PROCEDE DE PREPARATION DE NUCLEOTIDES ET ANALOGUES A

FAçON PAR SYNTHESE SUR SUPPORT SOLUBLE ET OUTILS

BIOLOGIQUES PREPARES

La présente invention concerne un procédé de préparation de monomères nucléotidiques ou de monomères d'analogues nucléotidiques sur support soluble, plus précisément une méthode de préparation de nucléotides, c'est-à-dire des nucléosides mono-, di- et triphosphatés. La synthèse chimique de nucléotides et oligonucléotides a fait l'objet de recherches intenses depuis le début des années quatre-vingt. Ainsi, en 1983, un procédé de synthèse d'oligonucléotides sur support solide a été mis au point par McBride et Caruthers. Cette méthode, dite « aux phosphoramidites », utilise un support solide auquel est attaché un nucléoside. Les supports solides utilisés dans cette méthode sont des billes de verre de porosité contrôlée. Le premier nucléoside est attaché au support solide via l'hydroxyle en position 3' et la synthèse progresse de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' de la chaîne d'acide nucléique. Plus précisément, en enlevant un groupe protecteur acide labile en position 5', on libère une fonction hydroxyle. Le groupe nucléophile terminal est alors couplé à un monomère 3'-O-phosphoramidite protégé en position 5' et éventuellement sur l'hétérocycle, en présence d'un activateur. La liaison 3', 5' phosphite triester est alors oxydée pour donner un lien phosphotriester. Dans cette méthode de synthèse, on réalise successivement les étapes de déprotection, couplage, « capping » et oxydation, et elles sont répétées jusqu'à ce qu'un oligomère de la longueur désirée soit obtenu.

Depuis lors, d'autres méthodes synthétiques ont utilisé des supports solides. Ainsi, ces méthodes sont décrites par Gallop et al J.Med. Chem. 37, 1233 (1994), GoId et al, Annu Rev. Biochem. 64,763 (1995) et Thompson et al Chem Rev, 96 555 (1996). Bien que l'on obtienne des résultats satisfaisants, les méthodes sur support solide présentent certains désavantages, par exemple un comportement non linéaire en termes de cinétique, une distribution irrégulière sur le support ou du fait du support, des problèmes de solvatation, un taux de couplage insuffisant ou des problèmes de synthèse dus à la nature hétérogène des conditions réactionnelles, et plus précisément du milieu réactionnel. De plus, les supports solides sont très coûteux, ce qui rend la synthèse à grande échelle très onéreuse. En outre, le rendement de synthèse en phase solide conventionnelle n'est pas toujours satisfaisant, compte tenu notamment de difficultés de purification du produit et de séparation du produit d'avec les séquences tronquées. Enfin, avec les méthodes sur support solide, le suivi réactionnel peut être difficile. D'autres méthodes alternatives ont donc été recherchées, qui mettraient en œuvre des conditions réactionnelles plus homogènes et l'utilisation de supports polymères solubles a été proposée. Cette méthodologie est appelée « synthèse en phase liquide » (« liquid phase synthesis ») et résout certains problèmes rencontrés avec les supports solides. Ces méthodes utilisent du polyéthylène glycol (PEG) comme support soluble, comme cela apparaît dans Mutter et al Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10, 811 (1971) et Bayer et al Nature (London) 237, 512 (1972). A part le PEG, d'autres supports sont connus dans la technique, notamment les PEG greffés sur polystyrène réticulé (Bayer, E. Angew. Chem. Int. Ed. Eng/30,113 (1991). On connaît aussi la synthèse de peptide sur polyéthylèneimine, le support ayant un poids moléculaire compris entre 30.000 et 40.000 (Pfaender et al In Peptides; Proc. Eight Eur. Pep. Symp; Ann Arbor Science; North Holland p. 137 (1967) et Blecher et al Liebigs. A" ^{n r} hem, 1263 (1973)). Des copolymères polyvinyl-alcool (Bayer et al

Liebigs An. Chem., 1671 (1974)) et des copolymères polyvinyl alcool- poly(1-vinyl-2-pyrrolidone) (Geckeler et al Makromol. Chem, 175, 1995 (1974)) ont également été utilisés comme support soluble pour la synthèse de peptides. Un des désavantages majeurs de ces premières synthèses peptidiques sur support soluble réside dans les rendements d'obtention du peptide attendu, qui sont bas, du fait d'un clivage incomplet et/ou de réactions annexes prédominantes. On a alors utilisé d'autres méthodes de clivage, tels que celles qui sont induites par des liaisons acide ou base labiles, des liaisons thiol labiles et le relargage photolitique des peptides après la synthèse. Une méthode récente pour synthétiser des oligopeptides, des oligosaccharides et des oligonucléotides utilisant la synthèse en phase liquide, est décrite dans WO2006096963. Le liquide ionique utilisé comme support liquide est un sel organique de type onium, par exemple un cation ammonium quaternaire hétérocyclique et un anion, par exemple CI ^" , Br ^" , BF ₄ ^" , PF ₆ ^" , SbF ₆ ^" , CuCI ₂ ^" et AICI ₄ ^" . Des exemples de cations comprennent également des pyridines substituées et des imidazoles 1 ,3-disubstitués. Donga et al, J. Org. Chem. 71 , 7907-7910 (2006) décrit la synthèse d'oligonucléotides sur support soluble du type liquide ionique (ILSS) avec de hauts rendements et avec une telle pureté qu'aucune étape de chromatographie n'est nécessaire pour la purification des intermédiaires avant le clivage du support. Dans cette méthode, le support ionique soluble est synthétisé à partir de N-méthylimidazole et 2-bromoéthanol puis isolé par chromatographie échangeuse d'anions. Le dérivé 3'-succinylé 5'-DMT- thymidine a été couplé au liquide ionique en utilisant de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et une quantité catalytique de 4- (diméthylamino)pyridine (DMAP) dans l'acétonitrile, pour donner le nucléoside greffé au liquide ionique. Ce dernier est isolé et purifié par précipitation d'une solution éthyléther/acétate d'éthyle, traité dans le

chloroforme et lavé à l'eau. Divers oligonucléotides ont été obtenus à partir du nucléoside greffé correspondant selon cette méthode. Le brevet américain US 6,001 ,966 décrit pour sa part une méthode de synthèse séquentielle en solution d'oligonucléotides, par réaction d'unités monomères.

En ce qui concerne l'obtention de monomères phosphatés, Parang et al in Organic Letters Vol. 3, No. 2 (2001 ) décrit un réactif supporté pour produire des monophosphates de carbohydrates et d'un nucléoside en utilisant un copolymère réticulé polystyrène-divinylbenzène fonctionnalisé par le cyanoéthyl-N,N-diisopropyl phosphoramidite comme agent de phosphitylation. Cet agent immobilisé est couplé avec des alcools en présence de 1 H-tétrazole pour produire des phosphite-triesters liés au polymère qui sont ensuite oxydés en phosphotriesters correspondants. Le dérivé phosphaté immobilisé est alors déprotégé et clivé du support solide. Ainsi, bien que différentes méthodes soient connues pour synthétiser des nucléotides, il reste encore des problèmes tant avec les synthèses en phase solide qu'avec les synthèses en solution, notamment des problèmes de rendements faibles et des procédures de purification longues. Pour la synthèse des nucléosides triphosphates, il y a un réel besoin pour une méthode générale qui produise des nucléosides triphosphates avec de hauts rendements et qui puisse être appliquée à de nombreux substrats (Burgess and Cook, Synthesis of Nucléoside Triphosphates, Chem Rev. 100(6) 2047-2060 (2000). On a donc besoin d'une méthode de production de monomères nucléotides ou d'analogues de nucléotide en grande quantité, à des prix de revient bas et sans étapes de purification laborieuses.

Un objet de la présente demande est de résoudre ces problèmes de l'art antérieur concernant la synthèse de monomères nucléotidiques. L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de nucléotides ou analogues de nucléosides phosphorylés (schéma ci-dessous), ces dérivés pr ^λ " ^β "tant un intérêt en tant qu'agents thérapeutiques potentiels, outils

biologiques... Au cours de ce procédé, un nucléoside ou un analogue de nucléoside (ci-dessous pyrimidine présentant une fonction aminé exocyclique) est couplé via l'intermédiaire d'un bras (linker) à un support polyéthylèneglycol soluble. Une fois l'(es) étape(s) de phosphorylation réalisée(s), le bras est clivé, et les dérivés mono-, di-, ou triphosphorylés peuvent être purifiés et isolés.

où R ₂ à R ₅ ont les significations données plus loin.

Cette approche permet de bénéficier à la fois des avantages de la synthèse sur support (élimination des excès de réactifs, purification facilitée) et de ceux de la synthèse en solution (suivi réactionnel et caractérisation). En conséquence, les rendements de synthèse sont améliorés et l'isolation des composés en est très largement facilitée en comparaison de la méthodologie classique (synthèse en solution), ce qui engendre une diminution importante des coûts de production.

La présente invention concerne une méthode utilisant un support soluble pour produire des nucléotides ou analogues de nucléotides. L'invention procure un procédé de préparation de monomères nucléotides ou d'analogues de nucléotides avec de hauts rendements.

Selon l'invention, les monomères obtenus sont des nucléosides ou analogues de nucléosides mono-, di- et triphosphatés.

Dans le procédé de préparation de monomères nucléotidiques de l'invention les étapes de purification sont très simplifiées, ce qui influe favorablement sur les rendements.

La présente invention concerne également des monomères nucléotidiques et des monomères d'analogues nucléotidiques obtenus par le procédé, comme outils biologiques.

Ces outils biologiques peuvent être utilisés en enzymologie, en pharmacologie ainsi que comme produit de départ pour la synthèse de molécules d'intérêt, notamment des antiviraux et/ou des anticancéreux. La présente invention concerne un procédé de préparation de nucléotides ou analogue de nucléotides monomères comportant les étapes suivantes : (1) couplage d'un support polyéthylèneglycol soluble pourvu d'au moins un bras de liaison diacide ou éther-acide et d'un nucléoside ou analogue de nucléoside monomère, via un groupe aminé exocyclique ou hydroxyle du nucléoside, à l'aide d'un agent de couplage; (2) au moins une phosphorylation dudit nucléoside ou analogue de nucléoside couplé au support avec un agent de phosphorylation. Le clivage du bras entre le support et le monomère peut alors avoir lieu, et permet alors la récupération du nucléotide ou analogue de nucléotide monomère. Ainsi, de façon générale, selon l'invention, on procède à l'accrochage du bras de liaison sur le support soluble de type PEG, puis on couple ce support à un nucléoside ou analogue par l'intermédiaire du bras de liaison, on phosphoryle alors le nucléoside couplé, en une ou plusieurs étapes de phosphorylation. On peut ensuite cliver le nucléotide afin de le récupérer. Ce procédé permet d'obtenir à façon des outils biologiques ou effecteurs phosphorylés (nucléosides mono-, di- et triphosphatés), nucléotides ou analogues, naturels ou non, en évitant les étapes usuelles longues, fastidieuses et onéreuses de purification. La synthèse a lieu en solution, ce qui permet un suivi réactionnel et la caractérisation des intermédiaires par des techniques usuelles. Cette technique sur support présente les avantages de purification facilitée des produits intermédiaires et finaux, le

plus souvent ioniques, et permet l'élimination des réactifs utilisés en excès. A titre d'exemple, l'AraCTP commercial a un coût plus de 13 fois supérieur au prix de revient (réactif et matériel) par le procédé proposé selon l'invention. Du point de vue des rendements, le procédé de l'invention s'avère également supérieur aux procédés usuels.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description et des modes préférés de réalisation ainsi que des exemples qui suivent, et sur les figures annexées. La figure 1 est un schéma illustrant d'une part l'arrimage (a) de bras de liaison divers sur des supports solubles, ainsi que les supports une fois ces bras attachés, puis la fonctionnalisation d'un support soluble par couplage (b) avec un nucléoside, via la fonction aminé exocyclique d'un hétérocycle R ¹ NH ₂ . Sur cette figure, sont également représentés (c) divers hétérocycles aminés susceptibles d'être couplés au support, dans le procédé de l'invention : un nucléoside à base purique (c-1), un nucléoside à base pyrimidique (c-2), un analogue structural à base pyrimidique modifié sur le sucre et la base (c-3), illustrant les analogues de nucléosides par modification du sucre, ainsi qu'un analogue de nucléoside à base purique (c-4) illustrant les analogues de nucléosides par modification sur la base. La figure 2 est un schéma où apparaissent, illustrées pour le cas (a-2), des étapes de phosphorylation que l'on peut mener notamment à partir des nucléosides greffés de la figure 1. Sont illustrées une diphosphorylation (d) directe et une monophosphorylation (e) pouvant être suivie, à la suite d'une étape d'activation, par une seconde monophosphorylation (g) menant à des nucléosides diphosphatés, ou encore deux monophosphorylations successives (g) ou une diphosphorylation (f), menant à des nucléosides triphosphatés.

Par « monomère », il est ici considéré que le nucléoside ou le nucléotide comporte une base, un sucre et dans le cas des nucléotides, un ou plusieurs groupe(s) phosphate(s). Sont ainsi donc exclus les oligomères.

La première étape selon l'invention consiste à coupler un monomère nucléosidique sur un support soluble possédant un bras de liaison. A titre de support soluble, selon l'invention, on peut utiliser un support polyéthylèneglycol (PEG) ayant au moins un bras acide, diacide ou éther- acide de jonction. Par au moins un bras, on entend un ou deux. Plus précisément, le PEG pourvu d'au moins un bras de liaison peut avoir pour formule

(I) RO-C ₂ H ₄ -O-PEG-O-C ₂ H ₄ -O-C(O)-(CH ₂ )P-COOH dans laquelle R est un groupe alkyle ou benzyle ou aryle ou -C(O)-(CH ₂ ) _n - COOH et p et n', indépendamment l'un de l'autre, représentent O ou un entier de 1 à 10, ou

(II) RO-C ₂ H ₄ -O-PEG-O-C ₂ H ₄ -O-(CH ₂ ) _m -COOH dans laquelle R est un groupe alkyle ou benzyle ou aryle ou -(CH ₂ ) _m -COOH et m et m', indépendamment l'un de l'autre, représentent O ou un entier de 1 à 3.

De préférence selon l'invention, p ou n' dans la formule (I) est inférieur à 6 et de préférence, p ou n' dans la formule (I) est un entier allant de O à 4 et dans la formule (II), m et m' sont de préférence 1 ou 2. Comme cela apparaîtra dans la description détaillée, un bras de liaison préféré est de type succinate.

Dans les formules ci-dessus, le radical alkyle est de préférence linéaire ou ramifié, en Ci à Ci ₂ , et le radical aryle est de préférence choisi parmi phényle, tolyle et o-tolyle. De préférence, R signifie méthyle ou benzyle. Le terme « polyéthylèneglycol » (PEG) n'est pas limité au seul polyéthylèneglycol proprement dit mais inclut tout polyéthylèneglycol dérivé, ayant par exemple des groupes hydroxyles à ses deux extrémités ou un groupe hydroxyle à l'une de ses extrémités et un groupe méthoxy à l'autre, le polyéthylèneglycol monométhyléther et le poly(oxyéthylène) glycol ou analogues. Plus généralement, tel qu'utilisé ici, « support soluble » signifie un support Hu tvpe polyéthylèneglycol ayant un bras diacide ou un bras éther-acide de

jonction ou deux tels bras. De préférence, le support soluble de la présente invention est un polyéthylèneglycol (PEG), polyéthyleneglycol monométhyléther ou un poly(oxyéthylene)glycol comportant au moins un bras diacide ou éther-acide. Le poids moléculaire dudit PEG selon l'invention est de préférence dans la fourchette allant d'environ 3.000 à environ 6.000. De préférence, le PEG a un poids moléculaire d'environ 4.000.

Le bras diacide ou éther-acide est attaché au PEG par diverses méthodes dépendant du type de bras de liaison à fixer, la méthode générale étant illustrée dans les exemples.

Par exemple, si le bras, du type succinate, doit être associé au PEG, la procédure comprend la dissolution du PEG dans un solvant, l'addition de l'anhydride d'acide correspondant, l'agitation à température ambiante, puis la concentration du mélange réactionnel sous pression réduite, et la précipitation du PEG comportant le bras diacide. Dans le cas précis du bras succinate, le promoteur du bras est l'anhydride succinique. Dans le cas d'un bras oxalate, c'est le chlorure d'oxalyle qui est utilisé. De façon plus générale, un dérivé d'acide carboxylique, anhydride ou chlorure d'acide, par exemple, peut être utilisé pour fonctionnaliser le PEG. Le bras éther- acide peut par exemple être obtenu par deux voies de synthèse impliquant l'oxydation de l'alcool terminal du support, tel qu'illustré dans les exemples ou encore par réaction du PEG avec un acrylate d'alkyle. Si le bras est l'acide éthanoïque, le procédé pour former le bras comporte par exemple l'oxydation du PEG par des sels de chrome, l'agitation du mélange à température ambiante et la précipitation du PEG modifié. On peut utiliser par exemple

un support fonctionnalisé avec un bras succinyle, ou un support fonctionnalisé de type PEG-acide

n dépendant dans les deux formules ci-dessus et le schéma ci-dessous du poids moléculaire du PEG.

La réaction de phosphorylation s'effectue de la même façon quelle que soit la nature du bras. Selon cette variante le bras de liaison peut rester solidaire du support PEG lors de l'étape de clivage. Parmi les supports

PEG-acide, de préférence, on utilise ceux pour lesquels m"=1.

Le bras de liaison est ci-dessus qualifié bras « acide » pour m"=0.

L'homme du métier saura adapter la méthode d'accrochage du bras au support soluble choisi et au bras requis. Comme cela apparaît à la figure 1 , le PEG peut être bifonctionnel (HO-PEG-OH), R représentant H et porter deux bras de liaison (a-2 ; a-4) ou monofonctionnel (RO-PEG-OH) et porter alors un bras de liaison (a-1 ; a-3), R représentant alkyle, benzyle ou aryle.

Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le PEG-OH est fonctionnalisé avec l'acrylate de t-butyle, et après une étape de déprotection, on obtient le PEG fonctionnalisé PEG-acide PEG-O(CH ₂ ^-

COOH selon le schéma suivant : Ainsi, selon l'invention, selon un mode de réalisation particulier, on utilise le

PEG-O-bis(succinyl-nucléoside).

Dans un autre mode de réalisation particulier, on utilise le PEG- bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-nucléoside).

Un avantage particulier des PEG fonctionnalisé par un bras de l'acide 3- hydroxypropanoïque réside dans la simplification de la procédure ultérieure.

Une fois réalisé l'accrochage du bras de liaison sur le support soluble, le support est mis en présence du nucléoside ou de l'analogue de nucléoside. Le couplage avec le support soluble peut avoir lieu par l'intermédiaire d'un groupe aminé exocyclique, à l'aide d'un agent de couplage et conduisant à la formation d'une liaison amide, cette variante étant illustrée à la figure 1 (b) ou via un groupe hydroxyle de l'analogue nucléosidique ou du nucléoside et conduisant à la formation d'une liaison ester. De préférence, selon l'invention, le couplage est réalisé sur la fonction aminé exocyclique. Ainsi, de préférence, le couplage est réalisé sur l'azote exocyclique de la base du nucléoside. Il s'agit par exemple de la fonction aminé exocyclique de la cytosine, parmi les bases pyrimidiques, et de l'adénine ou la guanine, parmi les bases puriques, illustrées à la figure 1 (b et c). Le procédé de couplage peut varier selon le nucléoside à coupler et le support choisi. Généralement, le PEG à bras de liaison est mélangé avec le nucléoside ou nucléoside analogue que l'on cherche à phosphoryler, et l'agent de couplage est ajouté au mélange. Le mélange réactionnel est agité pendant une durée suffisante pour obtenir le couplage, les solvents sont évaporés et le produit final précipité, éventuellement recristallisé. Par « nucléoside », on entend ici divers composés comportant d'une part un sucre et d'autre part un hétérocycle. Les nucléosides naturels sont des substances dont l'hydrolyse donne une molécule de ribose ou de déoxyribose et un hétérocycle purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (cytosine, uracile, thymine). Les monomères nucléosidiques, nucléosides et analogues de nucléosides de l'invention peuvent être naturels ou synthétiques.

Par « analogue de nucléoside » ou « nucléoside analogue », on entend, selon l'invention, tout nucléoside modifié, c'est-à-dire un composé possédant une analogie structurale avec un nucléoside.

De même, par « nucléotide analogue » ou « analogue de nucléotide », on entend, selon l'invention, tout nucléotide modifié, c'est-à-dire possédant une analogie structurale avec un nucléotide.

Les analogues peuvent ainsi comporter une ou plusieurs modifications sur le cycle osidique et/ou sur l'aglycone, les bases pyrimidique ou purique par exemple pouvant porter des modifications de leur hétérocycle. La figure 1 illustre certains de ces composés, et Ri à R ₆ sur le cycle osidique représentant les substituants usuels des résidus osidiques naturels ou non. Ainsi, Ri à R ₆ , indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, OH, halo, un groupement alkyle, O-alkyle, alcènyle, alcynyle en C ₁ à C ₄ , alkylamino, aminé, hydroxylamino, azido, nitro, cyano, ou tout autre substituant susceptible de former un nucléoside modifié. A la figure 1 , le nucléoside à coupler est noté R ¹ NH ₂ . C'est un ensemble sucre-base à aminé exocyclique (NH ₂ ), et R' représente l'ensemble sucre- base, sans cette aminé exocyclique NH ₂ de la base qui va se coupler avec le bras du support soluble (b).

Dans le composé analogue modifié sur le sucre de la figure 1 (c-3), la base est pyrimidique et, dans le cycle osidique, W peut représenter CH ₂ , CHX ou CX ₂ (X représentant ici halo) pour former un carbocycle, quand Y et Z sont aussi des atomes de carbone, mais W peut aussi représenter O ou S, Y et Z représentant des atomes de carbone, ou encore W et Z peuvent représenter O ou S, Y représentant CH ₂ , ou encore Y et W peuvent représenter O ou S, Z représentant CH ₂ . La base peut porter un halogène, X' représentant de préférence H ou F. Dans le composé analogue modifié de la figure 1 (c-4), la base est purique modifiée, W pouvant représenter CH ou CF, et X' représentant alors H, ou représenter N, et X' peut alors représenter F par exemple. Le sucre peut-être un ribose ou un déoxyribose ou encore tout autre analogue du type arabinofuranose, par exemple. La figure 1 suite illustre plus particulièrement le cas éther-acide (m"=1 ) c' ^ωO+ - ^à -dire un cas particulier de la figure 1 (a-3), (a-4) et (b).

La définition des nucléosides analogues de l'invention n'est donc pas limitée aux seuls composés illustrés à la figure 1 ou par les définitions de X, X', W, W, Y, Z et R ₁ à R ₆ données ci-dessus à titre illustratif non limitatif. Les nucléosides ou analogues de nucléosides utilisés comme produit de départ dans le procédé de l'invention comportent un groupe exocyclique amino ou un groupe hydroxyle qui permet leur couplage au bras de liaison du support soluble.

Des exemples de nucléosides comportant des bases sont par exemple l'adénosine, la guanosine, la cytidine. Ils peuvent être également les déoxynucléosides correspondants, de la déoxyadénosine, déoxyguanosine, ou déoxycytidine.

Les analogues de nucléosides peuvent être modifiés sur la base, purine ou pyrimidine, et/ou sur le groupe carbohydrate (sucre). Des exemples de nucléosides et d'analogues de nucléosides plus précisément employés comme produits de départ sont donnés ci-après : 3'- O-acétyl-2'-désoxycytidine, allopurinol riboside, 2-amino-6-chloropurine riboside, 2'-désoxyuridine, cytidine, 2'-désoxycytidine, 5-aza-2'- désoxycytidine, 8-azaguanine, 8-bromoguanosine, 8-bromoguanosine, 2- chloroadénosine, 2-chloro-N ⁶ -cyclopentyladénosine, 5-chlorocytosine arabinoside, 2-chloro-2'-désoxyadénosine, 5-chloro-2'-désoxyuridine, 6- chloropurine riboside, 2'-désoxyadénosine monohydrate, 2'-désoxycytidine, 2'-désoxyguanosine monohydrate, 3'-désoxyguanosine, 2'-désoxyuridine, 2,6-diaminopurine 2'-désoxyriboside, 2',3'-didésoxyadénosine, 2',3'- didésoxycytidine, 5,6-dihydrodésoxyuridine, 6-(γ,γ- diméthylallylamino)purine riboside, 1 ,N ⁶ -éthèno-2'-désoxyadénosine, 5- hydroxyméthyl-2'-désoxyuridine, 5-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-6- thioguanosine, S-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-6-thioinosine, 5-iodo-2'- désoxycytidine, N ⁴ -isobutyryl-2'-désoxycytidine, isocytosine, 2',3'-O- isopropylidèneguanosine, 8-mercaptoguanosine, 5-méthoxyuridine, 2'-O- méthyladénosine, 5-méthylcytidine, 2'-O-méthylcytidine, 3-méthylcytidine rrr^^ulfate, N ⁶ -méthyl-2'-désoxyadénosine, 7-méthylguanosine, N ² -

méthylguanosine, 6-méthylmercaptopurine riboside, 3'-O-méthyluridine, acide orotique, 2-thio-6-azauridine, 4-thiouridine, thymine 1 -/8-D- arabinofuranoside, uracil 1-β-D-arabinofuranoside, zeatine-riboside, 2', 3'- didésoxy-3'-thia-/M_-cytidine, 2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-5-fluorocytidine, 9[2- (phosphonylméthoxy) propyl] adénine, 9[2-(phosphonylméthoxy) éthyl] adénine, 1-(/3-D-ribofuranosyl)-1 H-1 ,2,4-triazole-3-carboxamide, /3-D-2'-C- méthyl cytidine, β-D-2'-C-méthyl 5-fluorocytidine, /3-D-2'-désoxy-2'-fluoro-2'- C-méthyl cytidine, β-D-2'-désoxy-2',2'-difluoro cytidine, 7-déaza-jβ-D-2'-C- méthyl adénosine, 7-déaza-7-fluoro-β-D-2'-C-méthyl adénosine, 2'-désoxy- jβ-L-thymidine, 2'-désoxy-β-L-cytidine, 1-(2'-fluoro-/3-L-ribofuranosyl)- uracile, 9-(β-D-arabinofuranosyl)-2-fluoro- adénine, 9-(β-D- arabinofuranosyl)-adénine, 1-(j8-D-arabinofuranosyl)-cytosine et analogues. Le couplage est réalisé à l'aide d'au moins un agent de couplage qui peut être choisi parmi un carbodiimide, une oxime aromatique ou les agents de couplage du type onium, c'est-à-dire par exemple ammonium, phosphonium ou uronium d'un anion nucléophile, ou leurs analogues. A titre d'exemple de carbodiimide, on peut citer le dicyclohéxylcarbodiimide (DCC) ou le diisopropylcarbodiimide (DIC). Comme oxime aromatique, on peut citer le 1- hydroxybenzotriazole (HOBt) ou le 1- hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt) et analogues.

Comme onium, en particulier phosphonium, on peut citer l'hexafluorophosphate de (2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1 , 1 ,3,3- tétraméthyluronium (HBTU), l'hexafluorophosphate de (2-(7-aza-1 H- benzotriazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium (HATU) ou l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris- pyrrolidinophosphonium (PyBOP), et analogues. Un autre agent de couplage est la diméthylaminopyridine (DMAP).

Les quantités utilisées dans la réaction de couplage dépendent des quantités de nucléosides ou analogues mises en jeu. Généralement, pour 1 à 5 éq de nucléoside, on utilise 1 à 10 éq d'agent de couplage. On peut aussi utiliser 1 à 2 éq de nucléoside, et 1 à 4 éq d'agent de couplage

Généralement, un équivalent du support soluble comportant un ou deux bras de liaison est couplé à un ou deux équivalents du nucléoside ou analogue.

Par « nucléotide », on entend ici des monomères constitués d'un hétérocycle et d'un sucre et d'au moins un groupe phosphorylé. Les nucléotides produits selon le procédé de la présente demande incluent des nucléosides mono-, di- ou triphosphates. Les nucléotides peuvent ainsi être naturels ou bien synthétiques. A l'issue de l'étape ou des étapes de phosphorylation décrites plus bas, et après le clivage, on obtient selon l'invention des nucléotides et analogues de nucléotides modifiés sur le sucre ou la base, comme l'étaient les nucléosides ou analogues de nucléoside de départ, et aussi des nucléotides pouvant être modifiés sur le ou les phosphates. Par exemple, les analogues de nucléotides modifiés sur la base peuvent être les suivants : 2'-désoxyinosine 5'-triphosphate, 2-amino-2- désoxyadénosine 5'-triphosphate, 5-aminoallyl-2'-désoxycytidine 5'- triphosphate, 5-fluorocytidine 5'-monophosphate, 2-fluoroadénosine 5'- monopohosphate, 5-iododésoxyuridine 5'-triphosphate, 5- trifluorométhylthymidine 5'-triphosphate, 5-(2-chloroéthyl) désoxyuridine 5'- triphosphate, 5-éthyldésoxyuridine 5'-triphosphate, (E)-5-(2-bromovinyl) désoxyuridine 5'-triphosphate, 5-fluorodésoxyuridine 5'-triphosphate, 6- thlopurine riboside 5'-triphosphate, 2-chlorodésoxyadénosine 5'- triphosphate, 5-azacytidine 5'-triphosphate, 3-déazauridine 5'-triphosphate, thiazofurine 5'-triphosphate, ribavirine 5'-triphosphate, allopurinol riboside 5'-triphosphate, Formycine B 5'-triphosphate, 8-bromoguanosine 5'- triphosphate, 8-mercaptoguanosine 5'-triphosphate, 7-méthyl-8- oxoguanosine 5'-triphosphate, 7-thia-8-oxoguanosine 5'-triphosphate, et analogues. Des exemples de nucléosides triphosphates modifiés sur la partie sucre sont les suivants : 2',3'-didésoxyadénosine 5'-triphosphate, 2',3'-

désoxycytidine 5'-triphosphate, 2'amino-2'-désoxyadénosine 5'- triphosphate et analogues.

Par exemple, des analogues de nucléotides modifiés à la fois sur la base et le résidu osidique peuvent être les suivants : arabinosyl-5-azacytosine 5'- triphosphate, 2-fluoroarabinofuranosyladénosine 5'-triphosphate, 1-(beta-L- ribofuranosyl)-2-isopropylamino-5,6-dichlorobenzimidazole 5'-triphosphate, 7-déaza-2'-C-méthyladénosine 5'-triphosphate, 2-amino-9-beta-D- arabinofuranosyl-6-méthoxy-9H-purine 5'-triphosphate, 1 -(beta-L-2-fluoro- 2-desoxyarabinofuranosyl)-5-méthyluracile 5'-triphosphate. Des exemples de nucléosides modifiés sur le phosphate sont les suivants : 2',3'-didésoxyadénosine 5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2',3'-didésoxycytidine-5'- O-(1 -thiotriphosphate), 2',3'-didésoxyguanosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'-désoxyadénosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'-désoxycytidine-5'-O-(1- thiotriphosphate), 2'-désoxyguanosine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), 2'- désoxythymidine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), adénosine-5'-O-(1- thiotriphosphate), cytidine-5'-O-(1 -thiotriphosphate), guanosine-5'-O-(1 - thiotriphosphate), adénosine 3', 5' cyclique monophosphate et analogues. La synthèse des monophosphates et diphosphates correspondants est aussi possible selon l'invention, comme cela apparaîtra par la suite, et dans les exemples.

Partant d'un nucléoside ou analogue fixé au support soluble, le nucléoside est mono-, di- ou triphosphorylé en une ou deux ou trois étapes de phosphorylation.

Comme cela apparaît à la figure 2, pour parvenir à un monophosphate, on procède à une monophosphorylation (e).

Pour parvenir à un monomère diphosphaté, on procède à une diphosphorylation. Celle-ci peut être menée directement en une étape avec un agent diphosphorylant (d), ou en deux étapes de monophosphorylation successives (e) puis (g), la seconde monophosphorylation (g) pouvant être activée.

Pour parvenir à un monomère triphosphaté, on procède à une triphosphorylation. Celle-ci peut être menée par diphosphorylation (d) avec un agent diphosphorylant, puis monophosphorylation ou encore par monophosphorylation (e), suivie par une diphosphorylation (f) ou suivie par deux monophophorylations successives (g).

De préférence les secondes phosphorylations sont activées. Pour réaliser la phosphorylation, on utilise un agent de phosphorylation. Selon la nature et la réactivité de cet agent, une activation préalable peut être nécessaire. Pour la monophosphorylation du nucléoside sur support polymère, à une solution du nucléoside sur support polymère dans un solvant approprié, on ajoute un agent de phosphorylation du type oxychlorure de phosphore et on extrait et/ou on isole par précipitation le nucléoside monophosphate supporté. Pour la phosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère, du nucléoside monophosphate supporté est dissous dans un solvant approprié, activé puis mis en présence d'agent phosphorylant du type phosphate de tributylammonium et le composé attendu est précipité. Pour la diphosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère, le nucléoside monophosphate sur support polymère dans un solvant approprié est activé, puis mis en présence d'agent phosphorylant du type pyrophosphate de tributylammonium et le produit attendu précipité. Les agents de phosphorylation peuvent être choisis parmi les composés de type Z'=PX ¹ ₃ , où Z' est O, S ou Se, pour une monophosphorylation, ou pour une diphosphorylation, W ¹ [(P=Z')X ¹ ] ₂ où W ¹ est O, NH, CH ₂ , CHOH, CHNH ₂ , CHCH ₃ , CHX ² ou CX ² ₂ et Z' est O, S ou Se, et X ¹ et X ² représentant halo, ou analogues appropriés.

D'autres agents de phosphorylation Z=P(O ) ₃ et W ¹ [(P=O)(O ^" ) ₂ ] ₂ où W ¹ et Z' ont la signification ci-dessus capables de mono- et diphosphoryler sont moins efficaces et peuvent nécessiter une activation du nucléoside ou de l'r""' ^λ ^ue de nucléoside.

Comme exemple d'agent de phosphorylation, on peut citer particulièrement les dérivés du phosphore (III) ou les dérivés du phosphore (V). Sont appropriés les agents de phosphorylation du type de l'oxychlorure de phosphore, pour une monophosphorylation, par exemple choisi parmi l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le O-(2-chlorophényl) dichlorothiophosphate, l'aminométhyl phosphonique acide, l'aminométhyl (méthyl) phosphonique acide, la 2-chloro-1 ,3,2-dioxaphospholane, la 2-chloro-2-oxo-1 ,3,2- dioxaphospholane, la 2-chloro-4H-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, le baryum 2-cyoanoéthylphosphate, le diéthylchlorothiophosphate, le diméthylchlorothiophosphate, le méthyl-phosphorodichloridate, le phényl- dichlorophosphate, le méthyldichlorophosphite et le diphénylphosphite et analogues et aussi le 2-chlorophénylphosphorodichloridate, le 4- chlorophényl-phosphorodichloridate, le diphényl-chlorophosphate et le dibenzyl-N,N-diisopropylphosphoramidite. Sont préférés selon l'invention, l'oxychlorure de phosphore, le trichlorure de thiophosphate, le 4-nitrophényl dichlorophosphate, le phosphate de tributylammonium et le diphénylphosphite. Parmi les agents de diphosphorylation du type pyrophosphate de tributylammonium, on peut citer l'acide étidronique, les sels de l'imidodiphosphate, l'imino di(méthyl phosphonique acide), le tétrachlorure de pyrophosphoryle, le méthyl bis(dichlorophosphonate), l'acide méthylène bisphosphonique. Sont préférés selon l'invention, le pyrophosphate de tributylammonium et l'acide méthylène bisphosphonique. Les quantités d'agents de phosphorylation utilisées dépendent de leur réactivité. De façon générale, 10 à 30 équivalents d'agents phosphorylants sont utilisés pour 1 à 2 équivalents du nucléoside couplé au support, de préférence, 15 à 30 équivalents d'agents phosphorylants. Comme agents d'activation, on peut citer par exemple le mésitylsulfonylnitrotriazole (MSNT), le mésitylsulfonyltriazole (MST), le ch ¹ "- ¹¹ "? de mésitylsulfonyle (MSCI), le chlorure de tri-isopropylsulfonyle

(TPSCI), le système Tf ₂ O/diméthylaminopyridine (DMAP), le 1 ,1- carbonyldiimidazole (CDI) et similaires. Les agents d'activation sont utilisés dans des quantités de l'ordre de 1 à 10 équivalents, de préférence 3 à 6 équivalents. Dans une étape ultérieure à la phosphorylation, le support soluble peut être dissocié du nucléotide ou de l'analogue du nucléotide obtenu, ceci étant réalisé en utilisant un agent de clivage.

Toute base ou tout nucléophile peut-être utilisé comme agent de clivage. Par exemple, on peut utiliser de l'ammoniaque, de l'hydroxyde de sodium, du méthylate de sodium, du méthanol ammoniacal ou du cyanure de potassium et analogues.

Selon l'invention, de façon générale, on utilise un excès de base. Les nucléotides clivés de leur support tels que produits par le procédé de la présente demande peuvent ensuite être isolés selon toute méthode de l'art. On peut utiliser la chromatographie liquide (LC) ou HPLC, par exemple sur colonne en phase inverse.

Ils peuvent être également purifiés par dialyse, notamment lorsque le résidu issu du clivage n'a pas été éliminé précédemment. La dialyse peut être réalisée par toute méthode convenable, par exemple sur membrane d'ester de cellulose.

De façon générale, pour les bras bifonctionnels, de type succinate, le bras clivé se sépare d'avec le substrat et du support. Ceci peut rendre une dialyse avantageuse pour purifier. Ainsi, le composé issu de l'hydrolyse du bras peut contaminer le substrat et une dialyse peut alors être envisagée comme étape de purification. En revanche, pour les bras du type ether- acide, le bras restant sur le support PEG, la dialyse peut ne pas être nécessaire.

Après l'étape (ou les étapes) de mono(di ou tri)phosphorylation(s), notamment dans le cas du PEG-O(CH ₂ ) ₂ -COOH, le clivage du bras permet d'obtenir directement le nucléotide attendu après élimination du support polvmérique, et ceci sans avoir à réaliser de dialyse.

Ainsi, comme cela apparaîtra dans les exemples, l'utilisation du PEG fonctionnalisé par un bras correspondant à l'acide-3-hydroxypropanoïque (PEG-O(CH ₂ ) ₂ -COOH permet de simplifier la procédure, l'étape de dialyse pouvant être supprimée. Comme indiqué ci-dessus, les nucléotides et analogues obtenus peuvent être utiles à titre d'effecteurs, d'outils biologiques pour la recherche, le diagnostic ou encore toute application thérapeutique ou pré-clinique. Bien que l'invention soit ici décrite dans ses modalités préférées, le spécialiste appréciera les équivalents, modifications, substitutions, omissions ou variantes possibles sans sortir pour autant du champ de l'invention. Exemple 1 : Polyéthylèneglycol-bis-succinate, PEG ₄ ooo-bis-succinate

20g (4,76 mmol) de PEG _40O o ont été co-évaporés avec de la pyridine anhydre et dissous dans 160 ml de pyridine. 5 g (49,90 mmol) d'anhydride succinique et 0,30 g (2,49 mmol) de diméthylaminopyridine ont été ajoutés et le mélange agité pendant deux jours à température ambiante. La solution a été concentrée sous pression réduite, co-évaporée avec du toluène et dissous dans un minimum de dichlorométhane. Le précipité brun formé a été éliminé par filtration. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et dissous dans un mélange dichlorométhane / N,N-diméthylformamide (3/7, v/v). Le PEG bis-succinate a été précipité par addition d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur pastilles de KOH pour donner du PEG bis-succinate sous forme d'un solide blanc (18,14 g, 86 %).

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 400 MHz) δ 4.18 (m, 2H, (OCH ₂ α)p£ _G ),

3.40-3.75 (m, (OCH ₂ )PR ₃ ), 2.57 (s, 4H, CH _2succ ).

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 100 MHz) δ 173.9, 172.2 (s, C=O _SU cc), 70.5

(s, (OCH ₂ )p _EG ), 68.9 (s, (OCH ₂ β)p _EG ), 64.2 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 29.3, 28.9 (s, CH _2sU cc).

Exemple 2 : Poly(oxyéthylène) ₄₀ oo bis (2-hydroxyacétique acide)

1 g de PEG ₄₀ OO (0,25 mmol) est dissous dans 10 ml d'acétone et 0,85 ml de réactif de Jones ( ^" I mmol de CrO ₃ ) est ajouté. A la fin de l'addition, les sels de chrome bleu-vert précipitent dans le milieu réactionnel. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 16h. La réaction a été stoppée par ajout de 0,15 ml d'isopropanol et 0,10 g de charbon actif, et l'agitation a été poursuivie pendant 3h. Le charbon actif a alors été éliminé par filtration sur un entonnoir de Buckner et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans un minimum de dichlorométhane et précipité par ajout d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther, puis séché sous vide sur pastilles de KOH pour donner le produit attendu sous forme d'un solide blanc (3,26 g, 81 %).

IR 1643 cm ^"1 (çOOH), 3418 cm ^"1 (OH).

RN ¹³ C (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 171.6 (s, C=O), 70.8 (s, (OCH ₂ a)pEβ), 70.4 (s, (OCH ₂ )PEG), 68.5 (s, (OçH ₂ COOH) _P EG).

Exemple 2 bis: Poly(oxyéthylène) ₄₀ oo bis (2-hydroxypropanoïque acide)

Une solution de 1 g de PEG ₄₀₀₀ (2,5 mmol, 1 eq.) et de tert-butoxide de potassium (0,25 mmol, 0,1 eq.) dans le toluène (25 mL) a été agitée à 40°C pendant 20 minutes, et du tert-butylacrylate (15 mmol, 6 eq.) a été ajouté Le mélange a été agité à 40 ⁰ C pendant 6h. Le solvant a été éliminé par

??

évaporation sous pression réduite. Le résidu obtenu a été dissous dans du dichlorométhane (100ml) et cette solution a été lentement ajoutée à un excès de diéthyléther froid (1 L). Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther plusieurs fois, puis séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit.

Le PEG-bis (O-(CH ₂ ) ₂ -COOfl3u) a été dissous dans du dichlorométhane (20ml) et un volume égal de TFA (acide trifluoroacétique) a été ajouté et le mélange a été agité à température ambiante toute la nuit.

Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et l'huile résultante dissoute dans le dichlorométhane (100ml), et cette solution a été lentement ajoutée à un excès de diéthyléther froid (1 L). Le précipité a été filtré, lavé au diéthyléther plusieurs fois, puis séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit. Le produit final PEG-bis (OCH ₂ CH ₂ -COOH) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (8.63g, 83%).

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 3.87-3.42 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 2.60 (t, 2H, CH ₂ a).

RMN ¹³ C (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 173.0 (s, C=O), 70.5 (s, (OCH ₂ ) _PEG ), 66.9 (s,CH ₂ b), 34.7 (s, CH ₂ a).

Exemple 3 : Méthode A: Couplage du PEG bifonctionnalisé et du nucléoside

Une solution du nucléoside ou de l'analogue de nucléoside (2eq.) dans du

N,N-diméthylformamide (30 ml) est ajoutée à une solution de PEG comportant deux bras de liaison (0,95 mmol, 1 eq), par exemple le PEG bis-succcinate, dans du dichlorométhane (70 ml). On ajoute du N, N- dicyclohexylcarbodiimide (3,79 mmol, 4 eq) et du N-hydroxylbenzotriazole (1 ,89 mmol, 2 eq) et le mélange résultant est agité à 60°C pendant 7h. Les solvants sont évaporés sous pression réduite et le résidu obtenu dissous dans un minimum de dichlorométhane et laissé à reposer à 4°C toute une nuit. La dicyclohexylurée précipitée est séparée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite et dissous dans du N ₁ N-

diméthylformamide (40 ml). La solution résultante est éliminée lentement à du diéthyléther froid en excès en volume. Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Le produit final est recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (40 ml) et séché sous vide sur pastilles de KOH .

Exemple 4 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl) succinate]

Le couplage entre du PEG-bis-succinate (4 g, 0,95 mmol) et le nucléoside araC (0,46 g, 1 ,89 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (3,65 g, 83 %).

(CH ₂ CI ₂ / MeOH, 7/3, v/v) : 0.7.

RMN ¹ H (D ₂ O, 200 MHz) δ 8.16 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.26 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.10 (d, J _{1 -2} - = 4.6 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.34 (t, J _{2 -1} . = J _{2 -3} - = 4.6 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.16 (m, 2H, (OCH ₂ α)p _£G ), 4.02-3.92 (m, 2H, H ₃ . H ₄ ), 3.73 (m, 2H, 2H ₅ ), 3.70-3.33 (m, (OCH ₂ ) _PeG ), 2.76-2.62 (m, 4H, CH _2s ucc).

RMN ¹ 1 ^J 3C, (D ₂ O, 75 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SUC c), 162.5 (s, C ₄ ), 156.7 (s, C ₂ ), 146.7 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 87.1 (s, C ₁ ), 84.0 (s, C ₄ ), 75.4 (s, C ₂ ), 75.2 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )p _EG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 60.7 (s, C ₅ -), 31.5, 28.5 (2s, CH _2succ ).

Exemple 5 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]

Le couplage entre du PEG-bis-succinate (4,84 g, 1 ,15 mmol) et la 2'- désoxycytidine (0,52 g, 2,30 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (4,60 g, 87 %).

(CH ₂ CI ₂ / MeOH, 6/4, v/v) : 0.9.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.25 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.27 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.13 (t, J _r .? _a = J _{v-2 b} = 6.2 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.30 (m, 1 H, H ₃ ), 4.19 (m, 2H, (OCH ₂ α)p _EG ), 4.04 (m, 1 H, H ₄ ), 3.85-3.50 (m, 2H ₅ - (OCH ₂ )PR ₃ ), 2.80-2.65 (m, 4H, CH _2succ ), 2.43 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.23 (m, 1 H, H _{2 b} ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=O _SU cc), 162.4 (s, C ₄ ), 156.7 (s, C ₂ ), 145.5 (s, C ₆ ), 97.7 (s, C ₅ ), 87.4 (s, Cr), 87.3 (s, C ₄ ), 70.2 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _PEG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α)p _£G ), 61.0 (s, C ₅ ), 40.1 (s, C ₂ ), 31.5, 28.4 (2s, CH _2succ ).

Exemple 6 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]

Le couplage entre le PEG-bis-succinate (5 g, 1 ,20 mmol) et la cytidine (0,58 g, 2,4 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3 et le composé obtenu sous forme d'un solide blanc (4.80 g, 87 %).

(CH ₂ CI ₂ / MeOH, 6/4, v/v) : 0.9.

RMN ¹ H (D ₂ O, 200 MHz) δ 8.26 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.26 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 5.79 (d, Jv _-2 ' = 2.7 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.19-4.14 (m, 2H, (OCH ₂ α) _PE G), 4.06 (d, J _{2 -1} - = 2.7 Hz, 1 H, H ₂ ), 3.98-3.25 (m, H ₃ - H ₄ ' 2H ₅ . (OCH ₂ ) _P EG), 2.64-2.76 (m, 4H, CH _2succ ).

RMN (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SU cc), 1 ³ C 162.6 (s, C ₄ ), 156.9 (s, C ₂ ), 145.6 (s, C ₆ ), 97.8 (s, C ₅ ), 91.3 (s, Cr), 83.8 (s, C ₄ ), 74.5 (s, C ₃ ), 69.5 (s, (OCH ₂ ) _PE G), 68.6 (s, C ₂ ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P EG), 64.1 (s, (OCH ₂ Q)PE _G ), 60.1 (s, C ₅ ), 31.5, 28.4 (2s,

Exemple 7 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)cytosyl) succinate]

Le couplage entre 0,25 g de PEG-bis-succinate (0,06 mmol) et 0,025 g de 2',3'-didésoxycytidine (0,12 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,23 g, 87 %).

R, (CH ₂ CI ₂ / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.33 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.26 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.97 (dd, J _{1 -23} = 6.6 Hz, Jr _{-2 b} = 2.0 Hz, 1 H, Hr), 4.20 (m, 3H, (OCH ₂ CI)PEG H ₄ ), 3.86-3.81 (m, 2H, 2H ₅ ), 3.73-3.62 (m, OCH ₂ )PEG), 2.79-2.65 (m, 4H, CH _2SUCc ), 2.45 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.05 (m, 1 H, H _{2 b} ), 1.97 (m, 1 H ₁ H ₃₃ ), 1 -65 (m, 1 H, H _3b ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SU cc), 162.4 (s, C ₄ ), 156.9 (s, C ₂ ), 145.7 (s, C ₆ ), 97.4 (s, C ₅ ), 88.3 (s, C ₁ ), 83.3 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _P£G ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 62.3 (s, C ₅ ), 32.5 (s, C ₂ ), 31.5, 28.5 (2s, CH ₂ SUCc), 24.1 (s, C ₃ ).

Exemple 8 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl) succinate]

Le couplage entre 1 g de PEG-bis-succinate (0,23 mmol) et 0,10 g de 3TC (0,47 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.88 g, 80 %).

(CH ₂ CI ₂ / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.42 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.25 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.24 (dd, J _r-2 . _a = 2.7 Hz, J _{1 -2} . _b = 5.4 Hz, 1 H, H ₁ ), 5.31 (t, J _{4 -5} ' = 3.6 Hz, 1 H, H ₄ ), 4.20-4.17 (m, (OCH ₂ α) _P£G ), 3.99 (dd, J ₅ > _a - ₄ - = 3 Hz, J _{53 -5 b} = 12.9 Hz, 1 H, H ₅₃ ), 3.90-3.34 (m, OCH ₂ ) _P£G H ₅ . _b H ₂₃ ), 3.22 (dd, J _{2 b-r} = 2.4 Hz, J _zb - _{2 a} = 12.6 Hz, 1 H, H _{2 b} ), 2.79-2.65 (m, 4H, CH _2succ ).

RMN ^lύ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SU cc), 162.6 (s, C ₄ ), 156.6 (s, C ₂ ), 146.1 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 88.0 (s, C ₁ ), 87.9 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _PR3 ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 61.5 (s, C ₅ ), 38.0 (s, C ₂ ), 31.5, 28.5 (2s, CH _2succ ).

Exemple 8 bis: PoIy (oxyéthylène) ₄ ooo bis[6-N-(1-(2'-désoxy-3',5'-O- ((tétraisopropyl)disiloxane-1 ,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)-adenosyl) succinate

Le couplage entre du PEG bis-succinate (1 g, 0.24 mmol) et de la 2'- désoxyadenosine (0.24 g, 0.48 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et on a obtenu le PEG-O-bis(succinyl-3',5'-TIPS,2'dA) sous forme d'un solide blanc (0.95 g, 78 %).

Rf (dichlorométhane/méthanol 98/2) : 0.57

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 8.74 (s, 1 H ₁ NH), 8.58 (s, 1 H, H ₈ ), 8.13 (s, 1 H, H ₂ ), 6.25 (m, 1 H, H ₁ ), 4.90 (m, 1 H, H ₃ ), 4.20 (m, 2H, (OCH ₂ CX)PEG), 4.12 (m, 3H, H ₄ - 2H ₅ ), 3.85-3.32 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 3.19 (m, 2H, CH _2su ∞ ), 2.72 (m, 2H, CH _2succ ), 2.61 (m, 2H, H ₂ ), 0.962 (m, 28H, ((CH ₃ J ₂ CH) ₄ ).

Exemple 8 ter: PoIy (oxyéthylène) ₄₀ oo bis[6-N-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-adénosyl) succinate

Le Peg-O-bis(succinyl-3',5'-TIPS,2 ¹ dA) (0,21 mmol, 1 eq.) a été dissous dans du tétrahydrofurane (10 ml), et on a ajouté à cette solution 1 ,06 ml de de TBAF fluorure tétrabutylammonium (solution 1 M TBAF dans le tétrahydrofurane 5 éq.) Le mélange résultant a été agité pendant 1h, à température ambiante. Le mélange réactionnel a été dilué dans du dichlorométhane (3 ml) et la phase organique a été lavée à l'eau et à la saumure. Après évaporation sous pression réduite, le résidu a été dissous

dans du déchlorométhane (2ml) pour être lentement ajouté à un excès en volume de diéthyl éther froid (20 ml). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyl éther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (2 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH. Le produit Peg-O- bis(succinyl-2'dA) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.82g, 90 %).

Rf (dichloromethane/methanol 98/2) : 0.43

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 9.15 (s, 1 H, HH), 8.63 (s, 1 H, H ₈ ), 8.19 (s, 1 H, H ₂ ), 6.41 (m, 1 H, H ₁ ), 4.73 (m, 1 H, H ₃ ), 4.22 (m, 4H, 2H ₅ - (OCH ₂ Q)PE _G ), 3.98 (m, 1 H ₁ H ₄ ), 3.86-3.39 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 3.22 (m, 2H, CH _25UCc ), 2.96 (m, 1 H, 1 H ₂ ), 2.80 (m, 2H, CH ₂ ^ ), 2.61 (m, 2H, CH _23UCc ), 2.37 (m, 1 H, 1 H ₂ ),

Exemple 9 : Poly(oxyéthylène)4000 Bis[4-N-(1-β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl) 2-hydroxyacétamide]

Le couplage entre 0,5 g de PEG-bis(OCH ₂ -COOH) (0,12mmol) et 0,06 g d'araC (0,24 mmol) a été réalisé par la méthode A de l'exemple 3. Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,46 g, 82 %).

Rf (CH ₂ CI ₂ / MeOH, 6.5/3.5, v/v) : 0.9 RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.22 (d, J _6-5 = 7.0 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.32 (d,

J _5-6 = 7.0 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.14 (s, 1 H, H ₁ ), 4.38 (m, 1 H, H ₂ ),

4.22 (m, 2H, (OCH ₂ COOH)P _£G ), 4.05 (m, 3H, H ₃ '

(OCH ₂ Q)PE _G ), 4.05-3.20 (m, H ₄ 2H ₅ (OCH ₂ )p _EG ).

(D ₂ O, 100 MHz) δ 172.3 (s, C=O), 162.1 (s, C ₄ ), 156.5 (s,

C ₂ ), 147.0 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 87.2 (s, Cr), 84.3 (s, C ₄ ),

75.5 (s, C ₂ ), 75.2 (s, C ₃ ), 70.6 (s, (OCH ₂ a) _PEG ), 70.0 (s,

(OCH ₂ )PEG), 60.5 (s, Oç_H ₂ COOH)PEG), 60.4 (s, C ₅ ).

Exemple 9 bis: PoIy (oxyéthylène) ₄₀ oo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl)-3-hydroxy propanamide]

Le couplage entre le PEG-bis (OCH ₂ CH ₂ -COOH) (3 g, 0.72 mmol) et araC (0.35 g, 1.44 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (2.40 g, 72 %).

R^ (CH ₂ CI ₂ / MeOH, 85/15, v/v) : 0.7

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 8.30 (d, J _{6 5} = 7.2 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.16 (d, J _5-6 = 7.2 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.09 (t, J _v . _ZBi = Jv- _Zb = 5.4 Hz, 1 H ₁ H ₁ ), 4.46 (m, 1 H, H ₂ ), 4.32 (m, 1 H, H ₃ ), 4.14 (m, 1 H, H ₄ ), 3.97-3.40 (m, 2H ₅ (OCH ₂ )PEG), 2.69 (m, 2H, CHJD).

Exemple 9 ter: PoIy (oxyéthylène) ₄₀ oo bis[4-N-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl)-3-hydroxy propanamide]

Le couplage entre PEG-bis (OCH ₂ CH ₂ -COOH) (3 g, 0.72 mmol) et la 2'- désoxycytidine (0.33 g, 1.44 mmol) a été réalisé en utilisant la méthode A, et il a été obtenu le composé sous forme d'un solide blanc (2.75 g, 83 %).

R _f (CH ₂ CI ₂ / MeOH, 85/15, v/v) : 0.8

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 8.42 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.38 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.16 (t, J _{r-2 a} = J _{r-2 b} = 6.2 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.50 (m, 1 H, H ₃ ), 4.11 (m, 1 H, H ₄ ), 3.85-3.50 (m, 2H ₅ - (OCH ₂ )PEG), 3.39 (t, JCH _23- CH ₂₅ = 4.5 Hz, 2H, CH^), 2.54 (m, 1 H, H _2a ), 2.32 (m, 1 H ₁ H ₂₆ ).

Exemple 10 : Méthode B : Monophosphorylation du nucléoside sur support polvmère

A une solution du PEG-O-bis(succinyl-nucléoside) ou PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ - CO-nucléoside), en fait le nucléoside sur support polymère (1 eq), dans du triéthylphosphate (6 ml) chauffé à 40°C ou dans de l'acétonitrile à 5°C, de l'oxychlorure de phosphore en excès est ajouté et le mélange est agité pendant 1 h. L'excès d'oxychlorure de phosphore est hydrolyse par addition d'une solution tampon de bicarbonate de triéthylammonium aqueux (1 M, pH= 7) (25 ml) et le mélange est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissous dans le dichlorométhane (180 ml) et la phase organique lavée à l'eau. La phase aqueuse subit plusieurs extractions au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées et évaporées sous pression réduite. Le monophosphate supporté est précipité à partir d'une solution de dichlorométhane, par addition d'un excès de diéthyléther froid. Le précipité est filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur KOH.

Exemple 11 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri-éthylammonium

La monophosphorylation de 3 g (0,64 mnol) de PEG-O-bis(succinyl-araC) de l'exemple 4 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10 et a donné le composé sous forme d'un solide blanc (2,99 g, 92 %).

HPLC tr _a raCMP ^' • 18-9 min tX monophosphorylation : 97 %. RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.34 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H ₁ H ₆ ), 7.10 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.18 (d, J _{1 -2} . = 5.0 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.42 (m, 1 H, H ₂ ), 4.19 (m, 2H, (OCH ₂ α)p _EG ), 4.10-4.15 (m, 4H, H ₃ . H ₄ - 2H ₅ ), 3.30-3.90 (m, (OCH ₂ )PR ₃ ), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH ₃ CJHg) ₃ NH), 2.62-2.85 (m, 4H, CH _2succ ), 1.18 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (çJH ₃ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.7, 174.4 (s, C=O _S u _cc ), 159.0 (s, C ₄ ),

148.1 (s, C ₂ ), 145.2 (s, C ₆ ), 96.9 (s, C ₅ ), 87.0 (s, Cr), 82.3 (d, Jc _4-P = 8.0 Hz, C ₄ ), 75.8 (s, C ₂ ), 74.1 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )PE _G ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P E _G ), 64.1 (s, OCH ₂ α)p _£G ), 63.6 (s, C ₅ -), 46.6 (s, (CH ₃ QHa) ₃ NH), 31.6, 28.3 (s, CH ₂ SUCc), 8.2 (s, (CHaCHz) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0,26 (s).

Exemple 11 bis: PoIy (oxyéthyïène) ₄₀ oo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate)-3-hydroxy propanamide] sels de triéthylammonium

La monophosphorylation du PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-AraC) (1.1 g, 0.24 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode B et le PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ - CO-AraCMP) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.95 g, 84 %).

RMN ¹ H (D ₂ O ₁ 200 MHz) δ 8.29 (d, J _6-5 = 7.2 Hz, 1 H ₁ H ₆ ), 7.27 (d, J _5-6 = 7.2 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.17 (m, 1 H, H ₁ ), 4.42 (m, 1 H, H ₂ ), 4.09 (m, 4H, H ₃ H ₄ ZH ₅ ), 3.96-3.25 (m, (OCH ₂ ) _PE G), 3.10 (q, J = 7 Hz, 6H, (CH ₃ CH ₂ ) ₃ NH), 2.62 (t, JCH _2a -CH _2b = 6 Hz, 2H, CH^a), 1.18 (t, J = 7 Hz, 9H, (CH ₃ CH ₂ J ₃ NH).

RMN 3 ^d 1 ^l P (D ₂ O, 81 MHz) δ 0.22 (s).

Exemple 12 : Poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de triéthylammonium

La monophosphorylation de 1 g (0,21 mmol) de PEG-O-bis(succinyl-dC) de l'exemple 5 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10 avec 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,59 ml, 6,49 mmol). Le composé a été obtenu sous forme de solide blanc (0,93 g, 86 %).

HPLC tracMP : 13.07 min tx _mθ nophosphoryiation : 80 %. RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.38 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.16 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.17 (t, J _{r-2 a} = Jr-?b = 6.1 Hz, 1 H, Hr), 4.45 (m, 1 H, H ₃ ), 4.19 (m, 2H, (OCH ₂ α) _P£G ), 4.11- 3.95 (m, 3H, H ₄ .2H ₅ ), 3.95-3.35 (m, (OCH ₂ ) PEG), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ CH ₂ J ₃ NH), 2.82-2.62 (m, 4H, CH _2succ ), 2.48 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.25 (m, 1 H ₁ H _{2 b} ), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (ç±bCH ₂ ) ₃ NH).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.7, 174.5 (2s, C=O _SU cc), 161.5 (s, C ₄ ), 155.2 (s, C ₂ ), 146.5 (s, C ₆ ), 97.5 (s, C ₅ ), 87.5 (s, Cr), 86.3 (d, J _C4 .p = 8.0 Hz, C ₄ ), 70.4 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )PEG), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 64.2 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 64.1 (d, J _{05 -P} = 8.0 Hz, C ₅ ), 46.6 (s, (CH ₃ CHg) ₃ NH), 40.1 (s, C ₂ ), 31.6, 28.4 (2s, CH _2succ ), 8.2 (s, (CH ₃ CHz) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.19 (s).

Exemple 13 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri-éthylammonium

La monophosphorylation de 0,50 g de PEG-O-bis(succ-C) (0,11 mmol) de l'exemple 6 a été réalisée en utilisant la méthode B de l'exemple 10, avec 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,29 g, 3,30 ml). Le composé a été obtenu sous forme d'un solide blanc (4,80 g, 89 %).

HPLC trcMP : 14.17 min tx monophosphorylation : 96 %.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.59 (d, J _6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.10 (d,

J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H ₁ H ₅ ),

5.97 (s, 1 H, H ₁ ), 4.91-4.12 (m, 7H, H ₂ . H ₃ - H ₄ - 2H ₅ .

(OCH ₂ α)pEG), 3.94-3.47 (m, (OCH ₂ )p _EG ), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ QHg) ₃ NH) ₁ 2.95-2.75 (m, 4H, CH _2succ ), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (CHgCH ₂ ) _S NH).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.7, 174.4 (2s, C=O _SU cc), 161.1 (s, C ₄ ), 154.0 (s, C ₂ ), 147.3 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 91.1 (s, C ₁ ), 86.4 (d, Jc4'-p = 8.0 Hz, C ₄ ), 74.3 (s, C ₂ ), 69.6 (s, C ₃ ' (OCH ₂ ) _PEG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PR3 ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 64.0 (s, C ₅ ), 46.6 (s, (CH ₃ CH ₂ J ₃ NH), 31.6, 28.2 (2s, CH _2SUCC ), 8.2 (s, (çJH ₃ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.12 (s).

Exemple 14 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-monophosphate) succinate] sels de tri- éthylammonium

La monophosphorylation de 0,04 g de PEG-O-bis(succinyl-ddC) (0,09 mmol) de l'exemple 7 a été réalisée par la méthode B de l'exemple 10, en utilisant 30 eq d'oxychlorure de phosphore (0,24 ml, 2,70 mmol), en présence de tamis moléculaire activé (3â). Le composé attendu a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,41 g, 96 %).

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.49 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.13 (d, J _5-6 = 7.3 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 5.98 (d, J _{1 -2} = 5.1 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.35 (m, 1 H, H ₄ '), 4.18-3.92 (m, 4H, (OCH ₂ α) _P£G 2H ₅ ), 3.85- 3.36 (m, OCH ₂ )PEG), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ CiH ₂ J ₃ NH), 2.79-2.68 (m, 4H ₁ CH _2succ ), 2.46 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.08 (m, 1 H, H _{2 b} ), 1.97 (m, 1 H, H ₃₃ ), 1.83 (m, 1 H, H _{3 b} ), 1.18 (t, J= 7.2 Hz, 9H, (QH ₃ CH ₂ ) _S NH).

RMN ^ά 31ψ 1 (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.37 (s).

Exemple 15 : Méthode C: Diphosphorylation : phosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère

Une suspension de PEG-O-bis(succinyl-nucléoside monophosphate) (1 eq) dans de la tributylamine (2,50 ml) est agitée pendant 10 min à température ambiante. On ajoute du diéthyléther froid (50 ml) et le précipité est filtré, lavé au diéthyléther et séché sous vide sur pastilles de KOH toute une nuit. Le nucléoside monophosphate sur support polymère est dissous dans du N.N-diméthylformamide anhydre (3,75 ml) et on ajoute du 1 ,1 '- carbonyldiimidazole (0,59 mmol, 6 eq). Le mélange réactionnel est agité pendant 2h à température ambiante, et traité avec du méthanol anhydre (0,10 ml). Après 15 minutes d'agitation, une solution de phosphate de tributylammonium dans du N,N-diméthylformamide anhydre (1 M, 1 ,49 mmol, 15 eq) est ajoutée et la suspension agitée pendant 24h à température ambiante. Le mélange est traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. Le résidu est précipité au diéthyléther froid (50 ml). Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Une chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 du produit brut est effectuée (gradient acétonitrile : 0 à 70 %, dans l'eau).

Exemple 16 : Poly(éthylèneglycol)4000 Bis[4-λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-diphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

La diphosphorylation de 0,5 g (0,09 mmol) de PEG-O-bis(succ-CMP) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15 et a conduit au composé sous forme d'un solide blanc (0,36 g, 66 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.24 (d, J ₆ - _S = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.27 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.17 (d, Jv-z = 5.1 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.42 (t, Jz-v = Jz-s = 5.1 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.28-4.05 (m, 6H, H ₃ - H ₄ ' 2H ₅ . (OCH ₂ α)p _£G ), 3.89-3.35 (m, (OCH ₂ )PeG) ₁ 2.92 (t, J = 7.7 Hz, 12H, (CHsCHsCHsç±yaNH), 2.80-2.68 (m, 4H, CH _2SUCc ), 1.54 (m, 12H, (CH ₃ CH ₂ CiH ₂ CH ₂ )SNH), 1.29 (m, 12H, (CH ₃ CiH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH), 0.81 (t, J = 7.2 Hz, 18H, (CiH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH).

RMN ¹ 1 ^J 3C, (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, 162.5 (s, C ₄ ), 156.8 (s, C ₂ ), 146.8 (s, C ₆ ), 97.6 (s, C ₅ ), 86.6 (s, Cr), 82.0 (d, Jc _4-P = 9.0 Hz, C ₄ ), 75.1 (s, C ₂ ), 74.3 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )PE _G ), 68.4 (s, (OCH ₂ β)p _£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _PeG ), 64.1 (s, C ₅ ), 52.6 (s, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ )SNH), 31.6, 28.4 (2s, CH _2succ ), 25.2 (s, (CH ₃ CH ₂ QH ₂ CHz) ₃ NH), 19.2 (s, CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ )SNH), 12.8 (s,

(çϋsCH ₂ CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.44 (m, P ₃ ), -11.03 (m, P ₀ ).

Exemple 17 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-diphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

La diphosphorylation de 0,30 g du PEG-O-bis(succ-dCMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15 et a conduit au composé sous forme d'un solide blanc (0,28 g. 81 %) après lyophilisation.

C ₄ ), 70.4 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )P _EG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.9 (d, Jc _{5 -} P = 6.0 Hz, C ₅ ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 52.7 (s, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CHg) ₃ NH), 39.9 (s, C ₂ ), 31.6, 28.5 (2s, CH _2succ ), 25.8 (s, (CHaC^çHgCH^NH), 19.2 (s, (CH ₃ ç_H£CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH), 12.7 (s, (CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH).

RMN ^J 31 ¹ P 1 (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.69 (d, J _β-α = 19.3 Hz, P _β ), -11.26 (d, J _α-β = 17.3 Hz, P _α ).

Exemple 18

La diphosphorylation de 0,55g du PEG-O-succ-CMP (0,11 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15. Un mélange (comprenant le dérivé 2', 3' carbonate correspondant) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,34 g, 60 %) après lyophilisation.

Poly(éthylène glycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- diphosphate) succinate], sels de fri-butylammonium

RMN ¹ H

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.79 (m, P _β ), -11.85 (m, P ₀ ).

Poly(éthylène glycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(2',3'-carbonyl-β-D-ribof uranosyl)- cytosyl-5'-diphosphate) succinate], sels de f/7-butylammonium

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.12 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.24 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.98 (s, 1 H, H ₁ ), 5.53, 5.46

(dd, J ₂ S = Js-2- = 7.5 Hz, J ₂ -V = J ₃ ^> -4' = 1.8 Hz, 2H, H ₂ ' H ₃ .), 4.84 (m, 1 H, H ₄ ) 4.07-4.30 (m, 4H, 2H _{5 a} (OCH ₂ α) _PEG ), 3.88-3.33 (m, (OCH ₂ )PEG), 3.09 (m, 12H, ((CH ₃ CH ₂ CH ₂ CHg) ₃ NH), 2.84-2.62 (m, 4H, CH _2succ ), 1.54 (m, 12H, (CHaC^çJHgCH^NH), 1.30-1.15 (m, 12H, (CH ₃ ç_H£CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH), 0.68-0.92 (m, 18H, (ç_H ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.79 (m, P ₃ ), -11.85 (m, P _α ).

Exemple 19 : Méthode D : Triphosphorylation ; diphosphorylation du nucléoside monophosphate sur support polymère

Une suspension de PEG-O-bis(succinyl-nucléoside monophosphate) ou du PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-nucléoside monophosphate) (1 eq) dans la tributylamine (2,50 ml) est agitée pendant 10 min à température ambiante. On ajoute du diéthyléther froid (50 ml) et le précipité est filtré, lavé et séché sous vide sur des pastilles de KOH toute une nuit. Le nucléoside monophosphate sur support polymère est dissous dans du N,N-diméthylformamide anhydre (3,75 ml) et on ajoute du 1 ,1 - carbonyldiimidazole (0,59 mmol, 6 eq). Le mélange réactionnel est agité durant 2h à température ambiante et traité avec du méthanol anhydre (0,10 ml). Après 15 min, on ajoute une solution de tributylamonium pyrophosphate dans du N,N-diméthylformamide (1 M, 1 ,49 mmol, 15 eq) anhydre. La suspension est agitée pendant 24h à température ambiante. Le mélange a été traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. Le résidu précipite dans du diéthyléther froid (50 ml). Le précipité est filtré et lavé au diéthyléther. Une chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 du produit brut est effectuée avec un gradient acétonitrile : 0 à 70 % dans l'eau.

Exemple 20 : Poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de frv-butylammonium

La triphosphorylation de 0,50 g du PEG-O-bis(succ-araCMP) (0,09 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19 et a fourni le composé sous forme d'un solide blanc (0,43 g, 69 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H

RMN ³¹ P 121 MHz) δ -10.94 (d, J _γ-β = 19.43 Hz, P _γ ), - 11.32 (d, J _Q- β = 19.43 Hz, P _α ), -23.28 (t, J _β-Y = J _β-α = 19.43 Hz, P _β ).

Exemple 20 bis: PoIy (oxyéthylène) ₄ ooo bis[4-N-(1-(β-D-arabinofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate)-3-hydroxy propanamide] sels de tri-butylammonium

La triphosphorylation du PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-AraCMP) (0,70 g, 0,15 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D et le PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO- AraCTP) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,41 g, 55 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.29 (d, J _6-5 = 7.2 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.27 (d, J ₅ - ₆ = 7.2 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.17 (m, 1 H, H ₁ ), 4.42 (m, 1 H, H ₂ ), 4.09 (m, 4H, H ₃ H ₄ '2H ₅ ), 3.94-3.30 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 3.06 (t, J = 7.9 Hz, 18H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH), 2.62 (t, JCH _2a- CH _2b = 6 Hz, 2H, CH ₂ A), 1.51 (m, 18H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH), 1.26 (m, 18H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH), 0.94 (t, 27H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH) .

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.80 (d, J _γ-β = 21.17 Hz, P _γ ), -11.84 (d, J _α - _β = 21.17 Hz, P ₀ ), -23.31 (t, J _β-Y = J _β-α = 21.17 Hz, P _β ).

Exemple 21 : Poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(2'-désoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

La triphosphorylation de 0,30g du PEG-O-bis(succ-dCMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19 et a fourni le composé sous forme d'un solide blanc (0,27 g, 73 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.35 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.17 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.17 (t, J _{1 -23} = Jr- _{2 b} = 6.3 Hz, 1 H, Hr), 4.51 (m, 1 H, H ₃ -), 4.21-4.13 (m, 5H ₁ H ₄ - 2H ₅ ' (OCH ₂ α)p _£G ), 3.89-3.31 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 3.17-2.95 (m, 18H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ QHg) ₃ NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH _2succ ), 2.47 (m, 1 H, H ₂₃ ), 2.26 (m, 1 H, H _{2 b} ), 1.59-1.45 (m, 18H, (CH ₃ CH ₂ CiH ₂ CH ₂ ) _S NH), 1.40-1.25 (m, 18H, (CHaçH^CHsCH^aNH), 0.90-0.75 (m, 27H, (CHgCH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH).

RMN ^1J C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.8, 174.6 (2s, C=O _SUC c), 161.8 (s, C ₄ ), 155.4 (s, C ₂ ), 146.3 (s, C ₆ ), 98.0 (s, C ₅ ), 87.4

(s, Cr), 86.2 (s, C ₄ ), 70.3 (s, C ₃ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )p _EG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 65.2 (s, C ₅ ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 52.6 (s, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ J ₃ NI-I), 40.0 (s, C ₂ ), 31.6, 28.4 (2s, CH _2succ ), 25.2 (s, (CH ₃ CH ₂ QH ₂ CHz) ₃ NH), 19.1 (s, (CHaçJHgCH^H^NH), 12.8 (s, (ç_H ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.73 (d, J _γ-β = 20.6 Hz, P _γ ), -11.34 (d, J _α-β = 19.4 Hz, P ₀ ), -22.81 (m, P _β ).

Exemple 22 : Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

La triphosphorylation de 0,30 g du PEG-O-bis(succ-CMP) (0,11 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19. Un mélange (1/1) du composé attendu et du dérivé 2',3' carbonate correspondant, a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0, 26 g, 70 %) après lyophilisation.

Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(β-D-ribof uranosyl)-cytosyl-5'- triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

RMN ¹ H

RMN ³¹ P (D ₂ O, 81 MHz) δ -10.65 (m, P _γ ), -12.10 (m, P ₀ ), -22.94

(m, P _β ). Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-carbonyl-β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de tri-butylammonium

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.12 (d, J _6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.21

(d, J ₅ - ₆ = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.97 (s, 1 H, H _r ), 5.50 (m, 2H, H ₂ . H ₃ ), 4.86 (m, 1 H, H ₄ -), 4.25-4.14 (m, 4H, 2H ₅ - (OCH ₂ α)p _£G ), 3.97-3.25 (m, (OCH ₂ ) _P£G ), 3.14-2.98 (m, 18H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ çH ₂ ) ₃ NH), 2.74-2.60 (m, 4H, CH _2succ ), 1.63-1.48 (m, 18H, (CHaCHpCH ₂ CHp) ₃ NH), 1.35-1.13 (m, 18H, (CH ₃ QH ₂ CH ₂ CH ₂ )SNH), 0.86-0.78 (m, 27H, (CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) _S NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 81 MHz) δ -10.65 (m, P _γ ), -12.10 (m, P ₀ ), -

22.94 (m, P _β ).

Exemple 23 : Poly(éthyïèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(β-D-ribofuranosyl)- cytosyl-5'-triphosphate) succinate] sels de f/v-éthylammonium et carbonyldiimidazolium

La triphosphorylation de 0,32 g du PEG-O-bis(succ-CMP) (0,06 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode D de l'exemple 19. L'activation a été réalisée avec du carbonyldiimidazole (3 eq) durant 30 min seulement. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,17 g, 42 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.60 (s, 2H, N=CH-N), 8.31 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.38 (s, 4H, N=CH=CH), 7.23 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.89 (d, Jy-? = 2.8 Hz, 1 H, H ₁ -), 4.28- 4.19 (m, 7H, H ₂ - H ₃ . H ₄ ' 2H ₅ . (OCH ₂ α) _P£ G), 3.86-3.34 (m, (OCH ₂ )p _£G ), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CHsCHp) ₃ NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH _2sU cc), 1.18 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (QHaCHaJaNH).

RMN ^J 3 ¹ 1 P 1 (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.75 (d, J _γ-β = 19.4 Hz, P _γ ), -11.37 (d, J _α - _β = 19.4 Hz, P _α ), -23.08 (t, J _β-Y = J _β-a = 19.4 Hz, Pp).

Exemple 24 : Poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(2\3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'- triphosphate) succinate] sels de tri- butylammonium

La triphosphorylation de 0,36 g du PEG-O-bis(succ-ddCMP) (0,07 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode de l'exemple 19. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,27 g, 60 %) après lyophilisation. RMN ¹ H

RMN ^1J C (D ₂ O, 100 MHz) : 174.8, 174.5 (2s, C=O _SUC c), 161.0 (s, C ₄ ), 155.0 (s, C ₂ ), 144.8 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 88.6 (s, Cr), 81.8 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )PEG), 68.4 (s, (OCH ₂ β)pE _G ), 66.0 (s, C ₅ ), 64.1 (s, (OCH ₂ Q)PE _G ), 52.6 (s, (C H ₃ C H ₂ C H ₂ CJi) ₃ N H), 32.5 (s, C ₂ ), 31.6, 28.4 (2s, CH _2succ ), 25.2 (s, (CH ₃ CH ₂ çH ₂ CH ₂ ) ₃ NH), 23.8 (s, C ₃ ), 19.2 (s, (CH ₃ çϋ _> CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH), 12.8 (s, (ç±bCH ₂ CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -11.00 (m, P _v P _α ), -22.85 (m, P ₃ ).

Exemple 25 : poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-β-D- ribofuranosyl)-cytosyl-5'-disphosphate)succinate], sels de tri- butylammonium

La diphosphorylation du PEG-O-bis(succ-ddCMP) (0.20 g, 0.04 mmol) a été réalisée en utilisant la méthode C de l'exemple 15. Le composé du titre a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.18 g, 80 %) après lyophilisation.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.35 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.21 (d, J _5-6 = 7.3 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.94 (d, J _{1 -2} - = 5.6 Hz, 1 H, H ₁ -), 4.31 (m, 1 H, H ₄ '), 4.16 (m, 3H, (OCH ₂ α) _PEG H _{5 a} ), 4.03-3.93 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.80-3.33 (m, OCH ₂ ) _P£G ), 3.00 (m, 12H, (CH ₃ CH ₂ CHzQHg) ₃ NH), 2.74-2.62 (m, 4H, CH _2sU cc), 2.37 (m, 1 H, H ₂₃ ), 2.00 (m, 2H, H _{2 b} H _{3 a} ), 1.77 (m, 1 H, H ₃ *), 1.55 (m, 12H, (CH ₃ CH ₂ ç_H _£ CH ₂ ) ₃ NH), 1.23 (m, 12H,

(CH ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ )SNH), 0.80 (m, 18H, (ç_H ₃ CH ₂ CH ₂ CH ₂ ) ₃ NH).

RMN ¹³ C

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.29 (m, P _β ), -10.97 (m, P ₀ ).

Exemple 26 : Méthode E : Clivage du nucléotide de son support Le nucléotide supporté (0,05 mmol, 1eq) est dissous dans l'ammoniaque concentré (2 ml). La solution est agitée à température ambiante pendant 1 h, puis évaporée sous pression réduite. On réalise la purification par chromatographie sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique eau) puis une dialyse sur membranes d'ester de cellulose.

Exemple 26 bis

Méthode E bis: Clivage des nucléotides sur support

Un nucléotide sur support (0.05 mmol, 1 eq.) a été dissous dans l'ammoniac concentré (2 ml_). La solution a été agitée à température ambiante pendant 1h, puis évaporée sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique eau), suivie d'une lyophilisation.

A la différence de l'exemple 26, l'étape de dialyse n'est pas réalisée.

Exemple 27 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,15 g du PEG-O- bis(succinyl-araCMP) (0,02 mmol). La purification par chromatographie sur colonne du produit brut a donné un mélange d'araCMP et de succinamide dans un rapport 93/7 (15 mg). Le succinamide a été éliminé par dialyse dans l'eau (2 ml) toute une nuit et l'araCMP (13 mg, 68 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. Rf (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.2.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.88 (d, J _{6 5} = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.11 (d,

J _{1 -2} - = 5.3 Hz, 1 H, H ₁ ), 6.02 (d, J _5-6 = 7.6 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 4.34 (t, J ₂ -r = J ₂ '-3' = 5.3 Hz 1 H, H ₂ ), 4.11-3.96 (m, 4H, H ₃ - H ₄ ' 2H ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.45 (s).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 7100), λ _min 247 nm (ε 4100).

LC/MS (M-NH ₄ ⁺ ) m/z : 322 tr : 11.7 min purity : 97 %.

Exemple 27 bis:

La méthode E bis a été appliqué au PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-AraCMP) (0.15 g, 0.02 mmol). La purification sur colonne chromatographique du produit brut a permis d'obtenir araCMP sous forme d'un solide blanc (0.51 g, 70 %) après lyophilisation.

Exemple 28 1 -(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,34 g du PEG-O- bis(succinyl-araCDP) (0,05 mmol). La purification du produit brut sur colonne de chromatographie a donné un mélange de araCDP et de succinamide dans le rapport 88/12 (55 mg). Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. L'araCDP (8,5 mg, 96 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

(iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J _6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.14 (d, J _{1 -2} . = 5.4 Hz, 1 H, H ₁ ), 6.03 (d, J _5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.35 (t, J ₂ '-v = Jz* = 5.4 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.20-4.10 (m, 3H ₁ H ₃ . 2H ₅ '), 4.00 (m, 1 H, H ₄ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.42 (d, J _β-α = 20.6 Hz, P _p ), - 11.10 (d, J _α-β = 20.6 Hz, P ₀ ).

UV (H ₂ O) λ _max 274 nm (ε 7900), λ _mm 246 nm (ε 3800).

LC/MS (M+H-2NIV) : m/z : 402 tr : 13.36 min purity : 86.7 %.

Exemple 29 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate sels d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,43 g du PEG-O- bis(succinyl-araCTP) (0,07 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange d'araCTP et de succinamide dans le rapport 95/5 (68 mg). Un échantillon du mélange (8,5 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. AraCTP (8 mg, 92 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

(iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.2.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J _{6 5} = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.14 (d, J _{1 -2} ' = 5.4 Hz, 1 H, Hr), 6.04 (d, J ₅ -e = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.35 (t, J ₂ '-v = J ₂ -S = 5.4 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.20-4.12 (m, 3H, H ₃ ' 2H ₅ ), 4.01 (m, 1 H, H ₄ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.45 (d, J _γ-β = 18.2 Hz, P _γ ), -11.20 (d, J _α -p = 19.4 Hz, P _α ), -22.96 (t, J _β-Y = J _β-α = 18.2 Hz,

Pβ)-

UV (H ₂ O) λ _ma x 273 nm (ε 8700), λ _mιn 246 nm (ε 4500). LC/MS (M+2H-3NH ₄ ⁺ ) : m/z : 482 tr : 19.25 min purity : 83.3 %.

Exemple 29 bis:

La méthode E bis a été appliqué à PEG-bis(OCH ₂ CH ₂ -CO-AraCTP) (0.20 g, 0.04 mmol). Après purification par chromatographie en phase inverse RP18 et lyophilisation, on a obtenu l'AraCTP sous forme d'un solide blanc (14mg, 79 %).

Exemple 30 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate sel d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,14 g du PEG-O- bis(succinyl-dCMP) (0,03 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCMP et de succinamide dans le rapport 86/14 (17 mg). Un échantillon du mélange (10 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. Le dCMP

(8,6 mg, 73 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.5.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.07 (d, J _6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.19 (t, Jv-za = Jv-2-b = 6.5 Hz, 1 H, Hr), 6.09 (d, J _5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.45 (m, 1 H, H ₃ ), 4.12 (m, 1 H, H ₄ ), 4.04-3.90 (m, 2H, 2H ₅ ), 2.44-2.32 (ddd, J _{2 a} -r = 6.2 Hz, J ₂₃ - _ï = 3.7 Hz, J _{23 -2} ' = 14.1 Hz, 1 H, H _{2 a} ), 2.27-2.18 (m, 1 H, H ₂ . _b ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 161.8 (s, C ₄ ), 151.7 (s, C ₂ ), 143.3 (s, C ₆ ), 95.5 (s, C ₅ ), 86.4 (s, Cr), 86.0 (d, J _{04 -} P = 8.0 Hz, C ₄ ), 70.7 (s, C ₃ ), 64.4 (d, J _{05 -} P = 5.0 Hz, C ₅ ), 39.5 (s, C ₂ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.23 (s).

UV (H ₂ O) λ _max 273 nm (ε 9100), λ _min 246 nm (ε 4800).

LC/MS (M-NH ₄ ⁺ ) : m/z : 306 tr : 11.23 min purity : 92.5 %.

Exemple 31 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,21 g du PEG-O- bis(succinyl-dCDP) (0,03 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCDP et de succinamide dans le rapport 90/10 (27 mg). Un échantillon du mélange (10 mg) a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. 9 mg de dCDP (86 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

(iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.08 (d, J _6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.19 (t, J ₁ -. 2a = Jv-zb = 6.6 Hz, 1 H, H ₁ ), 6.16 (d, J _5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.52 (m, 1 H, H ₃ ), 4.16-4.06 (m, 3H, H ₄ ' 2H ₅ ), 2.43-2.34 (ddd, J _{23 -} V = 6.3 Hz, J ₂ . _a - ₃ ' = 3.6 Hz, J _{23 -2} ' = Hz, 1 H, H ₂₃ ), 2.27-2.18 (m, 1 H, H _{2 b} ).

RMN 1 ^l 3 ^d ,C (D ₂ O, 100 MHz) δ 160.5 (s, C ₄ ), 147.9 (s, C ₂ ), 143.9 (s, C ₆ ), 95.4 (s, C ₅ ), 86.5 (s, C ₁ ), 86.0 (s, C ₄ ), 70.6 (s, C ₃ ), 64.9 (s, C ₅ ), 39.5 (s, C ₂ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.68 (d, J _β-α = 19.3 Hz, P _p ), -11.25 (d,

UV (H ₂ O) λ _max 273 nm (ε 9100), λ _min 246 nm (ε 4600). LC/MS (M+H-2NH ₄ ⁺ ) : m/z : 386 tr : 13.89 min purity : 77.4 %.

Exemple 32 : 1-(2'-désoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate, sels d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,25 g du PEG-O- bis(succinyl-dCTP) (0,04 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné un mélange de dCTP et de succinamide dans le rapport 94/6 (30 mg). Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. 9 mg dCTP (70 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

(iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6. a -

RMN 3 ^J 1 ¹ 1P (D ₂ O, 121 MHz) δ -9.62 (m, P _γ ), -11.07 (d, J _α-Y = 16.4 Hz, P _α ), -21.93 (m, P _β ).

UV (H ₂ O) λ _max 273 nm (ε 10100), λ _min 245 nm (ε 4300). LC/MS (M+2H-3NH ₄ ⁺ ) : m/z : 466 tr : 18.81 purity : 84.5 %.

Exemple 33 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée à 0,13 g du PEG-O- bis(succinyl-CMP) (0,02 mmol). La purification sur colonne de chromatographie a donné 17 mg d'un mélange de CMP et de succinamide dans le rapport 80/20. Un échantillon de 10 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. Le CMP (7 mg, 82 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.3.

RMN ¹ H (D ₂ O, 400 MHz) δ 7.98 (d, J _{6 5} = 7.7 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.08 (d,

J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.89 (d, J _{1 -2} - = 2.6 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.28- 4.18 (m, 3H ₁ H ₂ - H ₃ - H ₄ ), 4.17-3.94 (m, 2H, 2H ₅ ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 163.6 (s, C ₄ ), 154.4 (s, C ₂ ), 142.3 (s, C ₆ ), 96.0 (s, C ₅ ), 89.4 (s, C ₁ ), 83.0 (d, J _C -V-P = 9-0 Hz, C ₄ ), 74.3 (s, C ₂ ), 69.2 (s, C ₃ ), 63.7 (d, J _C5 --P = 5.0 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.29 (s).

LC/MS (M-NH ₄ ⁺ ) : m/z : 322 tr : 10.20 min purity : 86 %.

Exemple 34 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels d'ammonium

0,5 ml de triéthylamine ont été ajoutés à une solution de 0,20 g du PEG-O- bis(succinyl-CDP) (0,03 mmol.) dans un mélange éthanol/eau (6 ml, 1/1 , v/v). Le mélange a été agité à température ambiante durant 3h et concentré sous pression réduite. Le résidu a été traité selon la méthode E de l'exemple 25. La chromatographie sur colonne du produit a donné un mélange de CDP et de succinamide dans le rapport 95/5 (30 mg). Un échantillon (10,5 mg) du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse sur membranes d'ester de cellulose toute une nuit. 9 mg de CDP (93 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation, contaminé par 7 % d'un sous-produit identifié comme l'analogue cytidine 5'-diphosphate-2,3'-monophosphate cyclique.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.85 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 5.98 (d,

J _5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.83 (d, J _{1 -2} - = 3.9 Hz, 1 H, H _r ), 4.24-4.00 (m, 5H, H ₂ . H ₃ . H ₄ .2H ₅ ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 163.1 (s, C ₄ ), 154.2 (s, C ₂ ), 140.5 (s, C ₆ ),

94.8 (s, C ₅ ), 87.8 (s, C ₁ ), 81.3 (d, J _04- P = 9.1 Hz, C ₄ ), 72.7 (s, C ₂ ), 67.7 (s, C ₃ ), 62.9 (d, J _C5-P = 5.4 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.21 (d, J _β-α = 20.3 Hz, P _β ), -11.13 (d,

J _α-β = 20.3 Hz, P ₀ ).

UV (H ₂ O) λ _max 270 nm (ε 10500), λ _min 241 nm (ε 6700).

LC/MS (M+H-2NH ₄ ⁺ ) : m/z : 402 tr : 14.15 min purity : 71.8 %.

Exemple 35 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-triphosphate, sels d'ammonium

0,5 ml de théthylamine ont été ajoutés à une solution de 0,19 g du PEG- O-bis(succinyl-CTP) (0,03 mmol) dans un mélange éthanol/eau (6 ml, 1/1 , v/v). Le mélange a été agité à température ambiante durant 3h et concentré sous pression réduite. Le résidu traité selon la méthode E de l'exemple 25, La chromatographie du produit sur colonne a donné 24 mg d'un mélange de CTP et de succinamide dans le rapport 80/20. Un échantillon (16 mg) du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse sur membranes d'ester de cellulose toute une nuit. 13 mg de CTP (81 %) ont été obtenus sous forme d'un solide blanc après lyophilisation, contaminé par 10 % d'un sous-produit identifié comme l'analogue cytidine-2',3' monophosphate cyclique-5'-triphosphate.

R _/ (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.94 (d, J _6-5 = 7.7 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.10 (d,

J _5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.88 (d, J _r-2 . = 4.2 Hz, 1 H, H _r ), 4.31- 4.11 (m, 5H, H ₂ . H ₃ H ₄ ^H ₅ ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 162.2 (s, C ₄ ), 152.8 (s, C ₂ ), 142.9 (s, C ₆ ), 95.9 (s, C ₅ ), 89.2 (s, C _r ), 83.1 (d, J _C4 '-p = 9-3 Hz, C ₄ ), 74.3 (s, C ₂ ), 69.1 (s, C ₃ ), 64.5 (d, J _{C5 -P} = 5.0 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -9.72 (d, J _γ-β = 19.1 Hz, P _γ ), -11.22 (d, J ₀ . p = 19.4 Hz, P ₀ ), -22.69 (t, J _β-Y = J _β-α = 19.4 Hz, P _β ). UV (H ₂ O) λ _max 270 nm (ε 12500), λ _min 228 nm (ε 5300).

LC/MS (M+2H-3NH ₄ ⁺ ) : m/z : 482 tr : 17.74 purity : 75.9 %.

Exemple 36 : 1-(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'-triphospha te) ₎ sels d'ammonium

La méthode E de I exemple 26 a été appliquée au PEG-O-bis(succinyl- ddCTP) (0.20 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCTP et de succinamide dans un rapport 92/8 (30 mg). Un échantillon de 10.5 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. ddCTP (9.50 mg, 67 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.7

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.02 (d, J ₆ -S = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.08 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1H, H ₅ ), 6.02 (dd, Jr- ₂ > _a = 6.6 Hz, Jr _{-2 b} = 2.0 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.34 (m, 1 H, H ₄ '), 4.25 (m, 1 H, H _{5 a} ), 4.08 (m, 1 H, H _{5 b} ), 2.43-2.33 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.10-1.97 (m, 2H, H _{2 b} H _{3 a} ), 1.95-1.96 (m, 1 H, H^b).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 164.9 (s, C ₄ ), 155.4 (s, C ₂ ), 145.0 (s, C ₆ ), 97.1 (s, C ₅ ), 89.2 (s, C ₁ ), 82.8 (d, Jc-V- p = 8.5 Hz, C ₄ ), 68.3 (d, J ₀₄ '. P = 5.4 Hz, C ₅ ), 33.9 (s, C ₂ ), 26.1 (s, C ₃ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ - 9.76 (d, J _γ-β = 19.3 Hz, P _γ ), -10.90 (d, J _α-β = 18.9 Hz, P ₀ ), -22.38 (t, J _β-Y = J _β-a = 18.9 Hz, P _β ).

UV (H ₂ O) λ _max 279 nm (ε 11277), λ _min 242 nm (ε 2283).

LC/MS (M+2H-3NH ₄ ⁺ ) : m/z : 450 tr : 16.7 purity : 76 %

Exemple 37 : 1 -(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- monophosphate), sel d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée au PEG-O-succinyl-ddCMP (0.16 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCMP et de succinamide dans un rapport 86/14 (17 mg). Le succinamide est éliminé par dialyse d'une nuit réalisée dans l'eau (2 ml). ddCMP (14 mg, 79 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. R, (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.06 (d, J ₆ -S = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.02 (d, J _5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.93 (dd, J _{1 -23} = 6.6 Hz, J _{r-2 b} = 2.7 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.27 (m, 1 H, H ₄ ), 4.07 (m, 1 H, H _{5 a} ), 3.88 (m, 1 H, H ₅ -b), 2.37-2.32 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.07-1.83 (m, 3H, H _{2 b} H _{3 a} H ₃ b).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 162.3 (s, C ₄ ), 151.6 (s, C ₂ ), 143.3 (s, C ₆ ), 94.8 (s, C ₅ ), 87.3 (s, C ₁ ), 81.2 (d, J ₀₄ '- p = 8.4 Hz, C ₄ ), 65.2 (d, J _{C5 -} p = 5.0 Hz, C ₅ ), 32.0 (s, C ₂ ), 24.0 (s, C ₃ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.42 (s).

UV (H ₂ O) λm _ax 279 nm (ε 12276), λ _min 245 nm (ε 2408).

LC/MS (M-NH ₄ ⁺ ) : m/z : 290 tr : 10.75 purity : 93 %

Exemple 38 : 1-(2',3'-didésoxy-β-D-ribofuranosyl)-cytosyl-5'- diphosphate), sels d'ammonium

La méthode E de l'exemple 26 a été appliquée au PEG-O-succinyl-ddCDP (0.18 g, 0.03 mmol). ). La purification sur colonne chromatographique a conduit à un mélange du composé attendu ddCDP et de succinamide dans un rapport 92/8 (17 mg). Un échantillon de 16 mg du mélange a été dissous dans l'eau (2 ml) et purifié par dialyse toute une nuit. ddCDP (14.8 mg, 66 %) est obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

Rf (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.5 RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.10 (d, J _6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.09 (d, J _{5 6} = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.95 (dd, J _{1 -23} = 6.6 Hz, J _{v-2 b} = 2.7 Hz, 1 H, Hv), 4.30 (m, 1 H, H ₄ ), 4.18 (m, 1 H, H _{5 a} ), 3.99 (m, 1 H, H _{5 b} ), 2.45-2.30 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.10-1.80 (m, 3H, H _{2 b} H _{3 a} H ₃ - _b ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 161.7 (s, C ₄ ), 151.8 (s, C ₂ ), 143.6 (s, C ₆ ), 94.8 (s, C ₅ ), 87.4 (s, Cr), 81.2 (d, Jc ₄ -. p = 8.3 Hz, C ₄ ), 66.1 (s, C ₅ ), 32.0 (s, C ₂ ), 24.1 (s, C ₃ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 81 MHz) δ - 10.72 (m, P _β ), -11.03 (m, P ₀ ). UV (H ₂ O) λ _max 275 nm (ε 9803) , λ _min 245 nm (ε 3514) .

LC/MS (M+H-2NH ₄ ⁺ ) : m/z : 370 tr : 14.6 purity : 72 %

Exemple 39 : comparatif : Méthode F: Monophosphorylation d'un nucléoside ou analogue de nucléoside en solution: A une suspension de nucléoside (1 éq) dans le théthylphosphate (2 ml) à 0°C, on a ajouté de l'oxychlorure de phosphore (2 eq). Le mélange a été agité à 0°C pendant 4h, puis 3h à température ambiante. L'excès d'oxychlorure de phosphore a été hydrolyse par addition lente d'une solution aqueuse d'un tampon au bicarbonate de triéthylammonium (1 M, pH= 7) (5 ml). La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-cellulose, Sephadex avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium aqueux (0-1 M). Les sels de phosphate résiduels ont été supprimés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique eau).

Exemple 40 : 1-(β-D-arabinofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de sodium - - - - - - -

La monophosphorylation de l'AraC (0,2 g, 0,82 mmol) a été réalisée selon la méthode F (exemple 36). L'araCMP a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,2 g, 70%) après échange d'ions sur Dowex Na ⁺ et lyophylisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.2.

RMN ¹ H (D ₂ O, 400 MHz) δ 8.01 (d, J _6-5 = 7.8 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.13 (d, J _{1 -2} ' = 5.4 Hz, 1 H, Hv), 6.12 (d, J _5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.39 (t, J _{2 -1} . = J ₂ -. 3. = 5.4 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.15-4.08-(m, 2H, H ₃ - H ₅ a), 4.06-4.00 (m, 2H, H ₄ - H ₅ b).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 161.2 (s, C ₄ ), 151.0 (s, C ₂ ), 144.4 (s, C ₆ ), 94.7 (s, C ₅ ), 85.5 (s, C ₁ ), 81.5 (d, J _C4-P = 9.0 Hz, C ₄ ), 75.3 (s, C ₂ ), 73.5 (s, C ₃ ), 63.1 (d, J _C5-P = 4.0 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O 121 MHz) δ 0.80 (s).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 8100), λ _mιn 247 nm (ε 4900).

LC/MS (M-Na+) : m/z : 322 tr : 12.82 min purity : 97.7 %.

Exemple 41 : 1-(β-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de triéthylammonium

La monophosphorylation de la cytidine (0,20 g, 0,82 mmol) a été réalisée par la méthode F. La purification sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a donné le CMP (0,13 g, 36 %), sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

Rf (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.3. RMN ¹ H (D ₂ O, 400 MHz) δ 7.91 (d, J _6-5 = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.02 (d, J _5-6 = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.88 (d, J _{1 -2} . = 3.5 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.22-4.15 (m, 3H, H ₂ - H ₃ . H ₄ ), 4.04-4.11 (m, 1 H ₁ H _5a ), 3.94-4.01 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH ₃ CH ₂ ) _S NH), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9H, (ç±bCH ₂ ) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.46 (s).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 10238), λ _min 247 nm (ε 6530).

LC/MS (M-HNEt ₃ ⁺ ) : m/z : 322 tr : 10.7 min purity : 99 % .

Exempe 42 : 1-(2'-désoxy-/3-D-ribofuranosyl)-cytosine-5'-monophosphate, sel de triéthylammonium

La monophosphorylation de la 2'-désoxycytidine (sous forme chlorhydrate) (0,20 g, 0,76 mmol) a été réalisée par la méthode F avec les modifications suivantes : le mélange a été agité à 15°C au lieu de 0 ⁰ C pendant 4h, puis 3h à température ambiante. La purification sur colonne en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a donné le dCMP (0,15 g, 48 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation et une faible quantité de 5'3'dCMP (0.05 g, 11 %) a également été isolée sous forme de solide blanc.

Rf (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 6/2/2, v/v/v) : 0.5 RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.96 (d, J _{6 5} = 7.7 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.20 (t, Jv _-23 = Jr-z-b = 6.6 Hz, 1 H, H ₁ -), 6.06 (d, J _5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.45 (m, 1 H, H ₃ ), 4.11 (m, 1 H, H ₄ ), 4.03-3.90 (m, 2H, 2H ₅ ), 3.10 (q, J = 7.3 Hz, 6H, (CH ₃ CHg) ₃ NH), 2.40-2.31 (ddd, J ₂ . _{a -} r = 6.1 Hz, J _{2 a} . ₃ ' = 3.7 Hz, J _{23 -2} - = 14.1 Hz, 1 H, H _2a ), 2.26-2.16 (m, 1 H, H _{2 b} ), 1.19 (t, J= 7.3 Hz, 9H, (QHaCHa) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.27 (s) UV (H ₂ O) λ _max 271 nm (ε 9700), λ _min 247 nm (ε 6100).

LC/MS (M-HNEt ₃ ⁺ ) : m/z : 306 tr : 11.9 min purity : 100 %.

Exemple 43: 11 3-D arabinofuranosyl)-cytosine-5'-diphosphate, sels de sodium

A une solution d'araCMP sous forme de son sel de mono(triéthylammonium) (0,10 g, 0,23 mmol) dans l'eau (1 ,80 ml) est ajoutée de la tributylamine (0,46 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité pendant 30 min à température ambiante. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Après une co-évaporation à l'éthanol puis à la pyridine anhydre, le monophosphate est séché toute la nuit sous vide sur P ₂ O ₅ . On ajoute 0,23g (1 ,41 mmol) de 1 ,1 '-carbonyldiimidazole à une suspension de ce monophosphate dans 5 ml de N ₁ N- diméthylformamide. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à température ambiante et traité au méthanol anhydre (0,10ml, 2,50mmol) pour décomposer l'excès de 1 ,1 '-carbonyldiimidazole. Après 15 minutes, on ajoute une solution (1 M, 1 ,41 ml, 1 ,41 mmol) de tributylammonium phosphate dans le N,N-diméthylformamide. La suspension est agitée pendant 24h à température ambiante puis filtrée. Le filtrat est traité par un volume égal de méthanol et concentré sous pression réduite. Après purification sur colonne DEAE-Sephadex (gradient linéaire de TEAB, 0-1 M), les sels de phosphate résiduels sont alors éliminés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau). L'araCDP(45mg, 42%) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après échange d'ions sur DOWEX Na+ et lyophilisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.

RMN ¹ H (D ₂ O, 400 MHz) δ 7.85 (d, J ₆ - _S = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.17 (d, J _{1 -2} - = 5.6 Hz, 1 H, H ₁ ), 6.03 (d, J ₅ -e = 7.6 Hz, 1 H, H ₅ ), 4.37 (t, J ₂ -v =

J _{2 -3} - = 5.6 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.22 (t, J _{3 -2} ' = 6.0 Hz, 1 H ₁ H ₃ ), 4.17 (m, 2H, 2H ₅ ), 4.01 (m, 1 H ₁ H ₄ ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 166.1 (s, C ₄ ), 157.4 (s, C ₂ ), 142.7 (s, C ₆ ), 95.7 (s, C ₅ ), 85.1 (s, Cr), 81.1 (d, JCλ--P = 9.0 Hz, C ₄ ), 75.3 (s, C ₂ ), 73.6 (s, C ₃ ), 63.6 (d, J _{05 -} P = 5.0 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -8.46 (m, P _β ), -10.84 (m, P ₀ ).

UV (H ₂ O) λ _max 271 nm (ε 9100), λ _min 247 nm (ε 5700).

LC/MS (M+H-2Na+) : m/z : 402 tr : 15.8 min purity : 84.5 %

Exemple 44: Comparatif : Méthode G : Triphosphorylation de nucléosides en solution

G I : méthode « one pot » A une suspension du nucléoside désiré (1 eq) dans le triéthylphosphate (2 ml) à 0°C, on a ajouté de l'oxychlorure de phosphore (1 ,64 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité à 0 ⁰ C pendant 4h. Une solution de tributylammonium pyrophosphate dans du N,N-diméthyformamide anhydre (1 M, 4.11 mmol, 5eq) a été ajoutée, ainsi que de la tributylamine (0,90 mmol, 1 ,1 eq). Le mélange a été vigoureusement agité pendant 5 min et une solution d'un tampon de bicarbonate de triéthylammonium (1 M, 30 ml) a été ajoutée lentement. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-Sephadex, élution avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium (0-1 M). Les sels de pyrophosphate résiduels ont été éliminés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau). G2 : méthode avec activation au carbonyldiimidazole: A une solution du monophosphate requis sous forme de son sel mono(triethylammonium) (1eq) dans l'eau (1 ,80 ml) est ajoutée de la tributylamine (0,46 mmol, 2 eq). Le mélange a été agité pendant 30mn à température ambiante. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Après co-évaporation à l'éthanol puis à la pyridine anhydre, le monophosphate a été séché toute une nuit sous vide sur P ₂ O ₅ . A une

suspension de ce monophosphate dans le DMF (5ml) on a ajouté du 1 ,1 '-carbonyldiimidazole (1 ,41 mmol, 6eq). Le mélange réactionnel a été agité durant 2h à température ambiante et traité avec du méthanol anhydre (2,30 mmol, 10eq) pour décomposer l'excès de carbonyldiimidazole. Après 15min, on a ajouté une solution de tributylammonium pyrophosphate dans du N,N-diméthylformamide (1 M, 1 ,41 mmol, 6 eq) anhydre. La suspension a été agitée pendant 24h à température ambiante, puis filtrée. Le filtrat a été traité avec un volume égal de méthanol, puis concentré sous pression réduite. La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne DEAE-Sephadex, élution avec un gradient linéaire de tampon bicarbonate de triéthylamonium (0- 1 M). Les sels de phosphate résiduels ont été supprimés par chromatographie en phase inverse RP18 (isocratique/eau).

Exemple 45 : AraCTP

La triphosphorylation de l'araCMP (0,20 g. 0,82 mmol) a été réalisée selon la méthode G1 décrite ci-dessus. L'araCTP a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0,045 mg, 10%) après échange d'ions sur DOWEX Na ⁺ et lyophilisation.

La triphosphorylation de l'araC (0,10 g, 0,23 mmol) a également été réalisée selon la méthode G2 décrite ci-dessus. Après deux purifications sur colonne DEAE-Sephadex et sur une colonne en phase inverse RP18, l'araCTP (0.015 mg, 11 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc après échange d'ions sur Dowex puis lyophilisation.

R, (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.2.

RMN ¹ H (D ₂ O, 400 MHz) δ 7.84 (d, J _{6 5} = 7.6 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.17 (d, Jv-z = 5.4 Hz, 1 H ₁ Hr), 6.03 (d, J _5-6 = 7.6 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 4.37 (t, J ₂ ^> -v = Jz- 3 _' = 5.4 Hz, 1 H, H ₂ ), 4.25-4.16 (m, 3H, H ₃ - 2H ₅ ), 4.03 (m, 1 H, H ₄ ).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 166.0 (s, C ₄ ), 157.3 (s, C ₂ ), 142.8 (s, C ₆ ), 95.7 (s, C ₅ ), 85.3 (s, C ₁ ), 81.1 (d, J _Cλ '-P = 9 0 Hz, C ₄ ), 75.4 (s, C ₂ ), 73.6 (s, C ₃ ), 64.0 (d, J _{C5 -P} = 5.0 Hz, C ₅ ).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -9.55 (d, J _γ-β = 19.4 Hz, P _γ ), -11.12 (d, J ₀ - β = 19.4 Hz, P ₀ ), -22.69 (t, J _β . _γ = J _β-a = 19.4 Hz, Pp).

UV (H ₂ O) λ _max 271 nm (ε 10800), λ _min 245 nm (ε 6600).

LC/MS (M+2H-3Na+) : m/z : 482 tr : 18.5 min purity : 84.7 %

Exemple 46 : CTP

La triphosphorylation du CMP sous forme de son sel mono(triéthyïammonium) (0,10 g, 0,23 mmol) été réalisée selon la méthode G2. Une purification sur colonne DEAE-Sephadex puis en phase inverse RP18 (isocratique/eau) a conduit au CTP (0,70 g, 37 %) obtenu sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.3.

RMN ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.97 (d, J _6-5 = 7.7 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.10 (d, J _5-6 = 7.7 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.88 (d, Jv- _? = 4.3 Hz, 1 H, H ₁ ) 4.30-4.12 (m, 5H, H _? H _3' H ₄ . 2H ₅ ), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 18H, (CH ₃ ç±y ₃ NH), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 27H, (ç±bCH ₂ ) ₃ NH).

RMN ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 163.4 (s, C ₄ ), 154.1 (s, C ₂ ), 142.5 (s, C ₆ ), 96.1 (s, C ₅ ), 89.1 (s, C ₁ ), 83.0 (d, Jc-v-p = 12.0 Hz, C ₄ ), 74.3 (s, C ₂ ), 69.2 (s, C ₃ ), 64.5 (d, J _C5- p = 7.0 Hz, C ₅ ), 46.62 (s, (CH ₃ CHg) ₃ NH), 8.18 (s, (QHaCHz) ₃ NH).

RMN ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.78 (d, J _γ-β = 19.4 Hz, P _γ ), -11.36 (d, J _α-β = 20.6 Hz, P ₀ ), -23.20 (t, J _β-Y = J _β-α = 19.4 Hz, P _β ).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 12500), λ _min 242 nm (ε 7200). LC/MS (M+2H-3HNEt3+) : m/z : 482 tr : 17.1 min purity : 97.1 %

Exemple 47 : Couplage du nucléoside 3TC avec le support :

Poly(éthyleneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(2',3'- didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate] 6

Le couplage entre le PEG succinate (1 g, 0.23 mmol) et le 3TC (0.10 g, 0.47 mmol) a été realise selon la méthode A et on a obtenu le PEG-3TC sous forme d'un solide blanc (0.88 g, 80 %).

Rf (CH ₂ CI ₂ / MeOH, 8/2, v/v) : 0.8.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.42 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz ₁ 1 H, H ₆ ), 7.25 (d, J _{5 6} = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.24 (dd, J _V -2<a = 2.7 Hz, J _r- 2b = 5.4 Hz, 1 H, H ₁ ), 5.31 (t, J ₄ > _-5 ' _a = J _{4 -} Sb 3.6 Hz, 1 H, H ₄ ), 4.20-4.17 (m, (OCH ₂ ^Q PEG), 3.99 (dd, J _53-4 - = 3.0 Hz, J _53- Sb = 12.9 Hz, 1 H, H ₅₃ ), 3.90-3.34 (m, (OCH ₂ ) _P£G H _{5 b} H ₂₃ ), 3.22 (dd, J _{2 b} . _r = 2.4 Hz, J _{2 b} - sra≈ 12.6 Hz, 1 H, H _{2 b} ), 2.79-2.65 (m, 4H, CH _2sU cc).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SUC c), 162.6 (s, C ₄ ), 156.6 (s, C ₂ ), 146.1 (s, C ₆ ), 97.3 (s, C ₅ ), 88.0 (s, C ₁ ), 87.9 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )p _EG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 64.1 (s, (OCH ₂ Q)PEG), 61.5 (s, C ₅ ), 38.0 (s, C ₂ ), 31.5, 28.5 (2s, CH _2succ ).

Exemple 48 : Monophosphorylation du nucléoside sur support polymère par oxydation du H-phosphonate Méthode B'i : synthèse du nucléoside H-phosphonate 5'-monoester

A une solution de PEG-nucléoside (nucléoside sur support polymère) (1 eq.) dans de la pyridine anhydre (3.75 ml_), on a ajouté du diphénylphosphite (1.60 mmol, 30 eq.). La solution a été agitée à température ambiante pendant 20 min, et une solution aqueuse de triéthylamine (1.25 mL, 1/1 , v/v) a été ajoutée 15 min plus tard, le mélange a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (30 mL) et la phase organique lavée avec une solution aqueuse à 5 % de NaHCθ ₃ (20 mL). La phase aqueuse a été extraite

plusieurs fois avec du dichlorométhane (30 mL). Les phases organiques ont été combinées et soumises à évaporation sous pression réduite. Le nucléoside H-phosphonate supporté a été précipité à partir de la solution de dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther (25 mL) froid.

Le précipité est filtré, lavé au diéthyléther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (5 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH.

Exemple 49 : Application à la synthèse du monophosphate supporté du nucléoside ddC

Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-5'- hydrogénophosphonyl-β-D-ribo-furanosyl)-cytosyl) succinate] sels de tri- éthylammonium

Du PEG-ddC (0.25 g, 0.05 mmol) a été traité selon la méthode B\ de l'exemple 48, et on a obtenu le H-phosphonate 5'-monoester de la ddC supporté sous forme d'un solide blanc (0.23 g, 86 %).

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.34 (d, J ₆ - _S = 7.4 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.26 (d, J _5-6 = 7.4 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.67 (d, J _H-P = 637.2 Hz, 1 H, H _HP ), 5.99 (m, 1 H, Hr), 4.32 (m, 1 H, H ₄ ), 4.18-4.09 (m, 3H, (OCH ₂ α) _P £ _G H ₅₃ ), 3.94 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.83-3.36 (m, (OCH ₂ ) _P£G ), 3.09 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ CH^) ₃ NH), 2.82-2.66 (m, 4H, CH _2succ ), 2.45 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.08-1.97 (m, 2H, H _{2 b} H _3a ), 1.78 (m, 1 H, H _{3 b} ), 1.17 (t, J = 1.2

NMR ¹³ C 162.3 (s, C ₄ ), 156.9 (s, C ₂ ), 146.8 (s, C ₆ ), 97.6 (s, C ₅ ), 88.2 (s, Cr), 86.6 (d, J _C4- p =

7.6 Hz, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ )PEG), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 63.9 (d, J _C5 --P = 3.9 Hz, C ₅ ), 46.6 (s, (CH ₃ CJH ₂ J ₃ NH), 32.5 (s, C ₂ ), 31.5, 28.5 (2s, CH _2sU cc), 24.1 (s, C ₃ ), 8.2 (s, (QHaCHz) ₃ NH). NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 6.53 (s).

Exemple 50 : Application à la synthèse du monophosphate supporté du nucléoside 3TC

Poly(éthylèneglycol) ₄₀₀ o Bis[4-λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-5'- hydrogénophosphonyl-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate] sels de triéthylammonium

Du PEG-3TC (0.30 g, 0.06 mmol) a été traité selon la méthode B^ de l'exemple 48, et on a obtenu le H-phosphonate 5'-monoester du 3TC supporté sous forme d'un solide blanc (0.28 g, 87 %).

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.39 (d, J _6-5 = 7.4 Hz, 1H, H ₆ ), 7.26 (d, J ₅ - _G = 7.4 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.71 (d, J _H-P = 641.9 Hz,1 H, H _HP ), 6.25 (s, 1 H, H ₁ ), 5.40 (s, 1 H, H ₄ ), 4.29-4.13 (m, 4H, (OCH ₂ α) _PEG H _{5 a} H _{5 b} ), 3.85-3.36 (m, OCH ₂ ) _PEG H _Za ), 3.22 (m, 1 H, H _{2 b} ), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ CIy ₃ NH), 2.79-2.65 (m, 4H, CH _2s uc _c ), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (ç_H ₃ CH ₂ ) ₃ NH).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SUCc ), 162.6 (s, C ₄ ), 156.6 (s, C ₂ ), 146.1 (s, C ₆ ), 97.6 (s, C ₅ ), 88.0 (s, C ₁ ), 86.1 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _PEG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 64.2 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 63.5 (s, C ₅ ), 46.5 (s, (CH ₃ CUs) ₃ NH), 37.8 (s, C ₂ ), 31.6, 28.5 (2s, CH _2succ ), 8.1 (s, (QHaCHz) ₃ NH).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 6.35 (s).

Exemple 51 : Méthode B' ₂ : synthèse du monophosphate par oxydation du nucléoside H-phosphonate

Poly(éthylèneglycol) ₄ ooo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-O-monophosphoryl-β- D-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium

On a ajouté 0.20 ml_ (0.81 mmol) de λ/,O-bis(trimethylsilyl)acétamide à une solution de PEG-ddC-H-phosphonate monoester (0.10 g, 0.02 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (1.50 ml_) puis de la triéthylamine anhydre (0.06 ml_, 0.40 mmol). La solution a été agitée à 50 ⁰ C pendant 4 h pour donner l'intermédiaire phosphite silylé correspondant. Le mélange a été refroidi à 0 ⁰ C, et l'oxydation est menée par addition d'une solution de peroxide de tert-butyle dans le décane (0.36 mL, 5-6 M, 2.00 mmol) à température ambiante. Le mélange a été agité pendant 3h, traité avec un excès de MeOH-NEt ₃ (0.50 mL, 5/5, v/v) et l'agitation a été poursuivie pendant 1 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et le résidu dissous dans du dichlorométhane (10 mL). La phase organique a été lavée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 % (7 mL) et la phase aqueuse a subi plusieurs extractions au dichlorométhane (10 mL). Les phases organiques ont été combinées et évaporées sous pression réduite. Le nucléoside 5'-monophosphate sur support a été précipité à partir de la solution dans le dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther froid (100 mL). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyléther. Le monophosphate, légèrement contaminé par une petite quantité de produit de départ (84 % / 16 %) a été obtenu sous forme d'un solide blanc (0.09 g, 89 %). NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.49 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.13 (d, J _5-6 =

7.3 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.98 (d, Jy-? = 5.1 Hz, 1 H, H ₁ ), 4.35 (m, 1 H, H ₄ '), 4.19 (m, 3H, (OCH ₂ α)p _EG H ₅ a), 3.98-3.92 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.85-3.36 (m, (OCH ₂ ) _PEG ), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CHsçH^NH), 2.79-2.68 (m, 4H, CH _2S ucc), 2.46 (m, 1 H, H _{2 a} ), 2.08 (m, 1 H, H _{2 b} ), 1.97 (m, 1 H, H _{3 a} ), 1 -83 (m, 1 H, H _{3 b} ), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (ç_H ₃ CH ₂ ) ₃ NH).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.5, 174.5 (2s, C=O _SUcc ), 161.9 (s, C ₄ ), 156.0 (s, C ₂ ), 146.3 (s, C ₆ ), 97.4 (s, C ₅ ), 88.3 (s, C _r ), 81.8 (d, Jc ₄ '-p = 9.0 Hz, C ₄ ), 69.5 (s, (OCH ₂ ) _PEG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 65.2 (s, C ₅ ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _PEG ), 46.6 (s, (CH ₃ CH ₂ J ₃ NH), 32.6 (s, C ₂ ), 31.5, 28.4 (s, CH _2succ ), 23.8 (s, C ₃ ), 8.2 (s,

(CJH ₃ CH-O ₃ NH). NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.37 (s).

Exemple 52 : Oxydation du nucléoside 5'H-phosphonate monoester alternative à la méthode B' ₂

Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-O-monophosphoryl-3'- thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium

On a ajouté 0.30 ml_ (1.21 mmol) de λ/,O-bis(triméthylsilyl)acétamide à une solution de PEG-3TC-H-phosphonate monoester (0.15 g, 0.03 mmol) dans la pyridine anhydre (2.50 ml_). La solution a été agitée à 50 ⁰ C pendant 4 h pour donner l'intermédiaire phosphite silylé correspondant. L'oxydation est menée par addition d'une solution d'iode 200 mM (75 mg, 0.30 mmol) dans un mélange pyridine-eau (1.50 mL, 56/44, v/v) à température ambiante. Le mélange a été agité pendant 1h, traité avec un excès de MeOH-NEt ₃ (1.50 mL, 50/50, v/v) et l'agitation a été poursuivie pendant 1 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite et le résidu dissous dans du dichlorométhane (15 mL). La phase organique a été lavée avec une solution aqueuse de thiosulfate de sodium à 5 % (10 mL) et la phase

aqueuse a subi plusieurs extractions au dichlorométhane (15 ml_). Les phases organiques ont été combinées et évaporées sous pression réduite. Le nucléoside 5'-monophosphate sur support a été précipité à partir de la solution dans le dichlorométhane, par addition d'un excès en volume de diéthyléther froid (150 mL). Le précipité a été filtré et lavé au diéthyléther. Le produit final a été recristallisé dans l'alcool éthylique absolu (5 mL) et séché sous vide sur pastilles de KOH. Le monophosphate PEG-3TCMP a été obtenu sous forme d'un solide jaune (0.15 g, 103 %), contaminé par un résidu d'iode.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.44 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.26 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.25 (s, 1 H, H _r ), 5.40 (s, 1 H, H ₄ ), 4.42-4.07 (m, 4H, (OCH ₂ α) _PeG Hs-a H _{5 b} ), 3.84-3.36 (m, (OCH ₂ ) _PEG H _{2 a} ), 3.20 (m, 1 H, H ₂ . _b ), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 6H, (CH ₃ CJHg) ₃ NH), 2.82-2.67 (m, 4H, CH _2succ ), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 9H, (çhbCH ₂ ) ₃ NH).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O _SU cc), 162.6 (s, C ₄ ), 156.6 (s, C ₂ ), 146.3 (s, C ₆ ), 97.6 (s, C ₅ ), 88.1 (s, C ₁ ), 86.2 (d, J _04- P = 8.4 Hz, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _PEG ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.8 (s, C ₅ ), 64.1 (s, (OCH ₂ α)p _£G ), (s, (CH ₃ CHg) ₃ NH), 37.9 (s, C ₂ ), 31.6, 28.5 (s, CH _2succ ), (s, (ç±bCH ₂ ) ₃ NH).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.72 (s).

Exemple 53: Synthèse du dérivé diphosphate du 3TC par la méthode C Poly(éthylèneglycol) ₄₀ oo Bis[4-λ/-(1-(2',3'-didésoxy-5'-0-diphosphoryl-3'- thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium

La diphosphorylation du PEG-3TCMP (0,25 g, 0,05 mmol) a été réalisée selon la méthode C. Après échange d'ions sur DOWEX HNEt ₃ ⁺ et purification sur colonne (phase inverse) RP18 on a obtenu le diphosphate

PEG-3TCDP sous forme d'un solide jaune (0.17 g, 62 %) après lyophilisation.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.40 (d, J ₆ - ₅ = 7.5 Hz, 1 H ₁ H ₆ ), 7.20 (d, J _5-6 = 7.8 Hz, 1 H, H ₅ ), 6.24 (m, 1 H, Hv), 5.42 (m, 1 H, H ₄ ), 4.48-4.31 (m, 2H, H ₅₃ H ₅ -b), 4.18 (m, 2H ₁ (OCH ₂ α)p _EG ), 3.84-3.34 (m, (OCH ₂ )PEG H ₂₃ ), 3.21 (dd, J _{2 b-1} . = 2.7 Hz, J ₂ ^ ₂₃ = 12.6 Hz, 1 H, H _{2 b} ), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 18H, (CHaçH^NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH ₂ SUCc), 1.17 (t, J= 7.2 Hz, 27H, (QHaCH ₂ ) ₃ NH).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=O _SUCc ), 162.6 (s, C ₄ ), 156.6 (s, C ₂ ), 146.2 (s, C ₆ ), 97.7 (s, C ₅ ), 88.1 (s, Cv), 85.9 (d, JCA'-P = 8.6 Hz, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) _P£G ), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _PEG ), 64.1 (s, (OCH ₂ QPE _G ), 65.7 (s, C ₅ ), 46.6 (s, (CH ₃ CJH ₂ J ₃ NH), 37.8 (s, C ₂ ), 31.6, 28.4 (2s, CH _2suC c), 8.2 (s, (QHaCHz) ₃ NH).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.37 (d, J _β-α = 21 Hz, Pp) ₁ -11.36 (d, J _α-β = 20.2 Hz, P ₀ ).

Exemple 54 : Synthèse du dérivé triphosphate du 3TC par la méthode D Poly(éthylèneglycol) ₄₀₀ o Bis[4-λ/-(1 -(2',3'-didésoxy-3'-thia-5'-0- triphosphoryl-β-L-ribofuranosyl)-cytosyl) succinate], sels de triéthylammonium

La triphosphorylation du PEG-3TCMP (0.25 g, 0.05 mmol) a été réalisée selon la méthode D. Après échange d'ions sur DOWEX HNEt ₃ ⁺ et purification sur colonne (phase inverse) RP18 on a obtenu le triphosphate PEG-3TCTP sous forme d'un solide jaune (0.16 g, 54 %) après lyophilisation.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.41 (d, J _{6 5} = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 7.20 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 6.24 (m, 1 H ₁ H ₁ ), 5.42 (m, 1 H, H ₄ -), 4.45-4.22 (m, 2H, H ₅₃ H ₅ -b), 4.17 (m, 2H, (OCH ₂ α)p _EG ), 3.84-3.35 (m, (OCH ₂ ) _PEG H ₂₃ ), 3.23-3.18 (m, 1 H, H _{2 b} ), 3.09 (q, J = 7.2 Hz, 18H, (CH ₃ CiHg) ₃ NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH _2su cc), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 27H, (QH ₃ CH ₂ )SNH).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 100 MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, C=O _SUc c), 162.7 (s, C ₄ ), 156.4 (s, C ₂ ), 146.3 (s, C ₆ ), 97.6 (s, C ₅ ), 88.1 (s, C ₁ ), 86.2 (s, C ₄ ), 69.6 (s, (OCH ₂ ) PEG), 68.4 (s, (OCH ₂ β) _P£G ), 64.1 (s, (OCH ₂ α) _P£G ), 65.9 (s, C ₅ ), 46.6 (s, (CH ₃ CJH^ ₃ NH), 37.8 (s, C ₂ ), 31.6, 28.5 (2s, CH _2sU cc), 8.3 (s, (ç±bCH ₂ ) ₃ NH).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ -10.83 (d, J _γ-β = 18.9 Hz, P _γ ), -11.59 (d, J _α-β = 20.5 Hz, P ₀ ), -23.17 (t, J _β-Y = J _β-a = 20.1 Hz, P _β ).

Exemple 55 : Obtention des dérivés mono-, di- et triphosphates du nucléoside 3TC après l'étape de clivage selon la méthode E 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5 ^> -monophosphate, sel d'ammonium

La méthode E a été appliquée au PEG-3TCMP (0.14 g, 0.03 mmol). La purification sur colonne RP18 par chromatographie suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCMP (10.40 mg, 64 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation.

R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 7.97 (d, J _6-5 = 7.5 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.22 (t, J _{1 -2} . = 4.8 Hz, 1 H, H ₁ ), 5.96 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.35 (m, 1 H, H ₄ ), 4.16 (ddd, J ₅ 'a-4' = 3.3 Hz, J ₅ . _a - _{5 b} = 11.7 Hz, J _{5 a-P} = 5.6 Hz, 1 H, Hffa), 4.07-3.99 (m, 1 H ₁ H _{5 b} ), 3.45 (dd, J ₂ . _a -2' _b = 12.3 Hz, J ₂ < _a -v = 5.4 Hz, 1 H, H ₂₃ ), 3.13 (dd, J ₂ ^ ₂₃ = ¹² - ^{3 Hz} _> λrb-r = 4.2 Hz, 1 H, H _{2 b} ).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 165.8 (s, C ₄ ), 156.7 (s, C ₂ ), 142.0 (s, C ₆ ), 95.8 (s, C ₅ ), 87.4 (s, C ₁ ), 84.6 (d, J ₀₄ : _P = 8.6 Hz, C ₄ -), 65.3 (d, J ₀₅ .. P = 4.7 Hz, C ₅ ), 36.8 (s, C ₂ ).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ 0.83 (s).

UV (H ₂ O) λ _max 271 nm (ε 7771 ), λ _min 248 nm (ε 5277).

LC/MS (M-NH ₄ ⁺ ) : m/z : 308 rt : 10.80 min purity : 99 %

Exemple 56 : 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia-β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5'- diphosphate, sel d'ammonium

La méthode E a été appliquée au PEG-3TCDP (0.25 g, 0.05 mmol). La purification par chromatographie sur colonne RP18 suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCDP (12 mg, 51 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.4.

NMR ¹ H (D ₂ O, 200 MHz) δ 8.05 (d, J ₆ - _S = 7.7 Hz, 1 H, H ₆ ), 6.22 (t, J _{1 -2} - = 4.8 Hz, 1 H, H ₁ ), 6.02 (d, J _5-6 = 7.7 Hz, 1 H ₁ H ₅ ), 5.37 (m, 1 H, H ₄ ), 4.35-4.24 (m, 1 H, H _{5 a} ), 4.20-4.07 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.45 (dd, J _{2 a} - _{2 b} = 12.2 Hz, J _23-1 - = 5.2 Hz, 1 H, H _{2 a} ), 3.15 (dd, J ₂ - _b-2 - _a = 12.2 Hz, J _{2 b-}

NMR ¹³ C 75 MHz) δ 163.6 (s, C ₄ ), 153.9 (s, C ₂ ), 143.0 (s, C ₆ ), 95.4 (s, C ₅ ), 87.4 (s, C ₁ ), 84.8 (d, J ₀₄ -. p = 8.5 Hz, C ₄ -), 65.9 (d, J ₀₅ '. p = 5.0 Hz, C ₅ ), 37.0 (s, C ₂ ).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 81 MHz) δ -10.69 (d, J _β-α = 20.5 Hz, P _β ), -11.53 (d, J _α-β = 20.5 Hz, P ₀ ).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 7769), λ _min 248 nm (ε 5008).

LC/MS (M+H-2NH ₄ ⁺ ) : m/z : 388 rt : 13.40 min purity : 79 %.

Exemple 57 1-(2',3'-didésoxy-3'-thia -β-L-ribofuranosyl)-cytosine-5'- triphosphate, sel d'ammonium

La méthode E a été appliquée au PEG-3TCTP (0.25 g, 0.05 mmol). La purification par chromatographie sur colonne RP18 suivie d'une étape de dialyse a permis d'obtenir le 3TCTP (9 mg, 35 %) sous forme d'un solide blanc après lyophilisation. R _f (iPrOH/H ₂ O/NH ₄ OH, 5.5/3.5/1 , v/v/v) : 0.6.

NMR ¹ H (D ₂ O, 300 MHz) δ 8.10 (d, J _6-5 = 7.8 Hz, 1 H ₁ H ₆ ), 6.22 (t, J _r-2 '= 4.8 Hz ₁ 1 H, H ₁ ), 6.07 (d, J _5-6 = 7.5 Hz, 1 H, H ₅ ), 5.38 (m, 1 H ₁ H ₄ ), 4.37-4.31 (m, 1 H ₁ H _{5 a} ), 4.22-4.14 (m, 1 H, H _{5 b} ), 3.47 (dd, J ₂ < _a -2'b = 12.3 Hz, J _{2 a} -r = 5.4 Hz, 1 H, H ₂₃ ), 3.18 (dd, J ₂ ^a = ¹² - ^{3 Hz} ' ^J ?*>- r = 3.9 Hz, 1 H, H _{2 b} ).

NMR ¹³ C (D ₂ O, 75 MHz) δ 163.1 (s, C ₄ ), 150.8 (s, C ₂ ), 143.2 (s, C ₆ ), 95.3 (s, C ₅ ), 87.4 (s, Cr), 84.8 (d, Jc _{4 -} p = 8.5 Hz, C ₄ ), 66.1 (d, J _{C5 -} p = 5.5 Hz, C ₅ ), 37.0 (s, C ₂ ).

NMR ³¹ P (D ₂ O, 121 MHz) δ - 10.46 (d, J _γ-β = 19.1 Hz, P _γ ), -11.39 (d, J _α-β = 18.9 Hz, P ₀ ), -22.77 (t, J _β-Y = J _β-α = 18.9 Hz, P _β ).

UV (H ₂ O) λ _max 272 nm (ε 7444), λ _mi n 248 nm (ε 4451 ).

LC/MS (M+2H-3NH ₄ ⁺ ) : m/z : 468 rt : 16.10 min purity : 87 %.

Exemple 58 : Fixation de nucléosides puriques via l'utilisation d'un groupement protecteur

La protection du nucléoside a été réalisée avec un TIPS (tétra-isopropylsilyl ethers) comme groupe protecteur, selon Eur. J. Org. Chem. 2005, pp 5171- 83.

Le nucléoside est co-évaporé avec de la pyridine (x 3) et séché sous vide sur pastilles de KOH.

On ajoute du chlorure de tétra-isopropylsilyle (3.79 mmol, 1.02 eq.) à une solution du nucléoside (3.71 mmol, 1 eq.) dans de la pyridine (10 ml) et le mélange résultant est agité à température ambiante pendant 1 h30.

Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu huileux est dissous dans du chlorométhane (20ml) et la phase organique est lavée deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCθ ₃ , puis à la saumure. Après évaporation sous pression réduite, le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant dichlorométhane/méthanol 96/4).

Exemple 59 : Synthèse du PEG-O-bis(succinyl-2'dA)

2'dA-TIPS

La synthèse a été réalisée comme décrit à l'exemple 58 à partir de la 2 ¹ - désoxyadénosine (1 g, 3.71 mmol) et après purification, on a obtenu du 2'dA-TIPS sous forme d'un solide blanc (1.2Og, 65 %).

Rf (dichlorométhane/méthanol 96/4) : 0.45

RMN ¹ H (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 8.25 (s, 1 H, H ₈ ), 7.96 (s, 1 H, H ₂ ), 6.22 (t, J _v . 2a = Jv-2-b =2.4 Hz, 1 H, H ₁ ), 5.89 (s, 2H, NH ₂ ), 4.87 (m, 1 H, H ₃ ), 3.98 (m, 2H, 2H ₅ ), 3.82 (m, 1 H, H ₄ ), 2.60 (m, J? _a -r = J∞-v =2.4 Hz, 2H, H ₂ ), 0.962 (m, 28H, ((CH ₃ J ₂ CH) ₄ ).