Domaine de l'invention

[La présente demande concerne un procédé de préparation d'un échantillon peptidique à partir d'un échantillon biologique. Elle concerne aussi un procédé de détection et de quantification de protéines mettant en œuvre ledit procédé de préparation de l'échantillon peptidique. Elle concerne enfin l'utilisation de ces procédés pour la détection ou le suivi d'une condition ou d'une maladie.

Le domaine technique de l'invention est celui de l'analyse biochimique des protéines issues d'un échantillon biologique.

Etat de l'art

La détection et le suivi de l'évolution de maladies ou de conditions physiques particulières, telles que carences ou malnutrition, demandent la détection et la quantification de protéines spécifiques, dits « marqueurs cliniques protéiques», outils essentiels à la prévention, au diagnostic, au pronostic et aux choix thérapeutiques.

La détection des marqueurs cliniques protéiques dans un échantillon biologique complexe requiert, pour une analyse protéomique ou par spectrométrie de masse, une première étape de préparation d'un échantillon peptidique dont la qualité est primordiale pour permettre ensuite une analyse sensible et reproductible. En effet, l'analyse de ces milieux est soumise à des interférences dues à la présence de protéines très majoritaires et dans certain cas à la libération du contenu intracellulaire lors de la préparation de l'échantillon. C'est le cas notamment des produits sanguins dans lesquels l'hémoglobine, l'albumine ou les immunoglobulines sont très abondantes.

Les méthodes conventionnelles d'analyses de produits sanguins s'appliquent à des produits sous forme liquide ou solide, telle que par exemple du sang séché sur un buvard, cette dernière forme présentant en effet de nombreux avantages pratiques, analytiques, cliniques et financiers. A partir des échantillons solides, des méthodes d'extraction de petites molécules non protéiques (acides aminés, hormones stéroïdiennes, vitamines et médicaments) sont déjà connues et validées. Au contraire, l'analyse des marqueurs cliniques protéiques rencontre de nombreux problèmes analytiques du fait des interférences dues aux autres protéines très majoritaires, de la faible efficacité et reproductibilité des méthodes de préparation ou de digestion des protéines et de la présence possible d'impuretés dans le support solide.

Des progrès récents dans la spectrométrie de masse permettent une alternative intéressante à des procédés classique d'analyses cliniques déjà validés (immunodétection...). La différence de composition protéique entre un échantillon de sang solide et un échantillon de sérum ou de plasma, ainsi que la complexité de ces matrices rend actuellement l'analyse par spectrométrie de masse peu reproductible, peu sensible et peu compatible avec une utilisation clinique acceptable.

Il existe donc un besoin important de disposer d'un procédé reproductible, sensible, rapide et validé cliniquement de préparation d'échantillons peptidiques préalables à la détection et au suivi analytique de marqueurs cliniques protéiques, notamment par spectrométrie de masse.

Des procédés de préparation d'échantillons peptidiques préalables à une analyse sont décrits dans l'art antérieur. Ces procédés comprennent des étapes de dénaturation, élution, alkylation et digestion trypsique des protéines.

WO 2014/118474 décrit un procédé de détermination de la présence de la prolidase pour la détection du cancer colorectal, ce procédé comprend une étape de digestion enzymatique suivie d'une étape de nettoyage des protéines sur un support en phase solide HLB de Waters.

Yakundi et al. ( Journal of Pharmaceutical and Biomédical analysis, 56, 1057- 1063, 2011) cite un procédé destiné à quantifier la ranitidine dans un échantillon de sang séché, pour une application clinique. Ce procédé comprend une étape de nettoyage des protéines préalablement à une analyse par spectrométrie de masse, et ne comprend pas d'étape de digestion enzymatique.

Rosting et al. Ç American Chemical Society, 87, 7918-24, 2015) divulgue un procédé de détection d'une protéine modèle dans un échantillon de sang séché, comprenant une étape de digestion enzymatique suivie d'une pré concentration par extraction en phase solide (Solid-Phase Extraction, ou SPE), avant analyse par spectrométrie de masse. Description de l'invention

Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides, ce procédé comprenant successivement des étapes de dénaturation, réduction/alkylation, nettoyage des protéines par chromatographie sur un support solide comprenant au moins un polymère de polystyrène-divinyl benzène, puis digestion enzymatique.

Un procédé selon l'invention permet la détection reproductible d'un grand nombre de protéines marqueurs cliniques à partir d'un échantillon de faible volume, ce procédé peut être appliqué avec succès à un échantillon solide ou liquide, tel que du plasma, et est automatisable. Les analyses d'échantillons peptidiques par spectrométrie de masse présentent l'avantage d'une spécificité absolue dans la détection de protéines et sont considérées comme des méthodes de référence. Un procédé de préparation selon l'invention, suivi d'une analyse par un procédé comme la spéctrométrie de masse par exemple, permet de disposer de résultats statistiquement comparables aux tests validés cliniquement, comme par exemple les immunoessais.

Par rapport aux procédés de l'état de l'art, un procédé selon l'invention permet d'éliminer les interférences dues à la libération du contenu intracellulaire et à la présence de protéines majoritaires, permettant ainsi d'améliorer la sensibilité, la spécificité et les performances analytiques de l'analyse des composés.

Un procédé de préparation d'un échantillon peptidique selon l'invention est adapté pour l'analyse de tout type d'échantillon biologique, en particulier les échantillons sanguins, et plus particulièrement les échantillons sanguins solides, pour lesquels aucun procédé reproductible et validé cliniquement n'est disponible à ce jour. L'utilisation d'un support solide de type buvard est une méthode reconnue de collection du sang car non invasive (prélèvement au bout du doigt), facilement transportable (notamment par courrier postal) et facile à mettre en œuvre ; elle peut être réalisée par le sujet lui-même ou par une personne non qualifiée et est non dangereuse, car le prélèvement est décontaminé par le séchage. Un procédé selon l'invention mis en œuvre sur échantillon sur support solide permet une analyse à moindre coût, notamment pour le suivi longitudinal de sujets pour de multiples marqueurs. Une telle approche est prometteuse pour le suivi de populations dont l'accès aux laboratoires d'analyse est contraint et pour des développements futurs de télémédecine.

Selon un premier objet, la présente demande concerne un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique, comprenant les étapes successives suivantes : a) dénaturation des protéines présentes dans ledit échantillon, b) réduction et alkylation des protéines issues de l'étape a), c) nettoyage des protéines issues de l'étape b) par chromatographie en phase inverse sur support solide polymérique, ledit support solide comprenant au moins un polymère polystyrène-divinyl benzène, et d) digestion par une protéase des protéines issues de l'étape c).

Un procédé selon l'invention comprend au moins une étape de nettoyage des protéines dénaturées, réduites et alkylées et une étape de digestion enzymatique, ladite étape de nettoyage des protéines ayant lieu préalablement à l'étape de digestion enzymatique desdites protéines.

Par « échantillon biologique » on entend un échantillon comprenant des tissus et cellules issus du corps, humain ou animal, et leurs dérivés, et en particulier les produits suivants : sang, sérum, plasma, urines, selles, salive, crachats, biopsies, et toutes les sécrétions et liquides corporels.

Selon un premier aspect particulier du procédé selon l'invention, l'échantillon biologique est un produit sanguin sous forme liquide, choisi parmi : le sang total, le sérum et le plasma

Selon un deuxième aspect particulier du procédé selon l'invention, l'échantillon biologique est un produit sanguin sous forme solide, ou desséchée, choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma. Selon un aspect encore plus particulier, l'échantillon biologique est constitué par du sang total desséché déposé sur un support solide, aussi appelé Dried Blood Spot (DBS).

Typiquement, le prélèvement d'un tel échantillon consiste en un dépôt d'une goutte de sang d'un volume de 30 à 50 DL sur un support solide approprié suivi d'une étape de séchage. Le support solide de l'échantillon est ensuite facilement manipulable et peut notamment être envoyé par simple courier. Parmi les supports solides appropriés, on peut citer : les papiers buvard ou de recueil tels que le « papier Whatman 903 » ou le « papier Ahlstrom TFN/226 », sur lesquels du sang peut être déposé.

Par « polymère de polystyrène-divinyl benzène » on entend un polymère comprenant du polystyrène réticulé par le divinylbenzène. Le polystyrène, ou poly(l-phényléthylène), est obtenu par polymérisation du monomère styrène. Le divinylbenzène, ou DVB est un hydrocarbure aromatique de formule CioHio utilisé comme agent de réticulation.

Dans un procédé selon l'invention, un support solide pour le nettoyage de protéines comprend au moins un polymère de polystyrène-divinyl benzène associé éventuellement à un autre polymère ou à tout autre élément approprié

Le support solide de l'étape de chromatographie en phase inverse se caractérise par la présence de billes de polymère de polystyrène-divinyl benzène dont la taille est comprise entre 10 et 50 mm, de préférence entre 20 et 40 mm et de préférence de 30 m, d'une part, et des pores dont la taille est comprise entre 500 et 10.000 Ângstrom, et de préférence entre 2.000 et 4.000 Ângstrom, d'autre part.

Parmi les supports solides comprenant au moins un polymère de polystyrène- divinyl benzène utilisables dans un procédé selon l'invention, on peut citer notamment les cartouches RP-W® commercialisées par la société Agilent.

Lesdites cartouches RP-W® sont décrites pour une utilisation dans un procédé et une application très différente de celle du procédé selon l'invention. En effet, les procédés de l'état de l'art décrivent typiquement l'util isation de ces cartouches lors de la production d'anticorps recombinants, pour une étape de « dessalement », c'est-à-dire en particulier pour assurer l'élimination de la guanidine 6M nécessaire à la dénaturation des anticorps, préalablement à la digestion de ceux-ci par la trypsine.

Dans un procédé selon l'invention, chacune des étapes de dénaturation, réduction, alkylation et digestion enzymatique des protéines est réalisée au moyen de tout procédé bien connu de l'homme du métier, dans les conditions de tampon, de concentration, température et durée appropriées. De préférence, la dénaturation est réalisée grâce à l'addition d'un agent dénaturant les protéines, par exemple l'urée 8M, la réduction est réalisée grâce à l'addition d'un agent capable de réduire les ponts disulfures des protéines, par exemple le DTT, l'alkylation des cystéines libérées lors de la réduction est réalisée grâce à l'addition d'un agent alkylant, par exemple l'acide iodoacétique (IAA).

La digestion enzymatique des protéines est réalisée de préférence par l'addition d'au moins une protéase choisie parmi : la trypsine, l'endoprotéinase GluC et l'endoprotéinase LysC. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, la digestion enzymatique est réalisée pendant une durée supérieure à 2 heures, de préférence supérieure ou égale à 10 heures, de préférence supérieure ou égale à 14 heures, de préférence égale à 14 heures.

Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, la digestion enzymatique est réalisée en présence d'un ratio entre la quantité d'enzyme présente et la quantité de protéine substrat compris entre 1/10 et 1/200 et de préférence compris entre 1/50 et 1/100. L'homme du métier spécialiste du domaine est capable d'identifier et calculer précisément ledit ratio.

Selon un autre aspect particulier dudit premier objet, la présente demande concerne un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon sanguin sous forme solide ou desséchée, ledit procédé comprenant une étape d'extraction des protéines dudit échantillon sanguin solide préalablement aux étapes de dénaturation, réduction et alkylation, nettoyage des protéines et digestion par une protease.

L'extraction des protéines est réalisée par tout procédé d'extraction connu d'un homme du métier, en particulier par la mise en présence de l'échantillon avec du bicarbonate d'ammonium à température ambiante, éventuellement en présence d'ovalbumine.

Selon un deuxième objet, la présente demande concerne un procédé de détection de la présence d'au moins une protéine considérée comme un marqueur clinique dans un échantillon biologique, ledit procédé de détection comprenant un procédé in vitro de préparation d'un échantillon peptidique, selon l'invention, suivi d'une étape de détection de la présence d'au moins une protéine dans ledit échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente demande concerne un procédé de détection et de quantification d'au moins une protéine dans un échantillon biologique, ledit procédé de détection et de quantification comprenant un procédé in vitro de préparation d'un échantillon peptidique, selon l'invention, suivi d'une étape de détection et de quantification d'au moins une protéine dans ledit échantillon.

La détection et/ou la quantification de ladite au moins une protéine est réalisée par tout moyen technique connu, de préférence par spectrométrie de masse, plus préférentiellement par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide, ou Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (LC- MS). Ladite étape de détection et/ou de quantification peut être mise en œuvre pour une, deux ou plusieurs protéines. Ladite spectrométrie de masse peut être réalisée sous une forme multiplexe.

La détection et la quantification de protéines dans un échantillon biologique complexe par LC-MS comprend typiquement la préparation d'un échantillon peptidique, puis la séparation par chromatographie en phase liquide dudit échantillon peptidique, suivie par l'analyse par spectrométrie de masse, avec l'identification suivie éventuellement de la quantification de protéines, puis l'analyse statistique des résultats.

La détection et/ou la quantification de protéines est réalisée en utilisant au moins un standard consistant en un peptide marqué ou non marqué, permettant de détecter la protéine spécifique correspondante. Lesdits standards sont bien connus de l'homme du métier qui peut aisément les choisir parmi les standards commerciaux disponibles, selon la nature de la ou des protéines d'intérêt.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet un procédé de détection, suivie éventuellement de la quantification, d'au moins une protéine choisie dans le groupe constitué par les protéines suivantes : afamine, alpha-l-antichymotrypsine, alpha-lB-glycoprotéine (A1BG), alpha 1 glycoprotéine acide, albumine (ALBU), alpha-2-HS-glycoprotéine, alpha-2- antiplasmine, alpha-2-macroglobuline (A2MG), antithrombine-3 (ANT3), apolipoprotéine B100 (Apo B100), apolipoprotéine C2 (Apo C2), apolipoprotéine D, apolipoprotéine E (Apo E), apolipoprotéine M, apolipoprotéine (a), apolipoprotéine al (Apo Al), Apolipoprotéine A2 (Apo A2), apolipoprotéine a4, bêta-2-glycoprotéine 1, bêta-2-microglobuline (B2M), bêta-Ala-his-dipeptidase, protéine liant la C4b (chaîne alpha), CD5 antigène- like, CDNA-FU53327, céruloplasmine (CERU), cholinestérase, clustérine, facteur de coagulation X (CF-X), facteur de coagulation XI, facteur de coagulation XII, complément Clq sous-unité de sous-composante B, sous- unité C du complément Clq, complément Clr sous-composant, complément C1S sous-composant, complément C2 (C2), complément C3 (C3), complément C4-B (C4B), complément C5, composant de complément C8 (chaîne bêta), complément composante C9, facteur de complément B, facteur de complément D, facteur de complément I, Cystatine C (CysC), globuline liant les corticoïdes, protéine C réactive (CRP), fibrinogène (chaîne alpha) (FIBA), fibrinogène (chaîne beta) (FIBB), fibronectine, fibuline-1, gelsoline, haptoglobine, sous- unité d'hémoglobine alpha, hémopexine, héparine cofacteur 2, facteur de croissance analogue à l'insuline liant la sous-unité acide labile, facteur de croissance analogue à l'insuline liant la protéine 3, Haptoglobuline (HPT), inhibiteur de l'inter-alpha-trypsine chaîne lourde Hl, inhibiteur de l'inter-alpha- trypsine chaîne lourde H2, Insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFB3), protéine liant les lipopolysaccharides, lumican, Neuropiline-2, orosomucoïde (ORM), PEDF, Plasminogène (PLMN), Protéine_AMBP, prothrombine, protéine 4 liant le rétinal, serotransferrine (TRANSF), protéine sérum amyloïde A-4, globuline liant la thyroxine, transthyrétine (pré-albumine)(TTHY), vasorine, protéine liant la vitamine D, protéine C dépendante de la vitamine K, protéine dépendante de la vitamine K S, protéine 4 liant le rétinol (Retinol binding protein 4, RET4).

Selon un mode de réalisation plus particulier, la présente invention a pour objet un procédé de détection, suivie éventuellement de la quantification, d'une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, quinze, vingt, vingt-cinq, trente, trente-cinq, quarante ou plus de quarante protéines choisies dans le groupe défini ci-dessus.

Selon un troisième objet, la présente demande concerne un kit convenant pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique selon l'invention, ledit kit comprenant au moins :

- des réactifs convenant pour la dénaturation des protéines,

- des réactifs convenant pour la réduction des ponts disulfure et éventuellement des agents alkylants, - des réactifs convenant pour la digestion enzymatique des protéines, et

- des réactifs convenant pour la chromatographie en phase inverse sur un support solide, ledit support solide comprenant au moins un polymère choisi dans la famille des polymères de polystyrène-divinyl benzene.

Lesdits réactifs sont choisis parmi les réactifs existants, bien connus de l'homme du métier.

Selon un quatrième objet, la présente demande concerne l'utilisation d'un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, la présente demande concerne l'utilisation d'un procédé de détection et potentiellement de quantification d'au moins une protéine dans un échantillon biologique, selon l'invention.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique, selon l'invention, et/ou l'utilisation d'un procédé de détection et potentiellement de quantification selon l'invention, pour la détection et potentiellement de quantification d'au moins une protéine choisie parmi le groupe constitué par les protéines suivantes : afamine, alpha- 1-antichymotrypsine, alpha-lB-glycoprotéine (A1BG), alpha 1 glycoprotéine acide, albumine (ALBU), alpha-2-HS-glycoprotéine, alpha-2-antiplasmine, alpha-2-macroglobuline (A2MG), antithrombine-3 (ANT3), apolipoprotéine B100 (Apo B100), apolipoprotéine C2 (Apo C2), apolipoprotéine D, apolipoprotéine E (Apo E), apolipoprotéine M, apolipoprotéine (a), apolipoprotéine al (Apo Al), Apolipoprotéine A2 (Apo A2), apolipoprotéine a4, bêta-2-glycoprotéine 1, bêta-2-microglobuline (B2M), bêta-Ala-his- dipeptidase, protéine liant la C4b (chaîne alpha), CD5 antigène-like, cDNA- FU53327, céruloplasmine (CERU), cholinestérase, clustérine, facteur de coagulation X (CF-X), facteur de coagulation XI, facteur de coagulation XII, complément Clq sous-unité de sous-composante B, sous-unité C du complément Clq, complément Clr sous-composant, complément C1S sous- composant, complément C2 (C2), complément C3 (C3), complément C4-B (C4B), complément C5, composant de complément C8 (chaîne bêta), complément composante C9, facteur de complément B, facteur de complément D, facteur de complément I, Cystatine C (CysC), globuline liant les corticoïdes, protéine C réactive (CRP), fibrinogène (chaîne alpha) (FIBA), fibrinogène (chaîne beta) (FIBB), fibronectine, fibuline-1, gelsoline, haptoglobine, sous- unité d'hémoglobine alpha, hémopexine, héparine cofacteur 2, facteur de croissance analogue à l'insuline liant la sous-unité acide labile, facteur de croissance analogue à l'insuline liant la protéine 3, Haptoglobuline (HPT), inhibiteur de l'inter-alpha-trypsine chaîne lourde Hl, inhibiteur de l'inter-alpha- trypsine chaîne lourde H2, Insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFB3), protéine liant les lipopolysaccharides, lumican, Neuropiline-2, orosomucoïde (ORM), PEDF, Plasminogène (PLMN), Protéine_AMBP, prothrombine, protéine 4 liant le rétinal, serotransferrine (TRANSF), protéine sérum amyloïde A-4, globuline liant la thyroxine, transthyrétine (pré-albumine)(TTHY), vasorine, protéine liant la vitamine D, protéine C dépendante de la vitamine K, protéine dépendante de la vitamine K S, protéine 4 liant le rétinol (Retinol binding protein 4, RET4).

Selon un mode de réalisation plus particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique, selon l'invention, et/ou l'utilisation d'un procédé de détection et potentiellement de quantification selon l'invention, pour la détection et potentiellement de quantification d'une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, quinze, vingt, vingt-cinq, trente, trente-cinq, quarante ou plus de quarante protéines choisies dans le groupe défini ci- dessus.

Selon un cinquième objet, la présente demande concerne l'utilisation d'un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique selon l'invention pour la détection et/ou le suivi d'une condition ou d'une maladie particulière choisie parmi :

- une neuro-dégénérescence, notamment la maladie d'Alzheimer,

- une maladie neurologique ou psychiatrique, et notamment la sclérose en plaques et l'autisme,

- un état de carence, infectieux, d'inflammation ou de malnutrition,

- une maladie chronique ou évolutive, notamment un cancer, une hépatite ou une maladie métabolique. La détection et/ou le suivi d'une maladie ou d'une condition particulière peuvent être réalisés par la détection et/ou la quantification d'au moins une protéine considérée comme un marqueur clinique, éventuellement associée à la détection et/ou la quantification d'au moins un marqueur clinique non protéique.

Selon un aspect particulier, la présente demande a pour objet l'utilisation d'un procédé pour la préparation in vitro d'un échantillon de peptides à partir d'un échantillon biologique, selon l'invention, pour la détection et/ou le suivi de l'état de santé, nutritionnel et de fragilité et d'un sujet, en particulier un sujet âgé. Par sujet âgé on entend un sujet de 75 ans ou plus, plus particulièrement un sujet de 85 ans ou plus. Plus particulièrement, une utilisation selon l'invention comprend la détection et/ou la quantification d'une ou plusieurs protéines choisies parmi : l'albumine, l'alpha 1 glycoprotéine acide, la transthyrétine et la CRP (Protéine C Réactive).

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de mise en œuvre nullement limitatif, et des dessins annexes.

[Fig. l] représente schématiquement un mode de réalisation d'un procédé de préparation d'un échantillon peptidique selon l'invention et à partir d'un échantillon DBS (Fig. IA) et un mode de réalisation d'un procédé de préparation d'un échantillon peptidique selon l'état de l'art à partir de plasma (Fig. IB).

[Fig. 2] représente un histogramme montrant les résultats comparés de l'analyse LC-MS de 26 protéines différentes, réalisées sur des échantillons préparés selon trois protocoles différents : a) procédé selon l'invention appliqué à un échantillon de sang séché (« DBS RPW »), b) procédé selon l'invention appliqué à un échantillon de plasma (« plasma »), c) procédé de préparation des échantillons DBS selon l'état de l'art (« standard DBS préparation »). Pour chacune des protéines, les valeurs des aires obtenues lors de l'analyse par spectrométrie de masse dans les conditions « DBS RPW » et « plasma » sont divisées, respectivement, par les valeurs correspondantes des aires obtenues avec le procédé standard de préparation de l'échantillon. En ordonnées, LOG (aire/aire après préparation DBS standard) est représenté, en abscisse, les résultats pour chacune des 26 protéines sont représentés, avec « DBS RPW » en histogramme clair et « plasma » en histogramme foncé.

[Fig.3] représente schématiquement la comparaison de la quantification, dans

95 échantillons de plasma, de deux protéines sériques : la protéine C réactive (CRP) (Fig. 3A) et la serotransferrine (TRANSF) (Fig. 3B). Pour chacune des protéines, le résultat de la quantification par immunoessai validé cliniquement est exprimé sur l'axe des abscisses (en mg/L pour CRP et g/L pour TRANSF) et le résultat de la quantification par spectrométrie de masse sur des échantillons préparés par un procédé selon l'invention est exprimé sur l'axe des ordonnées (unités arbitraires).

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour limiter sa portée.

Exemple

EXEMPLE 1 : Préparation d'un échantillon peptidique à partir d'un échantillon de sang séché (DBS) et analyse comparative par LC-MS.

L'efficacité du procédé selon l'invention a été évaluée en détectant et quantifiant 26 protéines en LC/MS, en comparant respectivement l'analyse d'un échantillon DBS traité par un procédé selon l'invention (« DBS-RPW ») et l'analyse d'un échantillon de plasma traité par un procédé selon l'état de l'art (« plasma ») à une analyse effectuée directement à partir d'un échantillon DBS (« standard DBS »). Les étapes du procédé selon l'invention sont schématisées en Figure IA, les étapes du procédé de préparation d'un échantillon à partir de plasma et selon un procédé de l'état de l'art sont schématisées en Figure I B. L'expérience a été réalisée en duplicat et chaque analyse LC/MS a été réalisée en double. Les 26 protéines sont les suivantes : A1 BG, A2MG, ANT3, Apo Al, Apo A2, Apo B100, Apo C2, Apo E, B2M, CERU, CF_X, C2, C3, C4B, CRP, CysC, FIBA, H PT, FIBB, IGFB3, PLMN, ORM, RET4, TRANSF, TTHY, ALBU.

Le procédé de préparation à partir d'un échantillon DBS selon l'invention « DBS-RPW » est réalisé comme suit. Pour l'extraction des protéines, un « punch DBS » est réalisé par poinçonnage du support solide (papier buvard type 226) contenant l'échantillon. Ledit punch est transféré dans une plaque

96 puits, puis les protéines sont extraites en ajoutant 200 m\- d'ammonium bicarbonate à 50 mM, puis en agitant 30 minutes à l'aide d'un agitateur de paillasse à 350 rpm sur un appareil Eppendorf® Thermomixer Compact. L'échantillon est ensuite dénaturé par ajout de 200 m\- d'urée 8M et une nouvelle agitation pendant 10 minutes. Les ponts disulfures des protéines de l'échantillon sont ensuite réduits par ajout de 21 m\- de DTT à 200 mM dans du tris 1 M pH 8.5, et de 12 pL tris 1 M pH 8.5, et agitation une heure à 37°C sous agitation à 350 rpm sur un Eppendorf® Thermomixer Compact. Les cystéines libérées sont ensuite alkylées par ajout de 18 m\- d'IAA à 1 M, 6 pL de Tris 1 M pH 10, et nouvelle agitation 30 minutes à 37°C. L'étape d'alkylation est stoppée par ajout de 20 m\- de DTT à 200 mM. L'échantillon est ensuite acidifié par l'ajout de 10 m\- d'acide formique avant transfert des 210 m\- du surnageant dans deux nouveaux puits.

L'étape de nettoyage de l'échantillon est ensuite réalisée sur des cartouches RP-W® commercialisées par la société Agilent. Les cartouches sont lavées et conditionnées avec 100 pL à 300 pL/min d'une solution d'acétonitrile (70%)/TFA (0,l%)/eau (29,9%), et sont équilibrées avec 50 pL à 10 pL/min d'une solution de 0,1% acide formique. L'échantillon est chargé sur cartouche RP-W (Cat# G5496-60086) à 5 pL/min. La phase RP-W contenue dans la cartouche est lavée avec 50 m\- à 10 mΰ/Ghίh d'une solution de 0,1% TFA puis l'échantillon nettoyé est élué de la cartouche avec 20 m\- à 5 pL/min d'une solution d'acétonitrile (70%)/acide formique (0,l%)/eau (29,9%). L'élution est mise à sec (Speedvac™). L'échantillon sec est resuspendu dans 37,4 pL de Tris 20 mM pH 8,5 ; 5,6 pg de trypsine/LysC sont ajoutés pour réaliser la digestion trypsique. Cette réaction dure 14 heures à 37°C sous agitation (350 rpm sur un Eppendorf® Thermomixer Compact). La réaction de digestion est arrêtée par ajout de 3 m\- d'acide formique. La plaque de 96 puits est filmée et les échantillons sont prêts pour injection sur le système LC/MS.

La préparation des échantillons "DBS standard" est réalisée comme suit : une ou deux gouttes de sang capillaire, obtenues après piqûre au bout du doigt par une lancette, sont déposées sur chaque spot de DBS. Il est possible également de déposer avec l'usage d'une pipette 70 pL de sang total veineux collecté dans un tube sur un spot DBS. Après dépôt, les cartes sont mises à sécher pendant 2 heures à température ambiante. Elles sont mises dans un sachet plastique individuel et peuvent être conservées selon les usages à température ambiante, à 4°C ou congelées (-20°C ou -80°C). Avant analyse, les cartes sont remises à température ambiante. Un poinçon (« punch ») de 6 mm de diamètre est ensuite prélevé pour chaque spot et transféré dans un tube Eppendorf LoBind de 2 ml.

La préparation des échantillons "plasma" est réalisée comme suit : le procédé est schématisé en Figure IB, il représente un procédé typique connu dans l'état de l'art et comprend les étapes suivantes : à partir de 2 pL de plasma liquide ou déposé sur un support « papier Whatman 903 » ou le « papier Ahlstrom FN/226 », les protéines sont dénaturées et réduites, puis subissent une alkylation, une digestion enzymatique (en présence de trypsine/LysC pendant 14h à 37°C), puis une étape de nettoyage des peptides obtenus réalisée sur une colonne type ZORBAX Eclipse Plus C18, suivie de l'analyse par LC-MS.

Les résultats sont illustrés dans la Figure 2. On remarque pour la plupart des protéines une valeur positive. Ceci indique une plus grande quantité détectable (meilleure sensibilité) par rapport au procédé standard et on constate également une bonne correspondance entre valeurs plasma standard et DBS RPW.

Globalement, les intensités en spectrométrie de masse retrouvées après un traitement de l'échantillon DBS par un procédé selon l'invention (DBS RPW) sont 19 fois plus intenses que celles obtenues directement après DBS standard. Ces intensités correspondent pour la majorité des protéines à celles obtenues sur un échantillon de plasma préparé par un procédé standard.

Pour valider le procédé de préparation d'un échantillon peptidique selon l'invention et définir ses performances, l'étude suivante a été faite : Dix prélèvements indépendants prélevés chez des patients sur DBS (procédé DBS- RPW selon l'invention) ont été utilisés pour l'étude. Pour chaque patient, deux punchs DBS ont été analysés indépendamment et en duplicat. Les coefficients de variation (CV) de 91 peptides, correspondant à 76 protéines, mesurés donc 2 fois indépendamment et en duplicat ont été calculés. Ceci permet d'estimer la variabilité de tout le processus d'analyse des DBS (pré-analytique et analytique). La médiane des CVs obtenus sur tous les peptides est de 9,3%. La gamme des CVs s'étend de 2 à 52%. Par comparaison, lors de la même étude, la médiane des CV globaux obtenus cette fois ci sur le plasma prélevé chez les patients en même temps que le DBS était de 6,7% avec une gamme des CVs qui s'étendait de 2 à 48%. Pour valider l'intérêt clinique des mesures une corrélation entre les valeurs obtenues dans le plasma (celles qui sont donc utilisées pour la clinique) et celles obtenues dans les DBS a été calculées. 35 peptides présentent une corrélation très forte entre « plasma standard » et « DBS-RPW » (coefficient de corrélation >0,8), 32 une corrélation intermédiaire (entre 0,6 et 0,8) et 24 une faible corrélation (<0.6).

Les plasmas de 95 patients différents, recrutés par ordre chronologique et sans pathologie particulière ont été analysés, d'une part, par spectrométrie de masse sur des échantillons préparés par un procédé selon l'invention et en parallèle par immunoessai, sur un automate COBAS 6000 (Roche Diagnostic) sur le site de Biochimie de l'hôpital de Montpellier. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3, avec l'analyse de la CRP (figure 3A) et de la serotransferrine (figure 3B) respectivement. Les résultats obtenus par les deux méthodes ont été comparés par le logiciel R. La comparaison montre une corrélation statistiquement significative pour chacune des deux protéines quantifiées.

Les résultats ainsi obtenus permettent donc de valider l'intérêt clinique du procédé d'analyse comprenant un procédé de préparation d'un échantillon peptidique selon l'invention.