La présente invention a pour objet un procédé de préparation de macrophages, et plus particulièrement de macrophages humains, notamment de macrophages activés (encore désignés macrophages cytotoxiques), ou encore de macrophages (ou autres cellules dérivées des monocytes ou de leurs précurseurs) pour la présentation d'antigènes, ainsi que des trousses et des compositions susceptibles d'être utilisées pour la mise en oeuvre de ce procédé. Les macrophages jouent un rôle majeur dans la réponse antitumorale, ils peuvent être activés par des activateurs immunologiques contre des cellules cancéreuses (Adams D. and Hamilton T. : Activation of macrophages for tumor cell kill: effector mechanism and régulation. In Heppner & Fulton (eds), Macrophages and cancer. CRC Press, 1988, p. 27; Fidler I. : Macrophages and métastases. A biological approach to cancer therapy. Cancer Res. 45: 4714.

1985).

Par ailleurs, les macrophages, ou autres cellules dérivées des monocytes ou de leurs précurseurs, par leur forte capacité d'endocytose, de disgestion et de présentation à leur surface d'antigènes, sont capables d'induire une réponse immunitaire spécifique. A ce titre, ils représentent de bons candidats pour la préparation de vaccins, et plus particulièrement de vaccins cellulaires autologues. Les macrophages, ou autres cellules dérivées des monocytes, présentant à leur surface des antigènes particuliers capables d'induire une réponse immunitaire spécifique, sont encore désignés dans la suite de ce texte par l'expression MD-APC (pour "Monocytes Derived Antigen Presenting

Cells").

Les MD-APC sont obtenues par culture de cellules mononucléées (monocytes ou leurs précurseurs) prélevées sur un patient ou sur sujet sain, en présence d'un (ou plusieurs) antigène(s) que l'on souhaite exprimer sous forme de fragments à la surface des cellules obtenues en fin de période de culture.

Les antigènes susceptibles d'être mis en culture avec les cellules mononucléées susmentionnées sont par exemple des antigènes exprimés par des cellules tumorales (notamment des fragments de cellules tumorales tuées) ou par des pathogènes (notamment des fragments de protéines de bactéries ou de virus). Les MD-APC ainsi obtenues sont utilisées pour la préparation de vaccins dirigés contre la pathologie associée à l'antigène co-cultivé avec les cellules mononucléées (notamment des vaccins contre des maladies tumorales ou virales) et plus particulièrement pour la préparation de vaccins cellulaires autologues qui

sont avantageusement administrés au patient chez lequel les cellules mononucléées de départ ont été prélevées.

Des MD-APC peuvent également être obtenues par transfection des cellules susmentionnées mises en culture, ou des cellules différenciées, notamment des macrophages, obtenues après culture, avec des séquences d'ADN codant pour des fragments d'antigènes tels que définis ci-dessus.

Des macrophages présentant une activité cytotoxique particulièrement importante (encore désignés macrophages activés ou MAK (marque déposée) ainsi qu'un milieu de culture et un procédé d'obtention de tels macrophages ont fait l'objet de la demande internationale n° PCT/EP 93/01232, déposée le 18 mai 1993.

Le procédé de préparation des macrophages défini dans la demande internationale susmentionnée, est réalisé à partir d'une composition enrichie en cellules sanguines obtenue par cytaphérèse réalisée sur un individu sain, et comprend une étape de culture de monocytes dans un milieu de culture contenant de la vitamine D3 1 ,25-dihydroxy et du GM-CSF (Granulocytes- Macrophages colony stimulating factor). Avantageusement, les monocytes sont cultivés en présence des lymphocytes, pendant environ 6 à 7 jours, et les macrophages différenciés ainsi obtenus sont activés par addition d'interféron γ (IFN-γ) dans le milieu de culture.

Cette étape de culture est, comme dans tout procédé d'obtention de macrophages décrit jusqu'à ce jour, précédée par une étape de séparation d'une part des cellules mononucléaires, et d'autre part des globules rouges, granulocytes et d'une partie des plaquettes contenus dans la composition dérivée du sang obtenue par cytaphérèse, et par une étape d'élimination, par lavage, d'une partie des plaquettes sanguines et des anticoagulants restant après l'étape précédente.

L'étape de séparation susmentionnée des globules rouges et granulocytes est généralement réalisée par centrifugation du milieu contenant les monocytes dans un gradient de densité, notamment dans une solution ayant une densité d'environ 1 ,0 à environ 1 ,3 g/ml, telle qu'une solution du type Ficoll Paque

(Pharmacia) ayant une densité de 1 ,077 g/ml.

Dans la demande internationale susmentionnée, la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse contient environ 7 à 9J0 ⁹ leucocytes pour un volume d'environ 200 ml. Après l'étape de séparation des globules rouges et des granulocytes par centrifugation sur un gradient de densité, la composition de la suspension cellulaire mise en culture contient alors, pour un volume d'environ 500 ml à 1000 ml:

Hématocrite < 0, 1 % en nombre de globules blancs présents

(Globules rouges) dans la composition

Plaquettes < 10 ¹⁰

Globules blancs 3 à 5J0 ⁹ Lymphocytes 50-70% en nombre de globules blancs présents dans la composition Monocytes 30-50% en nombre de globules blancs présents dans la composition Polynucléaires < 5 % en nombre de globules blancs présents (ou granulocytes) dans la composition

L'élimination des globules rouges et des granulocytes, préalablement à l'étape de culture, a toujours été considérée comme une étape indispensable en raison notamment du fait que ces derniers sont susceptibles d'inhiber totalement ou partiellement la différenciation des monocytes en macrophages lors de l'étape de culture.

Cette inhibition serait principalement due au fait que les globules rouges, les granulocytes, et les plaquettes utilisent les constituants du milieu de culture pour leur propre métabolisme, épuisant ainsi les réserves nécessaires au développement des monocytes, et entraînant une acidification du milieu de culture dans des proportions telles que l'étape de culture ne peut être amenée jusqu'à son terme (qui est d'environ 6 à 7 jours).

Par ailleurs, les granulocytes et les plaquettes seraient notamment susceptibles de sécréter des facteurs suppresseurs de la fonctionalité des macrophages, tels que le TGF (Transforming growth factor), et les prostaglandines.

Ainsi, il est couramment admis que les granulocytes ainsi que le plus de plaquettes possible doivent être séparés des monocytes avant la mise en culture de ces derniers, bien que cette étape de séparation entraîne également une élimination d'environ 20% à environ 50%, notamment d'environ 30% des cellules mononuclées présentes dans le milieu avant séparation.

La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé d'obtention de macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, qui soit plus simple à mettre en oeuvre et présentant de meilleurs rendements que les procédés d'obtention des macrophages décrits jusqu'à maintenant. Un autre but de l'invention est de fournir des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ce procédé.

Un autre but de la présente invention est de fournir à l'utilisateur de telles trousses, des compositions utilisables en tant que témoins internes pour le

contrôle du suivi des différentes étapes du procédé, notamment pour le contrôle de la teneur en monocytes, et le cas échéant en autres constituants de la composition de départ du procédé de l'invention, et pour le contrôle de la teneur en macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, de la composition finale recherchée.

La présente invention est illustrée à l'aide des figures suivantes:

- la figure 1 représente le montage pour la mise en oeuvre de la déplaquettisation et du lavage du produit de la cytaphérèse,

- la figure 2 représente le montage de la mise en culture des cellules mononucléées pour l'obtention de macrophages ou MD-APC,

- la figure 3 représente le montage du système d'élutriation.

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, ne comprenant pas d'étape de séparation par voie physique, notamment par centrifugation sur un gradient de densité de la manière indiquée ci-dessus, d'une part des globules rouges et/ou des granulocytes, et, d'autre part, des autres globules blancs, notamment des monocytes, présents dans la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse.

L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé de préparation d'une composition comprenant des macrophages ou des MD-APC, le cas échéant activés, caractérisé en ce que, partant d'une composition dérivée du sang d'origine humaine, et enrichie en cellules sanguines, et plus particulièrement en globules blancs tels que les monocytes, ou en précurseurs de ces derniers, notamment d'une composition dérivée du sang telle qu'obtenue par cytaphérèse, ledit procédé comprend les étapes suivantes:

- avantageusement une dilution de ladite composition dérivée du sang, notamment dans environ 2 à 3 fois le volume de cette dernière, à l'aide d'une solution physiologique appropriée,

- une étape de lavage de ladite composition dérivée du sang, avantageusement par centrifugation simple et lavage du culot issu de la centrifugation susmentionnée, après récupération du culot dans une solution physiologique de lavage appropriée, notamment dans une poche (du type poche de transfert), en effectuant par exemple une pression sur ladite poche, la solution de lavage étant. alors éliminée vers une autre poche ou autre récipient, pour récupérer une composition dépourvue d'éventuels anticoagulants et de résidus divers et appauvrie en plaquettes,

- le cas échéant répétition de l'opération de lavage susmentionnée, notamment entre 1 et 2 fois,

- une étape de culture des cellules contenues dans la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage susmentionnée, en plaçant celle- ci dans un milieu de culture approprié, notamment dans une poche avantageusement hydrophobe, pendant environ 6 à environ 10 jours (notamment d'environ 6 à 7 jours), cette étape de culture étant le cas échéant effectuée en présence des antigènes particuliers susmentionnés, à savoir notamment en présence d'antigènes caractéristiques de cellules tumorales ou de pathogènes dans le cas de la production de MD-APC, et éventuellement suivie par une étape d' activation des macrophages ou MD-APC obtenus dans le milieu de culture, par addition dans ledit milieu de culture d'un activateur, tel que l'interféron γ, ledit activateur étant mis en contact avec le contenu du milieu de culture pendant environ 16 à environ 24 heures, cette étape de culture, et le cas échéant d' activation, étant éventuellement suivie par une centrifugation du milieu de culture et lavage du culot issu de la centrifugation, notamment de la manière indiquée ci-dessus, cette étape de culture, et le cas échéant d'activation, étant:

. précédée par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les monocytes, ou leurs précurseurs, susceptibles d'être présents dans la composition de départ, notamment des plaquettes, des globules rouges, des granulocytes et des lymphocytes, par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage précédant l'étape de culture, avec des anticorps dirigés contre tout ou partie des constituants susmentionnés, et récupération de la solution contenant les monocytes, ou leurs précurseurs, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps, et/ou suivie par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les macrophages ou MD-APC par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de culture avec les anticorps tels que décrits ci-dessus, et récupération de la solution contenant les macrophages ou MD-APC, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps,

. et/ou suivie par une étape de purification, notamment par élutriation, dans laquelle les macrophages ou les MD-APC, le cas échéant activés, sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, susmentionnée, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique.

L'invention découle de la découverte faite par les inventeurs que, contrairement aux idées reçues dans ce domaine, il est possible d'amener la culture des monocytes, ou leurs précurseurs, en macrophages ou MD-APC à

son terme avec de bons rendements lorsque le milieu de culture contient des quantités maîtrisées en globules rouges, lymphocytes, granulocytes et plaquettes.

L'invention offre donc l'avantage de disposer d'un procédé d'obtention de macrophages ou de MD-APC permettant de s'affranchir de l'étape de séparation par voie physique d'une part des cellules mononucléées, et plus particulièrement des monocytes, et d'autre part des globules rouges, des granulocytes (et de la grande majorité, sinon la totalité des plaquettes) contenus dans la composition dérivée du sang et obtenue par cytaphérèse, cette étape étant coûteuse (nécessitant la possession d'un matériel sophistiqué) et longue à mettre en oeuvre.

Avantageusement, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé susmentionné de l'invention, à savoir la composition de suspension cellulaire enrichie en cellules sanguines, telle qu'issue de la cytaphérèse, et avant l'étape de lavage précédent l'étape de culture dans le procédé décrit ci-dessus, est telle qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5%, notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. Une telle composition de départ, est avantageusement obtenue par mise en oeuvre d'un procédé de cytaphérèse réalisé sur un patient, ce procédé étant notamment effectué selon toute technique et avec tout matériel connus de l'homme de l'art dans ce domaine, le cas échéant, selon une procédure adaptée pour l'obtention d'une composition de départ telle que définie ci-dessus et ci- après.

Avantageusement, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine susmentionnée, peut contenir jusqu'à environ 3 % de globules rouges, et de préférence est telle qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 1 %, notamment de 0,3% à 0,5%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition.

Avantageusement encore, la composition de départ dérivée du sang d'origine humaine susmentionnée, est telle que:

- le nombre de plaquettes est compris entre environ 2J0 ^{1 1} à environ 6J0 ¹¹ pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml, - le nombre de globules blancs est compris entre environ 5 J0 ⁹ à environ 5J0 ¹⁰ pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml,

- la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80% . en nombre de globules blancs présents dans ladite composition,

- la proportion de monocytes est comprise entre environ 10% à environ 30% , en nombre de globules blancs présents dans ladite composition,

- la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'étape de lavage de la composition de départ, de préférence répétée 2 fois, permet essentiellement d'éliminer une partie des plaquettes, et le cas échéant des réactifs utilisés lors de l'obtention de la composition de départ, notamment lors de la cytaphérèse, tels que les anticoagulants. Avantageusement, le pourcentage de plaquettes éliminées lors de cette étape est d'environ 80% à environ 90% .

La composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, contient avantageusement, dans un volume d'environ 600 ml, les constituants suivants:

- Hématocrite: 0,2 à 0,4% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition

- Plaquettes: environ 2 à environ 6.10^

- Globules blancs: environ 4.10^ à environ 4.10 0

- Lymphocytes: environ 60% à environ 80% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Monocytes: environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition

- Polynucléaires: environ 10% à environ 15 % en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. Selon un mode de réalisation préférée du procédé de l' invention, l'étape de culture et de différenciation des monocytes, ou de leurs précurseurs, en macrophages ou en MD-APC, est réalisée à partir d'une composition dérivée du sang d'origine humaine contenant, non seulement des cellules mononucléées, à savoir des monocytes ou leurs précurseurs, et des lymphocytes, mais aussi des globules rouges (dans des quantités appropriées, notamment dans les proportions indiquées ci-dessus), des granulocytes et des plaquettes, ladite étape de culture étant notamment réalisée à partir de la composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, telle que décrite ci-dessus.

S'agissant de l'étape de culture elle-même, celle-ci est de préférence effectuée pendant environ 6 jours à environ 10 jours dans un milieu de culture spécifique et prêt à l'emploi à base d'IMDM (Iscove Modified Dubelcco

Médium, Gibco) modifié, à savoir le milieu de Dubelcco modifié par Iscove (IMDM) auquel on a ajouté de la L-Glutamine (2mM, Gibco) ou avantageusement de la L-Alanyl-L-Glutamine (2mM, Gibco), de l 'acide

pyruvique (2mM, Gibco), de l'Indométhacine (5J0 ^~ 6 M, Sigma), du mercaptoéthanol (3J0 ^~ 5 M, Gibco), et des acides aminés non essentiels (2% , Gibco). Au moment de la mise en culture, le milieu sera complété par 2 à 5 % de sérum AB ⁺ (ou de sérum autologue) ainsi que des antibiotiques tels que la pénicilline et la streptomycine.

L'invention a plus particulièrement pour objet le milieu de culture prêt à l'emploi susmentionné, contenant de la L-Alanyl-L-Glutamine en remplacement de la L-Glutamine. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence que le milieu prêt à l'emploi susmentionné contenant de la L-Alanyl-L-Glutamine peut avantageusement être conservé à 4°C avec l'ensemble des constituants des kits de l'invention décrits ci-après, tandis que le milieu prêt à l'emploi susmentionné contenant de la L-Glutamine doit être conservé à -20°C.

Pour la différenciation des monocytes en macrophages, le milieu de culture susmentionné est avantageusement complété par du GMCSF et de la vitamine D3.

Pour la différenciation des monocytes, ou de leurs précurseurs, en

MD-APC, le milieu de culture susmentionné est utilisé pour la co-culture avec les antigènes décrits ci-dessus, et est avantageusement complété par une à plusieurs cytokines telles que le GMCSF, le TNF-α, 1JL-13, 1JL-4, et/ou par d'autres adjuvants tels que le calcitriol et l'histamine.

Dans le cas de l'obtention de macrophages ou de MD-APC activés, un activateur, tel que l'interféron γ, est avantageusement introduit dans le milieu de culture susmentionné environ 16 heures à environ 24 heures avant l'arrêt de la culture. La composition de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré décrit ci-dessus. dans un volume d'environ 600 ml à 2000 ml, est avantageusement la suivante:

- Lymphocytes: environ 2.10^ à environ 2J0 ^χ 0

- Macrophages (ou MD-APC): environ 6.10^ à environ 6.10^ Cette dernière composition comprend peu ou pas de granulocytes, ces derniers s 'étant en grande partie décomposés durant l'étape de culture.

Les rendements de l'étape de culture susmentionnée, sont avantageusement d'environ 80% en cellules mononucléées, et d'environ 50% à environ 70% pour la différenciation en macrophages ou MD-APC (en prenant en compte le nombre de monocytes de départ).

Les rendements susmentionnés sont calculés en faisant le rapport entre le nombre de macrophages ou MD-APC obtenus après l'étape de culture et le nombre de monocytes présents dans la composition avant culture.

Avantageusement, dans le mode de réalisation préférée du procédé de l'invention décrit ci-dessus, l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, susmentionnée est suivie par une étape de purification notamment par élutriation, dans laquelle les macrophages ou les MD-APC, le cas échéant activés, sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, susmentionnée, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique.

Avantageusement, l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, mise en oeuvre dans le cadre du procédé préféré susmentionné, est suivie d'une étape d'élutriation telle que représentée sur la figure 3, cette dernière étant de préférence réalisée en utilisant le dispositif suivant:

- une poche (désignée B4 sur la figure 3) contenant la composition comprenant les macrophages ou les MD-APC, le cas échéant activés, obtenue après l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, ainsi qu'une poche contenant une solution physiologique (encore désignée solution d'élutriation) susceptible de maintenir l'ensemble du système d'élutriation dans un milieu viable pour les macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, et une prise d'air, sont reliées à un transfuseur à trois branches muni d'un filtre ,

- la prise d'air étant fermée, une pompe péristaltique entraîne le contenu de la poche B4 dans un élutriateur équipé d'un rotor avec une chambre d'élutriation, l'alimentation de l'ensemble du circuit d'élutriation en liquide physiologique étant assurée par l'entraînement du contenu de la poche contenant la solution d'élutriation, à l'aide de la pompe susmentionnée, pendant toute la durée de l 'élutriation, - la vitesse de rotation du rotor de l' élutriateur et le débit de la pompe sont tels que les divers constituants de la composition de la poche B4, introduits dans le rotor, sont séparés en fonction de leur taille dans la chambre d'élutriation, les constituants de plus petite taille migrant en premier vers le haut de la chambre (proche de la sortie de l' élutriateur), tandis que les constituants de plus grande taille, à savoir les macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, migrent vers la sortie de la chambre en dernier,

- les différents constituants de la composition contenue dans la poche B4, ainsi séparés sont récoltés séparément dans des poches reliées à l 'élutriateur, les plaquettes et divers résidus de petite taille étant récupérés les premiers dans une poche Cl , les globules rouges étant ensuite récupérés dans une poche C2, puis les lymphocytes dans les poches C3 et C4, et enfin les macrophages ou MD-APC dans une poche El , les différentes catégories susmentionnées de constituants étant extraites de l' élutriateur, en fonction de

leur taille respective, soit en diminuant la vitesse de rotation de l' élutriateur, soit en augmentant le débit de la pompe, la récupération des macrophages ou MD- APC dans la poche El pouvant avantageusement être réalisée par arrêt du rotor de l' élutriateur et ouverture de la prise d'air, la poche El contenant ainsi la composition recherchée de macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, avantageusement sous forme essentiellement pure.

En variante du procédé préféré décrit ci-dessus, l'étape de culture et différenciation des monocytes ou de leurs précurseurs en macrophages ou MD- APC, peut être précédée par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les cellules mononucléées, en particulier autres que les monocytes, susceptibles d'être contenus dans la composition obtenue après l'étape de lavage de la composition de départ, telle que décrite ci-dessus, ladite étape d'élimination étant effectuée non pas par voie physique, mais par mise en oeuvre de réactions immunologiques entre tout ou partie des constituants susmentionnés et des anticorps susceptibles de reconnaître lesdits constituants.

L'étape d'élimination par anticorps susmentionnée, est avantageusement réalisée par mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, avec des anticorps anti-plaquettes, et/ou anti-globules rouges et/ ou anti-granulocytes fixés sur un support solide, notamment sur les parois d'une poche du type transfert, ou sur les parois de tout autre dispositif dans lequel ladite composition issue de l'étape initiale de lavage est susceptible d'être introduite, ledit dispositif étant le cas échéant aménagé de manière à autoriser la circulation de ladite composition le long des parois sur lesquelles sont fixés lesdits anticorps. La mise en contact de ladite composition avec lesdits anticorps est réalisée, soit simultanément avec tout ou partie des anticorps susmentionnés, soit successivement notamment par introduction de ladite composition dans une poche ou autre dispositif tel que décrit ci-dessus, contenant des anticorps anti¬ plaquettes, puis passage de ladite composition dans une seconde poche contenant des anticorps anti-globules rouges, et/ou passage de ladite composition dans une troisième poche contenant des anticorps anti-granulocytes, les lymphocytes étant éliminés lors de l'étape d'élutriation suivant l'étape de culture.

Selon un autre mode de réalisation préférée du procédé de l'invention, ce dernier ne comprend pas d'étape d'élutriation, et l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, est:

- précédée par une étape de mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, avec des anticorps anti-

plaquettes, et/ou anti-globules rouges et/ou anti-granulocytes fixés sur un support solide, notamment de la manière indiquée ci-dessus, la mise en contact de ladite composition avec lesdits anticorps étant réalisée, soit simultanément avec tout ou partie des anticorps susmentionnés, soit successivement notamment de la manière indiquée ci-dessus, ladite composition étant ensuite transférée dans la poche contenant le milieu de culture,

- et suivie par une étape de mise en contact de la composition issue de l'étape de culture, et le cas échéant d'activation, avec des anticorps anti-lymphocytes, par introduction de ladite composition dans une (ou plusieurs) poche(s) ou autre dispositif tel que décrit ci-dessus, contenant des anticorps anti¬ lymphocytes, et récupération de la composition recherchée de macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, sous forme essentiellement pure.

Avantageusement, lorsque le procédé préféré décrit ci-dessus est réalisé par mise en contact de la composition issue de l'étape de lavage de la composition de départ, successivement avec des anticorps anti-globules rouges, puis anti-plaquettes, puis anti-granulocytes, la composition de la suspension cellulaire ainsi obtenue avant l'étape de culture, dans un volume d'environ 600 ml à environ 2000 ml, est avantageusement la suivante: - Globules rouges: < 0,1 %

- Plaquettes: < 10 ¹⁰

- Globules blancs: environ 3J0 ⁹ à environ 3J0 ¹⁰

- Lymphocytes: environ 60% à environ 80% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Monocytes: environ 20% à environ 30% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition - Polynucléaires: < 5 % .

La composition de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré décrit ci-dessus, dans un volume d'environ 600 ml à 2000 ml, est avantageusement identique à celle de la suspension cellulaire obtenue après l'étape de culture dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé préféré précédent ne faisant pas appel à une étape de réaction immunologique préalablement à l'étape de culture, à savoir:

- Lymphocytes: environ 2J0 ⁹ à environ 2J0 ¹⁰ - Macrophages: environ 6.10 ⁸ à environ 6J0 ⁹

Les rendements de l'étape de culture susmentionnée, sont avantageusement identiques à ceux décrits dans le cadre du procédé préféré précédent, à savoir environ 80% en cellules mononucléées, et environ 50% à environ 70% pour la

différenciation en macrophages (en prenant en compte le nombre de monocytes de départ).

Les rendements des procédés décrits ci-dessus, sont avantageusement du même ordre, que ces procédés soient réalisés suivant le principe de l' élutriation après l'étape de culture, ou suivant le principe de la réaction immunologique avant et après l'étape de culture.

Ainsi, les procédés décrits ci-dessus de l'invention sont tels que l'on obtient des suspensions cellulaires comprenant des macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, sous forme essentiellement pure, notamment dans des proportions d'environ 80% à environ 95 % , et avec des rendements finals d'environ 20% à environ 50% (lesdits rendements étant calculés en faisant le rapport entre la quantité de macrophages ou MD-APC purifiés obtenus en final et la quantité de monocytes mis en culture au départ).

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux des procédés de l'invention décrits ci-dessus, la composition de la suspension cellulaire de départ, et/ou l'une au moins des compositions de suspension cellulaire obtenue aux différentes étapes des procédés susmentionnés, et/ ou la composition de la suspension cellulaire finale, peu(ven)t être comparées à des compositions dites témoins internes, en vue du suivi du bon déroulement des procédés en question. Un témoin interne particulièrement avantageux est celui constitué d'une quantité déterminée de monocytes, purifiés à partir du sang prélevé chez un individu sain, avantageusement fixés, notamment par lyophilisation, ledit témoin interne permettant de quantifier le nombre de monocytes présents dans la composition de départ. Un témoin interne particulièrement préféré est tel qu'il comprend environ

2J0 ⁶ à environ 4J0 ⁶ monocytes lyophilisés pour un volume d'environ 1 ml à environ 2 ml d'une solution aqueuse.

La quantification du nombre de monocytes présents dans la composition de départ, est avantageusement réalisée par prélèvement d'une partie aliquote de la composition de départ, marquage des monocytes susceptibles d'être présents dans la fraction prélevée, notamment à l'aide d'anticorps marqués, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence, révélation du marquage effectué à l'aide de tout dispositif approprié, et comparaison à l' intensité de marquage obtenue dans les mêmes conditions opératoires avec ledit témoin interne.

Les anticorps marqués susceptibles de reconnaître des antigènes de surface spécifiques des monocytes sont avantageusement ceux dirigés contre par exemple les antigènes suivants: CD14, HLADR et le CD64.

Un autre témoin interne particulièrement avantageux est celui constitué d'une quantité déterminée de macrophages ou MD-APC purifiés, et le cas échéant activés, à partir du sang prélevé chez un individu sain, avantageusement fixés, notamment par lyophilisation, puis reconstitués dans une solution adéquate de 1 à 2 ml, ledit témoin interne permettant de quantifier le nombre de macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, présents dans la composition finale.

Un témoin interne particulièrement préféré est tel qu'il comprend environ 2J0 ⁶ à environ 4J0 ⁶ macrophages lyophilisés pour un volume d'environ 1 ml à environ 2 ml d'une solution aqueuse.

La quantification du nombre de macrophages ou MD-APC présents dans la composition finale, est avantageusement réalisée par prélèvement d'une partie aliquote de la composition finale, marquage des macrophages susceptibles d'être présents dans la fraction prélevée, notamment à l'aide d'anticorps marqués, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence, révélation du marquage effectué à l'aide de tout dispositif approprié, et comparaison à l'intensité de marquage obtenue dans les mêmes conditions opératoires avec ledit témoin interne.

Les anticorps marqués susceptibles de reconnaître des antigènes de surface spécifiques des macrophages et/ou des MD-APC sont avantageusement dirigés contre l'un au moins des antigènes suivants: CD54, CD58, CD80, CD86, CD14, CD16, MAX-1 , CD64, HLADR décrits notamment dans les articles suivants: Andreesen et al., Biology 47: 490-497 (1990), Lopez et al. , Journal of Immunotherapy 11 : 209-217 (1992), Chokri et al. , Anticancer Research 12: 2257-2260 (1992).

Avantageusement, les témoins internes susmentionnés sont constitués de billes, choisies notamment parmi les billes fluorescentes, présentant un diamètre comparable à celui des monocytes ou macrophages, et susceptibles de donner des signaux identiques à ceux donnés par les monocytes et les macrophages dans les solutions de départ et finale respectivement.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux des procédés décrits ci-dessus de l'invention, le contrôle des compositions de macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, obtenues lors de la mise en oeuvre de ces procédés, peut être effectuée par détection, et le cas échéant mesure, des cytokines sécrétées par les macrophages dans lesdites compositions, et comparaison au profil standard de sécrétion de cytokines par les macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés.

A titre d'illustration, la détection des cytokines sécrétées, comme 1JL-1 (Interleukine 1), l'IL-6 et le TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), peut être effectuée sur un prélèvement d'une partie aliquote du milieu de culture dans lequel la différenciation et l'activation des macrophages obtenus ont eu lieu. Les macrophages et les MD-APC, le cas échéant activés, obtenus par le procédé selon l'invention, peuvent être testés pour leur capacité à reconnaître et tuer des cellules tumorales (notamment par un test de cytotoxicité), ou, dans le cas des MD-APC, pour leur capacité de présentation antigénique, notamment en vérifiant leur capacité à induire une lymphoprolifération allogènique (par exemple test MLR, Mixed Lymphocyte Reaction). Ces tests permettront de déterminer le nombre d'unité fonctionnelle en macrophages ou MD-APC obtenu par le procédé de l'invention.

L'invention a également pour objet des trousses (ou kits) pour l'obtention de compositions de macrophages ou de MD-APC, le cas échéant activés, caractérisée en ce qu'elles comprennent:

. les éléments nécessaires aux lavages, la mise en culture et l' élutriation, comprenant:

- une (ou plusieurs) poche(s) de lavage,

- une (ou plusieurs) poche(s) de culture, de préférence hydrophobe(s),

- un (ou plusieurs) connecteur(s) pour l'élimination du surnageant des lavages,

- une (ou plusieurs) tubulure(s) de connexion entre les poches précédentes, - le cas échéant, un (ou plusieurs) site(s) d'injection dans la (ou les) poche(s) de lavage et de culture,

- un (ou plusieurs) système(s) permettant l'ouverture ou la fermeture des liaisons entre la (ou les) poche(s) de lavage et la (ou les) poche(s) de culture, notamment des systèmes de clamp sur les tubulures, - deux poches contenant la solution physiologique pour les lavages et l'élutriation,

- un transfuseur trois branches avec prise d'air,

- une tubulure en silicone et un raccord au rotor servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l' élutriateur, - une (ou plusieurs) poche(s) de collecte, le cas échéant reliées entre elles par des tubulures munies d'un système de clamp,

- une tubulure et un raccord au rotor servant de liaison entre la (ou les) poche(s) de collecte susmentionnée(s) et le rotor de l' élutriateur,

. les réactifs nécessaires à la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle, comprenant:

- une poche de milieu de culture spécifique et prêt à l'emploi, notamment un milieu de culture à base d'IMDM modifié, à savoir un milieu Iscove modified Dubelcco médium (IMDM, Gibco), auquel on a ajouté de la L-

Glutamine (2 mM, Gibco) ou de la L-Alanyl-L-Glutamine (2 mM, Gibco), de l'acide pyruvique (2 mM, Gibco), de l'Indométhacine (5J0 ^*6 M, Sigma), du mercaptoéthanol (3J0" ⁵ M, Gibco), des acides aminés non essentiels (2%, Gibco) ; 2 à 5% de sérum AB+ (ou de sérum autologue), ainsi que des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine, sont ajoutés au moment de la culture,

- un ou plusieurs suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, choisis parmi les suivants: * du GMCSF,

* de la vitamine D3,

* de l'mterleukine-13 (IL- 13),

* de l'IL-4

* du TNF-α * de l'histamine,

- le cas échéant un activateur tel que l'interféron γ, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée,

- avantageusement un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) comprenant des monocytes et/ou macrophages ou MD-APC, ces derniers étant le cas échéant activés, avantageusement fixés, ou lyophilisés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence,

- un ou plusieurs anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3 (marqueur des lymphocytes utilisé en tant que témoin négatif), CD45 (marqueur des leucocytes en général), CD14, CD16, CD64, CD54, CD58, CD80, CD86, HLA-DR et MAX-1.

Une trousse particulièrement avantageuse dans le cadre de la présente invention, se présente sous forme de deux ensembles: - l'ensemble I contenant les poches, tubulures, sites d'injection, systèmes de clamp, le transfuseur trois branches, à savoir les éléments dits "secs" utilisés pour les lavages, la mise en culture et la purification par élutriation,

- l'ensemble II contenant une poche contenant le milieu de culture spécifique ainsi que les réactifs pour la mise en culture, la différenciation, l'activation et le contrôle de qualité.

La trousse susmentionnée est davantage caractérisée en ce que: . l'ensemble I est constitué de deux sous-ensembles sous forme de deux boîtes:

- la boîte A contenant le matériel nécessaire pour les lavages des cellules provenant de la cytaphérèse, notamment:

* trois poches d'une capacité de 600 ml (poche centrale Al , et poches de recueil A2 et A3 sur figure 1)

* un set de transfert pour transférer le soluté de lavage dans la poche (poche Al sur figure 1) dans laquelle est transférée la composition sanguine en vue de diluer et laver les cellules issues de la cytaphérèse,

* un set de transfert des cellules lavées (contenues dans la poche Al sur la figure 1) vers les poches de culture (poches Bl , B2, et B3 sur figure

2),

* un set de transfert du milieu de culture, dan un premier temps vers les cellules lavées (contenues dans la poche Al sur la figure 1), et dans un deuxième temps vers les poches de culture susmentionnées, * trois poches de culture hydrophobes d'une capacité de 3 litres

(poches Bl , B2, et B3 sur figure 2),

- la boîte B contenant les éléments pour séparer les macrophages ou MD-APC différenciés des autres cellules présentes dans la culture lors de l'étape d'élutriation, notamment: * une poche de regroupement (ou poche de pooling B4 sur figure 2)

* un transfuseur trois branches avec prise d'air,

* une tubulure en silicone, et deux raccords au rotor, la tubulure et l'un des deux raccords servant de liaison entre le transfuseur et le rotor de l' élutriateur, l'autre raccord servant de liaison avec ledit rotor et l'ensemble de poches ci-après, cette dernière tubulure contenant un site de prélèvement d'échantillon,

* un ensemble composé de quatre poches de collecte (poches Cl , C2, C3, et C4 sur figure 3) d'une capacité d'un litre, d'une poche (poche El , sur la figure 3) d'une capacité 600 ml pour contenir la fraction finale des macrophages ou MD-APC purifiés, d'une poche (poche E2 sur figure 3) d'une capacité de 600 ml pour la récupération du surnageant de la poche précédente, et

d'une poche (poche E3 sur la figure 3) pour l'injection aux patients des macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés,

. l'ensemble II est représenté par la boîte C, cette dernière étant une boîte isotherme, le cas échéant avec refroidisseur pour maintenir la température à 4°C, et contenant notamment:

- une poche de deux litres de milieu de culture à base d'IMDM modifié tel que décrit ci-dessus,

- une boîte contenant les produits liquides ou lyophilisés suivants: * un flacon d'antibiotiques (pénicilline, avantageusement

1 000 U/streptomycine, avantageusement 1000 μg),

* un flacon de vitamine D3 (avantageusement 4 à 8 μg),

* un flacon de GMCSF (avantageusement 5J0 ⁵ à 10^ U),

* un flacon d'interféron γ (avantageusement 25J0 ⁴ à 5.10^ U), * un flacon d'IL-13,

* un flacon d'IL-4,

* un flacon de TNFα,

* un flacon d'histamine,

- une boîte contenant un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) tels que décrits ci-dessus, et un ou plusieurs flacons contenant des anticorps anti-CD3, anti-CD45, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD64, anti-MAX-

1 , anti-CD54, anti-CD58, anti-CD80, anti-CD86 et anti-HLA-DR marqués, notamment couplés à la fluorescéine.

L'invention vise également l'utilisation d'une trousse telle que définie ci- dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus selon l'invention comprenant une étape d'élutriation.

L'invention a également pour objet une trousse pour l'obtention de compositions de macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, caractérisée en ce qu'elle comprend: - une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-globules rouges,

- une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-plaquettes,

- une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-granulocytes,

- une (ou plusieurs) poche(s) à l'intérieur de laquelle (desquelles) se trouvent fixés des anticorps anti-lymphocytes,

- une (ou plusieurs) poche(s) de culture,

- une (ou plusieurs) poche(s) de récupération des macrophages ou MD- APC, le cas échéant activés, purifiés,

- des tubulures de raccord entre les différentes poches susmentionnées,

- des suppléments avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, à additionner au milieu de culture, notamment:

* des antibiotiques tels que pénicilline et streptomycine,

* du GMCSF,

* de la vitamine D3,

* de 1JL-13, * de l'IL-4,

* du TNFα,

* de l'histamine,

- le cas échéant un activateur tel que l'interféron γ, avantageusement sous forme liquide ou lyophilisée, - avantageusement un (ou plusieurs) témoin(s) interne(s) comprenant des monocytes ou macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, avantageusement fixés, et le cas échéant marqués, ou des billes calibrées, le cas échéant marquées, notamment par fluorescence, tel(s) que décrit(s) ci-dessus,

- des anticorps marqués, notamment par fluorescence, tels que ceux dirigés contre les antigènes CD3, CD45, CDU, CD16, CD64, CD54, CD58,

CD80, CD86, MAX-1 et HLA-DR.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une trousse telle que décrite ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci- dessus selon l'invention comprenant une étape de réaction immunologique. L'invention concerne également toute composition liquide contenant une suspension cellulaire dérivée de sang d'origine humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de monocytes supérieure à environ 5% , notamment d'environ 10% à environ 30%, en nombre de globules blancs présents dans ladite composition. L'invention a également pour objet toute composition telle que décrite ci- dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de globules rouges inférieure à environ 3%, ou inférieure à environ 1 %, notamment de 0,3% à 0,5% , en nombre de globules blancs présents dans ladite composition.

L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que:

- le nombre de plaquettes est compris entre environ 2J0 ¹¹ à environ 6J0 ¹¹ pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml,

- le nombre de globules blancs est compris entre environ 5J0 ⁹ à environ 5J0 ¹⁰ pour un volume d'environ 150 ml à environ 200 ml,

- la proportion de lymphocytes est comprise entre environ 60% à environ 80% , en nombre de globules blancs présents dans ladite composition, - la proportion de granulocytes est comprise entre environ 10% à environ 20% en nombre de globules blancs présents dans ladite composition.

L'invention vise plus particulièrement les compositions susmentionnées telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé de cytaphérèse réalisé notamment sur un volume sanguin d'environ 5 à 10 litres. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition telle que décrite ci-dessus, pour l'obtention d'une composition de macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés, notamment par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, ladite composition étant susceptible de pouvoir être administrée à un patient, le cas échéant après dilution des macrophages ou MD- APC, le cas échéant activés, ainsi obtenus dans une solution injectable appropriée.

L'invention a également pour objet les compositions (notamment pharmaceutiques ou vaccins) contenant des macrophages et/ou des MD-APC, le cas échéant activés, notamment dans les proportions de pureté indiquées ci- dessus, et telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention concerne également les compositions susceptibles d'être utilisées en tant que témoins internes dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, telles que décrites ci-dessus. A titre d'exemple, le contrôle interne dans le cadre de la préparation de macrophages activés, se présente de la manière suivante; Conditionnement :

- 1 flacon de lyophilisât (3xl0^/flacon)

- 1 flacon de tampon de reconstitution Reconstitution :

Réhydrater le flacon de lyophilisât avec 1 ml de la solution de reconstitution.

Mélanger doucement par retournement. Attendre au minimum 10 minutes avant l'utilisation de la préparation. Utilisation :

- le volume du contrôle interne utilisé est de lOOμl (3x10^ cellules)

- ajouter l'anticorps à tester

- incuber pendant 30 minutes à température ambiante

- ajouter 1 ml de PBS (ne pas laver)

- analyser au cytofluoromètre

Le pourcentage et l'intensité de marquage de macrophages ou MD-APC préparés seront comparés aux cellules produites.

Le tableau 1 qui suit donne une indication sur l'évolution des marqueurs membranaires en fonction du temps de stockage, des macrophages lyophilisés utilisés en tant que témoins internes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules positives et intensité de marquage. La ligne "Ctrl" correspond aux résultats obtenus avec des macrophages frais, non lyophilisés, cultivés et obtenus selon le procédé de l'invention. La ligne "7 Jours" correspond à des macrophages obtenus selon le procédé de l'invention, lyophilisés et réhydratés 7 jours après la lyophilisation. La ligne "7 Mois" correspond à des macrophages obtenus selon le procédé de l'invention, lyophilisés et réhydratés 7 mois après la lyophilisation. On constate que globalement les pourcentages de cellules positives ainsi que les intensités de marquage sont conservés entre les macrophages frais et ceux conservés à l'état lyophilisé pendant 7 jours ou 7 mois. Ainsi l'utilisateur des kits selon l'invention, est à même de pouvoir comparer les compositions qu'il obtient avec les témoins (ou standards) internes fournis dans ces kits, ces témoins étant avantageusement produits selon la même procédure et étant à l'état lyophilisé.

Tableau 1

Marqueurs

CD45 CD3 CD14 CD16 CD64 HLADR

Ctrl 92/115 0,3/54 87/149 22/35 77/63 84/115

7 jours 95/131 3/30 96/119 10/30 93/59 96/169

7 mois 91/119 3/22 86/95 10/25 81/54 82/116

Avantageusement les trousses selon l'invention sont accompagnées d'instructions écrites pour la préparation de macrophages ou MD-APC, le cas échéant activés.

Avantageusement, les trousses selon l'invention sont accompagnées également d'instructions sur support informatique permettant de guider l'opérateur pour la validation de chaque étape du procédé de l'invention, le but final étant de déterminer le nombre d'unités fonctionnelles susmentionnées obtenues par la mise en oeuvre du procédé de l'invention.

A titre d'illustration, les instructions écrites pour l'étape d'activation des macrophages, accompagnant un kit selon l'invention, peuvent se présenter de la manière suivante :

PRÉPARATION DE MAK ^*

Code Patient ^• Date :

ACTIVATION ^" DES MACROPHAGES Visa de (Suite S ^z l) l'operateur

Q Sortir la poche B 1 de l 'incubateur et effectuer les étapes ( 1) à (4) sous hotte à flux laminaire

Marque

N°

( 1) Prélever le \olume Y, de la solution d'interféion gamma a . ec une seπngue stérile de 1 ml

Prélèvement effectué OUI I I

NON

(2) Inoculer la solution d'interféron gamma dans la poche

(3) Sans retirer la seringue, aspirei et rémjectei son contenu jusqu'à homogénéisation

(4) Prélever stérilement et en une seule fois 1 ml de la poche dont a repartir dans 2 tubes:

• 0,5 ml de suspension cellulaire pour effectuer une numération, une viabilité et un contrôle de la taille des cellules (Cf annexe N ^' °7 ( A) paεe 33)

• 0,5 ml de suspension cellulane poui effectuer un contiôle bactérien (Cf annexe N°7 (D), page 35)

Q Sortir la poche B2 de l ^' incubateui et lépéter les étapes ( 1 ) a (4) Ajouter 0 5 ml dans chacun des deux tubes déjà utilisés pour les contrôles de la poche B 1

Q Sortir la poche B3 de l ^' incubateur et répéter les étapes ( 1) a (4; Ajoute! 0 5 ml dans chacun des deux tubes déjà utilisés pour les contioles des poche B 1 et

Prélèx ements effectués

Poche B 1 OUI | | Poche B2 OUI ^j Poche B3 OUI

NON I I NON ^' NO

Visa du responsable de la préparation

PRÉPARATION DE MAK ^*

Code Patient : Date :

ACTIVATION DES MACROPHAGES Visa de (Suite !s" ^> 2) l'opérateur ϋ Coller les étiquettes code-barres sur les deux tubes contenant les prélèvements.

Q Contrôle Bactériologique J6

Destinataire :

Q Remplir la fiche "Contrôle Bacténologique J6" qui se trouve dans la pochette i. AA' Documents de Liaison et la faire pan enir au destinatane avec le prélèvement

Q Entourer la mention "ACTIVATION" qui se e sur les poches B 1 B2 et B3

Q Replacer les poches B l, B2 et B3 à leur emplacement initial dans l'incubateur (Cf. page 9)

Q Détruire le reliquat d'interféron gamma

Date de destruction :

Opérateur :

Visa :

Q Compléter l'étiquetage ^•

PRÉPARATION DE MAK HUMAINS AUTOLOGUES

Etape ou produit: ACTIVATION

COLLER ICI

L'ETIQUETTE

CODE-BARRES

Dale . Heure :

Visa du responsable de la préparation

Description des figures :

La description des opérations représentées sur les figures 1 à 3 est la suivante :

I-DEPLAOUETTISATION DU PRODUIT DE CYTAPHERESE (figure (1) Transférer le contenu de la poche de cytaphérèse dans une poche Al de

600 ml.

(2) Ajouter dans la poche contenant les cellules mononucléées un poids de solution saline tamponnée, tel que le poids final de la poche soit de 450-500 g.

(3) Centrifuger la poche Al à 300 g, pendant 10 minutes à +4°C. (4) Evacuer le surnageant dans une poche A2, à l'aide d'une presse.

(5) Compléter à 450 g par la solution saline.

(6) Centrifuger une deuxième fois la poche Al .

(7) Evacuer le surnageant dans la poche A3 o Détacher les cellules de la poche de centrifugation Al , par friction (8) Compléter à 600 ml avec le milieu de culture préalablement préparé o Noter le volume de milieu de culture ajouté o Prélever stérilement les échantillons de contrôle II-MISE EN CULTURE DES CELLULES MONONUCLEEES (figure 2^ (9) Répartir équitablement dans les poches de culture Bl , B2 et B3 (10) Compléter le volume requis pour chaque poche par du milieu de culture.

(11) Transvaser le contenu des trois poches de culture dans la poche de pooling B4, après la fin de la période de culture et d'activation. ffl-SEPARATION PAR ELUTRIATION (figure 3) o Monter sur l'entrée de la chambre d'élutriation stérilisée, la partie I (Kit d'entrée) et sur la sortie de la chambre d'élutriation le kit de sortie (partie II)

(12) Remplir le circuit avec au moins 300 ml de solution d'élutriation.

(13) Simultanément, fermer l'arrivée de la solution d'élutriation et ouvrir celle de la poche de suspension cellulaire (poche B4) sans changer le débit de la pompe.

Dès que la totalité des cellules est passée, fermer l'arrivée de la poche des cellules B4 et ouvrir celle de la solution d'élutriation.

Augmenter le débit de la pompe tous les 500 ml et prélever un échantillon, (14) Quand les cellules de taille macrophagique commencent à sortir, arrêter la centrifugation et dévier le prélèvement sur la poche de collecte El en fermant l'arrivée de la solution d'élutriation et en ouvrant la prise d'air.

(15) Centrifuger la poche El à 400 g pendant 10 min.

(16) Evacuer le surnageant dans la poche E2

(17) Remettre les cellules en suspension dans une solution de 250 ml d'albumine humaine à 4% . Bien homogénéiser

(18) Transvaser dans la poche d'injection E3. La légende des figures 1 à 3 est la suivante : _.»- représente le sens de circulation du fluide.

représente la soudure.

-r» ΓD symbolise les perforateurs.

Λ représente le clamp.

représente la connection,

représente le site de connection.