane de nitrocellulose suivi d'un immunomarquage (Western Blot) tel que décrit dans ci-dessus (exemple 1.5).

Exemple 7: Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du facteur H recombinant (variants Y402 et H402).

A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), le facteur H recombinant est dilué à une concentration finale de 20 μg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de concentration décroissante de facteur H est ajouté au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34°C. Après plusieurs lavages, le facteur B restant complexé avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de facteur H ajoutée sont alors traitées tel qu'indiqué dans le protocole décrit ci-dessus (exemple 1.8). L'activité déterminée dans le surnageant d'extrait cellulaire ou après la purification est montré respectivement dans la figure 8A (surnageant) et 8B (purifié).

Exemple 8 : Détermination de l'activité cofacteur du facteur I des FH humains recombinants

L'activité cofacteur du Facteur I (FI) des FH humains recombinants produits dans la lignée PERC6 ou HEK et celle du FH plasmatique formulé ou en tampons PBS IX (dessalé) sont mesurées selon la méthode décrite dans la partie 1.8.2. 10μg de protéine C3b et 140ng de facteur I sont incubés à 37°C pendant 30min en présence de quantités croissantes de facteur H (50, 100, 250, 500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en SDS-PAGE afin de quantifier les bandes correspondants aux chaînes a' et β de la molécule C3b ainsi qu'aux fragments clivés α' 1 et α'2 de la chaîne '. Le pourcentage de molécules C3b inactivées est ensuite calculé par le rapport entre la quantité de chaînes a' clivées et la quantité totale de chaîne '.

Les résultats sont illustrés par les figures 12A, 12B, 12C et 12D.

Exemple 9 : Test de dosage de l'activité anti-hémolytique du facteur H humain sur des globules rouges de mouton (Test Sanchez-Corral)

Ce test permet de mesurer l'activité fonctionnelle de la partie C-terminale du facteur H recombinant humain purifié lors du développement de lots thérapeutiques en évaluant sa capacité à protéger des globules rouges de mouton de la lyse induite par un sérum dépiété ou déficient en facteur H fonctionnel. Ce test est adapté de la méthode « Sanchez-Corral » permettant de mesurer l'activité anti-hémolytique du facteur H présent dans le plasma de patients atteints du syndrome hémolytique urémique. (P. Sanchez-Corral, C. Gonzàlez-Rubio, S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41 (2004) 81-84).

Dans ce cadre, un mélange de sérum dépiété en facteur H et d'un pool plasma humain est réalisé en proportion égale afin de créer les conditions d'une lyse spécifique. L'ajout de facteur H recombinant humain purifié assure la protection des globules rouges de mouton (absence de lyse cellulaire) vis-à-vis d'une lyse induite par le complément

Sans CFH, la lyse spontanée des hématies est de 30%.

L'inhibition de la lyse des hématies de mouton par le rCFH est dose-dépendante et atteint son 100% d'inhibition à la dose de 4 μg. Il n'y a pas de différence entre les 2 rCFH mais une activité inhibitrice sensiblement supérieure à celle du CFH plasmatique.

A 40 μΐ d'une suspension d'hématies de mouton (lxlO ⁸ hématies/ml) sont ajoutés successivement 20 μΐ du tampon de réaction (Hepes 10 mM, NaCl 144 mM, MgC12 7 mM, EGTA 10 mM, pH 7.2), 2 μΐ de FH ou de PBS, puis 9 μΐ d'un pool de plasma humain suivi de 9 μΐ de plasma humain dépiété en FH. Après incubation 30 min à 37°C, 400 μΐ de tampon HBS-EDTA (Hepes 10 mM, NaCl 144 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) froid pour arrêter la réaction. Après centrifugation 5 min à 1730 g, 200 μΐ de surnageant sont prélevés, déposés dans une plaque de microtitration afin de mesurer l'absorbance à 414 nm.

Le pourcentage de lyse est déterminé selon la formule : O^ ^ _rfr Tube réaction -DO^ ^ _rfr Tube blanc

(— ) X100 Le témoin « 100% lyse » correspond à la lyse maximale des globules rouges de mouton observée en présence d'eau.

Le témoin blanc comprend le tampon de réaction + 50mM EDTA et correspond à la lyse spontanée des globules rouges de mouton.

Le résultat de ce test est illustré au tableau ci-après et à la figure