谢海峰 (中国四川省成都市高新区肖家河沿街99号, Sichuan 1, 610041, CN)
HU, Yunling (99# Xiaojiahe Yanjie, Hi-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
成都普瑞法科技开发有限公司 (中国四川省成都市高新区肖家河沿街99号, Sichuan 1, 610041, CN)
XIE, Haifeng (99# Xiaojiahe Yanjie, Hi-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
谢海峰 (中国四川省成都市高新区肖家河沿街99号, Sichuan 1, 610041, CN)
| 权利要求书 1、 制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 采用 β-葡萄糖苷酶水解罗汉果苷 V、 罗汉果或 含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物。 2、根据权利要求 1所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 所述的罗汉果提取物为 罗汉果水提取物或乙醇溶液提取物。 3、 根据权利要求 1或 2所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 每 kg罗汉果苷 V 采用 5k〜50k万 U β-葡萄糖苷酶水解； 其中， β-葡萄糖苷酶在最适 ρΗ值和温度的条件下， lmin水解 lwt%的 β -葡聚糖溶液产生 1 μ g葡萄糖的酶量为 1个 β-葡萄糖苷酶活力单位 U。 4、 根据权利要求 1〜3任一项所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： β-葡萄糖苷 酶的水解时间为 2〜24h。 5、 根据权利要求 1〜4任一项所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 采用 β-葡萄 糖苷酶水解罗汉果苷 V或含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物的具体步骤如下： a、 溶解： 罗汉果苷 、 罗汉果或含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物加溶剂溶解， 使溶液中 的罗汉果苷 V的浓度为 0.025〜0.300g/mL; b、 水解： a步骤所得溶液中加入 β-葡萄糖苷酶水解， 并调节溶液的 ρΗ值和温度使其与 β-葡萄糖苷酶的酶解 ρΗ值和温度相适应； c、 分离、 纯化， 得到罗汉果苷 IV。 6、 根据权利要求 5所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 所述 a步骤中的溶剂为 水或与 β-葡萄糖苷酶的酶解 ρΗ值相适应的缓冲液。 7、根据权利要求 5或 6所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 所述 b步骤水解时 溶液中的 β-葡萄糖苷酶的浓度为 1.5万〜 5.0万 U/mL。 8、根据权利要求 5所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 水解时溶液中的罗汉果 苷 V浓度 0. lg/mL, β-葡萄糖苷酶浓度为 2. 0万 U/mL， 水解时间为 16h。 9、 根据权利要求 1〜8任一项所述的制备罗汉果苷 IV的方法， 其特征在于： 所述的 β-葡 萄糖苷酶为纤维素酶、 1，4- β -ϋ-葡聚糖葡糖苷水解酶、 半纤维素酶中至少一种。 |
本发明涉及制备罗汉果苷 IV的方法， 属于中药领域。
背景技术
罗汉果主产于广西， 江西， 广东， 也被称作僧果， 在我国有数百年的种植历史， 其在中 医中的应用可追溯到 1813年。 罗汉果中的葫芦烷三萜甙类化合物， 包括赛门苷 I， 罗汉果苷 II， 罗汉果苷 III， 罗汉果苷 IIIE, 罗汉果苷 IV， 罗汉果苷 V等。 其中罗汉果苷 IV的含量极低， 提取难度大成本高， 国内外未见有罗汉果苷 IV的制备工艺的相关报道。
目前， 国外医药工作者发现罗汉果苷 IV具有良好的治疗丙肝的作用， 可单独或与其他药 物共用起到良好的治疗效果。 罗汉果苷 IV其毒副作用小， 生物利用度高， 是新兴的抗病毒天 然植物成分， 具有广阔的市场价值。
目前制约罗汉果苷 IV应用的瓶颈问题是罗汉果苷 IV的制备， 罗汉果苷 IV在罗汉果原料粉 末中含量<0.05 % (罗汉果苷 V的含量为 2%左右）， 所以苷 IV制备困难， 成本高。 严重的制 约了罗汉果苷 IV的开发应用。 因此， 如何开发出一种高效的制备罗汉果苷 IV的方法成为本领 域目前迫切需要解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本较 低的制备罗汉果苷 IV的方法。
本发明制备罗汉果苷 IV的方法为： 采用 β-葡萄糖苷酶水解罗汉果苷 V、 罗汉果 （可以是 罗汉果鲜果或罗汉果干粉） 或含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物。
其中， 罗汉果水提取物或乙醇溶液提取物均适用于本 发明。
进一步的， 上述的制备罗汉果苷 IV的方法， 优选每 kg罗汉果苷 V采用 5k〜50k万 U β- 葡萄糖苷酶水解； 其中， β-葡萄糖苷酶在最适 ρΗ值和温度的条件下， lmin水解 1^%的3 - 葡聚糖溶液产生 1 μ g葡萄糖的酶量为 1个 β-葡萄糖苷酶活力单位 U。 β-葡萄糖苷酶的水解时 间优选为 2〜24h。
其中， 上述制备罗汉果苷 IV的方法， 其采用 β-葡萄糖苷酶水解罗汉果苷 V或含有罗汉果 苷 V的罗汉果提取物的具体步骤如下：
a、 溶解： 罗汉果苷 、 罗汉果或含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物加溶剂溶解， 使溶液中 的罗汉果苷 V的浓度为 0.025〜0.300g/mL;
b、 水解： a步骤所得溶液中加入 β-葡萄糖苷酶水解， 并调节溶液的 ρΗ值和温度使其与 β-葡萄糖苷酶的酶解 ρΗ值和温度相适应；
c、 分离、 纯化， 得到罗汉果苷 IV。 其中， 所述 a步骤中的溶剂可以为常规溶剂， 溶剂优选为水或与 β-葡萄糖苷酶的酶解 pH 值相适应的缓冲液。
其中， 上述 a步骤酶解时， 若罗汉果苷 V浓度过高， 会在溶液中形成分子间氢键， 降低 酶水解效率； 若罗汉果苷 V浓度过低， 则罗汉果苷 IV的产率较低， 还会增加浓缩成本， 溶液 中的罗汉果苷 V的浓度为 0.025〜0.300g/mL较为合适。
进一步的， 由于 β-葡萄糖苷酶的溶解度有限， 加入过多， 则会造成浪费； β-葡萄糖苷酶 的浓度过低， 则水解效率较低， 上述 b步骤水解时溶液中的 β-葡萄糖苷酶的浓度优选为 1.5 万〜 5.0万 U/mL (指水解时酶的初始浓度）。
其中， 更优选的水解条件为： 水解时溶液中的罗汉果苷 V浓度 0. lg/mL (指水解时罗汉 果苷 V的初始浓度）， β-葡萄糖苷酶浓度为 2. 0万 U/mL (指水解时酶的初始浓度）， 水解时间 为 16h。
其中， 由于 β-葡萄糖苷酶的种类较多， 不同的 β-葡萄糖苷酶的最佳酶活的 pH值和温度 不同， 因此， 为了提高水解效率， 可以调节水解溶液的 pH值和温度使其与 β-葡萄糖苷酶的 酶解 pH值和温度相适应， 即调节至 β-葡萄糖苷酶的最佳酶活的 pH值和温度。
其中， 上述 C步骤中可以采用常规的分离、 纯化方法， 如： 凝胶柱层析方法、 HPLC纯化 法等， 分离、 纯化得到高纯度的罗汉果苷 IV产品。
其中， 上述的 β-葡萄糖苷酶可以为常规的 β-葡萄糖苷酶， 可以采用市售的 β-葡萄糖苷酶 或自行制备的 β-葡萄糖苷酶（β-葡萄糖苷酶可按常规方法制 备）， 考虑到成本的因素， 上述的 β-葡萄糖苷酶优选为纤维素酶、 1，4- β -ϋ-葡聚糖葡糖苷水解酶、 半纤维素酶中至少一种。
本发明方法工艺简单， 成本较低， 可以将罗汉果粉末中罗汉果苷 IV的含量从< 0. 05 %， 提高到 2. 00 %以上； 对于罗汉果提取物（罗汉果苷 V含量约为 40 %， 罗汉果苷 IV含量约为 1. 5
% ), 本发明方法可以将罗汉果苷 IV的含量提高到 20 %以上。 经过分离、 纯化， 可以使罗汉果 苷 IV的纯度达到 98 %以上。 本发明方法为罗汉果苷 IV的制备提供了一种新的途径， 具有广阔 的应用前景。
附图说明
图 1 是酶水解前后罗汉果提取物的 HPLC图， 其中， 图 Α为酶水解前的罗汉果提取物的 HPLC图， 图 B为酶水解后罗汉果提取物的 HPLC图， 图中划圈处为罗汉果苷 IV。
图 2 是经纯化后的罗汉果苷 IV的 HPLC图（图 A)及罗汉果苷 IV标准样品的 HPLC图（图
B ) 。
图 3 是纯化后的罗汉果苷 IV的核磁图谱 ^H NMR
图 4 是纯化后的罗汉果苷 IV的核磁图谱 （ 13 C NMR)。
图 5 是纯化后的罗汉果苷 IV的质谱图。
具体实施方式 罗汉果苷 V的结构如 （ I ) 所示， 罗汉果苷 IV的结构如 （Π)所示。
(II)
从结构式 （ I ) 和 （II)可以看出： 罗汉果苷 IV比罗汉果苷 V少一个葡萄糖， 理论上， 可以用糖基水解酶、 酸或碱水解使罗汉果苷 V的糖基减少， 从而得到罗汉果苷 IV。 但是， 经 过大量试验发现， 采用酸或碱水解罗汉果苷 V， 其目标性不强， 容易破坏罗汉果苷结构， 得 不到罗汉果苷 IV或得到的罗汉果苷 IV产率较低，难以满足工业大规模生产罗汉果 IV的需要。 本发明的发明人通过大量试验， 发现调整适当的 β-葡萄糖苷酶用量， 以及控制合适的酶解时 间， 却可以将罗汉果中葫芦烷三萜甙类化合物的苷 IV的含量从<0. 05 %， 提高到 2. 00 %以上， 对于罗汉果提取物（罗汉果苷 V含量约为 40 %， 罗汉果苷 IV含量约为 1. 50% )， 本发明方法可 以将罗汉果苷 IV的含量提高到 20 %以上。 均大幅高出了预计的罗汉果苷 IV的产率的<0. 05 % (以罗汉果粉为原料）和< 1. 50 % (以罗汉提取物为原料） ， 更远远高于酸或碱水解的罗汉果 苷 IV的产率 <0. 11 % (以罗汉提取物为原料） 和<2. 20 % (以罗汉提取物为原料） ， 达到了工 业大规模生产罗汉果苷 IV的要求。
本发明制备罗汉果苷 IV的方法为： 采用 β-葡萄糖苷酶水解罗汉果苷 V、 罗汉果或含有罗 汉果苷 V的罗汉果提取物。 其中， 罗汉果水提取物或乙醇溶液提取物均适用于本 发明。
进一步的， 为了提高罗汉果苷 IV的产率， 上述的制备罗汉果苷 IV的方法， 优选每 kg罗汉 果苷 V采用 5k〜50k万 υ β-葡萄糖苷酶水解。； 其中， β-葡萄糖苷酶在最适 ρΗ值和温度的条 件下， lmin水解 1^ %的 β -葡聚糖溶液产生 1 μ g葡萄糖的酶量为 1个 β-葡萄糖苷酶活力单 位 U。 β-葡萄糖苷酶的水解时间优选为 2〜24h。
其中， 上述制备罗汉果苷 IV的方法， 其采用 β-葡萄糖苷酶水解罗汉果苷 V或含有罗汉果 苷 V的罗汉果提取物或罗汉果原料本身的具体步 如下：
a、 溶解： 罗汉果苷 、 罗汉果或含有罗汉果苷 V的罗汉果提取物加溶剂溶解， 使溶液中 的罗汉果苷 V的浓度为 0.025〜0.300g/mL;
b、 水解： a步骤所得溶液中加入 β-葡萄糖苷酶水解， 并调节溶液的 ρΗ值和温度使其与 β-葡萄糖苷酶的酶解 ρΗ值和温度相适应；
c、 分离、 纯化， 得到罗汉果苷 IV。
其中， 所述 a步骤中的溶剂可以为常规溶剂， 溶剂优选为水或与 β-葡萄糖苷酶的酶解 pH 值相适应的缓冲液。
其中， 上述 a步骤酶解时， 若罗汉果苷 V浓度过高， 会在溶液中形成分子间氢键， 降低 酶水解效率； 若罗汉果苷 V浓度过低， 则罗汉果苷 IV的产率较低， 还会增加浓缩成本， 溶液 中的罗汉果苷 V的浓度为 0.025〜0.300g/mL较为合适。
进一步的， 由于 β-葡萄糖苷酶的溶解度有限， 加入过多， 则会造成浪费； β-葡萄糖苷酶 的浓度过低， 则水解效率较低， 上述 b步骤水解时溶液中的 β-葡萄糖苷酶的浓度优选为 1.5 万〜 5.0万 U/mL。
其中， 更优选的水解条件为： 水解时溶液中的罗汉果苷 V浓度 0. lg/mL (指水解时罗汉 果苷 V的初始浓度）， β-葡萄糖苷酶浓度为 2. 0万 U/mL (指水解时酶的初始浓度）， 水解时间 为 16h。
其中， 由于 β-葡萄糖苷酶的种类较多， 不同的 β-葡萄糖苷酶的最佳酶活的 pH值和温度 可能不同， 因此， 为了提高水解效率， 可以调节水解溶液的 pH值和温度使其与 β-葡萄糖苷 酶的酶解 pH值和温度相适应， 即调节至 β-葡萄糖苷酶的最佳酶活的 ρΗ值和温度。
其中， 上述 c步骤中可以采用常规的分离、 纯化方法， 如： 凝胶柱层析方法、 HPLC纯化 法等， 分离、 纯化得到高纯度的得到罗汉果苷 IV产品。
其中， 上述的 β-葡萄糖苷酶可以为常规的 β-葡萄糖苷酶， 可以采用市售的 β-葡萄糖苷酶 或自行制备的 β-葡萄糖苷酶（β-葡萄糖苷酶可按常规方法制 备）， 考虑到成本的因素， 上述的 β-葡萄糖苷酶优选为纤维素酶、 1，4- β _ϋ-葡聚糖葡糖苷水解酶、 半纤维素酶中至少一种。
下面结合实施例和试验例对本发明的具体实施 方式做进一步的描述， 并不因此将本发明 限制在所述的实施例范围之中。
试验例 1 β-葡萄糖苷酶用量的筛选试验
原料为罗汉果苷 V含量约 40. 00 % (本发明中的罗汉果苷 V或罗汉果苷 IV的含量均指质 量含量）， 罗汉果苷 IV含量 < 1. 00 %。 采用购至和氏璧生物技术有限公司 β—葡聚糖酶水解， 水解时的酶浓度 （指初始浓度） 分别为 0.5万 U/mL， 2.5万 U/mL， 5.0万 U/mL， 水解 12h， 测定罗汉果苷 IV的得率。 结果如表 1所示。 从表 1可以看出， 酶浓度为 2.5万〜 5.0万 U/mL 时， 罗汉果苷 IV得率较高。
表 1
试验例 2 水解时间的筛选试验
原料为罗汉果苷 V含量约 40.00%， 罗汉果苷 IV含量 < 1.00 %。 采用购至和氏璧生物技术 有限公司的 β—葡聚糖酶水解， 水解时的酶浓度 （指初始浓度） 为 2.5万 U/mL， 罗汉果苷 V 浓度为 0.05 g/mL， 分别水解 2、 8、 16、 24、 48、 72h， 测定罗汉果苷 IV的得率。 结果见表 2。 从表 2可以看出， 水解时间为 8〜24h时， 罗汉果苷 IV的得率较高。
表 2
水解时罗汉果苷 V浓度的筛选试验 原料为罗汉果苷 V含量约 40.00%罗汉果提取物， 其中罗汉果苷 IV含量 < 1.00%。 采用购 至和氏璧生物技术有限公司的 β—葡聚糖酶水解， 水解时的酶浓度 （指初始浓度） 为 2.5万 U/mL, 罗汉果苷 V浓度分别为 0.05g/mL、 0.25g/mL、 0.50g/mL， 水解 16h， 测定罗汉果苷 IV 的得率。 结果见表 3。 从表 3可以看出， 水解时罗汉果苷 V浓度为 0.05〜0.50 g/mL时， 罗汉 果苷 IV的得率均较高， 其中， 罗汉果苷 V浓度为 0.25g/mL时， 罗汉果苷 IV的得率最高。
表 3
试验例 4 正交试验
原料为罗汉果苷 V含量约 40%罗汉果提取物， 其中罗汉果苷 IV含量 < 1.00%。 根据试验 例 1〜3的结果决定试验因素与水平， 并设计正交表， 测定水解的最佳条件。 结果见表 4〜6。
表 4 试验因素与水平
表 5 正交表及试验结果
罗汉果苷 罗汉果苷
因 素 酶浓度 水解时间
V浓度 IV得率（％)
实验 1 1 1 1 10.80 实验 2 1 2 2 12.50 实验 3 1 3 3 12.58 实验 4 2 1 2 19.50 实验 5 2 2 3 18.10 实验 6 2 3 1 18.35 实验 7 3 1 3 17.43 实验 8 3 2 1 15.35 实验 9 3 3 2 16.95 均值 1 11.960 15.910 14.833
均值 2 18.650 15.317 16.317
均值 3 16.577 15.960 16.037
极 差 6.690 0.643 1.484 表 6 试验结果分析
从表 4 5可以看出， 通过分析， 理论得到的最佳组合为： 罗汉果苷 V浓度 0. 10g/mL 酶浓度 3. 5万 U/mL， 水解时间 16h
从表 4 6可以看出， 水解时， 罗汉果苷 V浓度表现为极显著性差异， 因浓度过高在罗汉 果苷溶液中分子之间形成氢键， 阻碍的酶的水解， 所以表现出并非浓度越高越好， 而是在一 定的范围内有最佳取值。 水解时间的影响在罗汉果苷 V浓度之后， 在酶浓度之前。 时间也并 非越长越好， 因为苷 IV也可以被继续被水解转换。 其中酶浓度影响不显著的原因推测为酶浓 度在溶液中的溶解度决定了其已经达到饱和状 态。 又由于酶的影响相对不显著， 综合考虑成 本原因， 酶浓度选择 1. 5至 2. 5万 U/mL较佳。
综上所述， 最佳水解条件优选为罗汉果苷 V浓度 0. lOg/mL, 酶浓度 2. 0万 U/mL， 水解时 间 16h。 重现试验结果为罗汉果苷 IV含量为 21. 78%
实施例 1 采用本发明方法制备罗汉果苷 IV
将鲜罗汉果 1000kg破碎后投入提取罐中， 用 4000kg纯化水于微沸状态下提取 3次， 提 取时间为 1.5h lh lh， 每次过滤后的滤渣进入下一次提取， 合并滤液浓缩至 4000L。 测得 罗汉果苷 V含量为罗汉果鲜重的 0.27%， 罗汉果苷 IV含量小于 0. 01 %。 温度降至 50°C加入 10g P—葡聚糖酶 （和氏璧生物技术有限公司生产， 下同）， 调 pH至 5， 水解时间 20h。 测得 罗汉果苷 V含量为 0.10 %，罗汉果苷 IV含量 0.12%。抽滤，滤液浓缩至一定体积，加入 10 % Ca (OH) 2 沉淀杂质， 静制， 过滤， 上清液用乙醚萃取酯溶性杂质， 弃去乙醚部分， 水相继续 采用 D280吸附树脂（青岛海洋化工厂）和 100-200目硅胶（青岛海洋化工厂）精制除去糖 ， 蛋白质类和色素分子， 收集罗汉果苷部分， 用 lmol/L盐酸调 pH至 5。 采用 201型强碱性离 子交换树脂脱色。 浓缩至合适体积， 经制备型 HPLC反复纯化， 浓缩， 干燥得到样品。 HPLC 检测得到罗汉果苷 IVO. 97kg， 其含量为 98 %以上。 经纯化后的罗汉果苷 IV的 HPLC图及罗汉 果苷 IV标准样品的 HPLC图如图 2所示。 纯化后的罗汉果苷 IV的核磁图谱如图 3所示， 纯化 后的罗汉果苷 IV的质谱图如图 4所示。
实施例 2 采用本发明方法制备罗汉果苷 IV
将罗汉果干粉 10kg投入提取罐中， 用 50L 50%乙醇回流提取 3次， 每次提取时间为 2h 每次过滤后的滤渣进入下一次提取， 浓缩干燥浸膏 lkg HPLC 检测测得罗汉果苷 V含量为 8.4 % ,罗汉果苷 IV含量小于 0. 1 %。浸膏复溶于 5L水，滤去不溶物，温度升至 50°C加入 10gl， 4- β -D-葡聚糖葡糖苷水解酶， 调 ρΗ至 4.8， 水解时间 20h， 测得罗汉果苷 V含量为 3.4 %， 罗 汉果苷 IV含量为 4.2 %。 采用实施例 1方案纯化， 得到罗汉果苷 IVO. 17kg, 其含量为 98 %以 上。
实施例 3 采用本发明方法制备罗汉果苷 IV
将 40%罗汉果苷 V原料 1kg投入提取罐中， 用 5L水溶解， 温度升至 50°C加入 10g β—葡 聚糖酶， 调 ρΗ至 5， 水解时间 16h， 测得罗汉果苷 V含量 15.5 %， 罗汉果苷 IV含量 17. 3 %。 浓缩， 经制备型 HPLC反复纯化， 浓缩， 干燥得到罗汉果苷 IVO. 157kg， 其含量为 98 %以上。 水解前后罗汉果提取物中罗汉果苷 IV含量的 HPLC图如图 1所示， 从图 1可以看出， 水解后 的罗汉果苷 IV含量明显更高。
实施例 4 采用本发明方法制备罗汉果苷 IV
同实施例 1， 只将其中 β—葡聚糖酶（和氏璧生物技术有限公司）改 纤维素酶（和氏璧 生物技术有限公司）， 最后得到罗汉果苷 IV l. 02kg， 其含量为 98 %以上。
实施例 5 采用本发明方法制备罗汉果苷 IV
同实施例 2， 只将其中 β—葡萄糖苷酶（和氏璧生物技术有限公司 β —葡萄糖苷酶）改 为半纤维素酶， 最后得到罗汉果苷 IV0.16kg， 其含量为 98 %以上。