L’invention concerne un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié ainsi qu'un lysat plaquettaire irradié obtenu par un tel procédé et un procédé de culture de cellules utilisant un tel lysat plaquettaire irradié.

L’invention s’applique au domaine des produits dérivés des plaquettes sanguines, et notamment au domaine de la culture cellulaire pour cultiver les cellules à usage thérapeutique, plus particulièrement les cellules souches mésenchymateuses.

Pour cultiver des cellules animales in vitro, on utilise classiquement des milieux de base de type RPMI (Roswell Park Memorial Institute), MEM (Modified Eagle Medium) ou DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) comprenant essentiellement des sels minéraux, du glucose, des acides aminés, des vitamines et des bases azotées. Ces milieux de base sont généralement complémentés extemporanément avec des antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne, de la L-glutamine - un acide aminé instable -, et entre 1 ,5 et 10% de sérum de veau fœtal comme complément nutritif.

Pour utiliser des produits plus performants et pour éviter l’utilisation de produits xénogènes dans les cultures de cellules à usage thérapeutique, il a été proposé de remplacer le sérum de veau fœtal par du lysat plaquettaire humain. Ce dernier présente notamment l'avantage de comprendre une quantité importante de facteurs de croissance tels que par exemple le facteur de croissance transformant bêtal (TGF-beta1 , Transforming Growth Factor-betal ), le facteur de croissance épidermique (EGF, Epidermal Growth Factor), le facteur de croissance dérivé des plaquettes AB (PDGF-AB, Platelet-Derived Growth Factor- AB), le facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-AB, Platelet- Derived Growth Factor-BB), le facteur de croissance 1 ressemblant à l'insuline (IGF-1 , Insulin-like Growth Factor-1 ), le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF, Vascular Endothélial Growth Factor) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2, Fibroblast Growth Factor 2), aussi appelé facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, Basic Fibroblast Growth Factor).

Ainsi, les cellules animales humaines ou non humaines suivantes ont été cultivées en présence de lysat plaquettaire : les kératinocytes, les cellules épithéliales rénales, les lignées cellulaires leucémiques ou issues de tumeurs solides, de même que les cellules primaires humaines telles que les adipocytes, les cellules souches du fluide amniotique, les cellules stromales de moelle osseuse, les chondrocytes, les cellules cornéennes, les cellules endothéliales, les kératinocytes, les cellules souches mésenchymateuses, les monocytes et les ostéoblastes (Pons, Miriam, et al. "Fluman platelet lysate as validated replacement for animal sérum to assess chemosensitivity." ALTEX-Alternatives to animal expérimentation (2018).

Le lysat plaquettaire est typiquement préparé à partir d’une suspension de plaquettes dans du plasma ou dans un mélange plasma et solution additive pour plaquettes, à laquelle on fait subir un ou plusieurs cycles de congélation/décongélation afin de libérer les facteurs de croissance contenues dans les plaquettes par lyse cellulaire.

Un inconvénient d’un tel lysat plaquettaire est qu’il contient du fibrinogène, provenant du plasma, dans une quantité variant d’environ 0,5 à 3 mg/ml, de sorte que l’addition d’un anticoagulant au milieu de base est nécessaire pour éviter une coagulation du milieu de base (Burnouf T, Strunk D, Koh MB, et al. : Human platelet lysate: replacing fêtai bovine sérum as a gold standard for human cell propagation? Biomaterials 2016; 76:371-387).

L’anticoagulant le plus utilisé est l’héparine. Mais les héparines disponibles dans le commerce sont généralement d’origine porcine, de sorte que le milieu de culture, bien que dépourvu de sérum de veau fœtal, comprend encore un produit xénogène. En outre, à certaines concentrations, l’héparine a un effet négatif sur la prolifération cellulaire (Viau, Sabrina, et al. "Pathogen réduction through additive- free short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells." PloS one 12.8 (2017): e0181406).

Plusieurs stratégies ont été proposées pour éliminer le pouvoir de coagulation d’un lysat plaquettaire :

Une première méthode est décrite dans le document WO 2013/003356, qui consiste à ajouter au lysat plaquettaire du chlorure de calcium, induisant la conversion du fibrinogène en fibrine et la formation d’un caillot. Le caillot est ensuite éliminé par centrifugation pour obtenir un lysat comprenant moins de 0,05 mg/ml de fibrinogène. Cette méthode entraîne cependant une perte en facteurs de croissance qui seraient piégés dans le caillot.

Une méthode indirecte consiste à éliminer le plasma qui contient le fibrinogène de la suspension de plaquettes de départ, par exemple en effectuant plusieurs cycles de lavage des plaquettes avant de préparer le lysat plaquettaire. Cette stratégie est par exemple décrite dans le document WO 2008/034803 et dans le document US 2012/0156306. L’élimination du plasma entraîne cependant de fait l’élimination d’autres protéines plasmatiques telles que l’albumine, nécessaires à la prolifération cellulaire.

Dans le document WO 2017/162830, il est proposé d’éliminer le plasma des suspensions de plaquettes de départ puis de chauffer le lysat plaquettaire entre 55 et 65°C pendant 20 à 40 minutes, de sorte à obtenir une quantité de fibrinogène inférieure à 0,3 mg/ml. Cependant, ce procédé réduit également la quantité des autres protéines présentes dans le lysat plaquettaire d’au moins 70%, ce qui n’est pas souhaitable pour une utilisation en culture cellulaire.

Laner-Plamberger et al. proposent une méthode originale consistant à ajouter le lysat plaquettaire non défibrinogéné au milieu de base afin de former un gel de fibrine, puis de détruire et éliminer ce gel par agitation vigoureuse et centrifugation. Le milieu de base complémenté en lysat plaquettaire ainsi obtenu est dépourvu de fibrinogène, mais contient encore les autres protéines plasmatiques (J Transi Med (2015) 13:354). Cette méthode est cependant complexe à mettre en place dans le cadre d’une production industrielle standardisée et de qualité contrôlée de lysats plaquettaires.

Dans le document WO 2016/193591 , le lysat plaquettaire subit une irradiation par un rayonnement ionisant afin d’être stérilisé. Suivant la dose d’irradiation utilisée, le lysat plaquettaire irradié peut comprendre moins de 0,4 mg/ml de fibrinogène. Selon l’exemple décrit, un lysat plaquettaire a été préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% de plasma et 70% d’une solution de conservation, puis irradié à une dose de 35 ou 45 kGy. Lorsque le lysat plaquettaire est ajouté dans une quantité de 8% dans le milieu de base, le milieu de base ne coagule pas.

Des essais supplémentaires d’irradiation par rayonnement gamma réalisés par le demandeur ont montré que le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire dépendait non seulement de la dose d’irradiation utilisée, mais aussi de la quantité de protéines dans le lysat plaquettaire et de la quantité de lysat plaquettaire ajouté au milieu de base.

Ainsi, un lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma, comprenant entre 20 et 30 g/l de protéines totales, et irradié à environ 35 kGy selon la méthode décrite dans le document WO 2016/193591 , coagule à 15% et plus dans un milieu de base MEM dépourvue d’héparine. Un lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma, comprenant entre 60 et 80 g/l de protéines totales, et irradié à 35 kGy selon la méthode décrite dans le document WO 2016/193591 , coagule dès 5% dans un milieu de base MEM dépourvue d’héparine. Pour réduire le pouvoir de coagulation d’un lysat plaquettaire, le demandeur a envisagé d’augmenter la dose d’irradiation utilisée jusqu’à 75 kGy pour obtenir un lysat plaquettaire stérilisé et non coagulable, même à forte concentration dans le milieu de base. Mais à très forte dose d’irradiation par rayonnement gamma, les protéines plasmatiques d’intérêt pour la croissance cellulaire sont dégradées.

Il reste donc un besoin d’obtenir un lysat plaquettaire avec un pouvoir réduit de coagulation en présence de calcium, même quand le lysat plaquettaire est ajouté à concentration élevée dans un milieu de base comprenant du calcium, tout en préservant les protéines plasmatiques.

En outre, le document WO 2013/042095 et l’article de S. Castiglia (Castiglia, Sara, et al. "Inactivated human platelet lysate with psoralen: a new perspective for mesenchymal stromal cell production in Good Manufacturing Practice conditions." Cytotherapy 16.6 (2014): 750-763) divulguent un lysat plaquettaire obtenu à partir de concentrés de plaquettes issus de buffy coat qui ont subi une inactivation virale par un rayonnement ultraviolet de type UVA en présence de psoralène, un agent chimique intercalant de l’ADN. Cette technique d'inactivation virale présente cependant l’inconvénient de devoir utiliser un agent chimique qui doit ensuite être éliminé du produit traité.

Une autre méthode d’obtention d’un lysat plaquettaire dépourvu de pathogènes est décrite dans l’article de S. Viau (Viau, Sabrina, et al. "Pathogen réduction through additive-free short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells." PloS one 12.8 (2017): e0181406). Dans cet article, un lysat plaquettaire est obtenu à partir de concentrés plaquettaires qui ont subi une inactivation virale par rayonnement UVC, en l’absence d’agent chimique.

Dans ces derniers documents, le lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires ayant subi une inactivation virale reste coagulable. L’invention propose un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire avec un pouvoir réduit de coagulation en présence de calcium, tout en conservant les protéines plasmatiques nécessaires notamment à la prolifération cellulaire.

Ainsi, selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes :

- la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d’obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation,

- la double irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm et par un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm, afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, ladite double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 40% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur Vil, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

Selon un deuxième aspect, l’invention concerne le lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon le premier aspect de l’invention.

Selon un troisième aspect, l’invention propose un procédé pour la culture de cellules, particulièrement de cellules animales et plus particulièrement de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon le deuxième aspect de l’invention.

D'autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit. Les figures 1 à 6 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de IGF-1 , TGF-bêta1 , bFGF, PDGF-AB, EGF et VEGF dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d’irradiation.

Les figure 7 à 1 1 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de coagulation facteur II, facteur VII, facteur IX, facteur X et facteur XI, exprimées en pourcentage par rapport à un plasma humain normal étalon, dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d’irradiation.

La figure 12 représente les facteurs d'amplification au 7 ^ème jour de culture de cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC en fonction de la dose d’irradiation.

Les figures 13 à 16, montrent respectivement, les concentrations en facteur de croissance bFGF, PDGF-AB, PDGF-BB et TGF-bêta1 , d’un lysat plaquettaire non irradié (LP), d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 35 kGy (LP-UVC-G35) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVC- G55).

Les figures 17 et 18 montrent, respectivement, les concentrations en protéines totales et les concentrations en vitamine B12, d’un lysat plaquettaire non irradié (LP), d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 35 kGy (LP-UVC-G35) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVC-G55).

La figure 19 représente les facteurs d'amplification au 7 ^ème jour de culture de cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence d’un lysat plaquettaire non irradié (LP), d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 35 kGy (LP-UVC-G35) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm ² puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVC-G55).

L’invention concerne un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié en vue notamment d’obtenir un lysat plaquettaire ayant un pouvoir de coagulation réduit.

Par lysat plaquettaire, on désigne le produit de la lyse de plaquettes, c'est-à-dire le produit obtenu après désintégration de la membrane cellulaire des plaquettes qui conduit à la libération des molécules (facteurs de croissance, cytokines) normalement contenues à l'intérieur des plaquettes.

La lyse des plaquettes est par exemple réalisée par un ou plusieurs cycles de congélation/décongélation, par l’utilisation d'ultra-sons ou par un traitement au solvant/détergent.

Le procédé selon l’invention comprend d’abord l’étape consistant en la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d’obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.

Le lysat plaquettaire est produit à partir de plaquettes en suspension dans un liquide comprenant du plasma. Une telle suspension de plaquettes est par exemple un concentré de plaquettes ou un mélange de concentrés de plaquettes, une couche leucoplaquettaire, aussi appelée buffy coat, ou un mélange de couches leucoplaquettaires, un plasma riche en plaquettes ou un mélange de plasmas riche en plaquettes. Plus particulièrement, la suspension de plaquettes est un concentré plaquettaire issu d'aphérèse ou préparé à partir d'un don de sang ou un mélange de concentrés plaquettaires issus d'aphérèse ou préparés à partir de dons de sang.

Par exemple, le mélange comprend entre 4 et 50 concentrés plaquettaires, en particulier entre 5 et 30 concentrés plaquettaires.

La préparation d’un lysat plaquettaire à partir d’un mélange de plusieurs concentrés plaquettaires, notamment plus de quatre concentrés plaquettaires, est avantageuse car elle permet de standardiser le lysat plaquettaire, c’est-à-dire d’homogénéiser la concentration de ses différents composants, notamment la concentration en facteurs de croissance (Viau S, Eap S, et al. A standardized and characterized clinical grade human platelet lysate for efficient expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotherapy. May 2017, Volume 19, Issue 5, Supplément, Page S195).

En effet, les concentrations en facteurs de croissance d’un lysat plaquettaire sont dépendantes du donneur de plaquettes initiales.

Les concentrés plaquettaires sont soit frais, c'est-à-dire qualifiés pour être transfusés à un patient, soit périmés, c'est-à-dire stockés pendant 5 jours ou plus après sa préparation et ne pouvant plus être transfusés à un patient.

De tels concentrés plaquettaires comprennent des plaquettes en suspension dans un milieu liquide contenant du plasma.

Par exemple, le milieu liquide ne comprend que du plasma. Selon un autre exemple, le milieu liquide comprend en outre une solution de conservation des plaquettes, telle que la solution SSP+ (Maco Pharma) ou l'Intersol® (Fresenius Kabi). Dans un exemple particulier, le milieu liquide comprend de 20% à 100%, notamment 30% de plasma et de 0% à 80%, notamment 70% de solution de conservation des plaquettes.

La lyse d’une suspension de plaquettes comprenant des plaquettes dans du plasma fournit un lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires normalement contenus à l’intérieur des plaquettes et d’autre part des constituants du plasma.

Le plasma est constitué d'eau à 90%, de sels tels que le sodium, le chlore et le calcium, de lipides tels que les triglycérides et le cholestérol, d’hormones, de vitamines telles que la vitamine B12 et la vitamine D et de protéines telles que l'albumine, les immunoglobulines, les facteurs de coagulation dont le fibrinogène, l’antithrombine III impliquée dans la chaîne de coagulation, les globulines, les interleukines et les interférons.

Ainsi, le lysat plaquettaire de départ auquel est appliqué le procédé de l’invention comprend notamment d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.

Ces facteurs de croissance sont notamment le TGF-bêta1 , EGF, PDGF-AB, IGF-1 , VEGF et bFGF. D'autres facteurs de croissance se trouvant dans le lysat plaquettaire sont notamment le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF, Connective Tissue Growth Factor) et le facteur dérivé des cellules stromales de type 1 -alpha (SDF-1 alpha, Stromal Cell-Derived Factor-1 alpha). Ces facteurs de croissance sont dits endogènes.

Par substance endogène, on désigne toute substance produite par les plaquettes ou comprise dans la suspension de plaquettes initiales utilisées pour préparer le lysat plaquettaire, par opposition à une substance exogène introduite dans le lysat plaquettaire ou dans la suspension de plaquettes initiales. Par exemple, un lysat plaquettaire produit par lyse par congélation/décongélation d’une suspension de plaquettes comprend les concentrations en facteurs de croissance suivantes : Tableau 1 :

Le lysat plaquettaire de départ comprend d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.

Les facteurs de coagulation sont notamment le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI. D’autres facteurs de coagulation sont le facteur V et le facteur VIII. Les autres protéines du plasma autre que les facteurs de coagulation sont notamment l’albumine et l’antithrombine III, protéine impliquée dans la chaîne de coagulation.

La quantité de protéines totales du lysat plaquettaire de départ dépend donc du pourcentage de plasma dans la suspension de plaquettes initiale, avant lyse des plaquettes.

Par exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma comprend notamment les composants suivants : Tableau 2 :

Dans un autre exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma et 70% d’une solution de conservation des plaquettes comprend notamment les composants suivants :

Tableau 3 :

L’étape de fourniture d’un lysat plaquettaire s’entend comme la mise à disposition d’un lysat plaquettaire. C’est-à-dire que le procédé de l’invention est mis en œuvre sur un lysat plaquettaire préalablement produit par lyse des plaquettes d’une suspension de plaquettes.

Après l’étape de fourniture d’un lysat plaquettaire de départ, le procédé selon l’invention comprend la double irradiation dudit lysat plaquettaire de départ par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm et par un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm d’autre part, afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, ladite double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 40% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur Vil, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

L’étape de double irradiation s’entend comme une première irradiation suivie d’une deuxième irradiation. Notamment, la première irradiation est une irradiation par rayonnement UVC et la deuxième irradiation est une irradiation par rayonnement ionisant. En alternative, la première irradiation est une irradiation par rayonnement ionisant et la deuxième irradiation est une irradiation par rayonnement UVC. Les première et deuxième irradiations sont successives, c’est-à-dire réalisées l’une après l’autre.

L’étape consistant en l’irradiation dudit lysat plaquettaire par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est notamment agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales du lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

Le rayonnement UVC désigne un rayonnement électromagnétique non ionisant, c’est-à-dire un rayonnement incapable de provoquer l'ionisation d'atomes ou de molécules. Le rayonnement UVC possède une longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm, en particulier 254 nm.

En conservant plus de 75% des protéines totales du lysat plaquettaire de départ, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC peut être utilisé comme complément pour milieu de base pour culture cellulaire. Notamment, l’albumine qui représente plus de 50% des protéines dans le plasma et qui est un nutriment particulièrement important dans la culture cellulaire, est conservée à au moins 80% par rapport au lysat plaquettaire de départ.

En particulier, au moins 80%, et plus particulièrement au moins 90% de la concentration en protéines totales dans le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est conservé par rapport au lysat plaquettaire de départ.

Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant de 20 à 80 mg/ml, selon la concentration en plasma de la suspension de plaquettes initiales.

Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 55 mg/ml à environ 80 mg/ml. Selon un autre exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 18 mg/ml à environ 30 mg/ml.

De plus, en réduisant d’au moins 20% la concentration de l’un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI, le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est réduit.

C’est-à-dire qu’un milieu de base comprenant du calcium, par exemple environ 0,2 g/l de chlorure de calcium ne coagulera pas en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ou coagulera à partir d’une concentration de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC dans le milieu de base plus élevée que celle d’un lysat plaquettaire de départ à partir de laquelle le milieu de base coagule.

Par exemple, le milieu de base alphaMEM coagule en présence de 5% ou plus de lysat plaquettaire de départ, alors que ce milieu coagule à partir de 10% ou plus de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.

Notamment, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est ajouté dans une plage allant de 2 à 25 %, en particulier dans la plage allant de 5 à 15%, et encore plus particulièrement dans la plage allant de 8 à 10% dans un milieu de base.

Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ayant un pouvoir de coagulation réduit, son utilisation en tant que complément de milieu de base pour culture cellulaire est possible, dans certaines concentrations, sans utiliser d’anticoagulant tel que l’héparine. En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour réduire d’au moins 20% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend les constituants plasmatiques suivants.

Tableau 4 :

De plus, le lysat plaquettaire de départ comprend notamment les facteurs de croissance endogènes TGF-bêta1 , EGF, PDGF-AB, IGF-1 , VEGF et bFGF.

L’irradiation par rayonnement UVC est en particulier agencée pour conserver au moins 80% la concentration de l’un des facteurs de croissance incluant IGF-1 , PDGF-AB, EGF et VEGF du lysat plaquettaire de départ, afin notamment de pourvoir utiliser le lysat plaquettaire irradié comme complément de milieu de base.

En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour conserver au moins 80% de la concentration de chacun des facteurs de croissance incluant IGF-1 , PDGF-AB, EGF et VEGF, afin notamment de pourvoir utiliser le lysat plaquettaire irradié comme complément de milieu de base.

Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend les facteurs de croissance suivants. Tableau 5 :

L’irradiation par rayonnement UVC est en particulier agencée pour conserver au moins 75%, particulièrement au moins 80%, du facteur d’amplification des cellules souches mésenchymateuses cultivées pendant 7 jours dans un milieu de base complémenté avec du lysat plaquettaire de départ.

Selon une réalisation particulière, l’irradiation par rayonnement UVC est réalisée à une dose comprise entre 0,01 à 2 J/cm ² , particulièrement entre 0,5 J/cm ² et 1 ,5 J/cm ² , et plus particulièrement à 1 J/cm ² .

Une dose de rayonnement UVC inférieure à 0,01 J/cm ² n’est pas suffisante pour dégrader les facteurs de coagulation présents dans le lysat plaquettaire de départ. Une dose de rayonnement UVC supérieure à 2 J/cm ² endommage les facteurs de croissance entraînant une perte importante en prolifération cellulaire.

En particulier, le lysat plaquettaire de départ est irradié par rayonnement UVC à l’état liquide.

Par exemple, le lysat plaquettaire de départ à l’état liquide est conditionné dans un récipient perméable aux UVC, telle qu’une poche d’irradiation perméable aux UVC. Une poche d’irradiation perméable aux UVC est notamment réalisée dans un matériau n’ayant pas un maximum d’adsorption dans la plage allant de 200 à 280 nm. La poche d’irradiation est en particulier réalisée en éthylène acétate de vinyle ou en polytétrafluoroéthylène. La poche d’irradiation contenant le lysat plaquettaire de départ est ensuite disposée dans un appareil d’illumination aux UVC. La poche est agitée de façon orbitale pendant l’irradiation par rayonnement UVC, de sorte à irradier de façon homogène la totalité du lysat plaquettaire.

En alternative, l’irradiation par rayonnement UVC du lysat plaquettaire de départ est réalisée sous condition de flux.

Selon une réalisation particulière, le procédé comprend, préalablement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration dudit lysat plaquettaire de départ au travers d'un filtre de porosité 0,65 pm ou moins, particulièrement 0,45 pm ou moins.

Cette étape de filtration permet d’éliminer les éventuels débris cellulaires provenant de l’étape de lyse des plaquettes et qui pourraient entraver l’irradiation du lysat plaquettaire.

Selon une autre réalisation particulière, le procédé comprend, postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration stérilisante dudit lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC au travers d'un filtre de porosité 0,45 pm ou moins, particulièrement 0,22 pm ou moins.

Cette étape de filtration au travers un filtre stérilisant permet de retenir les bactéries ayant une taille supérieure à 0,22 pm et, combinée à l’irradiation par rayonnement UVC, permet d’obtenir un lysat plaquettaire ayant un risque réduit en contamination bactérienne et virale.

Afin de réduire encore plus le pouvoir de coagulation lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, le procédé selon l’invention comprend une étape d'irradiation du lysat plaquettaire par un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm, particulièrement inférieure à 10 nm. Un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm comprend les rayons X-UV ayant une longueur d’onde allant de 10 nm à 100 nm, les rayons X ayant une longueur d’onde allant de 10 pm à 10 nm et les rayons gamma ayant une longueur d’onde inférieur à 10 pm.

Un procédé d’irradiation d’un lysat plaquettaire par rayonnement ionisant est notamment décrit dans la demande de brevet WO 2016/193591 .

Dans un tel procédé, préalablement à l’étape d’irradiation par rayonnement ionisant, le procédé comprend une étape de congélation dudit lysat plaquettaire afin d’irradier par rayonnement ionisant le lysat plaquettaire à l’état congelé.

En particulier, la congélation du lysat plaquettaire est réalisée à une température comprise entre -10°C et -196°C, notamment d'environ -20°C ou d’environ -80°C.

En alternative, le lysat plaquettaire est irradié par rayonnement ionisant dans un état lyophilisé.

Pour l’irradiation par rayonnement ionisant dans un état congelé, le lysat plaquettaire est conditionné dans un récipient résistant à la congélation et notamment dans une poche résistante à la congélation. Le matériau résistant à la congélation est notamment de l'éthylène acétate de vinyle, le polyéthylène ou un fluoropolymère tel que l’éthylène-propylène fluoré.

Selon une réalisation particulière avantageuse, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, c’est-à-dire que l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée sur le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.

Encore plus avantageusement, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC et postérieurement à la filtration stérilisante du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, c’est-à-dire sur le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC puis filtré stérilement.

Dans ce cas, l'étape d'irradiation par rayonnement ionisant est réalisée sur le lysat plaquettaire dans son conditionnement final, notamment dans une poche de stockage. La poche de stockage est par exemple réalisée en un matériau résistant à la congélation et à l'irradiation par rayonnement ionisant tel que l'éthylène acétate de vinyle.

En alternative, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée préalablement à l’irradiation par rayonnement UVC sur le lysat plaquettaire de départ.

Selon un mode de réalisation, le rayonnement ionisant est un rayonnement gamma ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 10 pm.

Le rayonnement gamma est un rayonnement électromagnétique composé de photons de haute énergie, de l'ordre de 1 ,6 MeV. Il est par exemple émis par une source de cobalt 60.

L'irradiation par rayonnement ionisant est agencée de sorte à conserver, dans le lysat plaquettaire irradié par rayonnement ionisant, au moins 80% de la concentration de l'un au moins des facteurs de croissance endogènes choisi dans le groupe constitué par le TGF-beta1 , l'EGF, le PDGF-AB, l'IGF-1 et le VEGF du lysat plaquettaire avant irradiation par rayonnement ionisant.

En particulier, l'irradiation par rayonnement gamma est agencée de sorte à conserver dans le lysat plaquettaire irradié par rayonnement ionisant, au moins 80%, particulièrement au moins 90%, et encore plus particulièrement 95% de la concentration de chacun des facteurs de croissance TGF-beta1 , EGF, PDGF-AB, IGF-1 et le VEGF, du lysat plaquettaire avant irradiation par rayonnement ionisant. Par exemple, l’irradiation par rayonnement ionisant est une irradiation par rayonnement gamma réalisée à une dose absorbée comprise dans la plage allant de 20 kGy à 75 kGy, notamment de 35 kGy à 55 kGy.

La dose absorbée est la quantité d'énergie communiquée à la matière par unité de masse.

Par exemple, l’irradiation est effectuée pendant une durée comprise dans la plage allant de 600 secondes à 1800 secondes, préférentiellement de 900 secondes à 1200 secondes, et plus préférentiellement pendant 1075 secondes, avec une source présentant une activité de 1 Mci (3,7x1019 Bq).

Selon le procédé de l’invention, le lysat plaquettaire subit une double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, c’est-à-dire une première irradiation par rayonnement UVC suivie d’une deuxième irradiation par rayonnement ionisant, ou bien une première irradiation par rayonnement ionisant suivie d’une deuxième irradiation par rayonnement UVC.

De façon avantageuse, l’irradiation par rayonnement ionisant et l’irradiation par rayonnement UVC sont agencées ensemble pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales du lysat plaquettaire de départ.

Ainsi, le lysat plaquettaire doublement irradié conserve son intérêt pour une utilisation en culture cellulaire ou autre application pour laquelle les protéines ont un intérêt.

La conservation de la plupart des protéines d’intérêt, dans leur totalité ou en grande partie, ainsi que la conservation des facteurs biochimiques (facteurs également important pour la croissance cellulaire) d’un tel lysat doublement irradié permet de compenser la perte partielle en certains facteurs de croissance induite par chacune des deux irradiations par rayonnement UVC et rayonnement ionisant. En outre, l’irradiation par rayonnement ionisant et l’irradiation par rayonnement UVC sont agencées ensemble de sorte à réduire d’au moins 40% la concentration de l’un au moins des facteurs de coagulation incluant le facteur II, le facteur Vil, le facteur IX, le facteur X et facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

En particulier, l’irradiation par rayonnement ionisant et l’irradiation par rayonnement UVC sont agencées ensemble de sorte à réduire d’au moins 40% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le facteur II, facteur Vil, facteur IX et facteur XI du lysat plaquettaire de départ.

Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma, irradié par rayonnement UVC puis irradié par rayonnement ionisant comprend les composants suivants.

Tableau 6 :

Ainsi, le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire doublement irradié est fortement réduit, de sorte qu’il peut être ajouté à concentration élevée, c’est- à-dire jusqu’au moins 20% à un milieu de base contenant du calcium sans coaguler, en l’absence d’anticoagulant tel que l’héparine.

Par exemple, l’irradiation par rayonnement UVC est réalisée à une dose comprise entre 0,01 à 2 J/cm ² , particulièrement entre 0,5 J/cm ² et 1 ,5 J/cm ² , et plus particulièrement à 1 J/cm ² , et l’irradiation par rayonnement ionisant est une irradiation par rayonnement gamma réalisée à une dose absorbée comprise dans la plage allant de 20 kGy à 60 kGy, particulièrement de 35 kGy à 45 kGy. Comme certains facteurs de croissance ne sont pas impactés au même niveau par l’irradiation par rayonnement UVC et par l’irradiation par rayonnement ionisant, il est possible de moduler la quantité des facteurs de croissance dans un lysat plaquettaire en modulant les paramètres respectifs de chacune des deux irradiations.

De plus, l’irradiation par rayonnement UVC et l’irradiation par rayonnement gamma ayant un effet antibactérien et antiviral, le procédé de l’invention permet en outre d’obtenir un produit hautement sécurisé d’un point de vue viral et/ou bactérien.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon le premier aspect de l'invention.

Le lysat plaquettaire préparé selon le procédé de préparation de l'invention présente un profil de facteurs de croissance et de protéines particulier.

En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC impacte certains facteurs de croissance non ou moins impactés par une irradiation par rayonnement ionisant. Ces facteurs de croissance comprennent notamment les facteurs EGF, TGF-bêta1 et PDGF-BB.

Par exemple, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en facteur de croissance endogène EGF inférieure à 2 800 pg/ml, et/ou une concentration en facteur de croissance endogène TGF-bêta1 inférieure à 70 000 pg/ml, notamment inférieure 40 000 ng/ml, et/ou une concentration en facteur de croissance endogène PDGF-BB inférieure à 12 000 pg/ml.

Il en va de même de la vitamine B12 impactée par le rayonnement UVC mais pas par le rayonnement ionisant.

Par exemple, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en vitamine B12 réduite de 10 à 30% par rapport au lysat plaquettaire de départ. En particulier, la concentration en vitamine B12 est comprise dans la plage allant de 125 à 140 pg/ml.

Certains facteurs de croissance ou protéines ne sont pas ou sont peu impactés par l’irradiation par rayonnement UVC et par l’irradiation par rayonnement ionisant.

Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et rayonnement ionisant comprend une concentration en facteur de croissance PDGF-AB comprise dans la plage allant de 16 000 à 45 000 pg/ml.

Certains facteurs de croissance ou protéines ne sont pas impactés par l’irradiation par rayonnement UVC, mais le sont par l’irradiation par rayonnement ionisant.

Par exemple, l’antithrombine III, protéine impliquée dans la chaîne de coagulation n’est que faiblement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC, mais est plus fortement impactée par le rayonnement ionisant.

Certains facteurs de croissance sont impactés à la fois par l’irradiation par rayonnement UVC et par l’irradiation par rayonnement ionisant.

Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en facteur de croissance bFGF endogène inférieure à 140 pg/ml.

Lorsque le lysat plaquettaire est en plus irradié par rayonnement ionisant, la concentration en facteur de croissance bFGF endogène est inférieure à 90 pg/ml.

Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant comprend en outre une concentration en fibrinogène inférieure à 0,4 mg/ml.

La double irradiation par rayonnement UVC et rayonnement ionisant n’a pas d’impact notable sur la concentration en protéines totales du lysat plaquettaire. Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et irradié par rayonnement ionisant comprend une concentration en protéines totales comprise entre 14 et 80 mg/ml, selon la quantité initiale de plasma.

Plus particulièrement, la concentration en protéines totales dans un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma, irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 55 mg/ml à environ 80 mg/ml.

La concentration en protéines totales dans un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma, irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 18 mg/ml à environ 30 mg/ml.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé pour la culture de cellules, particulièrement de cellules animales, et plus particulièrement encore de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon le deuxième aspect de l’invention.

Le procédé s’applique par exemple à la culture de cellules animales humaines ou non humaines, telles que les kératinocytes, les cellules épithéliales, les lignées cellulaires leucémiques ou issues de tumeurs solides, les adipocytes, les cellules souches du fluide amniotique, les cellules stromales de moelle osseuse, les chondrocytes, les cellules cornéennes, les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses, les monocytes, les ostéoblastes et les cellules tueuses naturelles. Les cellules souches mésenchymateuses sont par exemple des cellules souches mésenchymateuses humaines issues de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical.

Selon une réalisation particulière, la composition nutritive comprend de 2 % à 25%, en particulier de 5% à 15%, et encore plus particulièrement de 8 à 10% de lysat plaquettaire irradié selon l'invention.

Notamment, le lysat plaquettaire irradié est ajouté extemporanément de façon préliminaire audit milieu de base de sorte à former ladite composition nutritive.

Comme le lysat plaquettaire irradié présente un pouvoir de coagulation réduit, il n'est pas nécessaire d'ajouter à la composition nutritive un anticoagulant de type héparine pour éviter sa coagulation et la maintenir dans un état liquide.

Ainsi, selon un mode de réalisation du procédé pour la culture de cellules, particulièrement de cellules animales, la composition nutritive est sous forme liquide et exempte d'anticoagulant.

Exemple 1 : Lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC

1 .1 Préparation d'un lysat plaquettaire

Un lot de lysat plaquettaire est préparé comme décrit ci-dessous.

Des concentrés plaquettaires (20 concentrés plaquettaires) comprenant 70% de solution de conservation Intersol® et 30% de plasma ont été préparés à partir d'un mélange de cinq buffy coat et conservés dans des poches de stockage.

Les poches de stockage ont été congelées à -80°C pendant une durée d'environ 24 heures avant d'être décongelées à 4°C pendant environ 24 heures. Les poches de stockage décongelées sont ensuite centrifugées à une vitesse de 5000 g pendant 10 minutes de sorte à séparer le surnageant comprenant le lysat plaquettaire du sédiment comprenant les débris cellulaires.

Le surnageant de chacune des poches de stockage est transféré dans une poche de mélange de sorte à obtenir un mélange de lysats plaquettaires (LP).

1.2. Irradiation aux UVC

Le mélange de lysats plaquettaires est transféré, par volume de 500 ml, dans des poches d’irradiation. L’air et toutes les bulles sont éliminés des poches d’irradiation.

Les poches d’irradiation sont ensuite irradiées à l’aide d’un appareil d’illumination aux UVC (Macotronic UV, Maco Pharma, France), à différentes doses (0-3,2 J/cm ² ). Les poches d’irradiation sont agitées à une vitesse de 1 10 trs/min.

Après irradiation par rayonnement UVC, les contenus des poches d’irradiation sont re-mélangés dans une poche de transfert.

1 .3. Dosages de cytokines

Les tests suivants, réalisés sur 3 lots (LP0,LP1 ,LP2), ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses UVC :

- Dosages à l’aide de kits ELISA de l'IGF-1 (réf. DG100/lot 341313) et du TGF- Bêtal (réf. DB100B/lot 340010),

- Dosages à l’aide de kits ELISA du bFGF (réf. DFB50/lot P104841 ), du PDGF- AB (réf. DHD00C/lot P101565), de l'EGF (réf. DEG00/1 ot 339998), et du VEGF (réf. DVE00/lot P100719)

Les résultats, illustrés sur la figure 1 , montrent que la concentration en IGF-1 dans le lysat plaquettaire n'est pas impactée par l’irradiation aux UVC. La moyenne des 3 lots permet de conclure que la concentration en PDGF-AB est peu ou pas impactée par l'irradiation aux UVC (figure 4).

En revanche, les figures 2,3, 5 et 6 montrent que la concentration en TGF-bêta1 , bFGF, EGF et VEGF, diminue à mesure que la dose d'UVC augmente et ce, à partir de 0,8 J/cm ² .

Les pertes en EGF et VEGF sont moins importantes comparées aux pertes en bFGF et TGF-bêta1 . On observe 23% et 24% de perte respectivement pour le bFGF et le TGF-bêta1 à 0,8 J/cm ² , et jusqu'à 50% et 44% respectivement à 1 ,6 J/cm ² .

1 .4. Dosages de facteurs plasmatiques

Des dosages biochimiques, réalisés sur les 3 mêmes lots, ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses UVC.

Les résultats des dosages des facteurs plasmatiques dans le lysat plaquettaire après irradiation aux UVC, illustrés sur les figures 7 à 1 1 , montrent que les UVC ont un effet sur les facteurs II, Vil, IX, X, et XI. Comme pour le TGF-bêta1 , la concentration de ces facteurs plasmatiques diminue en fonction de la dose UVC délivrée lors de l’irradiation.

1 .5. Impact de l’irradiation par rayonnement UVC sur l'efficacité du LP (prolifération de CSMs)

Des tests de prolifération, réalisés sur 3 lots, ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses (figure 12).

Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) ont été ensemencées en plaques de 6 puits (triplicats pour chaque condition) à 2 500 cellules/cm ² . Tous les lysats plaquettaires ont été utilisés à 8% dans un milieu alphaMEM. L'expérience a été effectuée deux fois.

La figure 12 montre que les deux expériences génèrent le même profil de prolifération des CSMs au contact du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.

D'une part, on peut noter que les contrôles de lysat plaquettaire non irradié sont bien similaires. De plus, on observe un plateau de 0 J/cm ² à 1 ,2 J/cm ² où la prolifération des CSMs ne semble pas être impactée. Entre 1 ,2 J/cm ² et 1 ,6 J/cm ² la prolifération des CSMs commence à diminuer visiblement.

Ces expériences ont permis de déterminer qu’une irradiation par rayonnement UVC à une dose d’environ 1 J/cm ² permettait de maintenir une concentration en facteurs de croissance suffisante pour assurer une bonne prolifération cellulaire, tout en réduisant visiblement la concentration en facteurs de coagulation.

Exemple 2 : Production industrielle de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement gamma

2.1 Préparation du lysat plaquettaire

Plusieurs lots de lysat plaquettaire (LP) ont été produits comme décrit dans l’exemple 1 .1 ci-dessus, à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma et 70% d’une solution additive.

2.2 Irradiation par rayonnement UVC

Le mélange de lysats plaquettaires est filtré au travers un filtre de porosité 0,45 pm avant d’être irradié par rayonnement UVC. Le mélange de lysats plaquettaires filtré est transféré, par volume de 500 ml, dans des poches d’irradiation. L’air et toutes les bulles sont éliminés des poches d’irradiation.

Les poches d’irradiation sont ensuite irradiées à l’aide d’un appareil d’illumination aux UVC (Macotronic UV, Maco Pharma), à une dose de 1 J/cm ² . Les poches d’irradiation sont agitées à une vitesse de 1 10 trs/min.

Après irradiation par rayonnement UVC, les contenus des poches d’irradiation sont re-mélangés dans une poche de transfert et le mélange de lysats plaquettaires irradié par rayonnement UVC est filtré au travers un filtre stérilisant de porosité 0,2 pm pour former un lot de lysat plaquettaire irradié aux UVC (LP-UVC).

2.2 Irradiation par rayonnement gamma

Le mélange de lysats plaquettaires irradié aux UVC est ensuite redistribué dans des poches de 50 ml en éthylène acétate de vinyle.

Les poches de 50 ml sont congelées à -80°C puis irradiées par rayonnement gamma à une dose absorbée de 35 kGy ou 55 kGy (LP-UVC-G35 et LP-UVC-G55). Le même lot est utilisé pour l’irradiation à 35 kGy ou à 55 kGy.

2.3 Dosage des cytokines

Dans des échantillons de LP, LP-UVC-G35 et LP-UVC-G55, on dose, à l’aide de kits Elisa commerciaux, la quantité de bFGF (ref.SFB50/ lot P1 16487), PDGF- AB (ref.SHDOOC/ lot P122623), PDGF-BB (ref.SBBOO/ lot P1 16857) et TGF- bêtal (ref.SBI 00B/ lot P1 19433).

Sur la figure 13, la concentration en bFGF est impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma. Le LP-UVC-G35 perd 50% de sa concentration en bFGF et le LP-UVC-G55 perd 61 % de sa concentration en bFGF. On observe un effet de la dose de l’irradiation gamma sur la perte de bFGF : plus la dose d’irradiation par rayonnement gamma appliquée est forte, plus la perte en bFGF augmente.

Sur la figure 14, la concentration en PDGF-AB est légèrement impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma : le LP-UVC-G35 perd 13% de sa concentration en PDGF-AB, le LP-UVC-G55 perd 24% de sa concentration en PDGF-AB (figure 14).

Sur la figure 15, la concentration en PDGF-BB est plus fortement impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma que la concentration en PDGF-AB : le LP-UVC G35 kGy perd 34% de sa concentration en PDGF-BB, le LP-UVC-G55 perd 39% de sa concentration en PDGF-BB. L’effet de la dose de l’irradiation par rayonnement gamma sur la perte de PDGF- BB n’est pas clairement démontré.

Sur la figure 16, la concentration en TGF-bêta1 est impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma, sans effet de la dose de rayonnement gamma : le LP-UVC-G35 perd 31 % de sa concentration en TGF-bêta1 , le LP-UVC-G55 perd 34% de sa concentration en TGF-bêta1.

D’après ces résultats, seule la concentration en PDGF-AB est faiblement impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma. En revanche la concentration en bFGF diminue d’environ 50% pour les doses étudiées.

2.4 Dosage des protéines

Le dosage de protéines est réalisé grâce à un kit BCA (UP40840/C05KL03).

Aucun effet notable de a double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma n’est observé sur la concentration en protéines (figure 17). 2.5. Dosages biochimiques et facteurs de coagulation

Des analyses biochimiques ont été réalisés sur les 12 éléments suivants :

Parmi les 12 éléments dosés, seule la vitamine B12 est impactée par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma. L’effet de la dose de l’irradiation par rayonnement gamma sur la perte de vitamine B12 n’est pas montré (figure 18). Selon le tableau 7 ci-dessous, les concentrations en facteurs de coagulation (Fil, FVII, FIX, FX, FXI) et en antithrombine III (ATM I), protéine impliquée dans la coagulation, sont impactées par la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma. On observe un effet de la dose de l’irradiation par rayonnement gamma sur la perte en facteurs de coagulation : plus la dose d’irradiation gamma appliquée est forte, plus la perte en facteurs de coagulation augmente.

Tableau 7 : Pourcentages de différence en concentration de protéines par rapport au LP de départ

2.6. Test de gélification

Le test a été réalisé à différentes concentrations de lysat plaquettaire dans le milieu de base alphaMEM sans héparine: 2,5%, 5%, 8%, 10%, 15%, et 20%.

Tableau 8 :

- : pas de gélification

+ : effet gélifié mais quasi liquide

++ : gélifié à 50%

+++ : gélifié à 100%

Pour le lysat plaquettaire non irradié (LP), à faible pourcentage de lysat plaquettaire (2,5%), il n’y a pas d’effet gélifié. Les résultats montrent que plus le pourcentage de lysat plaquettaire présent dans le milieu de base augmente, plus la gélification du milieu de base est importante.

A 5% de LP, le milieu de base a déjà un effet gélifié, et à 8% de lysat plaquettaire, le milieu de base est gélifié jusqu’à 50%.

Le milieu de base contenant du LP-UVC ne commence à gélifier qu’à des concentrations de LP-UVC de 10%, et qu’à des concentrations de LP-G35 de 15%.

Aux pourcentages les plus élevés (15% et 20%), seuls les milieux de base contenant du LP-UVC-G35 et LP-UVC-G55 restent non gélifiés.

En conclusion, le milieu de base contenant du lysat plaquettaire doublement irradié ne gélifie pas, et ce quel que soit le pourcentage de ce lysat plaquettaire doublement irradié utilisé (jusqu’à des doses fortes de 20%), même sans ajout d’héparine. Ainsi, la double irradiation dégrade de façon conséquente le pouvoir de coagulation d’un lysat plaquettaire. 2.7. Tests de prolifération

Les cellules utilisées sont des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines primaires dérivées de moelle osseuse provenant de deux donneurs différents (M065 et M068). L’expérience a été réalisée en aveugle par deux expérimentatrices.

Le premier jour, on ensemence des plaques 6 puits à 2500 cellules/cm ² en triplicata. Les CSMs humaines sont à P3.

Le milieu de base utilisé est le milieu alphaMEM. Les lysats plaquettaires sont ceux du tableau 8, à 8% dans le milieu de base.

On change le milieu tous les 3 jours. Après 7 jours de culture cellulaire, les cellules sont comptées au ViCell.

On n’observe qu’un faible impact de la double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma sur l’efficacité du lysat plaquettaire : perte de 4% de la prolifération cellulaire causée par le rayonnement UVC et gamma à 35 kGy (figure 19).

En revanche, à 55 kGy, l’irradiation par rayonnement gamma a un impact plus marqué sur l’efficacité du lysat plaquettaire. Ainsi, l’effet cumulé de l’irradiation aux UVC et de l’irradiation gamma à 55 kGy engendre une perte de 18% de la prolifération cellulaire par rapport au contrôle LP. Toutefois, on peut noter que le LP doublement irradié à 55 kGy reste plus efficace que les conditions 10% SVF+bFGF à 1 ng/ml (résultats non montrés).

L’absence d’impact sur la prolifération cellulaire de la double irradiation du lysat plaquettaire par rayonnement UVC et gamma à 35 kGy pourrait être expliquée par le fait que, d’une part, les cytokines d’intérêt et, d’autre part, les différents facteurs biochimiques importants pour la croissance cellulaire (vitamines, ...), ne sont pas ou faiblement impactés. La relative perte de certains de ces facteurs (toujours présents même si pour certains en plus faible quantité) pourrait expliquer l’absence d’effet sur la prolifération cellulaire. De plus, à une irradiation par rayonnement gamma de 55 kGy, l’ensemble des cytokines étant plus impactées qu’à 35 kGy, ceci ne permettrait plus une prolifération optimale des cellules, ce qui pourrait expliquer l’effet négatif de la double irradiation par rayonnement UVC et gamma à 55 kGy sur la prolifération cellulaire (-18%).