Méthode de préparation de fragments synthétiques d'acides nucléiques bicaténaires

La présente invention concerne une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus.

L'utilisation accrue des techniques de biologie moléculaire tant pour le diagnostic, que comme outil d'analyse des mécanismes cellulaires, nécessite la fabrication de sondes très spécifiques et souvent chimères entre plusieurs espèces moléculaires.

La présente invention fournit une méthode qui permet d'aligner sur un même fragment d'acide nucléique des cibles moléculaires d'origines différentes (virales, bactériennes, végétales, humaines), ainsi que des signaux de traduction, de transcription, de destination, de restriction enzymatique, etc

Ce fragment peut être inséré dans un vecteur plasmidique par exemple, afin d'être clone. Ce vecteur recombinant, ou le fragment qu'il contient, peut être utilisé comme standard de quantification dans des réactions de type PCR, ou encore ^' en tant que sonde spécifique marquée utilisable pour les hybridations in situ, les hybridations ADN/ADN ou ARN/ADN ou encore comme témoin positif dans des tests de détection et/ou quantification d'ADN d'une pluralité de cibles moléculaires, ou encore comme plasmide de transfection, notamment afin d'analyser les processus de régulation de la croissance cellulaire.

La réaction de quantification peut avantageusement être réalisée par

PCR en temps réel. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur le même fragment nucléique permet de quantifier ou de détecter des cibles différentes dans un même échantillon et de les coquantifier, par exemple en utilisant des sondes marquées par des fluorochromes ou autres marqueurs différents. Un

tel fragment peut être utilisé pour la mise en évidence d'une co-infection (par exemple : HIVl -HCV ; HIV2-HCV ; HIVl -HBV ; HIV2-HBV) . Et ₅ Ia quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permet la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR.

Une grande quantité de cibles moléculaires identiques peut être produite par clonage afin de fournir des témoins positifs sans risque de contamination par l'utilisation de l'agent infectieux, et sans avoir à purifier spécifiquement l'ADN ou l'ARN des gènes d'intérêt. Il est, toutefois, évident que cet outil ne peut être utilisé que pour détecter des cibles de séquence connue.

De plus, l'insertion, de ces fragments d'acides nucléiques chimères, dans un plasmide permet la production d'une grande quantité de cible et la construction d'une gamme de quantification à large échelle (de 10 ⁹ copies à 1 copie par essai) . La présence de cibles moléculaires différentes au sein du même fragment nucléotidique permet la co-quantification d'au moins deux cibles dans le même essai.

On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine diverses.

Dans certaines méthodes, les dits fragments sont insérés dans un plasmide et clones en utilisant des sites de restriction pour l'orientation des fragments.

Ces techniques sont éprouvées mais elles présentent l'inconvénient que si plusieurs doivent être mis bout à bout, l'ordre et l'orientation ne peuvent être contrôlés qu'en créant aux extrémités des sites de restrictions uniques, ce qui alourdit considérablement la manipulation.

Dans une autre approche, les différents oligonucléotides sont liées entre eux, en utilisant une ligase qui va permettre, en utilisant les sites de restriction, d'obtenir un seul fragment, puis on effectue l'insertion de cette

construction dans un plasmide. Cette méthode est, elle aussi, assez laborieuse à réaliser.

Le but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode de préparation de fragments d'acides nucléiques améliorée, facile rapide et fiable.

Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant :

- une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation des dits oligonucléotides, suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre déterminé les dits oligonucléotides, les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et antisens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas échéant, et

- une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit grand premier fragment.

Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles

(dimérisation des amorces) . Ce phénomène est observé dans le cas où les conditions de PCR, notamment de température, sont mal adaptées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires.

La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une alternance d'oligonucléotides de séquences directes («sens») ou inverses (encore dénommées « reverses » ou «anti-sens») . Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la séquence d'un oligonucléotide une séquence nucléotidique complémentaire des premiers nucléotides de l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides seront hybrides par leur parties complémentaires, et grâce à l'activité polymérasique, par exemple de la Taq polymétase, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins. Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe et inverse correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré.

Plus précisément , la présente invention fournit une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques par dimérisation d'oligonucléotides et amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes fragments d'ADN synthétiques contigus, comprenant un brin directe 5' — 3' comprenant respectivement les n séquences polynucléotidiques seq^ seq ₂ , seq ₃ , seq _n desdits deuxièmes fragments successivement dans cet ordre, caractérisé en ce que :

1) . On réalise un mélange équimolaire des n oligonucléotides suivants comprenant:

-si n=2p

-p oligomicléotides O ₁ O ₃ , O _2P-1 comprenant respectivement des séquences identiques aux dites séquences d'ordre impair seq _{l 5} seq ₃ ,...seq _{2 t} dudit brin direct, et

-p oligonucléotides O ₂ , O ₄ , O _2p comprenant respectivement les séquences des brins anti-sens complémentaires des séquences d'ordre pair seq2, seq4, seq2p dudit brin direct, et

-si n=2p+ l

-p+1 oligonucléotides O ₁ , O ₃ , O _{2 + 1} comprenant respectivement les séquences identiques aux dites séquences d'ordre impair seq _{l 3} seq ₃ ,... seq _{2p+ 1} du dit brin direct, et

~p oligonucléotides O ₂ , O ₄ ,... O _2p comprenant respectivement les séquences du brin anti-sens complémentaires desdites séquences d'ordre pair seq ₂ , seq ₄ ^sec l _2p dudit brin direct, et

-O _2n ,., comprend à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de la séquence de l'extrémité 3' de O _2m , et apte à s'y hybrider, et

-O _2m comprend à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de O _2m.\ et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 5' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5' de O _{2m+ 1} ,et apte à s'y hybrider,

-O _{2m+ 1} comprend à son extrémité 5' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5' de O _2m , et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de O _2m+2 , et apte à s'y hybrider, et

-O _n comprend à son extrémité 5' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5'de O _n-1 et apte à s'y hybrider si n=2p + l, ou O _n comprend à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de O _n-1 et apte à s'y hybrider si n=2p

-n étant un entier supérieur ou égal à 2, , de préférence de 2 à 8; et m étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1 , et 2m+ l étant inférieur à n

-les dites séquences d'hybridation comprenant au moins 10, de préférence de 10 à 20 nucléotides, et

-chaque dite séquence terminale d'hybridation étant

- une séquence constituant respectivement la séquence de l'extrémité de la séquence d'ordre impair seq _2m+1 correspondante ou la séquence d'extrémité de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m correspondante, et/ou

- une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair seq _{2m+ 1} ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m correspondante,

- chaque dite séquence terminale d'hybridation ne se retrouvant nulle part ailleurs dans les séquences identiques ou complémentaires à l'une quelconque des différentes séquences seq et

2) on réalise une première réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase thermorésistante, sans amorce exogène, comprenant une série de cycles, de préférence au moins 40, comprenant:

2.1) une étape d' hybridation desdits oligonucléotides entre eux dans des conditions de température permettant la totalité des hybridations possibles entre lesdites séquences terminales d'hybridation complémentaires, de préférence à une température inférieure ou égale à 40°, de préférence encore de 37° à 40°C, et

2.2) une étape d'élongation par la dite enzyme polymérase dans les conditions de température et de durée permettant la polymérisation des acides nucléiques de 5' en 3' par la dite enzyme polymérase pour construire

un fragment double brin, de préférence à une température d'au moins 6O ⁰ C, de préférence encore 72 ⁰ C, et

2.3) une étape de dénaturation du fragment double brin obtenu à l'étape 2.2), et

2.4) chaque brin servant de matrice à un nouveau cycle d'étapes 2.1) à

2.3) de dite première amplification à l'aide des dits oligonucléotides, puis

2.5) de préférence, lors du dernier cycle, on s'arrête à l'étape d'élongation 2.2) que l'on prolonge pour une durée totale au moins double de celle des étapes 2.2) de la série de cycles précédent, de préférence une durée d'au moins 5 minutes, et

3) on réalise une seconde réaction d'amplification de type PCR à partir du produit de la réaction d'amplification de l'étape 2.5 , après dénaturation du produit d'amplification de l'étape 2.5), comprenant une série de cycles, de préférence au moins 40 dans lesquels on met en œuvre un jeu d' amorces de séquences, de préférence de 15 à 25 nucléotides, de préférence au moins 17 nucléotides correspondant respectivement pour l'une à celle de l'extrémité 5' et pour l'autre à une séquence complémentaire de l'extrémité 3' dudit brin directe du dit grand premier fragment à préparer et on réalise l'étape d'hybridation à la température optimale d'hybridation des dites amorces, que l'on choisit de préférence à 58°C, et

4) on termine par une étape d'élongation pour obtenir ledit grand premier fragment bicaténaire, et

5) de préférence, on analyse la séquence et/ou la taille du fragment obtenu pour vérifier si elle correspond à celle attendue pour le dit premier grand fragment.

On comprend donc que la séquence de Poligonucléotide O _n = seq _n (incluant dans ce cas la séquence terminale d'hybridation à son extrémité) ou O _n ^seq _n +séquence terminale d'hybridation exogène.

On comprend que chaque dite séquence terminale d'hybridation ne se retrouve nulle part dans O excepté le cas échéant à l'extrémité d'une dite séquence seq _p lorsque ladite séquence terminale d'hybridation constitue l'extrémité de la dite séquence seq _2m+1 (c'est-à-dire lorsque p = 2m+ l) ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m correspondante (c'est-à-dire lorsque p = 2m), ladite séquence terminale de O _p étant identique à la séquence complémentaire constituant l'extrémité correspondante des oligonucléotides O _{+ 1} ou O ₁ le cas échéant.

A l'issue de l'étape 2.1) on obtient un complexe d'hybridation comprenant un brin direct discontinu constitué des oligonucléotides O _2p+1 comprenant les séquences identiques aux séquences d'ordres impair seq _{2p+ 1} et un brin indirecte (ou anti-sens) discontinu constitué des oligonucléotides O _2p comprenant des séquences complémentaires aux séquences seq _2p .

A l'étape 2.2), la température dépend de l'enzyme Taq polymérase mise en œuvre .Le plus généralement, les enzymes sont opérantes dans des températures d'au moins 60°C, les plus répandues à 72°C. La durée de cette étape 2.2) est en fonction de la taille du fragment à polymériser et est comprise en général entre 1 et 2 minutes.

A l'étape 2.2), les différents oligonucléotides servant à la fois de matrice et d'amorce les uns par rapport aux autres successivement, et les extrémités 3' des différents oligonucléotides O _n discontinus servent d'amorces d'élongation dans le sens 5' — 3' et, à l'issue de l'étape 2.2), on obtient un fragment continu comprenant les séquences seq _n contiguës ou espacées par desdites séquences terminales d'hybridation.

Dans la seconde réaction d'amplification les séquences des amorces correspondent à :

-la séquence de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide O ₁ et la séquence inverse complémentaire de l'extrémité 3' de l'oligonucléotide O _n si n=2p + l , ou

-la séquence de l'extrémité 5' de Poligonucléotide O _n et la séquence de l'extrémité 5' de Poligonucléotide O ₁ Si n=2p.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite séquence terminale d'hybridation de O _p est une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair seq _{2m+ 1} ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m correspondante, mais correspondant à la séquence complémentaire constituant l'extrémité correspondante de O _p+1 ou O ₁ correspondante.

Ainsi, plus précisément :

- ladite séquence terminale d'hybridation de l'extrémité 5' de

O _{2m+ 1} peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 5' de la séquence d'ordre impair .seq _2m+1 , mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 5' correspondante de O _2m , et/ou

ladite séquence terminale d'hybridation de l'extrémité 3' de O _{2m+ 1} peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 3' de la séquence d'ordre impair seq _{2m+ 1} , mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 3' de O _2m+2 , et/ou

ladite séquence terminale d'hybridation de l'extrémité 3' deθ _2m peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 3' de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m , mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 3' de la séquence constituant l'extrémité

3'correspondante de O _2m . _j , et/ou

ladite séquence terminale d'hybridation de l'extrémité 5' deθ _2m peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 5' de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seq _2m , mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 5' de la séquence constituant l'extrémité 5 correspondante de O _{2m+ 1} .

Avantageusement, la taille desdits deuxièmes fragments ou oligonucléotides O _n est d'au moins 60 nucléotides.

Cette taille de 60 nucléotides correspond à des fragments incluant au moins une séquence sonde spécifique de 10 à 25 nucléotides encadrée de séquences amorces en 3' et 5' de 15 à 25 nucléotides, permettant ainsi la détection desdites séquences spécifiques dans une méthode d'amplification du type PCR telle que décrite ci-après.

Plus particulièrement, n est d'au moins égal à 3, plus particulièrement encore de 3 à 6.

La méthode selon l'invention est particulièrement utile pour obtenir facilement des dits grands premiers fragments comprenant plus de 180 paires de bases le cas échéant, alors que les synthétiseurs chimiques ne permettent pas d'obtenir des oligonucléotides d'une taille supérieure à 180 nucléotides stable chimiquement, et de séquence conforme à la séquence demandée.

La méthode selon l'invention permet aussi de préparer un dit grand fragment synthétique comprenant au moins une région 3' que l'on peut transcrire en ARN , à partir d'un dit grand premier fragment synthétique d'ADN obtenu à partir desdits oligonucléotides O ₁ -O _n d'ADN dans lesquels on introduit un site de fixation d'une ARN polymérase à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide O dont on retrouve la séquence identique ou complémentaire à l'extrémité 5' de la dite région , et on réalise une étape de transcription en ARN avec la dite ARN polymérase, du dit grand fragment synthétique d'ADN.

Plus particulièrement, pour obtenir un dit grand premier fragment entièrement constitué d'ARN, on insère un site de fixation de l'ARN polymérase à l'extrémité 5' de O ₁ .

Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques obtenu par la méthode selon l'invention, sont insérés dans un plasmide.

La présente invention fournit une technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique. Elle permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode totalement

originale, simple à mettre en œuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux.

Les utilisations en sont multiples : sondes marquées pour la détection d'un ADN ou d'un ARN, cibles moléculaires pour la détection ou la quantification d'un agent infectieux, fragments intégrés dans un plasmide de transfection afin d'étudier la régulation d'un gène, la liste des utilisations possible de cette méthode de construction est non exhaustive.

Son intérêt essentiel est pouvoir grouper sur le même fragment nucléotidique des cibles totalement hétérologues qui pourront être co- détectées ou co-quantifiées dans un même essai. La seule limite est que l'on ne peut s'adresser qu'à des cibles de séquence connue, mais dont la fonctionnalité n'est pas obligatoirement établie.

Comme mentionné ci-dessus, le fragment nucléotidique néosynthétisé selon l'invention est avantageusement utilisé pour la détection et/ou la quantification d'agents infectieux.

La présente invention a en effet également pour objet l'utilisation d'un fragment d'acide nucléique préparé par une méthode selon l'invention ou d'un plasmide en comprenant, comme standard de quantification, témoin positif ou sonde spécifique dans une méthode de détection et/ou quantification de PADN d'une cible moléculaire d'ADN correspondant à au moins l'un des dits deuxièmes fragments.

La présente invention fournit en particulier une méthode de détection de la présence et/ou quantification d'ADN d'un organisme vivant ou microorganisme, tel que de préférence un agent pathogène bactérien, parasitaire, de levure ou viral dans un échantillon contenant de I ¹ ADN à tester, dans laquelle on met en œuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR, de préférence quantitative, de

- l'ADN extrait dudit échantillon à tester et

- d'un fragment d'ADN synthétique préparé par une méthode selon l'invention comprenant au moins un dit deuxième fragment comprenant une

séquence spécifique dudit agent, dans un échantillon témoin positif et/ou dans un échantillon standard servant au calibrage de la quantification.

Plus particulièrement, dans un mode de réalisation,

- on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent pathogène appartenant à un groupe d'une pluralité d'agents pathogènes, de préférence de3 à 8, et/ou on quantifie le dit ADN provenant d'un dit groupe d'agents pathogènes, et

- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif et/ou standard de quantification, un grand premier fragment d'ADN synthétique obtenu par une méthode de préparation selon l'invention regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents dudit groupe.

Plus particulièrement, de façon connue, ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR des dites séquences spécifiques.

Dans ces méthodes de détection et/ou quantification d'ADN, comme mentionné ci-dessus, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans chacune des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide contaminant.

Le dit grand fragment comprend donc, en outre avantageusement, au moins une séquence exogène comprenant, de préférence encore, un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans

l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents du dit groupe.

Ainsi, on peut mettre en oeuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles :

1 - on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée,

2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et

3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, par l'une au moins des étapes suivantes :

- 3a-. on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction.

Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré.

- 3b-On réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires (ou dit »deuxième fragment »), et une sonde spécifique de la dite séquence exogène contenant le site de restriction.

Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié.

La technique de PCR en temps réel consiste en une PCR classique en utilisant une amorce de séquence directe et inverse, et une sonde dite « d'hydrolyse » apte à être hydrolysée par la Taq polymérase. Ladite sonde est marquée par un fluorophore en 5' et un agent bloquant en 3' permettant quand la sonde est hydrolysée une émission de fluorescence qui est proportionnelle aux nombres d'amplifiats. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier. Cette hydrolyse permet la libération de la fluorescence et ainsi peut permettre une quantification .Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux amorces et une sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec un fluorophore différent.

Avantageusement et plus particulièrement, on met en œuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le dit grand premier fragment contient parmi les dits deuxième fragments, un dit deuxième fragment comprenant une séquence spécifique d'un agent de quantification de l'échantillon à tester apte à permettre la quantification de la réaction d'amplification tel que une séquence spécifique de l'albumine.

L'albumine est en effet présente uniquement en 2 copies dans les cellules humaines et la mesure du signal de cette séquence permet donc la quantification du nombre de cellules initiales.

Plus particulièrement encore, le dit grand premier fragment comprend le fragment des positions 16280-16425 de l'exon 12 du gène de l'albumine

humaine de référence Genebank Ml 2523 de séquence du listage de séquence suivante :

SEQ .ID.n° l = 5'-GTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATC

GT (CTC GAGITTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGC CCACACAAA TCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCA GCAGCTCCCATGAGTTTGG-3'

Dans un mode de réalisation particulier visant à illustrer l'application de l'invention, ledit grand premier fragment comprend de I ¹ ADN provenant d'un agent viral appartenant au groupe des virus HIV-I , HIV-2 et HCV.

Plus particulièrement, lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées comprennent :

- pour le virus HIV l ,:le fragment des positions 522-642 du gène LTR de HIVl de référence Genebank K03455

- pour le virus HIV2, le fragment des positions 56-144 du gène LTR de HIV2 de référencez Genebank Ml 5390:

- pour le virus HCV ₅ Ie fragment des positions 145-211 de la région UTR 5' du virus HCV de référence genebank AY 460204

Plus particulièrement, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées seq de HIVl ,

HIV2 et HCV, incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage AIu 1 (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et se terminant le cas échéant par une dite séquence d'hybridation endogène (en italiques) ou exogène (en italiques et gras), comprennent les séquences suivantes du listage de séquences incluant ainsi que les séquences complémentaires :

-pour HIV 1 :

SEQ .ID. n°2 = δ'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTG AG(AGCT)TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAAC TAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT GGCGCCCGλACAGGGλCCT-y

- pour HIV 2:

SEQ. ID. n°3 = 5 - GAACAGGGACCTAGC AGGT AGAGCCT GGGυ G

TTCCCTGCT(AGCT-) CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGCCCCACGCT TGCTTTGCTTAAA-3'

- pour HCV:

SEQ .ID n°4 = 5'-AGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAAT TGCCAGGAACGACCfAGCnCCTTTCTTGGATTAACCCGC-3'

Plus particulièrement, le dit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques de HIVl , HIV2 et HCV présente la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et une dite séquence d'hybridation endogènes (en italiques) ou une séquence complémentaire :

SEQ .ID. n°5 = S'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTG AGfAGCT)TCAAGTA GTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAAC TAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT GGCGCCCGX^ CXGGG/ëCCTAGCAGGTAGAGCCTGGGTGTTCCCTGC TrAGCTKACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTTGCTTT GCTTAAAGAGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGG AACGACCAGCTCCTTTCTTGGATTAACCCGCTCAA-3'

Dans un autre mode de réalisation illustrant l'invention, ledit grand premier fragment comprend de l'ADN provenant d'un agent viral appartenant à un groupe comprenant au moins 2, de préférence au moins 3, virus parmi les virus HPV 16, HPV 18, HPV 31 , HPV 33, et HPV 45.

Plus particulièrement, lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées comprennent :

- pour le virus HPV 16, le fragment des positions 24-159 du gène E6 de référence Genebank NC 001526-

- pour le virus HPV 18,1e fragment des positions 472-576 du gène E7 de référence Genebank AY262282,

- pour le virus HPV 31 , le fragment des positions 474-554 du gène E6 de référence Genebank J04253,

- pour le virus HPV 33, le fragment des positions 487-552 du gène E6 de référence Genebank PPH33CG,

- pour le virus HPV 45, le fragment des positions 496-565 du gène E6 e référence Genebank X74479.

Plus particulièrement encore, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées seq p de

HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 et HPV45, incluant des séquences sondes(soulignées) encadrées par des séquences amorces(en gras), le cas échéant des séquences d'hybridation endogènes (en italiques) et exogène (en italiques et gras ) et un site de clivage Xho 1 (entre parenthèses), comprennent les séquences suivantes du listage de séquences ainsi que les séquences complémentaires

-pour HPVl 6:

SEQ ID. n°6 = S'-GrT^Gr^-T^CTAAGGGCGTAACCGAAATCGG TTGACTCGAGACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAA AGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTA CCACAGυυAυ GCACAGAGCT-V

- pour HPVl 8:

SEQ ID. n°7 = 5 - GCA C46^GCrAAAAACGACGATTTCACAACC ATAGCTGGGCACTCTCGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGC ACGACAGGAACGACTCCAACGACGC4G/4G-3'

- pour HPV31 :

SEQ ID . n°8 = 5 ' rGG^ r^^lA^GAAACGATTCCACAACATAGG

AGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTCG

TACTGAAACCCAAGTGT^GTγ^Gγ^γ^L4-3'

- pour HPV33:

SEQ.ID. n°9 = 5'-GMTTTCMTAATATTTCGGGTCGTTGGGCAGG GCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA-S'

- pour HPV45:

SEQ .ID. n° 10 = 5 '-GACAGTAC CGAGGGCAGT GTAATACATGTT

GTGACCAGGCACGGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGA^rgg^r

AAAAA G-V

Avantageusement, le dit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques modifiées de HPV16, HPV18, HPV31 , HPV33 et HPV45 et du gène de l'albumine avec une dite séquence exogène d'hybridation comprend la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras)et des dites séquences d'hybridation endogènes (en italiques), ou une séquence complémentaire :

SEQ. ID. n° l l = δ'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCAG GGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCACT TGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCACGG CAAGAAAGACTT C GCAGACGTAGGGAA γGGM TMMMMMGAAAC GATT

CCACAACATAGGAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTG GAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAGTTAGTγMG:L4TMMCTA AGGGCGTAACCGAAATCGGTTGAFCTCGAG)ACCGGTTAGTATAAAAG CAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA

GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT^TGC^ CAGAG CT KKKKKCG K

CGATTTCACAACCATAGCTGGGCACTFCTCGAG^GCCAGTGCCATTCG

TGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACGACGC^G^GGTγG

CT GT CAT CT CTT GT GGGCT GTAATCATCGT(CTC GAG)TTAAGAGTAA TATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTG TCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTG G-3'

La méthode selon la présente invention est une méthode totalement originale, simple à mettre en œuvre, rapide, fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence aux figures 1 à 8, dans lesquelles :

- la figure 1 représente le schéma du principe général de construction d'un fragment nucléotidique chimère à partir de trois oligonucléotides ;

- la figure 2 représente le schéma de construction du fragment de l'exemple 3 ;

- la figure 3 est une photo de l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarosebromure d'éthidium 1 ,5% du produit de la deuxième PCR pour la construction HPV16, HPVl 8, Albumine de l'exemple 3 ;

- les figures 4 et 5 représentent les courbes de détection et quantification de HPV 18 et la figure 6 celle de l'Albumine à l'exemple 4 ;

- les figures 7 et 8 montrent la linéarité des réactions en HPV 16 ou 18 de l'exemple 4.

Dans les exemples qui suivent le principe général de la construction d'un fragment nucléotidique chimère à partir de trois oligonucléotides comprend les étapes 1) à 3) suivantes illustrées sur la figure 1 :

1) Choix des oligonucléotides :

Les séquences sont choisies selon les besoins de l'utilisateur.

Quand le nombre et la nature des cibles moléculaires sont identifiés, le nombre d'oligonucléotides à faire synthétiser va dépendre de la longueur du fragment nucléotidique désiré. Les sociétés commerciales ne peuvent synthétiser de façon fiable que des oligonucléotides dont la longueur n'excède pas 180 nucléotides. Les séquences sont déterminées, en établissant une alternance d'oligonucléotides en séquence directe (I ₁ et 3 _t ) ou inverse (2j) . La séquence des oligonucléotides est établie en positionnant à l'extrémité 3' du premier oligonucléotide (I _j ) une séquence (4 _t ) de dix nucléotides complémentaires des 10 derniers nucléotides (5 _t ) de l'extrémité y de Foligonucléotide antisens suivant (2 _t ) , qui contient dans son extrémité 5' dix nucléotides complémentaires (O ₁ ) des 10 premiers nucléotides (I ₁ ) de l'extrémité 5' de Foligonucléotide sens suivant (3^, et ainsi de suite.

Il faut également faire synthétiser des amorces de PCR directe (S ₁ ) et inverse (9 _j ) ayant un température de fusion (Tm) entre 60°C et 62°C, dont la séquence correspond à celle des extrémités 5' et 3' de la construction finale.

2) Mise en continuité des oligonucléotides (PCR n° 1 figure 1):

Une première réaction de PCR est réalisée en introduisant dans le milieu réactionnel classique avec une Taq polymérase traditionnelle, tous les oligonucléotides (I ₁ , 2 _{l 5} 3 _{l 3} S ₁ , C ⁾ ₁ ), nécessaires à la construction du fragment, en équimolarité. Une température d'hybridation de 37 ⁰ C favorise une dimérisation des oligonucléotides par (2A) hybridation des parties complémentaires des oligonucléotides (séquences de dix nucléotides complémentaires dans les régions 5' et 3' de chacun d'eux 4 ₁ -5 ₁ -, O ₁ -T ₁ ) . Puis

(2B) une réaction d'élongation par polymérisation de 5' en 3' permet de synthétiser le fragment sens complet (voir schéma) .

3) Production du fragment attendu (PCR n°2 figure 1):

Le produit de la réaction précédente va servir de matrice pour une deuxième réaction de PCR classique dans laquelle les amorces (8 _{l 9} 9^

utilisées correspondent aux séquences 5' et 3' du fragment final. Pour cette réaction, il est intéressant d'utiliser une Taq polymérase Hotstart (enzyme dont le site actif est bloqué par un anticorps ou un ligand chimique : dans ce dernier cas, l'enzyme sera activé par chauffage à 95°C), la température d'hybridation et la température optimale d'hybridation des amorces est fixée à environ 58°C. Le produit final est analysé sur gel d'agarose : si sa taille correspond à la taille attendue, le fragment est purifié en utilisant le kit Qiaquick PCR purification kit Qiagen (Courtaboeuf France). Il peut alors être séquence directement ou clone dans un plasmide. Dans le cas ou le fragment est clone, les fragments insérés dans les plasmides recombinants sont amplifiés par PCR, et séquences. Le clone recombinant qui contient le fragment de séquence attendue, peut être purifié et utilisé comme sonde en vue d'hybridation ultérieure.

Cette technique a été utilisée pour la construction de plasmides de détection et de quantification de virus par PCR en temps réel utilisant des sondes fluorescentes : HIVl , HIV2, HCV, HPVl 6, HPVl 8, HPV31 , HPV33, • HPV45.

Exemple 1 : Construction avec deux oligonucléotides :

Plasmide permettant la détection et la quantification de virus à ARN : HIV1 -HIV2-HCV.

1) Séquence des oligonucléotides :

1.1) Oligonucléotide HIVl (sens) : gène LTR 522-642 référence K03455

SEQ. ID. n°2 = 5 '-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTG AG (AGCT)TCAA GTAGTGTGTGC CC GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAAC TAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT GGCGCCCGAACAGGGACCT-3 '

En gras : amorce sens et antisens ; en soulignement : la sonde Taqman ; entre parenthèses : le site de restriction AIu 1 ; en italiques : la séquence d'hybridation endogène des oligonucléotides.

1.2) Oligonucléotide HIV2-HCV (antisens) incluant les séquences inverses de SEQ.ID.n°3 et 4 :

-Pouf HIV2 gène LTR 56-144 référence Genebank : M15390

- Pour HCV région 5'UTR 145-211 référence Genebank : AY460204

SEQ. ID. n°12 = 5'-TTGAGCGGGTTTATCCAAGAAAGG(AGCT)U

GTCGTCCTGGCA A TTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCTC J ¹ TT AAGCAAGCAAGCGTGGGGCCGT CT GCCCAGCACCGGCCAAGTG(AGC TU GCA GGGAACACCCAGGCTCTACCTGCT AGGTCCCTGTTC-3 '

En gras : amorces sens et antisens HCV ; en double soulignement : la sonde Taqman HCV ; en gras doublement soulignées : amorce sens et antisens HIV-2 ; en souligné, la sonde taqman HIV-2 ; entre parenthèses : les sites de restriction AIu 1. En italiques : séquence d'hybridation endogène des 2 oligonucléotides.

2) Séquence des amorces dites de construction : Amorces d'amplification pour la deuxième PCR

Cons dir : CACTGCTTAAGCCTCAATAA

Cons rev : TTGAGCGGGTTTATCCAAGA

3) Séquence finale du fragment néosynthétisé de 296 paires de bases SEQ .ID. n°5 = 5'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAG(AG CT)TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAG ATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGC CCGyL40IGGG^CCTAGCAGGTAGAGCCTGGGTGTTCCCTGCT(AGCT) CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTTGCTTTGCTTAA AGAGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGAACGAC çAGCTCCTTTCTTGGATTAACCCGCTCAA-3'

Exemple 2 : Construction avec trois oligonucléotides

Plasmide permettant la détection et la quantification des papillomavirus humains HPV 16 et 18 et du gène de l'albumine humaine.

1) Séquences des oligonucléotides :

Dans les séquences suivantes sont représentées :

-En italiques : les séquences d'hybridation des oligonucléotides.

-En gras : les séquences des amorces directe et reverse pour la PCR en temps réel.

-En souligné : la séquence de la sonde d'hydrolyse de type Taqman marquée FAM pour HPVl 6 et 18 et VIC pour l'albumine

-Entre parenthèses : le site de restriction Xhol

1.1) Oligonucléotide HPV16 (sens) : gène E6 nucléotides 24 àl 59 référence Genebank : NC_001526 correspondant à

SEQ. ID n°6 = i 'Grr^Gr^ r^CTAAGGGCGTAACCGAAATCGG TTGA(CTCGAG)ACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAA AAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTT ACCACAGυυAυGCACAGAGCT-3 '

1.2) Oligonucléotide HPVl 8 (antisens) : gène E7 nucléotides 472-567 référence Genebank : AY262282, inverse de

SEQ. ID. n°7 = 5'- C-TCrGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTCG GTTGCAGCAC GAATGGCACTGGC (CTC GAG)A GTGCC CAGCTAT GTT

GTGAAATCGTCGTTTTT^GCrcrGTGC-i '

1.3) Oligonucléotide Albumine sens : Exon 12 nucléotides 16280-

16425 référence Genebank : M12523,

SEQ. ID. n°13 (incluants Eg. ID. n°1) = S'-CGλCGCλGλGGTTGCυG T CAT CT CTT GT GGGCTGTAATCATC GT(CTC GAG)TTAAGAGTAATAT TGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCT TTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG-S'

2.) Séquence du fragment de 388 paires de bases à obtenir :

SEQ. ID. n°14 = 5'-GTTMGrMrMMCTAAGGGCGTAACCGAAATC GGTTGACTCGAGACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCA AAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGT TACC ACAGTT ATGCAC AG AGCTA AAAACGACGATTTCACAACCATAG çTGGGCACTCTCGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACG ACAGGAACGACTCCAACGACGCMGMGGTTGCTGTCATCTCTTGTGGG CTGTAATCATCGTCTCGAGTTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATG CCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGA AAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG-3'

Exemple 3 : Construction avec cinq oligonucléotides HPV 31-33-45-

16-18-alb.

Ce fragment a été construit selon la méthodologie décrite précédemment et dont le schéma de construction est présenté sur la figure

2:

1) Séquences des oligonucléotides :

1.1) Séquence de l'oligonucléotide HPV 33 et 45 (sens):

SEQ. ID. n°15 = δ'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCAG GGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCACT TGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCACGG CAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGATAAAAA-S'

1.2) Séquence de l'oligonucléotide HPV 31 (antisens de SEQ.ID.n°8) = 5'-TTMTMCTMMCTMCACTTGGGTTTCAGTACGAGGTCT TCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTGTCCACCTGTCCTCCTATGTTGT GGAATC GTTT CTTTTTATCCA-y

Les oligonucléotides qui contiennent les cibles moléculaires pour

HPVl 6, HPVl 8 et l'albumine sont identiques à ceux précédemment décrits.

2) Séquence de 631 paires de bases du plasmide HPV 16, 18, 31, 33, 45 et Albumine :

SEQ. ID. n°l l = δ'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCAG GGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCACT TGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCACGG CAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGMTMMMMMGAAACGATT CCACAACATAGGAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTG GA GAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTA GTTAGXTMGTMTMMCTA AGGGCGTAACCGAAATCGGTTGAfCTCGAG)ACCGGTTAGTATAAAAG CAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTMTGCMCMGMGCTAAAAACGA CGATTTCACAACCATAGCTGGGCACT(CTCGAG) GCCAGTGCCATTCG

TGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACGA CGCMGMGGγγG

CTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTCGAG)TTAAGAGTAA TATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTG TCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTG G-3'

3) Mode opératoire général pour la construction, de tous les types de fragments (figure 2):

I ₂ = oligo HPV ₃₃ -HPV ₄₅

2 ₂ = oligo HPV ₃₁

3 ₂ = oligo HPV ₁₆

4 ₂ = oligo HPV ₁₈

S ₂ — oligo albumine

3.1) Première PCR : les oligonucléotides I ₂ , 2 ₂ , 3 ₂ , A ₂ , 5 ₂ sont introduits en équimolarité (0,2mMol) dans un tampon de polymérase IX MgC12 (l,5mMol), dNTP (0,2mMol), 0.2μl de Taq polymérase (toche) à 5U/μl dans un volume réactionnel final de 50μl . Programme de PCR : 95°C 2min ; puis 40 cycles 94°C 30s, 37°C 1min, 72 ⁰ C lmin30s ; 72°C 5min retour à 4°C.

3.2) Deuxième PCR : elle permet d'obtenir le fragment final 6 ₂ contenant bout à bout les cibles attendues. 1 μl du produit d'amplification de la première PCR est ajouté au mélange réactionnel contenant les amorces sens I ₂ et antisens 8 ₂ (0,2 mMol) spécifiques des extrémités du fragment attendu, dans le tampon IX de la taq polymérase MgC12 (l ,5mMol), dNTP (0,2mMol), 0.2μl de Taq polymérase Hotstar (Qiagen) à 5U/μl dans un volume réactionnel final de 50μl . Le programme d'amplification est : 95°C 15min (activation de la Taq polymérase); puis 40 cycles 94°C 30s, 58°C 1min, 72 ⁰ C lmin30s ; 72°C 5min retour à 4°C. Le produit de PCR est analysé sur gel BET agarose 1 ,5% dans du tampon TBE 0,5X.

La photo de l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1 ,5% du produit de la deuxième PCR pour la construction HPVl 6, HPVl 8, Albumine est représentée figure 3.

Le fragment sera purifié (kit Qiaquick PCR purification kit Qiagen Courtaboeuf France) . Ce fragment peut être séquence directement ou mieux, inséré dans un plasmide pour être clone.

3.3) Clonage du fragment :

Le fragment obtenu est directement clone dans le plasmide PGEMT easy on utilise le kit pGEM® T Easy Vector System 2 (Promega®,

Madison, Wisconsin, USA) .

3.4) Réaction d'insertion du fragment et de recircularisation du plasmide :

2 μl du fragment précédemment obtenu (environ 100 ng) sont introduits dans le mélange réactionnel contenant 5 μl de tampon de la ligase,

1 μl de T4 DNA ligase et 1 μl de plasmide PGEM T linéarisé et déphosphorylé. Le volume final est 10 μl. Le produit de ligation est incubé à

15°C pendant une nuit.

3.5 ^" ) Réaction de transformation :

7 μl du mélange réactionnel précédent sont mélangés à 50 μl de cellules compétentes {εLscherichia CoIi JM 109) et maintenues pendant 20 minutes dans la glace puis incubées pendant 1 minute à 42 ⁰ C. Après aj out de 950 μl de LB broth (USB®, Cleveland, Ohio, USA), et incubation pendant lh.30 à 37 ⁰ C, 500 et 250 μl de ce milieu de culture sont étalés sut 2 boites de Pétri contenant du LB agar (USB®, Cleveland, Ohio, USA) avec 100 μg/ml d'Ampicilline. Les boîtes sont incubées pendant une nuit à 37°C. Les colonies recombinantes sont déposées à la fois dans 50 μl d'eau distillée stérile et sur une boîte de LB agar Ampicilline.

Les colonies prélevées sont analysées par PCR : on utilise 5 μl de suspension bactérienne dans l'eau distillée et le milieu réactionnel de PCR précédemment décrit, qui contient le couple d'amorces Ml 3 (10 pm/μl) dont les séquences sont présentes de part et d'autre du polylinker du plasmide.

Séquence de ces amorces.

M13 direct : 5'CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3' (2949-2972)

M13 reverse : δ'TCACACAGGAAACAGTTATGACS' (176-197)

Le programme de PCR est identique à celui utilisé pour la deuxième étape de la construction. Les produits de PCR obtenus sont analysés sur un gel BET Agarose à 1 ,5 % dans du tampon TBE 0,5 X. Les fragments de la taille attendue sont purifiés en utilisant le kit QlAquick® PCR Purification Kit 250 PCR Qiakit (Qiagen®, Courtaboeuf, France). Ils sont ensuite séquences en utilisant le Big Dye® Terminator Vl .1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®, Warrington, UK) et 3,2 pmol/μl d'amorces Ml 3 directe et reverse, chromatographiées sur le séquenceur ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems®). La séquence obtenue est comparée à la séquence du fragment attendu (Figure IV) en utilisant par exemple les programmes auto assembler et Séquence Navigator (Applied Bisosytems®) . Un des clones recombinants, dont la séquence du fragment inséré est conforme à la séquence attendue, va être produit en grande quantité dans 100 ml de LB BROTH Ampicilline et purifié selon le protocole High Speed Plasmid Midi

Kit (Qiagen®, Courtaboeuf, Ftance) . Le plasmide purifié est ensuite stocké à -2O ⁰ C. La souche recombinante sélectionnée est congelée à - 80°C.

La concentration plasmidique est déterminée par la mesure de la densité optique à 260 nm, le nombre de copies de plasmide donc de copies de cible pourra être calculé selon la formule suivante :

Une unité de densité optique (DO) à 260 nm est estimée à 50 μg/ml d'ADN double brin : DO 260 nm x 50 = A xl O ^"6 g/ml de plasmide dans la solution de plasmide purifié.

Taille du plasmide = Taille de PGEMT easy + Taille du fragment = B pb x 2 =C bases.

La masse molaire d'un nucléotide est estimée à 330 Daltons (g/mole) . La masse molaire du plasmide sera : C x 330 = D g/mole.

La concentration du plasmide sera donc de A x 10 ^"6 /D = E mole/ml x nombre d'Avogadro (6,023.10 ²³ ) = Nombre de copies de plasmide /ml d'extrait.

De cette valeur est déduite le nombre de copies de plasmide présent dans l'échantillon.

Pour la construction de la courbe de quantification, on utilise comme point de départ, une dilution plasmidique correspondant à 10 ⁷ copies/réaction. La gamme de dilution s'échelonne de 10 ⁷ à 1 copie/réaction.

Exemple 4: Utilisation, d'un plasmide de détection et de quantification obtenu en utilisant la technique selon l'invention.

Les résultats présentés concernent uniquement le plasmide qui contient les cibles pour HPVl 6, HPVl 8 et l'albumine humaine. Les résultats obtenus avec les autres constructions sont absolument identiques à ceux présentés ci-dessous.

D construction HPV16 /HPV18 et Albumine :

On a utilisé une réaction de PCR en temps réel en double fluorescence afin, de détecter et de quantifier les virus au sein d'échantillon ainsi que le gène Albumine afin d'établir la relation entre la charge virale et le nombre de cellules infectées. Les sondes HPV 16 et 18 sont marquées avec le fluorochrome FAM alors que la sonde Albumine est marquée avec le fluorochrome VIC. Pour la mise au point de la réaction de PCR en temps réel en double fluorescence, on utilise la gamme plasmidique de quantification. On fait varier les quantités respectives d'amorces et de sonde, afin de conserver la même valeur de CT en mono-fluorescence et en double fluorescence. Les conditions expérimentales retenues sont celles pour lesquelles les valeurs de CT sont identiques en simple et double fluorescence. Les résultats sont présentés sur les figures 4 à 6.

Sur la figure 4, on montre la détection de HPVl 8 et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 10 ⁷ , 10 ⁵ ,10 ³ copies pour 5μl d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter HPV16 : courbes A ₃ , C ₃ et E ₃ ; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les amorces permettant de détecter à la fois les gènes de HPVl 6 et de l'albumine humaine : courbes A ₄ , C ₄ et E ₄ .

Sur la figure 5, on montre la détection de HPVl 8 et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 10 ⁷ , 10 ⁵ ,10 ³ copies pour 5μl d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter HPV18 : courbes A ₂ , C ₂ et E ₂ ; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les amorces permettant de détecter à la fois les gènes de HPVl 8 et de l'albumine humaine : courbes A ₇ , C ₇ et E ₇ .

Sur la figure 6, on montre la détection du gène de l'albumine humaine et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 10 ⁷ , 10 ⁵ , 10 ³ copies pour 5μl d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter l'albumine : courbes A ₁ , C ₁ et E ₁ ; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les

a E _{h ill dtc} noarn _{iie ga} morces permettant de détecter à la fois les gènes de HPVl 6 et 18 et de l'albumine humaine : courbes A ₄ et C ₇ , A ₇ et E ₇ , E ₄ et A ₁

2) Evaluation de la technique :

On a mesuré les valeurs de CT (« cycle theshold »). Il s'agit du point s'intersection entre la ligne de base de la réaction et la courbe logarithmique de représentation de l'amplification. Cette valeur de CT correspond au nombre de cycle d'amplification nécessaire pour que l'amplification commence. Elle est en relation avec la concentration du produit nucléique à quantifier, à savoir que plus le CT est bas plus la concentration est élevée.

Les valeurs de CT obtenues pour la gamme plasmidique d'étalonnage lors de manipulations différentes s'échelonnent entre 17 pour le point 10 ⁷ copies et 37 pour le point 1 copie. La pente de la courbe standard varie de - 2.8 à - 3.7 et le coefficient de corrélation de 0.96 à 0.99.

2.1) Résultats pour HPV 16

Valeur du CT

Moyenne Minimum Maxim um Coefficient Nombre* de variation

(%)

10 ⁷ 17,142 16,840 17,570 1 ,7 8

10 ⁶ 19, 8

Fl 839 19,180 20,460 1 ,9

10 ⁵ 21 ,558 21,090 21,910 1,1 8 10 ⁴ 24,887 24,430 25,350 1,3 8 v> 10 ³ 28,185 27,650 28,680 1 ,3 8 rj

O 10 ² P-ι 31 ,428 30,930 31,860 0,9 8

10 ¹ 34,366 31,470 35,450 3,6 8

56 32,965 32,440 33,800 1 ,9 4 tn 83 d 29,325 28,570 30,280 2,9 4

87 20,771 20,464 21,176 1 ,5 4

126 31,590 30,020 33,070 3,7 6 137 29,618 28,120 30,430 2,7 6

140 31,237 29,460 32,350 4 6

E _ht cna

2.2) Résultats pouf HPV 18

Valeur du CT

Moyenne Minimum Maximum Coefficient Nombre* de variation

10 ⁷ 17,582 16,670 18,030 2,8 8 a 10 ⁶ 20,510 19,950 20,980 1,8 8

û ni 10 ⁵ 22,261 21,420 23,450 2,9 8 bβ

<υ 10 ⁴ 25,596 24,850 26,080 1,9 8 Ti

10 ¹ 35,635 33,830 37,040 3,5 8

93 33,975 33,510 34,640 1,4 4

94 17,035 16,570 17,380 2,3 4

97 23,162 22,690 23,740 f) 2,2 4

0 125 31,540 30,670 32,390 2,7 4

126 31,785 31,220 32,310 1,8 4 131 32,880 32,190 33,470 1,6 4

132 34,185 33,080 35,290 3,1 4

139 34,395 33,060 35,230 2,9 6

2.3) Résultats pour l'ALBUMINE

Valeur du CT

Moyen n e Minim um Maximum Coefficient Nombre* de variation

10 ⁷ 17,044 16,850 17,240 0,7 8 a 10 ⁶ 19,729 19,330 20,180 1,7 8

B 10 ⁵ 21,647 21,130 22,400 1,7 8 bβ

V 10 ⁴ 24,983 24,650 25,230 0,8 8

""d

-M 10 ³ 28,422 28,090 28,930 1 8

O 10 ² 31,797 31,300 32,270 1,1 8

10 ¹ 33,871 32,780 34,570 1,7 8

97 23,885 23,400 24,320 1,9 4

125 24,537 24,050 25,100 2,1 4

126 26,453 25,680 26,940 1,8 8

130 20,508 20,260 20,950 1,5 4

131 23,212 22,950 23,470 0,9 4 137 25,097 25,060 25,180 0,2 4

138 23,055 22,680 23,240 1,1 4

140 28,828 28,420 29,250 1,2 6

* Nombre de points de gamme ou d'échantillons testés

2.4) Calcul du coefficient de variation pour chaque point de gamme et quelques échantillons positifs. Ces calculs sont effectués à partir des valeurs en CT.

La réaction est donc linéaire et son efficacité est maximale. Le seuil de détection peut être fixé à 5 copies soit un CT de 36. Cette technique permet d'évaluer la qualité de l'échantillon et de l'extraction de l'ADN grâce au dosage du gène de l'albumine (Le CT de l'albumine doit être < 31), soit environ 50 cellules nucléées. Nous évitons également ainsi, de rendre des résultats faussement négatifs.

Les résultats concernant la linéarité des réactions en HPV 16 ou 18 à partir d'un extrait d'ADN de cellules cervicales dilué selon un pas de raison dix les résultats sont présentés sur les figures 7 et 8.

Les figures 7 et 8 présentent les valeurs des CT obtenus pour la quantification de HPV 16 et respectivement HPVl 8 à partir d'un extrait d'ADN de cellules cervicales dilué 1 à 10 ^"5 et testé en double.

La linéarité de la réaction est bonne, puisqu'une dilution au 1 / 10 ^e correspond à une augmentation du CT d'environ 3 unités et ceci jusqu'à une copie pour 5 μl d'échantillon.

La reproductibilité est excellente : les coefficients de corrélation sont de 99.7 pour HPV 16 et 98.9 pour HPV 18.

3^ Calcul de la charge virale en HPV 16 et HPV 18

La charge virale de l'échantillon est déterminée en se référant à la gamme d'étalonnage qui est présente au sein de chaque plaque de dosage. Afin de comparer les échantillons entre eux, la charge virale est exprimée par million de cellules humaines nucléées présentes dans l'échantillon. La détermination du nombre de cellules humaines est rendue possible par la quantification du nombre de copie du gène de l'albumine présente dans l'échantillon d'ADN de cellules cervicales testé.

Le calcul est le suivant :

Charge virale (copies HPV / 10 ⁶ cellules)= (nombre de copies d'HPV/0.5x nombre de copies d'albumine) x 10 6

Le facteur 0.5 est introduit afin de tenir compte de la présence de deux copies du gène de l'albumine par cellule nucléée du fait de leur diploïdie.

4) Conclusion

Si la PCR en temps réel est aujourd'hui la seule méthode qui permette de mesurer précisément les charges virales. La possibilité de construire des

fragments chimères entre différents types ou sous-types de virus et entre différentes espèces permet de disposer sur une même construction de tous les témoins positifs adéquats, et de permettre une co-quantification comme présentée dans l'exemple ci-dessus. Il peut également servir de standard de contrôle de qualité.

Un dernier avantage et non des moindres apporté par cette invention est d'éviter l'utilisation de cellules infectées ou d'agents infectieux non cultivables ou dont la culture nécessite des équipements lourds.