La présente invention concerne le domaine de la fonctionnalisation des surfaces. Plus précisément, elle concerne un procédé de modification de surface qui permet notamment d'obtenir des compositions chimiques surfaciques non homogènes, typiquement des gradients chimiques surfaciques.

Au sens de la présente demande, on désigne par « support comportant un gradient chimique surfacique » un support dont la composition chimique en surface varie d'une position à l'autre sur la surface du support : la composition chimique n'est pas homogène sur toute la surface. La variation de composition chimique peut être continue ou discontinue.

La chimie des surfaces est un domaine de recherche de grand intérêt, particulièrement pour la préparation et l'étude de nanostructures dans lesquelles presque chaque atome est interfacial. Par exemple, l'organisation spontanée en deux dimensions des couches minces auto-assemblées fournit des systèmes moléculaires simples et flexibles sous la forme de films minces, dont les propriétés de surface peuvent être adaptées selon l'application envisagée. Les couches minces auto-assemblées sont des nano-objets pour lesquels les propriétés au niveau moléculaire sont liées aux phénomènes interfaciaux, tels que le mouillage, l'adhésion, la friction, la résistance à la corrosion, la biocompatibilité, etc. Toutefois, les surfaces fonctionnalisées connues de l'état de la technique ont généralement une composition homogène sur la totalité de la surface, ou bien les surfaces sont délimitées en diverses zones, chaque zone ayant une composition chimique spécifique et cette composition étant homogène sur toute la zone. L'objectif de la présente invention est de fournir un procédé qui permette d'obtenir des gradients chimiques surfaciques.

Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de fonctionnalisation d'un support comprenant une étape (E) où au moins une partie de la surface dudit support comportant des fonctions aldéhydes est mise en contact avec une solution comprenant au moins deux composés porteurs d'une fonction aminé de pKa différents, dans lequel la zone de contact entre la surface du support et la solution varie au cours du temps et où le pH de la solution est modifié au cours de cette variation. La variation simultanée de la zone de contact et du pH telle que mise en œuvre dans l'étape (E) permet de fonctionnaliser la surface de façon non homogène, et typiquement de créer un gradient de composition chimique à la surface du support lorsque la variation de la zone de contact est continue. La zone de contact est la celle entre la surface comportant des fonctions aldéhydes et la solution comportant des aminés, permettant ainsi le greffage des composés porteurs de fonction aminé par formation de liaisons imines avec les fonctions aldéhydes.

Comme le pKa des aminés présentes dans le milieu est distinct, le greffage de chacun des composés est en compétition par rapport aux autres composés présents : parmi les composés présents, le composé dont l'azote de la fonction aminé est le plus nucléophile dans les conditions de greffage se greffe préférentiellement. Ainsi, en opérant une modification du pH simultanément à la variation de zone de contact, la sélectivité du greffage d'un composé par rapport à(aux) l'autre(s) varie. La composition moléculaire greffée à la surface varie en fonction de l'endroit sur le support. Ainsi, la composition chimique surfacique peut être contrôlée en modulant le pH et la durée de maintien à un endroit donné, et il est ainsi possible de créer des gradients chimiques en surface.

Le procédé s'avère simple, rapide et très général : il permet de générer rapidement, avec des modulations infinies de leurs formes, des gradients aux fonctionnalités multiples sur des surfaces.

Typiquement, la variation simultanée du pH et de la zone de contact peut être obtenue par un des deux modes de réalisations suivants.

Dans un premier mode de réalisation de l'étape (E) (MR1 ), la variation de la zone de contact est réalisée en immergeant initialement le support en totalité ou en partie dans la solution puis en sortant progressivement le support de la solution, le pH de la solution étant modifié au cours du retrait. Ce mode de réalisation présente l'avantage d'être très simple et peu coûteux. Typiquement, le support est sorti à une vitesse de 0,1 à 10 cm. h ^"1 , de préférence de 0,5 à 2 cm. h ^"1 . Toutefois, la vitesse adéquate pour sortir la plaque dépend également de la vitesse de variation du pH au cours du temps. Dans ce mode de réalisation, on obtient un gradient dans la direction du déplacement du support, et la composition est homogène dans la direction orthogonale à la direction de déplacement du support.

La mise en œuvre du mode de réalisation MR1 repose sur le fait que la formation de la liaison imine est réversible. Il est en effet possible de greffer un premier composé (par formation de liaison imine), puis « d'échanger » ce composé par un deuxième composé, notamment en modifiant le pH de la solution pour qu'il soit tel que le deuxième composé soit le plus nucléophile (par exemple en ajustant le pH tel qu'il soit proche du pKa de la fonction aminé de ce deuxième composé). Ainsi, au début de l'étape (E), le composé le plus nucléophile au pH initial se greffe sur la zone de contact. Cette zone de contact se rétrécit de plus en plus lorsque le support est sorti de la solution. A un instant t ultérieur, si le pH est tel qu'un autre composé est alors le plus nucléophile à ce pH, celui-ci se greffe sur la zone de contact restante par échange avec le premier composé greffé.

Dans un second mode de réalisation de l'étape (E) (MR2), la mise en contact est obtenue en appliquant la solution sur le support sur une zone de contact qui varie avec le temps, le pH de la solution étant modifié au cours de la variation de la zone de contact. Ce mode de réalisation a l'avantage de permettre une fonctionnalisation localisée plus modulable sur la surface du support. Il peut notamment être mis en œuvre par une tête d'application, typiquement une tête d'impression, reliée à un réservoir comprenant la solution (appareillage du type « imprimante jet d'encre », où la solution remplace l'encre).

Pour la mise en œuvre de l'étape (E), le support fonctionnalisé peut être tout matériau solide dont au moins une partie de la surface est susceptible de comporter des fonctions aldéhydes. Il peut s'agir d'un support dont la surface comprend, de façon inhérente, des fonctions aldéhydes, d'un support dont la surface comprend des fonctions susceptibles d'être transformées en fonction aldéhyde, ou bien le plus souvent d'un support sur la surface duquel des fonctions aldéhydes ont été introduites préalablement à la mise en œuvre de l'étape (E). En pratique, de nombreux supports sont adaptés à cet effet. Certaines surfaces de support comportent des fonctions susceptibles d'être transformées en fonction aldéhyde. Ainsi, par exemple, des fonctions esters et acide peuvent être transformées en fonction aldéhyde par réduction. De même, des fonctions alcools peuvent être transformées en fonction aldéhyde par oxydation. De plus, des fonctions alcènes peuvent être transformées en fonction aldéhyde par ozonolyse réductrice. Ces transformations de fonctions de surface en fonction aldéhyde sont particulièrement adaptées lorsque le support est un polymère. Typiquement, la présence de fonctions aldéhydes sur le support employé dans le procédé précité est obtenue en greffant sur au moins une partie de la surface des composés porteurs d'une fonction aldéhyde préalablement à l'étape (E). Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé comprend en outre avant l'étape (E) une étape préalable (étape (P)) consistant à fonctionnaliser au moins une partie de la surface du support par un composé porteur d'une fonction aldéhyde pour obtenir un support dont la surface comporte des fonctions aldéhydes.

Le composé porteur d'une fonction aldéhyde mis en œuvre lors de l'étape (P) comporte généralement (i) au moins une fonction aldéhyde d'une part (ou un précurseur de fonction aldéhyde) et (ii) au moins une fonction capable de réagir avec la surface du support pour former une liaison forte, notamment ionique ou covalente, de préférence covalente, d'autre part. Par exemple, un composé porteur d'une fonction aldéhyde adapté au greffage de fonctions aldéhydes sur une surface en quartz ou de silicium est un composé porteur d'une fonction silane, notamment trialkoxysilane (par exemple un triéthoxysilane) et d'une fonction aldéhyde (greffage par silanisation) ; un composé porteur d'une fonction aldéhyde adapté au greffage de fonctions aldéhydes sur une surface en métal est un composé porteur d'une fonction thiol et d'une fonction aldéhyde. Le composé porteur d'une fonction aldéhyde est susceptible de comporter en outre d'autres fonctions que la fonction aldéhyde et la fonction servant au greffage sur la surface.

De préférence, la fonctionnalisation de la surface du support par un composé porteur d'une fonction aldéhyde obtenue après l'étape (P) conduit à la formation d'une couche sur la surface du support, généralement une couche continue, avantageusement d'une couche mince auto-assemblée, c'est-à-dire une monocouche homogène de densité élevée dans laquelle les composés porteurs de fonction aldéhyde s'auto-organisent, généralement de sorte que les composés sont perpendiculaires à la surface, les fonctions aldéhydes étant orientées vers l'extérieur. Préalablement à la fonctionnalisation d'au moins une partie de la surface du support par un composé porteur d'une fonction aldéhyde, ladite partie de la surface, ou même le support en entier, peut être prétraité pour favoriser le greffage ultérieur du composé. Ainsi, par exemple, une plaque de silicium ou en quartz peut être prétraitée par une solution de piranha (75-25%vol de H ₂ SO ₄ et H ₂ O ₂ ), rincée puis séchée (de préférence par un gaz inerte, tel que l'argon) avant greffage des composés porteurs d'une fonction aldéhyde. Le prétraitement de la surface peut également être réalisé par plasma d'oxygène. De même, un cristal de silicium peut être prétraité par activation avec une lampe UV/ozone. Généralement, les dimensions du support mis en œuvre à l'étape (E) sont supérieures à supérieures à 0,5 cm, de préférence supérieures à 1 cm. Des dimensions inférieures peuvent être envisagées. Par exemple, il est possible de réaliser l'étape (E) avec un support sous forme de tige dont deux dimensions sont inférieures à 0,5 cm, la troisième dimension étant supérieure à 2 cm, notamment 5 cm. Le support est de préférence en verre, en quartz, en métal, par exemple en or en argent, et/ou en polymère, notamment en (co)polymère (meth)acrylique.

Chacun des composés porteurs d'une fonction aminé peut comporter plus d'une fonction aminé. En particulier dans ce cas, le point isoélectrique (pHi ou pi) du composé peut également avoir un rôle sur le greffage. Le point isoélectrique est défini comme étant le pH (potentiel hydrogène) pour lequel la charge globale du composé est nulle ou, autrement dit, le pH pour lequel le composé est électriquement neutre (forme zwitterionique ou ion mixte). De préférence, les composés ont des pi distincts.

De préférence, le composé ne comporte qu'une fonction aminé. Chacune des fonctions aminés présente sur chacun des composés porteurs d'une fonction aminé est de préférence primaire. Le composé porteur d'une fonction aminé est de préférence organique. Typiquement, l'atome d'azote de la fonction aminé est relié à un carbone, qui peut avoir n'importe quelle hybridation (sp, sp ² ou sp ³ - aliphatique ou aromatique). Chacun des composés porteurs d'une fonction aminé peut comporter une ou plusieurs fonctions (en plus la fonction aminé), ce qui permet de manière avantageuse de préparer des supports dont les surfaces sont fonctionnalisées et présentent des propriétés de surface spécifiques. Par exemple, chacun des composés porteurs d'une fonction aminé peut être une acide aminé (naturel ou non), un peptide, une protéine, un nucléotide ou une base azotée porteur d'une fonction aminé (adénine, guanine, cytosine) ou un brin d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN). Dans un mode de réalisation, au moins un des composés porteurs d'une fonction aminé est un peptide ou une protéine. Dans un mode de réalisation particulier, chacun des composés porteurs d'une fonction aminé est un peptide ou une protéine. De préférence, les peptides et/ou protéines mis en oeuvre ont des pi distincts.

Le pKa de chacune des fonctions aminés est défini par la relation pKa = - log(Ka), où Ka est la constante d'acidité mesurée dans l'eau du couple fonction aminé protonée (acide) / fonction aminé neutre (base).

Les fonctions aminé des composés ont des pKa différents, qui diffèrent de préférence au moins de 0,3, notamment au moins 0,5, de préférence au moins 0,9. Lorsque des sélectivités particulièrement élevées sont recherchées, il est préférable que les pKa des composés diffèrent au moins de 1. Dans ce cas, on atteint le plus souvent des sélectivités supérieures à 99/1.

La solution comprend au moins deux composés porteurs d'une fonction aminé, mais peut en comporter plus, par exemple 3 ou 4. Pour optimiser la sélectivité du greffage d'un composé par rapport à(aux) autre(s), il est préférable que la solution ne comporte pas plus de 10, plus préférentiellement pas plus de 6 composés porteurs d'une fonction aminé.

Les composés porteurs d'une fonction aminé sont en solution et sont partiellement ou totalement dissous dans un solvant. Le solvant choisi est de préférence inerte : il n'est susceptible de réagir ni avec les fonctions aldéhydes, ni avec les fonctions aminés, ni avec les éventuelles autres fonctions présentes sur les composés porteurs des fonctions aldéhydes ou aminés. Le solvant est notamment un solvant halogène (chloroforme, dichlorométhane), un alcool (méthanol, éthanol), du toluène, de l'acétonitrile, du dmso, une solution aqueuse, de préférence de l'eau, ou un mélange de des solvants. La concentration de chacun des composés porteurs d'une fonction aminé peut varier dans une large mesure, mais est généralement comprise entre 0,001 mM et 1 M, notamment entre 0,01 mM et 0,5 M, de préférence entre 0,05 mM et 1 m M. Il n'est pas nécessaire que les composés porteurs d'une fonction aminé soient en quantités équimolaires pour observer une sélectivité lors du greffage.

Généralement, le rapport entre un composés porteur d'une fonction aminé par rapport à un autre est compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 0,2 et 5.

Dans le mode de réalisation MR1 précité, une couche de solvant de densité inférieure à celle de la solution et non miscible avec la solution peut être ajoutée au dessus de la solution. Par exemple, lorsque la solution est une solution aqueuse, il est possible d'ajouter une couche hydrophobe au dessus de la solution. Cette couche hydrophobe est notamment un solvant organique de densité inférieure à 1 et non miscible à l'eau, par exemple un alcane, notamment l'heptane. Cette couche ajoutée permet avantageusement de limiter les phénomènes de diffusion et d'augmenter la sélectivité du greffage d'un composé porteur d'une fonction aminé par rapport à l'autre.

Au cours de l'étape (E), le pH de la solution est modifié, c'est-à-dire que le pH est augmenté (notamment par ajout d'une base dans la solution) ou diminué (notamment par ajout d'un acide dans la solution), une diminution de pH pouvant suivre une augmentation, et réciproquement.

De manière avantageuse, le pH est modifié de façon à ce qu'il varie dans une gamme de pH dans laquelle sont compris les différents pKa des différentes aminés.

Par exemple, dans le mode de réalisation dans lequel la solution comporte deux aminés de pKa différents, soit pKa1 et pKa2 avec pKa1 inférieur à pKa 2, lorsque le pH est inférieur au pKa1 , les deux fonctions aminés sont protonées et se greffe le composé protoné le plus nucléophile des deux. Lorsque le pH est augmenté, quand il atteint le pKa1 , le composé 1 est à moitié sous forme protonée, à moitié sous forme neutre (alors que le composé 2 est majoritairement protoné), et le composé 1 se greffe préférentiellement. En continuant à augmenter le pH jusqu'à pKa2, le composé 2 est alors à moitié sous forme protonée et à moitié sous forme neutre (le composé 1 étant alors majoritairement sous forme neutre), et se greffe le composé, qui, sous la forme neutre, est le plus nucléophile. Ensuite, si on diminue le pH en sens inverse, vont être greffés successivement le composé, qui, sous la forme neutre, est le plus nucléophile (pH > pKa2), puis le composé 1 (pKa1 < pH < pKa2), puis le composé qui, sous forme protonée, est le plus nucléophile des deux (pH < pKa1 ).

Le même raisonnement peut être facilement adapté par l'homme du métier lorsque la solution comporte plus de deux composés porteurs d'une fonction aminé.

En plus de l'étape (E) précitée pendant laquelle le pH de la solution et la zone de contact varient simultanément, le procédé peut comprendre en outre au cours de la modification de surface une ou plusieurs des étapes suivantes:

- une étape (A), pendant laquelle la zone de contact entre la surface du support et la solution varie alors que le pH de la solution reste constant , et/ou

- une étape (B), pendant laquelle le pH de la solution varie alors que la zone de contact entre la surface du support alors que la solution reste identique, et/ou

- une étape (C), pendant laquelle le pH de la solution reste constant et la zone de contact entre la surface du support alors que la solution reste identique. Le procédé peut comprendre une ou plusieurs étape(s) (E).

Selon un deuxième aspect, l'invention a également pour objet le support fonctionnalisé susceptible d'être obtenu par le procédé précité. Ce support est recouvert d'un gradient chimique en surface, dont la composition chimique a été régulée par la position de la zone de contact sur cette surface et le pH de la solution à cette position.

La couche de composés greffés (par l'intermédiaire de la fonction aminé) est généralement continue. Typiquement, une couche mince auto-assemblée est obtenue.

La caractérisation des surfaces peut être effectuée par les méthodes classiques de caractérisation des surfaces, telles que par ellipsométrie, par microscopie à force atomique (AFM), par microbalance à quartz (QCM - Quartz

Crystal Microbalance), par mesure d'angle de contact ou par analyse de fluorescence si les composés greffés sont fluorescents.

Selon un troisième aspect, l'invention a également pour objet les utilisations potentielles du support fonctionnalisé. A titre non limitatif, le support peut être employé pour des applications dans le domaine de la biologie, telles que la croissance directionnelle d'axones, les mouvements de déplacement de bactéries, la locomotion de protéines de transport telle que la kinésine, l'immobilisation de protéines, la séparation de protéines, la délivrance de médicaments, ou pour des applications dans le domaine de la physique, telles que pour fournir un effet de gonflement osmotique, de pression de surface, de mouillage de surface ou d'adsorption de polymères. Le support fonctionnalisé selon l'invention peut notamment être mis en œuvre dans les applications ci-dessus en suivant les procédures décrites dans Millet et al. (Lab Chip, 2010, 10, 1525-1535) pour l'utilisation de gradients chimiques pour la croissance directionnelle d'axones, dans Kim et al. (Prog. Polym. Sci. 2008, 33, 138-164) pour les applications biomédicales et dans la thèse de M ^θllθ Lara Tauk (soutenue le 16 Décembre 2009 à l'université de Strasbourg, intitulée « Chimie Combinatoire Dynamique aux Surfaces - Formation hiérarchique de gradients (bio) fonctionnels fondés sur des monocouches auto-assemblées stimulables par le pH ») et dans les références qui y sont citées pour les applications physiques et chimiques.

L'invention sera encore illustrée par les exemples ci-après, données en référence aux figures ci-annexées, sur lesquelles :

FIGURES

La figure 1 est un schéma de principe du mode de réalisation MR1 qui représente l'évolution du système entre un temps t1 (figure 1A) et un temps t2 (figure 1 B), avec t2 > t1. Au temps t1 , le support 1 , dont au moins une partie de la surface 2 comporte des fonctions aldéhyde, est immergé dans une solution 3 ayant un pH égal à pH1 et comportant au moins deux composés porteurs de fonction aminé. Au niveau de la zone de contact 4, les composés porteurs de fonction aminé réagissent avec les fonctions aldéhydes de la surface du support. Le(s) composé(s) le(s) plus nucléophile(s) au pH1 se greffe préférentiellement et un mélange de composition spécifique à ce pH1 se greffe (représenté par des ronds). La figure 1 B représente le système après que le support ait été partiellement sorti de la solution, le pH de la solution étant modifié à une valeur de pH égale à pH2 (différente de pH1 ). Au temps t2, au niveau de la zone de contact 5, les composés porteurs de fonction aminé en solution s'échangent avec les composés porteurs de fonctions aminés déjà greffés de sorte qu'un mélange de composition spécifique à pH2 se greffe (représenté par des triangles). La figure 1 représente un mode de réalisation pour lequel le support est sorti en une fois, ce par quoi deux zones de greffage sont obtenues (ronds et triangles). En sortant le support de manière continue, il est possible de faire varier la composition chimique de manière continue sur la surface, de façon à y greffer un gradient de composition.

La figure 2 est un schéma de principe du mode de réalisation MR2 qui représente l'évolution du système entre un temps t1 (figure 2A) et un temps t2 (figure 2B), avec t2 > t1. Un support 1 comprenant une surface 2 comportant des fonctions aldéhydes, qui est mise en contact avec une solution 3 comportant au moins deux composés porteurs de fonction aminé au niveau d'une zone de contact 4 grâce à une tête d'impression (ou tête d'application) 6. Au temps t1 (figure 2A), les composés porteurs de fonction aminé réagissent avec les fonctions aldéhydes de la surface 2 du support 1. Le(s) composé(s) le(s) plus nucléophile(s) au pH1 se greffe(nt), et un mélange de composition spécifique à pH1 est greffé sur la zone de contact 4. Entre le temps t1 et le temps t2, le support 1 est déplacé par rapport à la tête d'application 6 (ou la tête d'application 6 est déplacée par rapport au support 1 ) et le pH de la solution est modifié simultanément. Au temps t2 (figure 2B), au niveau de la zone de contact 5, les composés porteurs de fonction aminé réagissent avec les fonctions aldéhydes de la surface du support. Le(s) composé(s) le(s) plus nucléophile(s) au pH2 se greffe(nt), et un mélange de composition spécifique à ce pH1 est greffé sur la zone de contact 5.

La figure 3 représente le spectre de fluorescence obtenue par microscopie confocale de la surface imine formée selon le procédé de l'exemple 2a) par la condensation entre l'aldéhyde 1 greffé sur la plaque en quartz et le composé 2 (λ _ΘXt = 488 nm ; λ _θm = 585 nm), et par la condensation entre l'aldéhyde 1 greffé sur la plaque en quartz et le composé 3 (λ _ΘXt = 488 nm ; λ _θm = 675 nm). L'axe des abscisses est la longueur d'onde en nm et l'axe des ordonnées est l'intensité en a.u..

La figure 4A représente les 96 spectres d'émission de fluorescence (l'axe des abscisses est la longueur d'onde en nm et l'axe des ordonnées est l'intensité en a.u.), chaque spectre étant associé à un pH (7,5 < pH < 1 1 ,8) et à une coordonnée de surface, d'une couche mince auto-assemblée obtenue selon le procédé de l'exemple 3 à partir d'une solution des composés 2 et 3 réagissant avec la surface d'une plaque en quartz fonctionnalisée par l'aldéhyde 1.

La figure 4B représente un dessin du contour des 96 spectres montrés en figure 4A, l'axe des abscisses étant le numéro du spectre, et l'axe des ordonnées à gauche étant la longueur d'onde en nm. Ce dessin montre également la composition du gradient continu en deux dimensions (3 → 2 → 3 → 2) de la couche mince auto-assemblée dynamique en fonction du pH (axe des ordonnées à droite) (points blancs) obtenue dans l'exemple 3.

La figure 5 représente le log (composé 2 / composé 3) (axe des ordonnées à gauche et histogrammes) en fonction de la position à la surface en mm pour un support sorti de la solution sur une distance de 24 mm soumise à la formation de gradient 3 → 2 → 3 → 2 en utilisant une modification de pH dans la gamme 7,5 à 1 1 ,94 pour l'exemple 3 (les logarithmes des rapports en composés ont été déterminés par déconvolution de chaque spectre à partir de ceux des composés purs). La figure représente également le pH (axe des ordonnées à droite et points blancs) en fonction de la position à la surface. La position 0 correspond à l'immersion de la plaque.

La figure 6A représente le log (composé 2 / composé 3) (axe des ordonnées à gauche et histogrammes) en fonction de la position à la surface en mm pour un support sorti de la solution sur une distance de 24 mm soumise à la formation de gradient 3 → 2 → 3 en utilisant une modification de pH dans la gamme 7,5 à 11 ,94 et une couche surnageante d'heptane comme indiqué dans l'exemple 4 (les logarithmes des rapports en composés ont été déterminés par déconvolution de chaque spectre à partir de ceux des composés purs). La figure représente également le pH (axe des ordonnées à droite et points blancs) en fonction de la position à la surface. La position 0 correspond à l'immersion de la plaque.

La figure 6B représente le log (composé 2 / composé 3) (axe des ordonnées à gauche et histogrammes) en fonction de la position à la surface en mm pour un support sorti de la solution sur une distance de 24 mm soumise à la formation de gradient 3 → 2 → 3 en utilisant une modification de pH dans la gamme 7,5 à 11 ,94 et sans couche surnageante d'heptane comme indiqué dans l'exemple 4 (les logarithmes des rapports en composés ont été déterminés par déconvolution de chaque spectre à partir de ceux des composés purs). La figure représente également le pH (axe des ordonnées à droite et points blancs) en fonction de la position à la surface. La position 0 correspond à l'immersion de la plaque et les valeurs négatives correspondent à la fonctionnalisation ayant lieu par diffusion à la surface et hors de la solution par la formation d'un film d'eau.

Les figures 7 et 8 représentent les schémas réactionnels de synthèse des composés 2 et 3 utilisés dans les exemples 2 à 4.

EXEMPLES :

Pour démontrer la faisabilité du procédé, les exemples ont été réalisés en mettant en œuvre le mode de réalisation MR1 (support sorti progressivement d'une solution - figure 1 ) avec deux composés porteurs d'une fonction aminé (composés 2 et 3).

Les exemples 3 et 4 illustrent le procédé de préparation de gradients chimiques selon l'invention. L'exemple 1 illustre la préparation d'un support dont la surface comporte des fonctions aldéhydes. L'exemple 2 détaille le mécanisme expliquant le procédé. L'exemple 5 démontre la faisabilité du procédé avec des protéines comme composés porteurs de fonction aminé.

Dans les exemples 1 à 4, les composés 1, 2 et 3 ont les formules suivantes (les contre-ions des composés 2 et 3 étant soit du potassium, soit du sodium) :

Les composés 2 et 3 ont été synthétisés en suivant les schémas réactionnels représentés sur les figures 7 et 8.

CHOIX DES COMPOSES :

Pour pouvoir réaliser une caractérisation quantitative de la composition moléculaire des couches minces auto-assemblées dans l'espace, la méthode d'analyse a été la fluorescence de substrat en verre recouvert de colorants (2 et 3) en utilisant la microscopie confocale en mode spectral car cette méthode est sensible, mais aussi car elle permet de déconvoluer quantitativement les signaux mélangés à partir des spectres des composés purs.

Le composé 1 a été choisi et permet de greffer un aldéhyde aromatique à la silice et les composés 2 et 3 permettent la recombinaison dynamique de fluorophores (figure 1 B). En effet les structures des composés 2 et 3 présentent de nombreux avantages : a) Ils sont solubles dans l'eau à n'importe quel pH. b) Ils présentent des coefficients d'extinction molaire très importants et des rendements quantiques modérés, ce qui permet d'obtenir des signaux de fluorescence extrêmement vifs et permet la détection simple de couches minces. c) Ils sont très résistants aux procédés de dégradation par blanchissage optique. d) Leurs parties conjuguées présentent des structures similaires malgré le fait qu'il y ait un grand écart entre leur longueur d'onde d'émission maximum

(respectivement environ 580 nm et environ 680 nm). e) Le bras espaceur thioalkyl a une taille identique. f) Leurs groupes aminés (respectivement benzylamine et alkylamine), qui sont supposés permettre la liaison dynamique sur la surface recouverte de fonction aldéhyde, ont différents pKa (respectivement 9,5 et 10,5).

ANALYSE DES COUCHES MINCES AUTOASSEMBLEES : a) Mesures QCM (Mesures microbalances à quartz)

Les mesures microbalances à quartz ont été réalisées sur un appareil Q-Sense D300 2 Q-Sense AB (Gothenburg, Suède) pour mesurer la fréquence de résonance des cristaux recouverts de silice et après équilibrage avec de l'éthanol absolu. b) Mesures de fluorescence :

La distribution de la densité de surface des molécules greffées a été déterminée en utilisant un microscope confocal Nikon C1 Si en mode spectral. Comme habituellement dans un microscope confocal, l'échantillon est scanné et la lumière émise par fluorescence est collectée à travers un trou d'épingle. Toutefois, au lieu d'être réduite spectralement par un filtre passe bande et collectée par un seul tube photo-multiplicateur (PMT), la lumière émise est ici réfractée par un réseau, puis finalement collectée par une multianode PMT (jusqu'à 32 canaux). Ainsi, un seul scan délivre simultanément une série d'images spectrales résolues de l'échantillon. Dans ces expériences, les échantillons ont été scannés à une longueur d'onde λ = 488 nm, avec une puissance constante déterminée lors d'expériences préliminaires, et 20 images résolues spectralement ont été collectées dans la gamme de 555 à 745 nm, chacune avec une largeur de bande de 10 nm. Un objectif à immersion dans l'eau 6Ox (NA 1 ,2) a été utilisé, correspondant à un domaine d'images de 100x100 μm ² bien plus petit que la taille caractéristique des gradients de concentration de surface. Un spectre moyen a été calculé sur l'image globale. Les spectres d'émission des échantillons ont été pris le long de la ligne de gradient, la position à la surface étant déterminée en utilisant une règle étalon avec une précision de 0,3 mm.

EXEMPLE 1 : Préparation de supports dont la surface comporte des fonctions aldéhydes.

Protocole expérimental : PRETRAITEMENT DES SURFACES ET GREFFAGE DU COMPOSE 1 a) silanisation des surfaces pour les analyses de fluorescence :

Une plaque de quartz suprasil dont les deux faces ont une qualité optique et de dimension de 32 x 12 x1 mm (Thuet B France) a été immergée dans une solution piranha fraîchement préparée (75-25 volume % de H ₂ SO ₄ et H ₂ O ₂ ) pendant une heure à 90 °C. Après rinçage avec de l'eau ultra pure puis d'éthanol absolu, la surface a été traitée par 10 mM d'une solution de 1 dans le toluène anhydre à température ambiante toute la nuit. La surface a ensuite été rincée plusieurs fois au toluène et séchée sous courant d'argon.

b) silanisation de surfaces pour ellipsométrie et mesure par microscopie à force atomique (AFM) :

Des plaques de silicium avec une orientation (100) et une épaisseur de 0,5 mm (Wafer.lnc. - San José USA) ont été coupées à une taille d'environ 1 x1 cm ² , nettoyées avec un mélange chloroforme / méthanol : 1/1 , puis activées pendant 1 minute dans une solution piranha fraîchement préparée, et finalement traitées par une solution 10 mM de 1 dans du toluène anhydre à température ambiante pendant 1 heure. Les analyses ont été réalisées immédiatement après avoir rincé les plaques au toluène et séché avec un courant d'argon. c) silanisations de surfaces pour des mesures QCM :

Des cristaux de SiO ₂ (50 nm, QSX 303, Q-Sense Company (Suède)) ont été activés en utilisant une lampe UV/ozone pendant 1 heure et insérés immédiatement dans l'appareil QCM pour des mesures in situ.

Une plaque de quartz a été choisie car sa surface est homogène et transparente optiquement. La surface a été activée en utilisant une solution pirhana puis en en l'immergeant dans une solution de l'aldéhyde 1 à 10 mM dans le toluène à température ambiante. Le taux de greffage et la densité de la fonctionnalisation ont été évalués en utilisant une microbalance à quartz et en utilisant l'approche Sauerbrey pour les films solides, qui lie la fréquence des oscillations de cristaux de quartz avec la masse des molécules absorbées à la surface (sensibilité de 2 ng.cm ^"2 ).

Ces résultats indiquent un taux initial de silanisation V ₀ (I) de 12,2.10 ¹⁴ molécules. cm ^"2 .min ^"1 et une densité finale D _f (1_) de 1 ,9.10 ¹⁴ molécules. cm ^"2 après 50 minutes. Le procédé de greffage de cette première couche a également été caractérisé par mesure des angles de contact qui présentaient une variation de Θ _ACJV < 6 avant fonctionnalisation à Θ _ACJV = 65 ± 2 après. L'éllipsométrie a également indiqué une augmentation de l'épaisseur de 16 Â (± 0,13) pour la plaque de silicium jusqu'à 33 Â (± 0,18) après le traitement par le composé 1 (moyenne sur 10 mesures expérimentales). Les images de microscopie à force atomique démontrent une augmentation de la rugosité moyenne (MR) de 0,16 pour la plaque de silice activée, à 0,23 après silanisation (et une rugosité en moyenne quadratique (RMS) évoluant de 0,26 à 0,3 respectivement).

Les données obtenues après la silanisation de la plaque en quartz confirment le fait que le composé 1 forme une couche dense car : a) la variation de l'angle de contact avant et après le traitement par le composé 1 est en accord avec les données rapportées pour une surface recouverte d'aldéhyde, b) les mesures QCM indiquent une densité moyenne finale d'une molécule d'aldéhyde pour une surface de 52 Â ² qui correspond à un degré élevé de fonctionnalisation avec les molécules occupant un espace conique avec un angle d'inclinaison de 14° dans la couche mince auto-assemblée (en considérant une longueur de 16 Â pour le composé 1 tel que déterminé par modélisation moléculaire), c) les données d'éllipsométrie montrent que cette couche mince auto-assemblée présente une épaisseur compatible avec la taille du composé 1 (17 Â), et ce avec une grande homogénéité (déviation standard de 0,18), et d) les images obtenues par microscopie à force atomique démontrent également une grande homogénéité de la couche mince auto-assemblée avec des chaînes perpendiculaires à la surface.

EXEMPLE 2 : Mise en évidence de la fonctionnalisation de la surface du support comportant des fonctions aldéhydes par des composés porteurs de fonctions aminés par formation de liaisons imines et du caractère réversible de la liaison.

Exemple 2a : Mise en évidence de la fonctionnalisation de la surface du support comportant des fonctions aldéhydes par des composés porteurs de fonctions aminés par formation de liaisons imines

Protocole expérimental : Imination des surfaces :

Des plaques en quartz recouvertes d'aldéhydes telles qu'obtenues dans l'exemple 1 ont été immergées dans une solution à 0,1 mM soit de l'aminé 2, soit de l'aminé 3, dans de l'eau ultra pure (le pH a été mesuré comme étant dans la gamme de 7 à 8 à cette concentration). Après 30 min, la surface a été rincée avec de l'eau ultra pure, passée au sonificateur dans de l'eau ultra pure pendant 5 min (pour retirer les composés absorbés physiquement), puis rincée encore une fois. Les plaques ont alors été analysées par mesure des angles de contact (θ composé 2) = 36±2 ; (θ composé 3) = 40±2. Les données d'éllipsométrie indiquent une augmentation de 31 Â après le traitement avec le composé 2, atteignant ainsi une valeur finale de 48 Â (± 0,21 ) pour la couche comportant l'imine condensée (moyenne sur 10 expériences). Les valeurs MR (0,23) et AMS (0,34) ont également été déterminées à partir des images de microscopie à force atomique des plaques en silice fonctionnalisés avec le composé 2. Les surfaces ont été caractérisées par microscopie de fluorescence confocale. En excitant les deux composés avec un laser à 488 nm, les spectres des couches minces ont été obtenus avec une longueur d'onde d'émission maximale à 585 nm pour le composé 2 et 675 nm pour le composé 3. La durée nécessaire pour atteindre l'équilibre (c'est-à-dire le maximum de fonctionnalisation) a été déterminée en comparant les intensités des longueurs d'ondes d'émission pour des durées différentes d'immersion dans la solution. Bien que les intensités de fluorescence n'augmentent plus après 5 min d'immersion, les plaques ont été conservées pendant une durée moyenne de 30 min dans les solutions des composés 2 ou 3. Après cette durée, les surfaces fonctionnalisées apparaissent être homogènes, comme vérifié à deux longueurs d'ondes par microscopie confocale et par des mesures de microscopie à force atomique sur les plaques (voir Figure 2).

Finalement les densités des composés à la surface ont été déterminées en hydrolysant complètement les imines à un pH de 1 (clivage des liaisons imines pour redonner le support dont la surface est recouverte d'aldéhyde et le composé 2 (ou 3) en solution) et en mesurant les intensités de fluorescence totale des composés libérés en solution. Ces expériences ont été réalisées trois fois, à la fois pour le composé 2 et le composé 3, et indiquent une densité moyenne de fonctionnalisation de 1 ,44 (± 0,1 1 ).10 ¹⁴ molécules. cm ^"2 pour le composé 2 et de 1 ,89 (± 0,16) x 10 ¹⁴ molécules. cm ^"2 pour le composé 3.

Les diverses mesures réalisées après la formation de couches minces auto-assemblées de type imine en utilisant soit le composé 2 pur, soit le composé 3 pur, montrent une fonctionnalisation homogène et rapide de cette deuxième couche, car après une durée de 30 min d'immersion : a) les mesures des angles de contact confirment une augmentation importante du caractère hydrophile de la surface, ce qui est cohérent avec la présence de charges provenant des composés (indolinium et sulfate), b) l'augmentation de l'épaisseur de la couche organique à la surface mesurée par éllipsométrie est conforme avec la taille du composé 2 (qui a été évaluée à 31 , 5 Â par modélisation moléculaire dans sa forme allongée), c) la rugosité de la surface imine mesurée par microscopie à force atomique est proche de celle mesurée pour la surface recouverte d'aldéhyde, ce qui indique un degré similaire de fonctionnalisation et de plus, les images montrent que les chaînes des molécules dans la seconde couche sont également perpendiculaires à la surface avec une distribution homogène à l'échelle sub-micrométrique, d) les images de fluorescence par microscopie confocale démontrent également des surfaces homogènes à l'échelle du 10 ^θmθ de μm et les spectres correspondants (Figure 3) sont conformes avec les longueurs d'ondes d'émission maximum de chacun des composés en solution (575 nm et 675 nm pour le composé 2 et le composé 3 dans l'eau), e) les mesures des intensités de fluorescence totale après hydrolyse des imines de la surface à un pH de 1 démontrent une densité de fonctionnalisation de une molécule du composé 2 pour une surface de 69 Â ² , et une molécule du composé 3 pour une surface de 53 Â ² . Ces résultats sont similaires avec la densité mesurée pour la couche mince faîte de l'aldéhyde (composé 1), indiquant ainsi une très grande conversion du procédé de condensation de l'imine et un bon encombrement des imines sur la couche mince auto-assemblée avec des inclinaisons approximatives de 5,8° pour les couches [composé 1 + composé 2] et de 5,3° pour

[composé 1 + composé 3] (en considérant des longueurs moléculaires respectivement de 47,5 Â et 46 Â).

Exemple 2b) : Mise en évidence du caractère réversible de la liaison imine

Protocole expérimental :

La même procédure que pour l'exemple 2 a été utilisée pour les réactions d'échange entre les composés 2 et 3.

L'échange in situ de chaque composé par l'autre a été réalisé pour démontrer la nature dynamique de la surface par des réactions de transimination. En partant de la couche mince auto-assemblée fonctionnalisée par le composé 1 et le composé 2 telle que décrite dans l'exemple 2, la plaque de quartz a été immergée dans une solution 0,1 mM du composé 3 à température ambiante pendant 30 min. Les analyses par microscopie confocale indiquent un échange complet du composé 2 par le composé 3.

Le processus inverse a également été réalisé de manière quantitative en partant d'une surface fonctionnalisée par le composé 3 pour aboutir à une couche mince auto-assemblée fonctionnalisée par le composé 2.

EXEMPLE 3 : Fonctionnalisation d'un support dont une surface est recouverte de fonction aldéhyde avec une solution comprenant deux composés aminés 2 et 3 de pKa différents, en faisant varier le pH de la solution et en sortant progressivement la plaque de la solution, en utilisant une couche hydrophobe au-dessus de la solution.

Protocole expérimental :

Des plaques en quartz recouvertes d'aldéhyde telles qu'obtenues dans l'exemple 1 ont été immergées sur une profondeur de 24 mm dans une solution des aminés 2 et 3 (0,05 mM et 0,1 mM respectivement dans de l'eau ultra pure, la solution étant recouverte d'une couche de 0,5 cm d'heptane (pour minimiser la diffusion de l'eau sur les surfaces hydrophiles lorsqu'elles sont extraites de la solution aqueuse). La plaque a été sortie de la solution progressivement en utilisant un robot lié à un ordinateur à une vitesse de 1 ,2 cm/heure.

Le pH a été mesuré pendant l'extraction de la plaque et de manière concomitante avec l'addition goutte à goutte de solutions soit d'acide trifluoroacétique (pour abaisser le pH), soit de triéthylamine (pour augmenter le pH) dans de l'eau ultra pure. Plus précisément, simultanément au retrait de la plaque de la solution, le pH a été modifié par addition régulière d'une solution de triéthylamine dans l'eau pour atteindre un pH de 1 1 ,85 après un déplacement de 18 mm. Ensuite, une solution d'acide trifluoroacétique dans l'eau a été ajoutée goutte à goutte pour diminuer le pH graduellement jusqu'à 9,99 après un déplacement de la plaque de 6 mm en plus.

Sur les 24 mm totaux du gradient, 35 coordonnées linéaires ont été associées à des valeurs de pH, et la surface a ensuite été analysée par microscopie confocale. Des spectres de fluorescence pour 96 points différents de la surface ont été mesurés, chaque spectre étant associé à sa position et ainsi à une valeur de pH (Figure 4A). A partir de cette série de données, une courbe a été dessinée associant le pH et l'intensité de fluorescence mesurée entre 500 et 800 nm (Figure 4B). Ensuite, chacun des 96 spectres a été déconvolué à partir des spectres de référence des composés 2 et 3, donnant ainsi accès à la quantification individuelle des composés à n'importe quelle position de la surface de la plaque. Les logarithmes du ratio des composés, en fonction des paramètres de pH et de position, sont représentés sur la Figure 5. Les surfaces ont été rincées avec de l'eau ultra pure, passées au sonificateur dans de l'eau ultra pure pendant 5 min, puis rincées encore une fois avant les analyses de fluorescence.

Les mesures réalisées lors de la formation du gradient (3 → 2 → 3 → 2) démontrent l'efficacité du procédé selon l'invention et son potentiel pour la modulation contrôlée des propriétés de surface. Les figures 4 et 5 montrent l'évolution de la composition de la couche mince selon la variation de pH et, en particulier, sa correspondance avec les pKa des composés 2 et 3.

En effet, en partant d'un pH de 7,5, les deux aminés sont présentes sous leur forme ammonium (2H ⁺ et 3H ⁺ ), menant ainsi à la condensation de la plus nucléophile des deux (3H ⁺ ). A une valeur de pH de 9,5 (qui correspond au pKa du composé 2), le greffage commence à s'inverser comme le composé 2 est plus nucléophile que la forme protonée du composé 3 (3H ⁺ J et le maximum de sélectivité est atteint pour un pH de 10. Ensuite, la situation s'inverse à nouveau pour atteindre un 2 ^θmθ point d'isosélectivité à un pH de 1 1 , très proche de la valeur de pKa estimé du composé 3 à 10,5, et ensuite, une sélectivité maximum se produit à pH 1 1 ,8 (le composé 3 étant plus nucléophile que le composé 2).

La couche mince auto-assemblée répond alors de manière inverse lorsque le pH est abaissé jusqu'à 10. La grande symétrie observée tout au long du gradient autour du point isobestique à 655 nm ainsi que la superposition parfaite des spectres obtenus en allant de pH 11 ,8 à 10 à ceux obtenus en allant de pH 10 à 1 1 ,8 indique un procédé complètement réversible et rapide. Les données quantitatives représentées à la Figure 5, et pour lesquelles les distances à la surface sont données à partir du point zéro correspondant à la position initiale d'immersion, montrent l'aspect réel de la surface dans l'espace et sa composition. La déconvolution des spectres des plaques avec les composés mélangés par rapport à celle avec les composés purs donne des valeurs précises de la sélectivité (log du composé 2/ composé 3) allant de + 0,58 à - 0,62. Ce rapport moléculaire est également illustré avec la reconstruction physique de la surface fluorescente en utilisant les intensités relatives des composés sur le gradient de 24 mm et en comparant avec les émissions des composés 2 et 3 purs. La caractéristique importante démontrée ici est la correspondance entre le pH, la position à la surface et la sélectivité. En effet les valeurs de pH reportées sur le graphe sont celles mesurées en solution à une position donnée (c'est-à-dire une qui correspond au point à l'interface entre la solution et l'extérieur).

Le fait que la sélectivité observée à la surface soit en accord avec le pH mesuré, notamment pour les deux isosélectivités qui sont obtenues pour les deux valeurs de pKa, montre qu'une diffusion très limitée des colorants à la surface hydrophile se produit à la sortie des solutions aqueuses. Cette bonne corrélation a été rendue possible par l'utilisation d'une couche surnageante d'heptane pendant le procédé de fonctionnalisation. Des tests similaires ont été réalisés avec trois composés porteurs d'une fonction aminé, qui démontrent que la formation du gradient est effective.

EXEMPLE 4 : Fonctionnalisation d'un support dont une surface est recouverte de fonction aldéhyde avec une solution comprenant deux composés aminés 2 et 3 de pKa différents, en faisant varier le pH de la solution et en sortant progressivement la plaque de la solution, sans utiliser de couche hydrophobe au-dessus de la solution.

Les expériences de l'exemple 3 ont été reproduites avec un gradient 3 → 2 → 3 avec une modification de pH de 7,5 à 1 1 ,94, avec un couche d'heptane et sans couche d'heptane surnageante. Lorsque les expériences ont été réalisées sans utiliser la couche hydrophobe additionnelle d'heptane, la diffusion a été très importante et a ainsi affecté dramatiquement le motif de distribution et a abaissé la sélectivité (comparer les figures 6A (avec couche d'heptane) et 6B (sans couche d'heptane)). Sans couche d'heptane, la diffusion a lieu sur une distance de plusieurs millimètres.

La présence fonctions ioniques dans les composés 2 et 3 rend la surface du support sur laquelle ils sont greffés très hydrophile, ce qui favorise la diffusion. Cette diffusion serait moindre en utilisant des composés plus hydrophobes que les composés 2 et 3.

EXEMPLE 5 : Fonctionnalisation d'un support dont une surface est recouverte de fonction aldéhyde avec une solution comprenant deux protéines.

Les protéines choisies sont l'avidine de poulet et la streptavidine bactérienne, car elles présentent les caractéristiques avantageuses suivants : a) l'affinité spécifique entre la strept(avidine) et la biotine (constantes de dissociation K ₀ ≈ 10 ^"14 - 10 ^"16 M) ; b) la stabilité de leur structure supramoléculaire à la chaleur et à une large gamme de pH (2 à 13) ; c) leurs caractéristiques communes, telles que leur poids moléculaire ; et d) leurs compositions différentes en aminoacides : l'avidine ayant, grâce à sa teneur élevée en résidus arginine et lysine, un pi (point isoélectrique) de 10,4 alors que la straptavidin a un pi proche de 6.

Les capacités du conjugué de l'avidine-fluorescéine (λ _θm = 518 nm - Invitrogen™ ^® ) et du conjugué streptavidine-Texas Red (λ _θm = 518 nm - Invitrogen™ ^® ) à se greffer à la surface comportant des aldéhydes a tout d'abord été testée. Chaque protéine fluorescente a été dissoute dans de l'eau ultrapure à une concentration environ égale à 10 ^"3 M et la plaque de quartz recouverte de fonction aldéhydes a été immergée pendant 30 minutes dans ces solutions. Après retrait de la plaque, rinçage et sonification pendant 2 minutes, les surfaces ont été analysées par microscopie confocale. Les spectres de fluorescences, ainsi que les images des surfaces, ont été enregistrés en utilisant deux lasers différénets pour l'excitation (λ _ΘX = 457 nm pour le conjugué de l'avidine-fluorescéine et λ _ΘX = 514 nm pour le conjugué streptavidine-Texas Red). Les données démontrent le greffage homogène de chacune des deux protéines à la surface avec des spectres de fluorescence très similaires à ceux obtenus dans les solutions correspondantes. Ensuite, les deux surfaces de protéines ont été immergées pendant 30 minutes dans deux nouvelles solutions comprenant le conjugué protéine-fluorophore opposé et les échanges complets d'un conjugué à l'autre ont été confirmés par microscopie confocale pour les deux protéines. Ensuite, l'expérience de compétition entre les deux protéines a été réalisé en faisant varier la position et le pH (dans la gamme de 5 < pH < 1 1 ) dans les mêmes conditions expérimentales que celles de l'exemple 3. Après rinçage de la plaque de quartz, les spectres de fluorescence de 150 positions différentes à la surface ont été mesurées avec une longueur d'onde d'excitation à la surface de 457 nm, et pour 150 autres positions à la surface avec une longueur d'onde d'excitation à la surface de 514 nm. Le tracé des intensités normalisées de chaque composé en fonction de la position et du pH a permis de visualiser le gradient avidine-streptavidine : à pH faible et pour les premières positions sur la plaque, le conjugué de streptavidine-Texas Red a été greffé préférentiellement. Lorsque le pH est augmenté, le conjugué l'avidine-fluorescéine s'est greffé de plus en plus. Le conjugué l'avidine-fluorescéine a été l'unique conjugué greffé pour les pH les plus élevés (pH 15) et les positions les plus éloignées.

Cet exemple démontre la faisabilité du greffage sélectif de protéines et la formation d'un gradient de protéines.