本发明涉及一种免疫层析试纸的制备方法，具 体涉及一种检测胎 膜早破免疫层析试纸的制备方法。

背景技术

免疫层析试纸是一种利用层析原理将待检测液 中的目标检测分 子或成分等在试纸条上流动至检测线 （T线）和质控线 （C线）， 当 检测线发生颜色变化则说明检测结果为阳性， 否则为阴性， 当质控线 发生颜色变化时， 则说明检测结果有效， 否则无效。

免疫层析试纸在检测或诊断某些疾病时具有非 常便利的优点，因 此其已被充分运用到多种疾病或症状的检测或 诊断过程中，例如早孕 试纸。 一般情况下， 免疫层析试纸包含有以下几种构成： 样品垫、 胶 体金结合垫、 层析膜、 吸水垫、 胶板， 所述样品垫、 胶体金结合垫、 层析膜和吸水藝依次粘贴在胶板上；所述层析 膜上依次设置有检测线 和质控线； 其工作原理为： 将待测液滴加至样品垫上， 待测液利用层 析原理流向胶体金结合垫，待测液溶解胶体金 结合垫中的胶体金结合 物， 并与其共同依次流向层析膜上的检测线和质控 线； 当待测液中含 有目标检测分子， 则目标检测分子、胶体金结合物会与检测线内 包含 的抗体成分结合从而形成免疫复合物， 同时检测线颜色发生变化； 当 待测液流至质控线时，质控线内包含的抗体成 分会与胶体金结合物结 合， 从而质控线颜色发生变化。 胎膜破裂（ Rupture of Fetal Membrane, 简称 ROM )在孕期可能 随时发生， 在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM )。 足月 后（37孕周后）PROM的发生率约为 10%,足月前（37孕周前） PROM 的发生率为 2-3.5%。 胎膜早破是引起产科病人产前、 产后并发症的 主要因素，也是导致胎儿早产和新生儿必须入 住重症监护室的主要原 因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及 孕妇感染的风险和胎儿 肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者 的管理成本高、难度大， 准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要 。

现有检测胎膜早破的方法中除以往的临床询问 病史等方法外 ,主 要以妊娠妇女阴道分泌物中的细胞间粘附分子 -1 (简称 ICAM-1 ) 为 检测指标的检测工具为较新的方法。其中以 ICAM- 1为检测指标的检 起到了较好的效果； 所述免疫层析试纸的检测线内包被有羊抗人 ICAM-1多克隆抗体工作液， 质控线内包被有羊抗鼠 IgG工作液， 胶 体金结合物中含有鼠抗人 ICAM-1单克隆抗体。

现有的以 sICAM-1 为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸虽 然为产科病人提供了便利， 但其灵敏性、特异性以及准确度均不够理 想， 从而容易造成误诊， 对产科病人来说同样会造成不便。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测胎膜早破免疫 层析试纸的制备方 法，该制备方法制备所得的检测胎膜早破免疫 层析试纸的灵敏性和特 异性有较明显的提高， 分别可达到 97%以上和 93%以上， 从而减少 误诊的发生率。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是采 用一种检测胎膜早 破免疫层析试纸的制备方法， 所述制备方法包括有以下步骤：

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 1.5-2.5mg/mL,质控线工作液浓度为 0.5-1.5mg/mL,将所述检测 线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进 行包被，所得硝酸纤维 素膜在 36-38 °C下干燥 8- 12小时得层析膜；

B、 将 0.005g-0.03g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加 入浓度为 0.5-2g/mL的柠檬酸三钠水溶液 2-3mL, 煮沸 3-10分钟， 冷 却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.0-7.0得胶体金； 所得胶体金中 加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产物为胶体 金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 10-30mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体 金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维上， 于 36-38°C干燥 8-12小 时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸。

优选的， 所述 A步骤中检测线工作液浓度为 2.5mg/mL, 质控线 工作液浓度为 1.5mg/mL。

优选的， 所述 A步骤中经包被后的硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时。

优选的， 所述 B步骤中氯金酸水溶液的浓度为 0.01g/100mL。 优选的， 所述 B 步骤中加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为

2g/mL。

优选的， 所述 B步骤中加入的柠檬酸三钠水溶液的量为 2.5mL。 优选的， 所述 B步骤中 K ₂ C0 ₃ 水溶液的浓度为 0. l-0.3mol/L。 优选的， 所述 B 步骤中磷酸盐緩冲液中叠氮钠的浓度为 20mg/100mL

优选的， 所述 B 步骤中加入的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体的量占胶体金的比例为 150-180 g /mL。

优选的， 所述 B 步骤中加入的牛血清白蛋白的量占胶体金的比 例为 150-200mg/100mL。

优选的， 所述 C 步骤中样品垫为采用以下方法制备而成： 将玻 璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 2-6小时后，于 36-38°C干 燥 8-12小时得样品垫。

优选的， 所述 C步骤中磷酸盐緩冲液中还含有 0.5-3.0mL/100mL 的 Triton-XlOO和 0.5-2g/100mL的 BSA。

本发明与现有技术相比， 其详细说明如下：

本发明采用的技术方案为：检测胎膜早破免疫 层析试纸的制备方 法， 所述制备方法包括有以下步骤：

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 1.5-2.5mg/mL,质控线工作液浓度为 0.5-1.5mg/mL,将所述检测 线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进 行包被，所得硝酸纤维 素膜在 36-38°C下干燥 8-12小时得层析膜；

B、 将 0.005g-0.03g/100mL氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入 浓度为 0.5-2g/mL的柠檬酸三钠水溶液 2-3mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却 后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.0-7.0得胶体金； 所得胶体金中加 入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加 入牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产物为胶体金 结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中， 所 述磷酸盐緩冲液中含有 10-30mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金 结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维上，于 36-38°C干燥 8-12小时 得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸。

首先， 细胞间粘附分子（ intercellular adhesive molecule 1 , 简称 ICAM-1 )是一种参与细胞与细胞之间以及细胞与细胞� �基质之间相 ( soluble intercellular adhesive molecule 1 , 简称 sICAM-1 )和存在于 细胞表面的膜型细胞间粘附分子（简称膜型 ICAM-1 )。其中， sICAM-1 不仅保留了膜型 ICAM-1的生物学特性，其还是膜型 ICAM-1在体液 中的可溶形式。 本发明人经过充分的研究发现， 发生胎膜早破的妊娠 妇女受胎膜和羊水中的单核细胞上 ICAM-1 的表达和中性粒细胞的 影响， 其阴道分泌物中的 ICAM-1含量明显升高， 包括膜型 ICAM-1 和 sICAM-1的含量。 现已有将 ICAM-1为目标分子来检测胎膜早破 的检测工具， 但在实际应用过程中， 其灵敏性和特异性均较低， 容易 产生误诊。

本发明人经过充分的研究发现，在发生胎膜早 破的妊娠妇女的阴 道分泌物中导致 ICAM-1含量升高的原因主要在于 sICAM-1含量的 变化，而不是含量变化较小的膜型 ICAM-1 ;本发明人通过实验发现， sIC AM- 1 是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一， 含量一般为 14ng/mL 左右； 而发生胎膜早破时， 除了胎膜表面细胞上的膜型 ICAM-1会随羊水流至阴道外， 主要还是以羊水为主， 而羊水中含量 较多的的 sICAM-1 则会出现在阴道分泌物中。 因此， 采用妊娠妇女 阴道分泌物中的 sICAM-1作为检测目标分子相对于以 ICAM-1为检 测目标分子来检测胎膜早破可以有更好的灵敏 性和特异性。

鉴于上述实验结果和本发明人的充分研究，本 发明技术方案所述 的检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法中采 用羊抗人可溶性细胞 间粘附分子 - 1多克隆抗体作为检测线工作液，羊抗鼠 IgG多克隆抗体 作为质控线工作液。

免疫层析试纸用于检测疾病时的灵敏性为患病 人群中得出阳性 检测的样本占病人总数的百分比，特异性为健 康人群中得出阴性检测 的样本占健康人总数的百分比。 影响灵敏性和特异性的因素较多， 包 括有试纸本身的制造工艺的区别以及个人操作 是否规范等等，但基本 还是以试纸本身的制造工艺为主。在免疫层析 试纸的制造工艺中包括 有几个关键步骤， 主要为层析膜、 胶体金、 胶体金结合垫以及样品垫 的制备。

本发明经过蛋白芯片陣选试验发现，确诊的胎 膜早破产妇与确诊 的非胎膜早破产妇相比 (两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配， 无基石出疾 病， 无妊娠合并症）， 其阴道分泌物样本中 sICAM-1的浓度具有明显 差异； 其中， 确诊的胎膜早破产妇阴道分泌物样本中 sICAM-1 的浓 度 90%以上均在 2ng/mL以上， 而确诊的非胎膜早破产妇阴道分泌物 样本中 sICAM-1的浓度 90%以上均在 Ing/mL以下。

鉴于上述实验结果，为了让免疫层析试纸能够 正确检测出妊娠妇 女是否发生胎膜早破，免疫层析试纸的制备方 法就需要经过一定的调 整， 本发明则主要是以调整其中检测线工作液和质 控线工作液的浓 来提高免疫层析试纸的灵敏性和特异性。 抗体）的不同浓度对于检测样本中的抗原成分 （本发明中为妊娠妇女 阴道分泌物中的可溶性细胞间粘附分子） 的显色程度有着不同的效 果； 当检测线中的抗体浓度过低， 则其和抗原起结合反应的量较少， 从而导致显色不明显，导致患病人群中本应检 测出阳性结果的检测出 阴性结果， 灵敏性偏低； 当检测线中的抗体浓度过高， 则其和抗原起 结合反应的量较多， 从而导致显色过于明显， 导致健康人群中本应检 测出阴性结果的检测出阳性结果， 特异性偏低。

质控线中抗体 (本发明中为羊抗鼠 IgG多克隆抗体）的不同浓度 对于试纸的检测结果有效性的判定有着不同的 效果； 当检测液经过检 溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体）会与检测线内的抗体结合形成� �� 有一定颜色的结合物，而部分没有结合的胶体 金结合垫内的抗体则会 继续移动至质控线， 从而与质控线中的抗体成分结合成另一种结合 物， 质控线颜色变化， 从而说明检测结果有效。 当检测线工作液的浓 度过高， 则会导致移动至质控线的胶体金结合垫的抗体 含量较少， 从 而导致质控线颜色变化不够明显， 导致检测结果失效； 当检测线工作 液的浓度偏低，则会导致移动至质控线的胶体 金结合垫的抗体含量较 多， 从而导致质控线工作液成本上的浪费。

鉴于上述原因，如果仅仅单独调整检测线工作 液浓度和质控线工 作液浓度， 则得到的是两者单独使用时的最佳浓度，但由 于免疫层析 试纸中检测线和质控线为同时使用，因此两者 之间组合后的较佳浓度 需要经过大量的实验进行陣选和验证。 本发明人经过充分的研究发 现， 在现有制备检测胎膜早破免疫层析试纸方法的 基 上， 将检测线 工作液浓度和质控线工作液浓度分别调整为 1.5-2.5mg/mL 和 0.5-1.5mg/mL时，所得试纸在相同的使用方法下可 以有更好的灵敏性 和特异性。

另外，本发明检测胎膜早破免疫层析试纸的制 备方法中所得检测 线和质控线包被过的硝酸纤维素膜需要在 36-38°C下干燥 8-12小时得 层析膜。 包被过的硝酸纤维素膜经过一定温度的干燥后 ， 其对于试纸 的灵敏性和特异性也能够起到一定的提高作用 。

本发明所述氯金酸为四氯金酸， 化学式为 AuCl ₃ 'HC14H ₂ 0。 本发明所述胶体金可以采用现有已知的制备方 法来获得，还可以 采用购买市售胶体金的方式获取；现有已知的 制备胶体金的方法包括 有将氯金酸水溶液在还原剂如白磷、 抗坏血酸、 柠檬酸三钠、 鞣酸等 任意一种或多种的作用下， 还原聚合成一定大小的金颗粒， 所得金颗 粒在静电作用下呈稳定的胶体状态， 也即胶体金。 其中， 所加入还原 剂的浓度以及加入量均可以采用现有的制备条 件和方法进行。

本发明经过充分的研究发现，本发明制备方法 中为了使所得胶体 金结合垫中的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子单 克隆抗体能够与胶体 金更好的结合， 本发明优选采用胶体金的制备方法为： 将氯金酸水溶 液加热至沸， 搅拌下加入浓度为 0.5-2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液， 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.0-7.0得胶体 金。

本发明所述制备方法中采用柠檬酸三钠作为氯 金酸的还原剂，其 浓度和加入量是通过大量的试验研究所得。柠 檬酸三钠作为氯金酸的 还原剂，所得胶体金的金颗粒分散均匀程度主 要取决于氯金酸水溶液 与还原剂的反应条件，其中以加入的柠檬酸三 钠水溶液的浓度以及加 入量为主。 本发明柠檬酸三钠的加入时间为氯金酸水溶液 加热至沸 时，这种方式可以使加入的柠檬酸三钠在足够 温度的条件下能够快速 分散于氯金酸水溶液中， 从而所得胶体金的金颗粒大小均匀。

当柠檬酸三钠水溶液的浓度过高时 ,其加入氯金酸水溶液中容易 产生局部浓度过高， 就不易达到快速分散于其中的目的，从而导致 所 得胶体金的金颗粒大小不够均匀； 当柠檬酸三钠水溶液的浓度偏小 时， 其加入氯金酸水溶液的量就不够， 这时就需要多次重复加入柠檬 酸三钠水溶液， 所得胶体金中金颗粒的颗粒大小仍然会不够均 匀。

同样的，柠檬酸三钠水溶液的加入量也对所制 备的胶体金的颗粒 均匀程度有一定的影响。鉴于上述原因， 本发明制备方法中优选采用 加入氯金酸水溶液中的还原剂柠檬酸三钠水溶 液的浓度为 0.5-2.0g/100mL, 加入量为 2mL-3mL。 4宁檬酸三钠水溶液的浓度与加 入量的组合并不是简单的组合，需要经过大量 的实验才能得到较佳效 果。

另外， 本发明制备方法中胶体金的制备过程中， 经还原后的氯金 酸水溶液冷却后需要调节 pH值至 6.0-7.0, 从而获得胶体金。 该制备 响。 、、 ⁵ " ' ' 、 本发明胶体金结合物采用上述制备方法，所得 胶体金结合物的保 存时间较为理想的同时，其制备的胶体金结合 垫的层析效果也较为理 想，从而所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性 能够得到较为明显的提 高。

本发明胶体金结合物为鼠抗人可溶性细胞间粘 附分子单克隆抗 体与胶体金的结合物。现有胶体金结合物的制 备方法中通常会加入氯 化钠溶液来延长其保存期限，同时会在磷酸盐 緩冲液中加入叠氮钠来 更好的起到延长保存期限的目的。氯化钠和叠 氮钠的加入虽然会延长 胶体金结合物的保存期限，但两者的加入会在 一定程度上降低所得胶 体金结合垫的层析能力， 从而降低免疫层析试纸的灵敏性和特异性。

本发明胶体金结合物的制备方法中并未加入氯 化钠溶液，而且叠 氮钠的浓度调整为 10-30mg/100mL,该制备条件对所得胶体金结合垫 的层析能力影响较小，所得免疫层析试纸的灵 敏性和特异性得到有效 的提高， 与此同时， 所得胶体金结合物的保存期限不会受到影响。

进一步的， 本发明优选采用所述 A步骤中检测线工作液浓度为

2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL。 本发明制备方法中检测 线工作液浓度为 1.5-2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 0.5-1.5mg/mL; 本发明在上述浓度区间内经过筛选和试验，本 发明制备方法中优选采 用检测线工作液浓度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 本发明优选采用上述两种浓度的组合，所制得 的免疫层析试纸在检测 妊娠妇女胎膜早破的灵敏性和特异性均有明显 的提高。

进一步的， 本发明优选采用所述 A步骤中经包被后的硝酸纤维 素膜在 38°C下干燥 10小时。 本发明制备方法中经包被后的硝酸纤维 素膜为在 36-38°C下干燥 8-12小时， 本发明优选采用在 38°C下干燥 10小时。

进一步的，本发明优选采用所述加入的柠檬酸 三钠水溶液的浓度 为 0.5-2g/100mL。本发明优选采用当所述柠檬酸三钠 水溶液的浓度为 0.5-2g/100mL时， 其加入量为 2.5mL; 本发明优选采用上述方式可以 使所得胶体金中的金颗粒大小更加均匀。

进一步的， 本发明优选采用所述 K ₂ C0 ₃ 水溶液的浓度为

0.1-0.3mol/L。 本发明优选采用上述方式可以便于调节溶液的 pH值； 浓度过高的 K ₂ C0 ₃ 溶液在调节溶液 pH 的过程中容易出现过量的情 况， 而浓度过低的 K ₂ C0 ₃ 溶液在调节溶液 pH值的耗时会太长， 因此 本发明制备方法优选采用 。0 ₃ 溶液的浓度为 0.1-0.3mol/L。

进一步的， 本发明优选采用所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠。 本发明在上述制备条件的基础上， 可以进一 步对磷酸盐緩冲液中叠氮钠的浓度进行调整， 具体优选为 20mg/mL。

进一步的，本发明优选采用所述加入的鼠抗人 可溶性细胞间粘附 分子 -1单克隆抗体的量占胶体金的比例为 150-18(^g /100mL。本发明 所述胶体金结合物的制备过程中可进一步优选 鼠抗人可溶性细胞间 粘附分子 -1单克隆抗体的的量占胶体金的比例为 150-180mg/100mL, 层析试纸的灵敏性和特异性有一定的提高。 更进一步的， 本发明优选 采用 所述加入的牛血清白蛋白 的量占胶体金的比例为

150-200mg/100mL _o

进一步的， 本发明优选采用所述 C 步骤中样品垫为采用以下方 法制备而成： 将玻璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 2-6小 时后， 于 36-38°C干燥 8-12小时得样品垫。 本发明样品垫可以采用现 有已知的制备方法进行制备所得， 也可以采用购买市售的产品； 本发 明优选采用所述样品垫为采用上述优选方式制 备所得，该法所得样品 垫对于所得试纸的灵敏性和特异性有一定的提 高作用。

进一步的， 本发明优选采用所述 C 步骤中磷酸盐緩冲液中还含 有 0.5-3.0mL/100mL的 Triton-XlOO和 0.5-2g/100mL的 BSA。本发明 所述 Triton-XlOO为聚乙二醇辛基苯基醚，其是一种表� ��活性剂； BSA 为牛血清白蛋白；本发明中采用将上述两种物 质共同配制于磷酸盐緩 冲液中并用于浸泡玻璃纤维，其制备所得的样 品垫对于待测样品的緩 冲作用效果更佳， 从而对试纸的灵敏性和特异性有明显的提高。

附图说明

图 1 是胎膜早破组阴道分泌物样本的细胞因子 /趋化因子抗体芯 片检测结果图；

图 2是健康对照组阴道分泌物样本的细胞因子 /趋化因子抗体芯 片检测结果图；

图 3是健康妊娠妇女羊水样本的细胞因子 /趋化因子抗体芯片检 测结果图；

图 4是 sICAM-1的酶联免疫吸附法的检测结果图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的 技术方案，下面结 合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例 1

胎膜早破组： 110例胎膜早破妊娠妇女（其中 80例足月胎膜早 破和 30例足月前胎膜早破 );

健康对照组： 110例分娩前的胎膜完整妊娠妇女；

羊水样本组： 30例行剖宫产的胎膜完整妊娠妇女。

实验对象临床筛选标准：

胎膜早破组一 （i ) 临产前观察到羊水漏出；

( ii ) 阴道分泌物样本 pH试纸检测阳性；

( iii )羊齿植物叶状结晶检测阳性。

健康对照组一 （i ) 临产前未观察到羊水漏出；

( ii ) 阴道分泌物样本 pH试纸检测阴性；

( iii )羊齿植物叶状结晶检测阴性。

实验对象年龄分布： 80例足月胎膜早破平均年龄 28岁 （年龄范 围 19-35岁）， 30例足月前胎膜早破平均年龄 31岁 （年龄范围 19-45 岁）， 健康对照组平均年龄 30岁 （年龄范围 18-43岁）。

样本收集方法： 妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下， 双下 肢分开屈曲， 暴露外阴）， 窥开阴道后， 用一次性无菌棉签伸入阴道 后穹窿处， 旋转 5圈取样。 将棉签头插入 lmL样本稀释液（磷酸盐 緩冲系统） 中， 旋转 5次后， 紧贴管壁挤压旋转 2次， 获得样本。

A、 实验方法： 细胞因子 /趋化因子抗体芯片定性检测

实验条件： 1)将预先标记有 174个细胞因子抗体的膜（RayBiotech, 美国） 放入检测盒中， 然后加入 2ml封闭液,室温封闭 6小时；

2)弃去封闭液， 加入 1.2 ml待检样本 1份， 4°C过夜孵育；

3)弃去样本， 用 2ml洗涤緩冲液清洗 5次；

4)加入 1ml生物素偶联的检测抗体， 室温孵育 2小时；

5)弃去抗体， 用 2ml洗涤緩冲液清洗 5次；

6)加入 2ml辣根过氧化物酶（ HRP )偶联的链霉素亲和素， 室温 孵育 2小时；

7)弃去液体， 用 2ml洗涤緩冲液清洗 5次；

8)在膜上加入化学发光试剂 500 μ ΐ, 避光作用 2分钟， 观察结 果。

从胎膜早破组、 健康对照组和羊水样本组中各收集的待测样本 均采用上述实验条件进行检测， 所得结果如图 1、 图 2和图 3所示。

实验结果： 图 1、 图 2和图 3中的标记 1为 IGFBP-1的表达信 号， 标记 2为 sICAM-1的表达信号， 标记 3为 Axl的表达信号。 从 图 1、 图 2和图 3中可以看出， 胎膜早破组的阴道分泌物和羊水样本 组中 IGFBP- 1、 sICAM- 1、 Axl的表达较强 , 而健康妊娠妇女阴道分 泌物样本中上述三者的表达较弱， 上述三者中， 又以 sICAM-1 的表 达最强。

B、 实验方法： 酶联免疫吸附法定量检测

实验条件：

实验材料： sICAM-1 ELISA检测试剂盒（ R&D公司 ) 1.试剂的配制

洗涤緩冲液 ( Wash Buffer )

底物溶液（ Substrate Solution ): 使用前， 将试剂盒中的显 色剂 A和显色剂 B等量、 避光混合 15分钟， 每个孔需要两种显色剂 的混合物 200μ1。

sICAM- 1标准品： 用 1 ml去离子水将 sICAM- 1标准品稀 释。 稀译后的标准品原液浓度为 250ng/ml。 为确保标准品充分混匀， 在进一步稀释前， 将标准品放于摇床上轻轻晃动混勾至少 15分钟以 上。

分别将 250ng/ml的标准品配置成浓度为 50ng/ml、25 ng/ml、 12.5 ng/ml、 6.25 ng/mL 3.13 ng/mL 1.56 ng/ml的 sICAM-1检测标准 品； RD5-7校准稀释剂作为空白对照 （O ng/ml )

2.检测程序

向每个微孔中加入 ΙΟΟμΙ sICAM-1 Conjugate; 标准品、 对 照物、 样本的加入量为 ΙΟΟμΙ, 并加入到对应的微孔中。 将微孔用试 剂盒提供的胶条盖好。 将微孔板在室温条件下置于水平摇床上 500士 50转 /分钟培育 1.5小时。 洗板； 每孔加底物溶液（ Substrate Solution ) 200 μΐ, 室温条件下， 避光、 平放培育 30分钟； 每孔加 50μ1终止液 ( Stop Solution )„ 孔中溶液的颜色将由蓝色变为黄色。 如果孔中溶液 颜色为绿色或颜色变化不一致，轻轻拍打平板 ，以确保溶液充分混匀； 30分钟内测 450nm吸光值。

3.制作标准曲线， 计算样本含量。

4.将计算所得的每个待测样本的含量统计并绘� ��成图表， 所 得图表见附图 4。

实验结果：图 4中， AF of control为羊水样本， CVF of PROM 为胎膜早破组的阴道分泌物， CVF of control为健康对照组的阴道分 泌物。从图 4可以看出， sICAM-1在健康妊娠妇女羊水样本中的浓度 最高， 平均可达到 80ng/mL; sICAM-1在胎膜早破组阴道分泌物样本 中的浓度 90%以上可达到 2ng/mL以上； sICAM-1在健康对照组阴道 分泌物样本中的浓度 90%以上在 Ing/mL以下。

从实施例 1的实验结果可知，发生胎膜早破妊娠妇女的� �道分泌 物中主要发生含量变化之一的是可溶性细胞间 粘附分子 sICAM-1 ,而 sIC AM- 1主要来自于胎膜破裂的羊水中。

以下是以妊娠妇女阴道分泌物中 sICAM-1 为检测目标分子， 并 制备方法如下：

对照例 1

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2mg/mL, 质控线工作液浓度为 2mg/mL, 将所述检测线工作液 和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得 层析膜；

B、将 0.03g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸，搅拌下加� ��浓度为 9g/100mL 的柠檬酸三钠水溶液 1.2mL, 煮沸 3-10 分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在所得胶 体金中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 - 1 单克隆抗体标记 20-50min后，加入牛血清白蛋白封闭 20-50min,然后加入 lOg/lOOmL 的氯化钠， 离心分离， 所得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金 结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 90mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被 在玻璃纤维上， 于 36-38°C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例 1-检测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售的 产品。

对照例 2

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 Img/mL, 质控线工作液浓度为 3mg/mL, 将所述检测线工作液 和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得 层析膜；

B、将 0.003g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸，搅拌下加 入浓度 为 10g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 1.2mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后 用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金； 将所得胶体金与鼠 抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶 体金中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 - 1 单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min, 然后加入 5g/100mL 的氯化钠， 所得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中，所述磷酸盐緩冲液 中含有 80mg/100mL 的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维 上， 于 36-38°C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例 2-检测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售的 产品。

对照例 3

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 3mg/mL, 质控线工作液浓度为 3mg/mL, 将所述检测线工作液 和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被得 层析膜；

B、 将 0.005g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 9g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 1.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶体金 中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min, 然后加入 5g/100mL的氯化钠， 所 得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的 磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 5mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例

3-检测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售的 产品。

对照例 4

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 1.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 0.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 得层析膜；

B、 将 0.005g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 0.5g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶体金 中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min , 然后加入 1 g/ 1 OOmL的氯化钠， 所 得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的 磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 lOmg/lOOmL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例

4-检测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫为购买市售的产 口口

对照例 5

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 得层析膜；；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶体金 中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min, 然后加入 5g/100mL的氯化钠， 所 得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的 磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得对照例 5-检测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售的 产品。

对照例 6

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 1.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 得层析膜；

B、 将 0.02g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 0.5g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 3mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶体金 中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min, 然后加入 5g/100mL的氯化钠， 所 得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的 磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 30mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫； C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸；所述样品垫、吸水 垫均为购买市售的产品。

对照例 7

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 0.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用

K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0-8.0得胶体金；将所得胶体金与鼠抗人 可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体制备成胶体金结合垫；在胶体金 中加入鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后， 加入牛血清白蛋白封闭 20-50min , 然后加入 1 g/ 1 OOmL的氯化钠， 所 得离心产物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的 磷酸盐緩冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 25mg/100mL的叠氮钠； 将加入了胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在 玻璃纤维上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸；所述样品垫、吸水 垫均为购买市售的产品。

对照例 8

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 1.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 36°C下干燥 8小时得层析膜；

B、 将 0.01g/100mL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.0得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 150mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸；所述样品垫、吸水 垫均为购买市售的产品。

对照例 9

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 0.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 12小时得层析膜；

B、将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸，搅拌下加� ��浓度为 2g/100mL 的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10 分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 7.0得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 180μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 150mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售产品。

对照例 10

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.5得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 200mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫、 吸水垫均为购买市售产品。

对照例 11

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.5得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 200mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、 将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、 胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫为采用以下方法制备而成： 将 玻璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 2小时后， 于 36°C干燥 8小时得样品垫； 所述吸水垫为购买市售产品。

对照例 12

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.5得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 200mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫为采用以下方法制备而成： 将 玻璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 6小时后， 于 38°C干燥 12小时得样品垫； 所述吸水垫为购买市售产品。

对照例 13

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.5得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 200mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫为采用以下方法制备而成： 将 玻璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 2-6小时后， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得样品垫； 所述磷酸盐緩冲液中含有 0.5mL/100mL 的 Triton-XlOO和 0.5g/100mL的 BSA; 所述吸水垫为购买市售产品。

对照例 14

A、 羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体作为检测线的工 作液， 羊抗鼠 IgG多克隆抗体作为质控线的工作液；检测线工 作液浓 度为 2.5mg/mL, 质控线工作液浓度为 1.5mg/mL, 将所述检测线工作 液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被 ，所得硝酸纤维素膜在 38°C下干燥 10小时得层析膜；

B、 将 O.Olg/lOOmL的氯金酸水溶液加热至沸， 搅拌下加入浓度 为 2g/100mL的柠檬酸三钠水溶液 2.5mL, 煮沸 3-10分钟， 冷却后用 0.1-0.3mol/L的 K ₂ C0 ₃ 水溶液调节 pH值至 6.5得胶体金； 将所得胶 体金与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1 单克隆抗体制备成胶体金结 合垫； 在胶体金中按比例每 lOOmL加入 150μ§的鼠抗人可溶性细胞 间粘附分子 -1单克隆抗体标记 20-50min后，按比例每 lOOmL胶体金 加入 200mg的牛血清白蛋白封闭 20-50min后离心分离， 所得离心产 物为胶体金结合物； 将所得胶体金结合物溶于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩 冲液中， 所述磷酸盐緩冲液中含有 20mg/100mL的叠氮钠； 将加入了 胶体金结合物的磷酸盐緩冲液包被在玻璃纤维 上， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得胶体金结合垫；

C、将 A和 B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品� �、胶 体金结合垫、层析膜、 吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检 测胎膜早破免疫层析试纸； 所述样品垫为采用以下方法制备而成： 将 玻璃纤维浸泡于 pH7.2-7.4的磷酸盐緩冲液中 2-6小时后， 于 36-38 °C干燥 8-12小时得样品垫； 所述磷酸盐緩冲液中含有 3.0mL/100mL 的 Triton-XlOO和 2g/100mL的 BSA; 所述吸水垫为购买市售产品。

上述对照例 1 -20中的材料来源如下：

羊抗人可溶性细胞间粘附分子 -1多克隆抗体： 购自 R&D公司； 羊抗鼠 IgG多克隆抗体： 购自上海派坤生物工程有限公司； 鼠抗人可溶性细胞间粘附分子 -1单克隆抗体： 购自 R&D公司； 样品垫 (市售）：

吸水垫（市售）：

胶体金 (市售）：

牛血清白蛋白 （BSA ): Roche公司

实施例 2

将不同方法制备而成的对照例 1-20免疫层析试纸分别用于检测 同样的妊娠妇女阴道分泌物的临床样本，包括 有胎膜早破组和健康对 照组， 其中胎膜早破组为 240例， 健康对照组为 260例， 试验对象均 采用实施例 1的方法进行临床诊断和筛选。

样本收集： 妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下， 双下肢分 开屈曲， 暴露外阴）， 窥开阴道后， 用一次性无菌棉签伸入阴道后穹 窿处， 旋转 5圈取样。 将棉签头插入 lmL样本稀译液（磷酸盐緩冲 系统） 中， 旋转 5次后， 紧贴管壁挤压旋转 2次， 获得样本。

样本试验对象年龄分布：

利用对照例 1-20分别对所收集的 500例样本进行检测， 所得检 测结果的阴性和阳性例数统计见 一：

样本 胎膜早破组 健康对照组 灵敏性 特异性 准确度 对照例 阳性 阴性 阴性 阳性 ( % ) ( % ) ( % )

1 215 25 230 30 89.583 88.46 89.0

2 213 17 227 33 88.75 87.30 88.0 3 216 24 229 31 90.00 88.08 89.0

4 235 5 245 15 97.917 94.23 96.0

5 236 4 246 14 98.33 94.61 96.4

6 235 5 247 13 97.917 95.0 96.4

7 236 4 248 12 98.33 95.38 96.8

8 238 2 248 12 99.167 95.38 96.8

9 237 3 247 13 98.75 95.0 96.8

10 238 2 249 11 99.167 95.77 97.4

11 239 1 251 9 99.58 96.54 98.0

12 239 1 251 9 99.58 96.54 98.0

13 240 0 254 6 100 97.69 98.8

14 240 0 254 6 100 97.69 98.8

上表一中， 对照例 1-3为现有制备方法所制备的免疫层析试纸； 对照例 4-7相对于对照例 1-3为仅调整胶体金的制备方法的试纸条； 对照例 8-10为本发明主要制备方法；对照例 11-20为本发明进一步改 进的制备方法， 其中对照例 11-16主要进一步改进了胶体金结合物的 制备方法， 对照例 17-20主要进一步改进了样品垫的制备方法。

从上表一数据和对照例的不同可以得出，本发 明制备方法可以明 显提高所得免疫层析试纸的灵敏性和特异性； 同样的， 本发明进一步 改进的制备方法所得的免疫层析试纸的灵敏性 和特异性也有较明显 的提高。

以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出的是， 上述优选实施 方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护 范围应当以权利要求所 限定的范围为准。 对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本 发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和 润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。