Die Herstellung von Glykoproteinen durch Kultivierung eukaryontischer Zellen erfolgt im aligemeinen in handelsüblichen Kulturmedien. Dabei kann der Zusatz bestimmter Substrate zu dem Kulturmedium notwendig sein, um eine gewünschte Glykosilierung des Polypeptids zu erreichen. Dies ist fur ein Batch-Verfahren in kleinen Volumina (< 1000 moi), einer niedrigen Startzelldichte (5 x 104 Zellen/ml) und einer kurzen Kultivierungsdauer (48 h) beispielhaft an einem humanen IgM-Antikörper in der japanischen Offenlegungsschrift H6-292 592 beschrieben. Dort wird bei der rekom- binanten Herstellung von Antikörpern in Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, anstelle der üblicherweise verwendeten Glucose ein manderez Zucker, beispielsweise Fructose, Mannose, Galactose, N-Acetylglucosamin, Ribose, Fucose, N-Acetylgalactosamin oder dergleichen verwendet. Weiterhin wird ein mehrstufiges Kultivierungsverfahren offenbart, bei dem die Zellen zunächst in einem glucosehaltigen Medium kultiviert werden, welches anschließend durch ein einen anderen Zucker enthaltendes Medium ausgetauscht wird.

Das in der japanischen Offenlegungsschrift H6-29592 beschriebene Verfahren hat jedoch schwerwiegende Nachteile. Durch den Verbrauch des Zuckers während der Zellkultivierung verandert sich standing dessen

Konzentration im Kulturmedium, so daß ein gleichbleibend hoher Glykosilie- rungsgrad der Polypeptide nicht gewährleistet ist. Das Batch-Verfahren ist außerdem ungeeignet, wenn fOr eine gewünschte Glykosilierung eine gleichbleibende Substratkonzentration erforderlich ist, da sich die Anfangs- konzentrationen der Substrate durch den Zellstoffwechsel standing ver- ringern. Weiterhin musse die fOr hohe Zelidichten und einen gleichbleibend hohen Glykosilierungsgrad erforderlichen hohen Zuckerkonzentrationen bereits zu Anfang der Fermentation vorgelegt werden, wodurch jedoch das Wachstum der Zellen gehemmt und somit die erreichbare Zelidichte begrenzt wird. Eine wirtschaftliche Produktion hochglykosilierter Polypeptide mit dem in der oben genannten japanischen Offenlegungsschrift beschriebenen Verfahren ist daher nicht möglich.

Die Kultivierung eukaryontischer Zellen durch ein Batch-Verfahren mit Zufütterung (Fed-Batch), bei dem während der Kultivierung Nährlösung zugegeben wird, ist bekannt. Bei dieser Art von Verfahren kann durch geeignete Zufütterung eine höhere Zelidichte und eine langer Kultivierungs- dauer erzielt werden. Ein Beispiel ist die kontinuierliche und limitierte Zufütterung der essentiellen Aminosäure Glutamin, die zu einem verbes- serten Zellwachstum führt (Ljunggren et al. Biotech. Lett. 12 (1990), 705- 710). Die Zielsetzung der Zufütterung von Glutamin ist die Reduzierung der Ammoniumbildung, da Ammonium toxisch fur tierische Zellen ist (Mirabet et al., Biotechnol. Bioeng. 56 (1997), 530-537).

Gawlitzek et al. (Biotechnol. Bioeng. 57 (1998), 518-528) beschreiben, dal3 durch erhöhte Konzentrationen von Ammoniumionen oder Glucosamin im Medium von kultivierten eukaryontischen BHK-21 Zellen eine Zunahme der Komplexität von N-gebundenen Kohlenhydratstrukturen in rekombinanten Glykoproteinen gefunden wird, die von den kultivierten Zellen sekretiert werden. Dieser Befund steht jedoch im Widerspruch zu Ergebnissen von Borys et al. (Biotechnol. Bioeng. 43 (1994), 505-514) oder Andersen und Goochee (Biotechnol. Bioeng. 47 (1995), 96-105), wo eine Hemmung der

Glykosilierung durch erhöhte Ammoniumkonzentrationen im Kulturmedium festgestellt wurden. Somit wird deutlich, daß die Kontrolle der Ammonium- bildung in der Kultur nur ein isolierter Aspekt und daher nicht ausreichend fOr die wirtschaftliche Herstellung von Proteinen mit geeigneter Glykosilie- rung ist.

Der Glykosilierungsgrad von Polypeptiden kann einen großen Einfluß auf deren biologische Aktivität haben. Dies wird im folgenden Beispiel von Erythropoietin (EPO) erläutert. EPO ist ein humanes Glycoprotein, welches die Produktion von roten Blutzellen stimuliert. EPO kommt im Blutplasma von gesunden Personen nur in sehr geringen Konzentrationen vor, so da (3 eine Bereitstellung in größeren Mengen auf diese Weise nicht möglich ist.

EP-B-0 148 605 und EP-B-0 205 564 beschreiben die Herstellung von rekombinantem humanen EPO in CHO-Zellen. Das in EP-B-0 148 605 beschriebene EPO weist ein höheres Molekulargewicht als urinaires EPO und keine O-Glykosilierung auf. Das in EP-B-0 205 564 beschriebene EPO aus CHO-Zellen ist mittlerweile in gro#en Mengen und in reiner Form verfügbar.

Weiterhin ist die Gewinnung von humanem EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anomie bekannt (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564).

Rekombinantes und urinaires EPO wird als Gemisch verschiedener Isoformen gewonnen, von denen bekannt ist, da (3 sie sich in ihrem Sialylierungsgrad unterscheiden. Diese EPO-Isoformen weisen unterschiedliche isoelektrische Punkte auf und können durch isoelektrische Fokussierung bzw. Kapillarelek- trophorese aufgetrennt werden (siehe Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196 ; Nieto et al., Anal. Commun. 33 (1996), 425-427 ; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471 ; Bietot et al., J. Chromatogr.

759 (1997), 177-184 ; Watson et al. Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393).

Die Isoformen mit der höchsten Anzahl von Sialinsäuren weisen die höchste spezifische Aktivität auf, während die mit der niedrigsten Anzahl die

geringste Aktivität besitzen (siehe z. B. Imai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990), 457-462 ; EP-A-0 428 267).

Takeuchi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822) beschreiben einen Zusammenhang der biologischen Aktivität mit dem Sialinsäuregehalt und dem Verhältnis von bi-und tetraantennären Kohlenhy- dratstrukturen. Takeuchi et al. kommen weiterhin zur Schlußfoigerung, daß die in den EPO-Kohlenhydratstrukturen vorhandenen N-Acetyl-Lactosamin- Disaccharideinheiten nicht mit der biologischen Aktivität korrelieren.

Fukuda et al. (Blood 73 (1989), 84-89) befassen sich mit der Geschwindig- keit der Elimination von EPO aus dem Blutkreislauf, die wesentlich zur biologischen Aktivitat beitragt, und kommen zu dem Schluß, daß EPO mit einer grö#eren Anzahl an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten schneller aus dem Kreislauf entfernt wird als EPO ohne Lactosamin-Einheiten. Morimoto et al.

(Glycoconjugate J. 13 (1996), 1093-1120) beschreiben die Auftrennung von EPO-Isoformen mittels Mono-Q-Chromatographie, so dafl die einzelnen Fraktionen jeweils aus nur noch wenigen Isoformen bestehen. Die mit diesen Fraktionen durchgeführten Untersuchungen zeigen eine Gleichver- teilung aller Strukturen in allen Fraktionen. Es wird keine Korrelation des Gehalts an bi-oder triantennären Strukturen oder des Gehalts an N-Acetyl- Lactosamin-Einheiten mit der spezifischen Aktivität gefunden.

Somit geht aus dem genannten Stand der Technik hervor, daß eine generelle Korrelation der biologischen Aktivität mit der Zuckerstruktur besteht, insbesondere im Hinblick auf den Gehalt an Sialinsäuren.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch eine kontinuierliche und bedarfsgerechte Zufütterung von kohlehydrathaltigen Substraten während einer Hochzelidichte-Fermentation oder/und durch Verwendung eines Gemisches von mindestens 2 Kohlenhydraten während der Kultivierung eine

hohe Ausbeute an gewünschtem Protein, beispielweise EPO, mit hohem Glykosilierungsgrad erhalten wird.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Gewinnung eines glykosilierten Polypeptids aus eukaryontischen Zellen, wobei die eukaryontischen Zellen in einem geeigneten Medium kultiviert und das gewünschte Polypeptid aus den Zellen oder/und dem Kulturüberstand gewonnen wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Kulturmedium eine Mischung von mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 3 Kohlenhydraten zugegeben wird.

Die Kohlenhydrate werden vorzugsweise aus Mono-un Disacchariden wie etwa Glucose, Glucosamin, Ribose, Fructose, Galactose, Mannose, Saccharaose, Lactose, Mannose-1-Phosphat, Mannose-1-Sulfat und Mannose-6-Sulfat ausgewähit. Beispielsweise sind Nährmedien geeignet, die Glucose oder/und Mannose oder/und Galactose enthalten. Besonders gute Ergebnisse wurden mit Nährmedien erzielt, die eine Mischung von Glucose, Galactose und Mannose, beispielsweise im Masseverhältnis von 1 : (0,5- 3) : (1-5) und insbesondere von 1 : (0,7-2,4) : (1,8-4,0) enthalten, wobei die Kohlenhydrate jeweils besonders bevorzugt in der D (+)-Form eingesetzt werden. Die Gesamtkonzentration aller Zucker iiegt während der Fermenta- tion vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10 9/l, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2 bis 6 9/l Kulturmedium. Vorzugsweise erfolgt die Zugabe der Kohlenhydratmischung abhängig vom jeweiligen Bedarf der Zellen wie im folgenden weiter ausgeführt wird.

Ein zweiter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines glykosilierten Polypeptids aus eukaryontischen Zellen, wobei die eukaryonti- schen Zellen in einem geeignetem Medium kultiviert und das gewünschte Polypeptid aus den Zellen oder/und dem Kulturüberstand gewonnen wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß während der Kultivierung eine kontrollierte und bedarfsgerechte Zugabe von Nährstoffen,

umfassend mindestens eine fOr die jeweils kultivierte Zellinie essentielle Aminosäure oder/und mindestens ein Kohlenhydrat, abhängig vom jeweiligen Bedarf der Zellen erfolgt.

Um eine bedarfsgerechte Zugabe von Nährstoffen zu ermöglichen, wird kontinuierlich oder in geeigneten Zeitintervallen, z. B. mindestens einmal täglich, die Konzentration von Parametern bestimmt, die in Korrelation zum Nahrstoffbedarf der Zellen stehen und deren Verbrauchsraten ermittelt. Auf these Weise konnen die fOr den Bedarf der Zellen benotigten Nahrstoffe quantitativ oder/und qualitativ ermittelt und in entsprechender Zusammen- setzung bzw. Menge dem Kulturmedium zugefuhrt werden. Souche Parameter konnen Nahrstoffe oder Stoffwechselprodukte der Zellen sein, wie etwa die Glutamin-, die Ammonium-, die Glucose-oder/und die Lactatkonzentration, insbesondere die Glutamin-Konzentration.

Aufgrund der kontrollierten und bedarfsgerechten Zugabe von Nahrstoffen kann selbst bei einer Hochzelldichtefermention (Zelldichte bei der Ernte > 10 # 105 Zellen/ml und vorzugsweise > 20 x 105 Zellen/ml) in Großfer- mentern (Volumen > 1 I, z. B. 50 bis 10 000 I) eine deutlich verbesserte Glykosilierung erhalten werden.

Die gemä# diesem Aspekt der Erfindung zugegebenen Nährstoffe umfassen essentielle Aminosäuren, z. B. Glutamin oder/und Tryptophan, oder/und Kohlenhydrate, sowie vorzugsweise weiterhin nichtessentielle Aminosäuren, Vitamine, Spurenelemente, Salzeoder/und Wachstumsfaktoren, z. B. Insulin.

Vorzugsweise enthalten die Nährstoffe mindestens eine essentielle Aminosäure und mindestens ein Kohlenhydrat. Diese Nährstoffe werden vorzugsweise in gelöstem Zustand der Fermentationskultur zudosiert. Die Nährstoffe enthalten vorzugsweise zumindest Glutamin und Kohlenhydrate, insbesondere eine Mischung aus mindestens 2 Kohlenhydraten wie zuvor genannt. Besonders bevorzugt wird eine Mischung von Glucose, Galactose und Mannose eingesetzt. Weiterhin ist bevorzugt, daß die Zugabe der

Nahrstoffe iiber die gesamte Wachstumsphase der Zellen bedarfsgerecht, d. h. abhängig von der im Kulturmedium gemessenen Konzentration der ausgewähiten Parameter erfolgt.

Das Mengenverhältnis von Glutamin zu Kohlenhydraten in der Nährstoff- 16sung wird vorzugsweise so gewählt, da# es dem Verbrauchsverhältnis im Fermenter im wesentlichen entspricht. Auf diese Weise kann eine weitge- hend gleichbleibende Konzentration einzelner Substrate im Fermenter erreicht werden. Vorzugsweise wird die Konzentration von Glutamin auf einem Wert gehalten, der < 150 mg/l im Kulturmedium ist und die Entstehung einer Ammoniumkonzentration 2 2,3 mmol/l im Kulturmedium verhindert. Die Gesamtkonzentration der Zucker iiegt während der Fermentation-wie bereits ausgeführt-vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10 9/l, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2 bis 6 g/l Kulturmedium.

Die verwendete Nährstofflösung enthält ein Masseverhältnis von Glutamin zu Zuckern, das vorzugsweise im Bereich von 1 : 3 bis 20 und besonders bevorzugt von 1 : 5 bis 15, bezogen auf die gesamten Zucker, liegt. Bei Verwendung einer Nährstofflösung, die Glutamin sowie die drei Zucker Glucose, Galactose und Mannose enthält, liegt das Masseverhältnis von Glutamin zu den Zuckern vorzugsweise bei 1 : (1 bis 3) : (1 bis 5) : (2 bis 8) und besonders bevorzugt bei 1 : (1,5 bis 2,2) : (1,5 bis 3,6) : (4 bis 6).

Das erfindungsgem5geVerfahren istgrunds6tzlichzur Herstellung beliebiger glykosilierter Polypeptide geeignet. Bevorzugt sind jedoch Polypeptide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste tragen, da durch das erfindungsgemä#e Verfahren besonders der Sialylierungsgrad der Polypeptide erhöht werden kann. Weiterhin kann auch die Antennärität beeinflußt werden.

Das erfindungsgemä#e Verfahren ist besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Polypeptiden geeignet, da deren biologische

Aktivität und somit auch deren pharmazeutische Wirksamkeit von der Glykosilierung und insbesondere vom Sialylierungsgrad oder/und von der Antennärität abhängt. Beispielsweise können die glykosilierten Polypeptide ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus physiologisch aktiven Glykoproteinen wie etwa Lymphokinen, Cytokinen, Immunglobulinen und Hormonen, z. B. EPO, Thrombopoietin (TPO), G-CSF, GM-CSF, Interleukinen, Interferonen, Blutgerinnungsfaktoren und Gewebsplasminogenaktivatoren.

Die Polypeptide konnen naturliche humane Polypeptide oder rekombinante Muteine soicher humanen Polypeptide sein. Besonders bevorzugt ist das glykosilierte Polypeptid EPO.

Die zur Kultivierung verwendeten Zellen können grundsätzlich beliebige eukaryontische Zellen sein, beispielweise Hefezellen oder Insektenzellen.

Vorzugsweise sind die eukaryontischen Zellen jedoch Saugerzellen, z. B. vom Hamster abgeleitete Zellen wie CHO oder BHK oder insbesondere humane Zellen. Weiterhin ist bevorzugt, daß die eukaryontischen Zellen kon- tinuierliche Zellinien tierischen oder humanen Ursprungs sind, wie etwa die humanen Zellinien HeLaS3 (Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956), 273- 284), Namalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033) oder davon abgeleitete Zellinien. Die Produktion des gewünschten Polypeptids in den kultivierten Zellen kann (a) durch Expression eines natürlichen endogenen Gens, (b) durch Expression eines aktivierten endogenen Gens oder/und (c) durch Expression eines exogenen Gens (rekombinant) erfolgen.

Besonders bevorzugt sind Zellen, in der in das gewünschte Polypeptid durch Expression eines durch homologe Rekombination aktivierten endogenen Gens erfolgt, z. B. die in der europäischen Patentanmeldung EP 97 112 640.4 offenbarten Zellinien, die zur Produktion gro#er Mengen an EPO in der Lage sind.

Die Kultivierung der Zellen kann grundsätzlich auf beliebige Weise erfolgen. Bevorzugt ist jedoch die Kultivierung als Suspension. Weiterhin ist bevorzugt, da (3 die Zellen in einem Medium mit geringem Serumgehalt, z. B. maximal 1 % (v/v) oder insbesondere in einem serumfreien Medium, z. B. in einem serumfreien, proteinarmen Fermentationsmedium (vgl. z. B.

W096/35718) kultiviert werden. Beispieie für geeignete Kulturmedien sind Basalmedien wie z. B. RPMI 1640, DMEM, F12 oder eRDF mit entsprechen- den Zusätzen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Kultivierung in Großfermentern, d. h. in einem Kulturvolumen von mehr als 1 I, vorzugs- weise mehr als 10 50@bis10.000@.Weiterhinerlaubtdasbeispielsweise erfindungsgemäße Verfahren eine Hochzelidichtefermentation, das bedeutet, daß die Konzentration der Zellen nach der Wachstumsphase (d. h. zum Zeitpunkt der Ernte) mehr als 10 x 105 Zellen/ml und besonders bevorzugt mehr als 20 x 105 Zellen/ml beträgt.

Die Kultivierung wird vorzugsweise als wiederholt satzweiser Betrieb mit bedarfsgerechter Zufütterung durchgeführt, wobei nach einer Wachs- tumsphase ein Teil der Kulturbrühe geerntet wird und der Rest der Kulturbrühe im Fermenter bleibt, der anschließend wieder bis zum Arbeits- volumen mit frischem Medium befüllt wird. Durch das erfindungsgema (3e Verfahren kann das gewünschte glykosilierte Polypeptid in sehr hohen Ausbeuten geerntet werden. So beträgt die Konzentration zum Erntezeit- punkt beispielsweise mindestens 30 mg und insbesondere mindestens 40 mg des gewünschten Polypeptids pro I Kulturmedium.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines glykosilierten Polypeptids aus eukaryontischen Zellen, wobei die eukaryontischen Zellen in einem geeigneten Medium kultiviert und das gewünschte Polypeptid aus den Zellen oder/und dem Kulturüberstand gewonnen wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von'35,5 °C, vorzugsweise zwischen 33 und 35,0 OC erfolgt. Überraschenderweise wurde nämlich festgestellt,

daß durch Temperatursenkung bei der Kultivierung der Anteil an Polypepti- den mit gewünschter Glykosilierung deutlich erhöht wird.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele betreffend die Herstellung von EPO in HeLa S3 Zellen erläutert.

Es zeigen : Figur 1 den relativen Anteil einzelner EPO-lsoformen in Abhängigkeit von den dem Kulturmedium zugesetzten Kohlenhydraten und Figur 2 die biologische Aktivität von EPO-Praparaten in Abhängigkeit von den dem Kulturmedium zugesetzten Kohlenhydraten.

Beispiele Beispiel 1 Bestimmung der spezifischen Aktivität in vivo von EPO Fur die biologische Aktivität in vivo bei EPO ist der Glykosilierungsgrad, z. B. die Anzahl von tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten, dieanzahivon N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosilierungsstelle des EPO-Moleküls und der Siaiinsäuregehalt pro EPO-Molekül wesentlich. Entsprechend der Anzahl von endständig gebundenen Sialinsäuren treten bis zu 14 Isoformen auf, die sich aufgrund ihrer Ladung z. B. mit der Kapillarzonenelektrophorese (CZE) auftrennen lassen. Die hochsialidierten sauersten Isoformen 1 bis 5 sind ma#geblich für die biologische in vivo Aktivität von EPO.

Die dosisabhängige Aktivität von EPO auf die Vermehrung und Differenzie- rung von Erythrozyten-Vorlauferzellen wurde in vivo in Mausen uber den Anstieg der Reticulocyten im Blut nach EPO-Gabe bestimmt.

Hierzu wurden jeweils acht Mäusen verschiedene Dosen der zu analysieren- den EPO-Probe und eines EPO-Standards (abgeglichen gegen den EPO- WHO-Standard) parenteral verabreicht. Die Mäuse wurden anschließend unter konstanten definierten Bedingungen gehalten. 4 Tage nach EPO-Gabe wurde den Mäusen Blut entnommen und die Reticulocyten mit Acridin- orange angefärbt. Die Bestimmung der Reticulocytenzahl pro 30 000 Erythrocyten erfolgte mikrofluorimetrisch im Durchflußcytometer durch Analyse des Rotfluoreszenz-Histogramms.

Die Berechnung der biologischen Aktivität erfolgte aus den Werten finir die Reticulocytenzahlen der Probe und des Standards bei unterschiedlichen Dosen nach dem von Linder beschriebenen Verfahren der paarweisen Gehaltsbestimmung mit parallelen Geraden (Linder, Planen und Auswerten von Versuchen, 3. Auflage, 1969, Birkenhäuser Verlag, Basel).

Beispiel 2 Bestimmung des Gehalts an Sialinsäureresten Die Bestimmung des Sialinsäuregehaltes erfolgte chromatographisch tuber HPAEC-PAD (High pH Anion Exchange Chromatography mit Pulsed Amperometric Detection) auf einem Dionex System nach enzymatischer Abspaltung der Sialinsäuren mit Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens (A. ureaf., Boehringer Mannheim).

Ansätze mit je 22 µg EPO aus verschiedenen Präparationen aus CHO-und humanen Zellinien (z. B. HeLa S3) wurden auf eine EPO-Konzentration von 0,2 mg/ml in 5 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2 eingestellt. Je eine Halte jedes Ansatzes wurde fur die genaue Bestimmung der EPO Menge tuber RP- HPLC verwendet. Zur 2. Halte der Ansätze wurde je 5 mM U Neuramini- dase von A. ureaf. gegeben und tuber Nacht (ca. 18 h) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Verdauansätze halbiert, 20-fach auf 500 pI mit H20 verdünnt und 50 µl davon (entspricht ca. 27 pmol EPO) auf das Dionex

System aufgetragen. Hierzu wurden folgende Chromatographie-Parameter verwendet : Saule : CarboPac PA 100 Flu# : 1,0 mi/min Detektorempfindlichkeit : 300 nA Gradient : t (min) % Puffer B 0 17 7 17 9 100 12 100 13 0 20 0 Puffer A : 0,1 M NaOH Puffer B : 0,1 M NaOH ; 0,5 M Na-Acetat Die Menge an Sialinsäuren in der aufgetragenen Probe wurde mit Hilfe einer Eichgerade, die aus Werten eines mitgefuhrten Sialinsaurestandards (Boehringer Mannheim) erhalten wurde, ermittelt. Der Sialinsäuregehalt (mol Sialinsäure/mol EPO) wurde aus dem Ergebnis der Sialinsäurebestimmung (Dionex System) und der Bestimmung der eingesetzten EPO-Menge tuber RP- HPLC berechnet.

Beispiel 3 Bestimmung des Anteils an bi-, tri-und tetraantennären Kohlenhydratstrukturen Die Analytik der N-gebundenen Kohlenhydratstrukturen erfolgte chromato- graphisch tuber HPAEC-PAD auf einem Dionex System. Die asialo Oligo- saccharide von EPO-Praparationen aus CHO-und humanen Zellinien (z. B. HeLa S3) wurden durch enzymatische Abspaltung mit N-Glycosidase F

(Boehringer Mannheim) und Neuraminidase aus A. ureaf. (Boehringer Mannheim) gewonnen.

Ca. 30 pg EPO je Ansatz wurden mittels MicroCon-Ultrazentrifugationsein- heiten (Amicon, Ausschlu#grö#e 10 kD) entsalzt und mit 10 mM Na- Phosphat-Puffer, pH 7,2 auf eine Konzentration von 0,3 mg/ml eingestellt.

Anschließend wurde jeder Ansatz mit 1 U N-Glycosidase F und 10 mU Neuraminidase versetzt und tuber Nacht (ca 18 h) bei 37°C inkubiert. Zur Abtrennung des EPO-Polypeptidanteils von den abgespaltenen Oligosac- chariden wurden die Ansätze nach der Inkubation durch Ultrafree-Zen- trifugationseinheiten (Millipore, kD)zentrifugiertunddas10 Ultrafree-Device zweimal mit 20 NI HZO nachgewaschen. Die im Durchlauf enthaltenen Oligosaccharide wurden mit H20 auf 150, ul aufgefüllt und 100 NI davon auf dem Dionex System analysiert. Hierzu wurden folgende Chromatographie-Parameter verwendet : Saule : CarboPac PA 100 Fluß : 1,0 ml/min Detektorempfindlichkeit : 300 nA Gradient : t (min) % Puffer B 0 0 2 0 60 10 62 100 67 100 69 0 80 0 Puffer A : 0,1 M NaOH Pouffer B : 0,1 M NaOH ; 0,5 M Na-Acetat

Die Identifikation der Peaks in einem Chromatogramm von N-Zuckern des komplexen Typs erfolgte durch Standard-Oligosaccharide (Oxford Glyco Sy- stems) und wurde durch den enzymatischen Verdau der Oligosaccharide von EPO mit dem Enzym Endo-ß-Galactosidase bzw. Fucosidase und anschlieRender Analytik auf dem Dionex System verifiziert. Die Berechnung der prozentualen Anteile an bi-, tri-und tetraantennären Strukturen erfolgte tuber die Flache der Peaks, die die entsprechende N-Zuckerstruktur repräsentieren, bezogen auf die Gesamtpeakfläche (Summe der Peakflächen von bi-, tri-und tetraantennären Strukturen).

Beispiel 4 Bestimmung des Anteils an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten und des mittleren Anteils an zusatzlichen N-Acetyl-Lactosamin- Einheiten (Repeats) Die Gesamtzahl an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten in den N-gebundenen Kohlenhydratstrukturen von EPO (d. h. in den Core-Kohlenhydratstrukturen) wurde aus den Peakflächen der Chromatogramme der Experimente von Beispiel 3 berechnet.

Die Berechnung der Anzahl des mittleren Gehalts (n) von N-Acetyl- Lactosamin-Einheiten pro Kohlenhydratkette war wie folgt : n= # % (bi)x2+ % (tri) x3+ % (tetra) x4 + % (tri + 1 r) x4 + % (te- tra + 1 r) x5 + % (tri + 2r) x5 + % (tetra + 2r) x6 wobei % (bi) = prozentualer Anteil biantennärer Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydrat- ketten % (tri) = prozentualer Anteil triantennärer Strukturen ohne zusätzliche N-Acetyl-Lactosamin-Einheit % (tetra) = prozentualer Anteil tetraantennärer Strukturen ohne zusätziiche N-Acetyl-Lactosamin-Einheit

% (tri + 1 r) = prozentualer Anteil triantennärer Struktu- ren mit 1 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa- min-Einheit % (tetra + 1 r) = prozentualer Anteil tetraantennärer Struk- turen mit 1 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa- min-Einheit % (tri + 2r)= prozentualer Anteil triantennärer Struktu- ren mit 2 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa- min-Einheiten % (tetra + 2r) = prozentualer Anteil tetraantennärer Struk- turen mit 2 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa- min-Einheiten.

Ein weiterer wichtiger Parameter ist der Anteil von N-Acetyl-Lactosamin- Einheiten, die als sogenannte Repeats an die Core-Kohlenhydratstrukturen gebunden sein können. Der Repeatgehalt wird als prozentualer Anteil der repeathaltigen Kohlenhydratstrukturen bezogen auf die Gesamtheit der Kohlenhydratstrukturen (bi +tri +tetra =100%) angegeben. Dieser Anteil von Repeats kann bei EPO-Präparaten aus CHO-Zellen und aus humanen Zellen unterschiedlich sein. <BR> <BR> <P>Beispiel 5 : Beeinflussung der biologischen Aktivität von EPO durch kontrollierte und bedarfsgerechte Zufütterung Die Kultivierungen wurden als wiederholt satzweiser Betrieb mit bedarfs- gerechter Zufütterung (Repeated Fed Batch) bei einer Temperatur von 36,5 °C durchgeführt. Dazu wurde in einem geruhrten Fermenter (Gesamtarbeits- volumen : 10 L) serumfreies proteinarmes Kulturmedium vorgeiegt und einmalig mit einer Inokulumskultur beimpft. Die Zelidichte nach Beimpfen lag im Bereich 3 ~ 1x105 lebende Zellen/ml.

Nach einer Wachstumsphase von 14424 Stunden wurde ein Teil der Kulturbrühe geerntet. Der Rest der Kulturbrühe verblieb im Fermenter und stellte das Inokulum fur die nächste Wachstumsphase dar ; dazu wurde der Fermenter wieder bis zum Arbeitsvolumen mit frischem Medium aufgefüllt.

Der EPO-haltige Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation der Fermenta- tionskultur erhalten.

Während der Wachstumsphase wurde der Kultur kontinuierlich Nähr- stofflösung zugeführt. Dazu wurde ein Vorratsgefä# mit Nährlösung an den Fermenter gekoppelt. Die Nährstofflösung enthielt Aminosäuren, Vitamine, Insulin, Spurenelemente, Salze, Glutamin und Kohlenhydrate. Es wurden 2 Fermentationen wie folgt durchgeführt : Bei der Fermentation A enthielt die Nährstofflösung als Zucker D- (+)- Glucose und bei der Fermentation B die Zucker D- (+)-Glucose, D- (+)- Galactose und D- (+)-Mannose. Das Masseverhältnis von Glutamin zu den Zuckern betrug bei Fermentation B 1 : 2,2 : 3,6 : 6. Die Konzentration der einzelnen Zucker in der Nährstofflösung lag zwischen 7,2 und 18 9/l.

Die Glutaminkonzentration in der Kultur wurde bei Fermentation B periodisch analysiert und der Verbrauch berechnet. Der momentane Volumenstrom der Nährstoffiösung wurde dem Bedarf der Zellen an Nährstoffen angepaSt. Bei Fermentation A wurde die Glutaminkonzentration nicht als Regelgrö#e verwendet. Die Nährstofflösung bei der Fermentation B enthielt eine Mischung der Zucker D- (+) Glucose, D- (+) Galactose und D- (+) Mannose im Massenverhältnis von 2 : 3 : 5. Während der Kultivierung wurde durch entsprechende Zufütterung die Konzentration aller Zucker im Fermenter in einem Bereich von 2 bis 6 9/l gehalten.

Die Zelidichte veränderte sich durch das Wachstum auf mehr als 20x105 Zellen/ml, typischerweise 30 1 Ox 105 Zellen/ml zum Erntezeitpunkt. Die

Konzentration an EPO betrug zum Erntezeitpunkt typischerweise 40+ 10 mg/l.

Aus geernteten Kulturbrühen wurde die Konzentration an humanem Ery- thropoietin z. B. durch ELISA bestimmt. Eine prozentuale Verteilung der auftretenden Isoformen dieses Proteins wurden z. B. durch Trennung mittels Kapillarzonenelektrophorese (CZE) bestimmt.

Tabelle 1 zeigt den Vergleich der EPO-Isoformenverteilung zwischen einer Fermentation A mit Zufütterung einer Nährstofflösung mit Glucose und einer Fermentation B mit kontrollierter und bedarfsgerechter Zufütterung einer Nährstofflösung mit Glucose, Mannose und Galactose. Der Anteil der EPO- Isoformen bei Fermentation B wurde als prozentualer Anteil der korrespon- dierenden Isoformen der Fermentation A berechnet. Letztere wurden auf jeweils 100% normiert. Die Daten belegen, daß die erwünschten höher glykosilierten EPO-Isoformen 2-4 während der Fermentation gegenüber der Fermentation A in mal3geblich höheren Anteil vorliegen.

Tabelle 1 : Isoformbezeich-1 2 3 4 5 6 7 8 nung in der CZE [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] Fermentation A : n. b. 100 100 100 100 100 100 100 Zufütterungmit Glucose Fermentation B : n. b. 136 140 115 102 91 76 55 bedarfsgerechte Zufütterungmit Glucose,Mannose und Galactose n. b. = nicht bestimmbar, da Wert unter Nachweisgrenze

Das bei Zufütterung erhaltene Isoformenmuster war bei vier aufeinand- erfolgenden Ernten aus einer Fermentation mit kontrollierter und bedarfs- gerechter Zufütterung der Nährstofflösung reproduzierbar.

Beispiel 6 : Beeinflussung der biologischen Aktivität von EPO durch Veränderung der Kultivierungstemperatur Die Durchfuhrung erfolgte wie in Beispiel 5 (Fermentation B) beschrieben im Fed-Splitbatch-Verfahren mit kontrollierter und bedarfsgerechter Zufütte- rung, außer daß die Fermentertemperatur 35,0 OC anstelle von 36,5 OC betrug und die Fermentation im 1000 I Maßstab durchgeführt wurde.

Tabelle 2 zeigt den Vergleich der EPO-Isoformenverteilung zwischen einer Fermentation C bei 36,5 °C und einer Fermentation D bei 35,0 OC jeweils mit kontrollierter Zufütterung einer Nährstofflösung. Der Anteil der EPO- Isoformen bei Fermentation D wurde als prozentualer Anteil der korrespon- d ierenden Isoformen der Fermentation C berechnet. Letztere wurden auf jeweils 100 % normiert. Die Daten belegen, daß die sauren EPO-Isoformen 2 bis 4 durch Absenkung der Temperatur ma#geblich angehoben werden.

Tabelle 2 : Isoformbezeich-1 2 3 4 5 6 7 8 nung in der CZE [%][%][%][%][%][%][%][%]RelativeIsoformenv- erteilung Fermentation C : n. b. 100 100 100 100 100 100 100 Temperatur36,5 °C Fermentation D : n. b. 131 116 110 94 100 88 86 Temperatur 35,0 OC n. b. = nicht bestimmbar, da Wert unter Nachweisgrenze

Beispiel 7 : Beeinflussung der biologischen Aktivität von EPO durch Veränderung der Kohlenhydratzusammensetzung im Medium Das im folgenden dargelegte Verfahren belegt die Möglichkeit, die Qualität von humanem Erythropoietin durch Veränderung des Kohlenhydratangebo- tes im Zufütterungsmedium zu verändern.

Es werden zwei Varianten des oben beschriebenen Verfahrens gezeigt (nachfolgend Fermentation E und Fermentation F genannt), die sich durch die Zusammensetzung der verwendeten Medien unterscheiden.

Fur beide Ansätze basierte die Rezeptur des Kulturmediums auf modifizier- tem eRDF-Medium. Es wurde kein Serum eingesetzt, sondern rekombinantes Insulin (einziger Proteinzusatz) und weitere Supplemente (z. B. Selenit, Putrescin, Hydrocortison, Eisensulfat), die üblicherweise bei serumfreien bzw. proteinfreien Medien eingesetzt werden.

Die Zufutterungs-Nahrlosung basiert ebenfalls auf modifiziertem eRDF- Medium, enthält jedoch nicht die Salze KCI, Na2HP04 und NaCI.

Der maßgebliche Unterschied der Fermentationen E und F liegt im Zusatz von verschiedenen Monosacchariden zum Zufütterungsmedium.

Fermentation E : Es wurde fOr Fermentation E der üblicherweise eingesetzte Zucker D- (+)- Glucose verwendet. Die Startkonzentration betrug 3 g/l. Durch eine geeignete Zufütterung der glucosehaltigen Nährlösung wurde die Glucose-

konzentration in der Kulturbrühe bei 3 0,5 g/l wahrend der gesamten gehalten.Kultivierungkonstant Die Kultivierungsdauer lag typischerweise bei 100 ~ 20 h. Die Konzen- tration an EPO betrug zum Erntezeitpunkt typischerweise 40 ~ 10 mg/l.

Fermentation F : Fur die Fermentation F wurden zusätzlich zu D- (+)-Glucose die Zucker D- (+)-Galactose und D- (+)-Mannose im Verhältnis von ca. 1 : 2 : 3 for das Zufütterungsmedium eingesetzt. Während der Kultivierung wurde durch entsprechende Zufütterung die Konzentration aller Zucker in einem Bereich zwischen 0,25 9/l und 3,5 9/l gehalten.

Die Kultivierungsdauer lag typischerweise bei 10020 Stunden. Die Konzentration an EPO betrug zum Erntezeitpunkt typischerweise 40 ~ 10 mg/l.

Erythropoietin wurde aus den Kulturüberständen aufgereinigt. Das durchgefuhrte Aufreinigungsverfahren war so ausgelegt, daß die Verteilung von relevanten Isoformen des Glykoproteins nicht beeinflußt wurde.

Die Isoformenverteilung des gereinigten Erythropoietin wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Die Kohlenhydratstrukturen der Isoformen von humanem Erythropoietin und ihre Verteilung unterscheiden sich in den geernteten Kulturüberständen von Fermentation E zu Fermentation F. Die Fermentation F zeigt einen deutlich höheren Anteil der Isoformen 2,3 und 4 gegenüber Fermentation E. Diese Unterschiede werden durch eine Zufütterung der Monosaccharide Mannose und Galactose bewirkt (vgl. Fig.

1).

Die biologische Aktivität, bestimmt durch den Normo-Maus-Test (Beispiel 1), korreliert mit der Verteilung und den Kohlenhydratstrukturen der EPO- Isoformen (Fig. 2). Die Kohlenhydratstrukturen der aus den Kulturüber- ständen E und F erhaltenen EPO-Präparationen wurden mit CZE-und HPAEC-Analytik untersucht.

In Tabelle 3 sind die Antennärität (Gehalt an Bi-Tri-und Tetrastrukturen), der Gehalt an N-Acetyl-Lactosamineinheiten (LE), der Sialinsäuregehalt (SA) und das Produkt aus LE und SA der beiden EPO-Präparationen dargestellt.

Tabelle 3 bi tri tetra SA-LE-LExSA [%]GehaltGehalt[%][%] Fermentation E 12,6 25,4 62,0 10,8 10,8 1 16,7 Fermentation F 10,1 19,2 70,6 1 1,6 1 1,25 130,5