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Patent Searching and Data


Title:
METHOD OF PRESERVING CRUSTACEANS AGAINST MELANOSIS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2006/082267
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method of preserving a crustacean against melanosis, consisting in bringing the crustaceans into contact with a solution containing a suitable quantity of lactic acid bacteria and subsequently storing same under suitable conditions. The invention also relates to the use of lactic acid bacteria as melanosis-inhibiting agents in crustaceans and to crustaceans treated with lactic acid bacteria for food use.

Inventors:
LLAMAS MARCOS ARGIMIRO (ES)
LLAMAS GALILEA PEDRO (ES)
VARGAS JIMENEZ JOSE MANUEL (ES)
NAVARRO ROLDAN FRANCISCO (ES)
CORDOBA GARCIA FRANCISCO (ES)
BORRERO ROMERO MANUEL JESUS (ES)
Application Number:
PCT/ES2006/000039
Publication Date:
August 10, 2006
Filing Date:
January 27, 2006
Export Citation:
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Assignee:
UNIV HUELVA (ES)
LLAMAS MARCOS ARGIMIRO (ES)
LLAMAS GALILEA PEDRO (ES)
VARGAS JIMENEZ JOSE MANUEL (ES)
NAVARRO ROLDAN FRANCISCO (ES)
CORDOBA GARCIA FRANCISCO (ES)
BORRERO ROMERO MANUEL JESUS (ES)
International Classes:
A23B4/22; A22C29/02
Foreign References:
US20040249129A12004-12-09
CA2502565A12004-05-21
ES2065858A11995-02-16
Other References:
BENNER ET AL.: "Lactic acid/melanosis inhibitors to improve shelf life of brown shrimp (Penaeus aztecus)", JOURNAL OF FOOD SCIENCE, vol. 59, no. 2, 1994, pages 242 - 250
CHINIVASAGAM ET AL.: "Can spoilage bacteria cause blackspot (melanosis) in stored prawns", LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 27, 1998, pages 5 - 8
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Claims:
REIVINDICACIONES
1. Un método de preservar un crustáceo frente a la melanosis, caracterizado porque comprende los pasos de poner en contacto los crustáceos con una solución que contiene una cantidad adecuada de bacterias ácido lácticas y su posterior almacenaje bajo condiciones adecuadas.
2. El método de acuerdo con Ia reivindicación anterior, caracterizado porque las bacterias empleadas son de los géneros lactobacillus, lactococcus, leuconostoc y pediococcus.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque las bacterias son del tipo Lactobacillus helveticus, L. Lactis, C. piscícola, L. plantarun, y P. addilacti.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque las bacterias se suspenden en un medio de cultivo adecuado.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque dicho medio de cultivo se selecciona entre medio esencial mínimo (MEM), medio pobre (MP), medio MRS y el medio de cultivo sintetizado por ellas mismas, utilizando glucosa como solución nutritiva.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque dicho medio de cultivo es el medio pobre (MP).
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque Ia concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 80 UFC/ml y 140 UFCVmI.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque Ia concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 100 UFC/ml y 110 UFC/ml.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, caracterizado porque Ia concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 106 UFC/ml y 108 UFC/ml.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a9 caracterizado porque el tiempo de inmersión es de entre 5 y 120 minutos.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a10 caracterizado porque el tiempo de inmersión es de entre 10 y 60 minutos.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 11 , caracterizado porque los crustáceos son tratados a Ia temperatura de entre 0 0C y 35 0C.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 12, caracterizado porque los crustáceos son tratados a Ia temperatura de 30C.
14. Uso de bacterias ácido lácticas (BAL) como agentes inhibidores de Ia melanosis de crustáceos.
15. El uso de acuerdo con Ia reivindicación anterior caracterizado porque las bacterias empleadas son de los géneros lactobacillus, lactococcus, leuconostoc y pediococcus.
16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 14 a 15, caracterizado porque las bacterias son del tipo Lactobacillus helveticus, L. Lactis, C. piscícola, L. plantarun, y P. acidilacti.
17. Uso de bacterias ácido lácticas en Ia eliminación de otras bacterias que producen Ia formación de ciertas aminas biogénicas, no deseables en crustáceos.
18. Los crustáceos tratados con bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de melanosis para su uso alimenticio.
Description:
Método de preservación de crustáceos frente a Ia melanosis

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere al uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de Ia melanosis. Así como a un método de preservar un crustáceo frente a Ia melanosis por el empleo de dichas bacterias y los crustáceos tratados con éstas para su uso alimenticio.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La melanosis o ennegrecimiento de los crustáceos, de las frutas y verduras y de los alimentos en general, es un proceso enzimático inherente a Ia fisiología de los productos del reino animal y vegetal, y como tal fenómeno se manifiesta negativamente, a partir del momento en que el animal muere o cuando Ia fruta o verdura se desprotege de su piel, se modifica su aspecto al cabo de pocos minutos, apareciendo una tonalidad marrón para las frutas y verduras y negra para el marisco (pardeamiento enzimático o melanosis). El hecho es que ha ocurrido un proceso de oxidación de los tejidos.

La melanosis en los crustáceos, se manifiesta mediante Ia aparición de manchas oscuras, ennegrecimiento en el cefalotórax y a lo largo de todo el cuerpo. Dicho ennegrecimiento ocurre principalmente como consecuencia de Ia oxidación catalítica, originada por Ia presencia del oxigeno del aire, con intervención de enzimas del tipo fenol-oxidasa (PPO), que acelera el proceso de oxidación de compuestos orgánicos tipo fenólico, como Ia tirosina, aminoácido esencial del que forma parte el elevado contenido proteínico del marisco, a o-quinonas las cuales polimerizan espontáneamente para formar un residuo oscuro, de alto peso molecular.

Varios métodos han sido desarrollados para prevenir el ennegrecimiento, incluyendo el calor para Ia inhibición de Ia PPO y varios tratamientos químicos tal como alterar el pH de los alimentos. La inactivación por calor no es un método apropiado para los alimentos frescos. Igualmente, bajando el pH por adición de

un ácido, como el ácido cítrico, ácido fosfórico como ha sido descrito por Mc- Cord y Kilara en J. Food Science , 48: 1797-1483 (1983) puede conducir a los mismos efectos.

La actividad del enzima es elevada en distintas fases del crecimiento del tejido externo (esqueleto) de los crustáceos y en Ia fase post mortem. La utilización de productos químicos como inhibidor de los procesos enzimáticos y no enzimáticos de oxidación es hasta ahora el método más extendido capaz de paliar el grave problema que tiene el sector marisquero a Ia hora de controlar el "ennegrecimiento" de los crustáceos.

El ácido bórico fue ampliamente utilizado, aunque desde hace dos décadas se prohibió su uso por razones sanitarias. Desde su prohibición, como agente conservador de crustáceos frente a Ia melanosis y el deterioro del marisco, han sido muchos los esfuerzos encaminados a encontrar alternativas de compuestos químicos, no tóxicos, capaces de inhibir esta actividad enzimática.

El empleo de los sulfitos en el tratamiento de Ia melanosis fue descrito por Zawistowski et al., en Can. Inst. Food Sci.Tech. J., (1987) 20(3): 162-165. Sin embargo su cantidad está limitada y regulada dependiendo de Ia naturaleza del alimento, dado que su ingestión, inhalación y el contacto con Ia piel, y en su manejo, presentan riesgos potenciales para Ia salud.

La forma usual de aplicación de los sulfitos es por espolvoreo, inmediatamente después de Ia captura de los crustáceos para retardar Ia aparición de Ia melanosis. La dosificación y homogeneidad del aditivo en las muestras es problemática siendo difícil conseguir de forma manual a bordo. Son muchos los ejemplos recogidos en Ia literatura científica de utilización de sulfitos como inhibidores de melanosis en crustáceos (Knowles, M. E. Chem. Ind. (London), (1971 ), 910-911 ; McWeeny, D.J., et al. J. Sci. Food Agrie, (1974) 25, 735-746; Wedzicha, B.L. et al. Food Chem., (1988) 27, 259-71) y así como de patentes que los utilizan (ES 2.112.798, US 5.882.688, FR 2.696.077, EP 141.875, GB 2.222.509, etc.). No obstante, ninguno de estos métodos ha resultado ser plenamente satisfactorios.

Labuza y cois, en Cereal Foods World, (1989) 34(4):353 describe el uso de proteasas especialmente ficina, en el control enzimático en el pardeamiento de ciertos alimentos. Este autor atribuye este efecto al ataque sobre Ia PPO de esta proteasa.

La patente americana US 4.981.708 describe Ia utilización de una proteasa libre como inhibidor del pardeamiento de alimentos. En éste método, alimentos que son susceptibles de pardeamiento, incluyendo por ejemplo, ciertos crustáceos, frutos, vegetales, y bebidas, incluido jugos de frutos y vinos, son tratados con extracto de una cantidad suficiente de proteasa-libre inhibiendo Ia reacción de pardeamiento. El extracto de Ia proteasa-libre que se extrae del látex (ficus) es tan efectiva como el bisulfito sódico.

Debido a que el fenómeno de Ia melanosis se manifiesta a las pocas horas cuando no se tratan los crustáceos con agentes antimelanósicos tradicionales, se ocasionan graves problemas de tipo económico al sector pesquero y a los comercializadores del marisco por Ia depreciación de su valor en el mercado.

Es por tanto deseable contar con un tratamiento de Ia melanosis o pardeamiento de alimentos y en especial de crustáceos que minimice los problemas e inconvenientes de los productos anteriores.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores sorprendentemente han encontrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser empleadas como agentes inhibidores de Ia melanosis en crustáceos. Por Io tanto, de acuerdo con un primer aspecto de Ia presente invención, ésta se refiere un método de preservación de crustáceos frente a Ia melanosis por su tratamiento con bacterias ácido lácticas.

De acuerdo con un segundo aspecto de Ia presente invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de Ia melanosis en crustáceos.

De acuerdo con una realización preferida las bacterias ácido lácticas empleadas son de los géneros lactobacillus, lactococcus, leuconostoc y pediococcus. Estas bacterias se han utilizado durante muchos años, en fermentaciones, en las que forman parte de cultivos mixtos naturales junto con otras bacterias, levaduras y mohos utilizadas para Ia producción de diversos alimentos humanos o animales tales como productos lácteos (quesos, mantequilla, yogurt, leches acidas, etc.), vegetales fermentados (encurtidos, aceitunas, etc.), embutidos, panes ácidos, encurtidos y ensilados.

De acuerdo con una realización preferida, se emplean como starters microbianos Lactobacillus helveticus, L. Lactis, C. piscícola, L. plantarun, y P. acidilacti.

Bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas son bacterias cocoides o bacilares inmóviles, de forma bacilar, o esférica, unidas. En preparaciones para el microscopio aparecen aisladas o formando cadenas de cocos o de bacilos. Los habitat son muy variados; flora normal de Ia superficie de material vegetal (frutas y verduras), alimentos ricos en azúcares, leche y derivados. Obtienen energía exclusivamente por fermentación de azúcares y requieren una gran cantidad de factores nutritivos (aminoácido, bases nitrogenadas, algunas vitaminas), teniendo unas posibilidades anabólicas muy limitadas Io que contribuyen a reducir el rendimiento de su crecimiento.

Toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias por Io que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan.

Incapaces de respirar por que no pueden sintetizar compuestos porfirínicos, y, por tanto, formar una cadena de trasporte de electrones. Carecen de ciclo de

Krebs funcional y, son incapaces de sintetizar ATP por respiración, Io que es un reflejo de su incapacidad para sintetizar citocromos.

La catalasa (enzima que destruye el H2O2.) necesita un grupo porfirínico y, por tanto, este tipo de bacterias no tienen esta enzima, Io que permite Ia identificación del grupo. La tolerancia al oxígeno puede conseguirse por que acumulan gran cantidad de manganeso (Mn 2+ ) que actúa como una superóxido dismutasa.

Todos estos organismos debido a Ia limitada capacidad biosintética, tienen requerimientos nutricionales altos, necesitando factores de crecimiento, vitaminas del grupo B, aminoácidos. Como consecuencia, las BAL se cultivan en medios que contienen peptona, extracto de levadura u otros hidrolizados de materiales vegetales o animales, con un glúcido fermentable que proporcione una fuente de energía.

El pequeño tamaño de las colonias es atribuible, en primer lugar, a los bajos rendimientos de crecimiento debido a su metabolismo fermentativo. Algunas especies pueden producir colonias grandes cuando se cultivan en medios que contienen sacarosa, como resultado de Ia síntesis masiva de polisacáridos extracelulares como los dextranos y lévanos, correspondiendo gran parte del volumen de Ia colonia a estos azúcares. Otra característica fisiológica distintiva de estas bacterias, es su elevada tolerancia a los ácidos, consecuencia necesaria de su modo de metabolismo. Aunque las bacterias cocoides del ácido láctico pueden iniciar su crecimiento a pH neutros e incluso alcalinos, Ia mayoría de las formas bacilares no pueden crecer en medios con pH inicial menor a 6. El crecimiento de las BAL puede continuar hasta que el pH ha bajado a 4.5 o incluso menor. La capacidad de las BAL para producir y tolerar una concentración relativamente elevada de ácido láctico tiene un gran valor selectivo, ya que les permite eliminar Ia competencia de Ia mayoría de las otras bacterias, en ambientes ricos en nutrientes. Como resultado de su extrema especialización fisiológica, las BAL están confinadas a unos cuantos ambientes naturales característicos. Algunas viven en asociación con plantas y crecen a

expensas de los nutrientes liberados tras Ia muerte y descomposición de los tejidos vegetales.

S. Orla Jensen, en "Le clasication des bacterias lactiques. Lait 4. pag 468-474, señaló que las BAL podían dividirse en dos subgrupos bioquímicos, que se distinguen por los productos formados a partir de Ia glucosa. Los homofermentadores convierten Ia glucosa casi cuantitativamente en ácido láctico, y los heterofermentadores Ia convierten en una mezcla equimolecular de ácido láctico, etanol, ácido acético y CO2.

Los homofermentadores desamilan Ia glucosa por Ia vía de Embden-Meyerhof. Sin embargo los heterofermentadores no pueden utilizar esta ruta ya que carecen de Ia enzima fructosa difosfato aldolasa, por Io tanto estos organismos desamilan Ia glucosa por Ia vía de las pentosas fosfato.

Es conocido, que los ácidos orgánicos inhiben las reacciones enzimáticas bajo ciertos rangos de pH. La polifenoloxldasa como cualquier otra enzima tienes unos valores de pH bajo los que actúa eficazmente, otros en los que cataliza con menos eficiencia y, finalmente, en ciertos rangos Ia reacción es prácticamente inexistente.

La tirosinasa (polifenoloxidasa) es conocida por ser una enzima clave en Ia síntesis de melanina en plantas, microorganismos y células mamarias, y por poseer cobre en su estructura. Muchos compuestos como el ácido kójico y Ia arbutina, son inhibidores de Ia tirosinasa.

Es conocido el papel de ciertos metabolitos producidos por las BAL, por ejemplo:

(i) ácido láctico: puede ser sintetizado como L(+), D(-), y bajo forma racémica. La forma D(-) no se metaboliza por los humanos, por Io que no es recomendado su ingesta, sobre todo en niños y en adolescentes. EI ácido láctico, al igual que otros ácidos orgánicos, producen a nivel de Ia membrana citoplasmática de los microorganismos desajustes en el potencial de membrana e inhibe los procesos de transporte.

(ii) peróxido de hidrógeno: las BAL no poseen catalasas, por Io que no pueden desdoblar el peróxido de hidrógeno, excretándolo al medio. Esta molécula es un fuerte oxidante, produciendo oxidaciones en los lípidos y proteínas de Ia membrana.

dióxido de carbono: es producido por las BAL heterofermentativas, creando un ambiente anaerobio en el medio, Io cual podría dañar a ciertas bacterias aerobias. También produce descenso del pH a ambos lados de Ia membrana citoplasmática.

(iv) diacetilo: es en producto del metabolismo del ácido cítrico, y es el responsable del sabor característico de algunos alimentos como mantequillas y otros productos lácteos fermentados siendo producido por ciertas bacterias de los géneros Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus y Lactobacillus. Dicha producción es inhibida cuando existen hexosas metabolizables en el medio. Las bacterias Gram-, los hongos y las levaduras son más sensibles que las Gram+ al diacetilo. Al parecer su mecanismo de acción esta basado en interferencias en Ia utilización del aminoácido arginina por parte de estos microorganismos.

(v) reuterina: es producida por Lactobacillus Reuteri en un medio con una mezcla de glucosa y glicerol ó gliceraldehido. Tiene un espectro antimicrobiano general afectando a virus, hongos, protozoos y bacterias. Esta actividad se produce, al inhibir Ia ribonucleótido reductasa.

En Enzyme and microbiological Technology, 1999, pag 87-107, se indica que el medio empleado para el crecimiento de las BAL es determinante para Ia cantidad de ácido láctico que será producido.

Las BAL tienen Ia capacidad de soportar pH de 5 e inferiores, Io que les confiere una ventaja selectiva sobre otras bacterias. La temperatura óptima de crecimiento está entre 20 y 45 0 C. Muchas de ellas son consideradas beneficiosas para el consumo humano, pero otras pueden llegar a ser tóxicas

como algunos streptococos. BAL tienen complejos requerimientos nutricionales, por su limitada capacidad de sintetizar vitaminas del grupo B, y aminoácidos.

Las BAL pueden usar los glúcidos fermentándolos hasta un solo producto final (homofermentadores) o varios productos finales (heterofermentadores). En los homofermentadores el producto principal y casi único, es el ácido láctico, mientras que los heterofermentadores sintetizan ácido láctico, etanol, dióxido de carbono (CO 2 ), y acetatos. La cantidad de etanol y acetato formado depende del potencial redox del medio. Todas las BAL pueden usar Ia vía de las pentosas fosfatos, es decir llevar a cabo una heterofermentación, excepto lactobacilos del tipo I como por ejemplo Lactobacillus delbrueckii. Una mezcla de ácidos se produce por homofermentadores como los lactococos, cuando disminuye Ia concentración de glucosa en el medio, y durante el crecimiento en otros azúcares como Lactobacilus lactis en maltosa, lactosa y galactosa, o cuando aumenta el pH y disminuye Ia temperatura.

Por ejemplo, Lactobacilus amylophilus crece a 15 0 C y 45 0 C, pero Ia mayor producción Ia lleva a 25 y 37 0 C. Para Lactobacilus casei y Lactobacilus paracasei entre 37 y 44 0 C, Io cual es contradictorio, ya que estas bacterias crecen a 15 0 C y no a 45 0 C. Lactobacilus lactis y Lactobacilus rhamnosus exhibieron las mayores productividades a 33-35 0 C y a 41-45 0 C.

Dada Ia competencia que las BAL pueden ejercer con bacterias del género pseudomonas, proteus, flavobacterium, enterobacter, shewanella etc. estas bacterias serian desplazadas del medio por las condiciones tan extremas en las que pueden vivir las bacterias lácticas.

Ciertas aminas se forman en el marisco después de su captura, aún conservando a bajas temperaturas, debido a que bacterias de los géneros anteriormente mencionados, producen Ia descarboxilación de aminoácidos libres. La formación de aminas como Ia histamina, putrescina y cadaverina, es paralela al crecimiento de estos microorganismos, produciendo malos olores, Gasificación del medio y produciendo en algunos consumidores reacciones alérgicas.

De acuerdo con un tercer aspecto de Ia presente invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas en Ia eliminación de otras bacterias que producen Ia formación de ciertas aminas biogénicas, no deseables en crustáceos.

De acuerdo con un cuarto aspecto de Ia invención, ésta se refiere a los crustáceos tratados con starters microbianos consistentes en BAL.

De acuerdo con una realización de Ia presente invención, el uso de bacterias ácido lácticas como Lactobacillus helveticus, L. lactis, C. piscícola, L. plantarun, y P. acidilacti, produce Ia inhibición de manera drástica de Ia aparición de Ia melanosis en los crustáceos, pos-mortem, una vez tratados por inmersión.

Otros aspectos y ventajas del tratamiento por inmersión de los crustáceos con soluciones de bacterias ácido lácticas son: ,

(i) distribución homogénea del agente antimelanósico en los crustáceos por inmersión en Ia solución que contiene las BAL.

(ii) el método de Ia inmersión en Ia disolución establece el control de Ia concentración efectiva del agente antimelanósico beneficioso en Ia parte comestibles de los crustáceos.

(iii) una vez que se instalan las bacterias ácido lácticas en los crustáceos, su acción sobre el enzima (PPO-Cu), sustrato proteínico, etc., perdura una vez que cesa el proceso de tratamiento por inmersión de los crustáceos.

Una vez que los crustáceos se sacan del contenedor que contiene Ia solución de bacterias ácido lácticas, las propiedades organolépticas (el aspecto, presencia, color, sabor) prácticamente no se alteran, Io que proporciona notables ventajas sobre los métodos tradicionales de espolvoreo de los sulfitos, (productos agresivos) los cuales permanecen en contacto con los crustáceos durante

semanas, meses, provocando decoloración del esqueleto externo, sequedad, mal sabor etc.,

De acuerdo con una realización preferida, Ia concentración de bacterias ácido lácticas empleada está entre aproximadamente 80 UFC/ml y 140 UFC/ml. De modo más preferido, entre 100 UFC/ml y 110 UFC/ml, siendo aún más preferido entre 106 UFC/ml y 108 UFC/ml.

Los medios de cultivo adecuados para Ia realización del método de acuerdo con Ia presente invención, son aquellos medios selectivos de bacterias lácticas, en el cual las bacterias crecen satisfactoriamente. Entre los medios más adecuados se encuentran:

Medio Esencial Mínimo (MEM): Cloruro sódico (NaCI) (0.7%) y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio . heptahidratado

(0,005%). pH inicial entre 6-6.3.

Medio Pobre (MP): Cloruro sódico (NaCI) (0.7%) y D(+) glucosa (5%), pH inicial entre 6 y 6.5.

Medio MRS: caldo citrato diamónico comercia; extracto de carne en polvo, extracto de levadura, D(+) Glucosa, sulfato magnésico, sulfato de manganeso (II), peptona bacteriológica, fosfato dipotasio, acetato sódico, y tween 80. Este medio tiene un pH inicial de 6,2 aproximadamente.

De acuerdo con una realización preferida de Ia presente invención, se emplea como caldo de cultivo un medio seleccionado entre Medio Esencial Mínimo, Medio Pobre, MRS y el medio de cultivo sintetizado por ellas mismas, utilizando glucosa como solución nutritiva. En una realización más preferida el medio de cultivo es Medio Pobre.

De acuerdo con una realización preferida, el tiempo establecido de inmersión de los crustáceos en Ia solución de bacterias ácido lácticas es de entre 5 y 120 minutos. En una realización más preferida el tiempo de inmersión es de entre 10

y 60 minutos. Según una realización aún más preferida el tiempo de inmersión es de entre 15 y 45 minutos, siendo especialmente preferido un tiempo de inmersión de aproximadamente 30 minutos.

De acuerdo con una realización preferida, Ia temperatura a Ia que se lleva a cabo el tratamiento de los crustáceos está comprendida entre 0 0 C y 35 0 C. De acuerdo con una realización más preferida, Ia temperatura de tratamiento es de 3 0 C.

Una vez tratados los crustáceos en las condiciones fijadas, los crustáceos se refrigeran para posteriormente ser distribuidos para su consumo en fresco, o bien se congelan si su consumo se dilata en el tiempo. La suspensión microscópica de las bacterias ácido lácticas en el medio de cultivo es apta para repetir varios ciclos de tratamiento de los crustáceos por inmersión. Esta forma de proceder se puede extrapolar indefinidamente siempre que se mantenga prácticamente Ia concentración de las bacterias ácido lácticas para que no se resienta el proceso de melanización y Ia calidad de los crustáceos. La posibilidad de realización de estos ciclos de tratamiento por inmersión, hace que el proceso de utilización de la las bacterias ácido lácticas como inhibidor de melanosis sea tecnológicamente rentable.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Las descripciones en el resumen de esta solicitud se incorporan aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 Representación de Ia actividad enzimática de Ia enzima Polifenol Oxidasa de Parapenaeus longirostis, mediante diferentes curvas de absorbancia (A) y pH en función del tiempo (t).

Se observa en Ia gráfica que a medida que el pH del medio es más ácido Ia absorbancia es menor y por consiguiente se desarrolla menos color, que es el objetivo que se persigue con Ia producción de ácido láctico producido por las bacterias lácticas, en nuestro caso Lactobacilus helveticus.

FIG. 2. Se representa comparativamente el porcentaje de actividad de inhibición de Ia PPO de P. longirostris, a Ia que se Ie efectúa ningún tratamiento (en azul), frente a muestras tratadas con las bacterias L. lactis (I), C. piscícola (H), L. plantarum (III), L. helveticus (IV) y L. Pediococus acidilactici (V), en medios en medio pobre (en rojo) y en medio esencial mínimo (en blanco).

FIG. 3. Representación gráfica de Ia medida de Ia absorbancia (A) frente al tiempo (t) de Ia velocidad de aparición de Dopacromo.

Los siguientes modos de realización se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1. Estudio de la microflora autóctona del marisco

Uno de los factores esenciales de actuación de las BAL es Ia competencia con otras bacterias que aceleran el proceso de melanosis. Para el estudio microbiológico se utiliza el sistema de tiras API, el cual es un sistema de identificación estandarizado, que utiliza distintos tests bioquímicos miniaturizados y una base de datos. Consta de diez microtubos que contienen sustratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensión bacteriana, que reconstituye los medios. Durante Ia incubación, se producen cambios de color espontáneo o revelado por adición de reactivos.

Después de una incubación de 18-24 horas a 35-37 0 C, Ia lectura de reacciones se visualiza contrastando lista de perfiles, o con un software de identificación.

La extracción de Ia flora bacteriana del marisco se realizó, usando agua de peptona tamponada, esterilizada en autoclave 121 0 C durante 20 minutos, con un 0.01% de Tritón X-100 en un agitador magnético, a 37 0 C durante 12 horas. En ese tiempo las bacterias se despegan de su huésped, y pasan a Ia solución de agua peptonada. A continuación, se procedió al aislamiento de las cepas que habitan en el medio líquido, pasando a utilizar un medio sólido, general, no específico, donde cualquier bacteria, puede crecer. Este medio es el TSA (Triptona Soja Agar). Se realizaron en placas de petri, siembras "por agotamiento", con triplicado, se incubaron a 37 0 C durante 24 horas. AI día siguiente se pudo observar como han crecido en las placas decenas de colonias, en Ia mayoría de los casos entre 3 y 4 colonias distintas, por Io que cabe de esperar que en el marisco de forma natural en descomposición, estén instaladas predominantemente este mismo número de bacterias.

Los crustáceos, una vez capturados, y después de quince días de almacenamiento en frigorífico a Ia temperatura de 0-5 0 C no presenta melanosis y durante un tiempo indefinido (de 1 a 10 meses) a Ia temperatura de -18 0 C, cuando fueron tratados con starters microbianos como Lactobacillus helveticus, L. Lactis, C. piscícola, L. plantarun, y P. acidilacti.

Ejemplo 2. Inhibición de Ia melanosis en crustáceos.

Los estudios se basan todos ellos en el crustáceo Parapenaeus longirostris, conocido como "gamba blanca de Huelva". Este artrópodo tiene cutícula y apariencia con tonalidades claras, por Io que los efectos de Ia melanosis será más acusada. Los ejemplares siempre fueron frescos y sin tratamiento químico, ni otro de cualquier naturaleza anterior a nuestras experiencias.

Reconstitución de cepas bacterianas.

Se encargaron al Centro Español de Cultivos Tipo las bacterias Lactobacillus helveticus, CECT 4305 T. Estas cepas se presentan liofilizadas en pequeñas ampollas, a las que se Ie añadió 0,3 mililitros del medio MRS, y resuspendió con pipeta Pasteur, y se inocularon con 200 mi del mismo medio contenido en

matraz aforado. Este caldo se incubó durante 24 horas a 37 0 C, y al cabo de este tiempo, se obtuvieron concentraciones de Lactobacillus helveticus de 100 a 1000 millones de células por mililitro en un medio que alcanza un pH entre 4,20 y 4,50.

Actividad enzimática de Ia enzima Polifenol Oxidasa de Parapenaeus lonαirostis. entre un intervalo de DH 3 v 9.

Se tomaron muestras de cefalotorax, lugar donde Ia enzima es más abundante, se pesó el extracto del tejido tomado y se procedió a su homogenización con nitrógeno líquido y con 3 mililitros de los distintos tampones utilizados. Se centrifugó a 13240 gs durante 30 minutos y se desechó el precipitado, separando Ia fase soluble donde se encuentra Ia enzima. A continuación se preparó una solución de tripsina al 5% en agua destilada, y una solución de DL- Dopa 25 mM en tampón fosfato pH 6,5.

Se midió Ia absorbancia producida en el espectrofotómetro a Ia longitud de onda (λ de 390 manómetros), cada 2 minutos, durante 20 minutos, de máxima actividad de Ia PPO. Los resultados se recogen en Ia Tabla 1.

Tabla 1

Se observó que a partir de los 8 minutos Ia reacción enzimática dejaba de ser lineal. El estudio de esta zona, en Ia que Ia reacción de formación de producto con respecto al tiempo es lineal nos permite calcular Ia pendiente de Ia recta que representa Ia cinética de Ia reacción, y que nos sirve para cuantificar Ia actividad enzimática.

1. pH= 4. No existe reacción. La pendiente es igual a 0.

2. pH= 5. Y = 0.0042X + 0.058.

3. pH= 6. Y = 0.0084x + 0.011.

4. pH= 7. Y= 0.0108x + 0.0002. 5. pH= 8. Y= 0.0106X + 0.001.

6. pH= 9. Y= 0.0276X + 0.089.

Aplicando Ia ecuación de Ia Actividad Enzimática Específica:

Abs. VoI. Tampón extracción (mi)

Act. Enz. Esp. = e '1 • d "1

VoI. muestra (mi) - tiempo (min) peso fresco

e = coeficiente de extinción molar 3600 M "1 - cm "1

d = camino óptico = 1 cm

obtenemos los siguientes resultados:

Para pH 4, no existe actividad enzimática.

Para pH 5, tenemos una actividad enzimática específica de 3,80 x 10 elevado a

Ia menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco.

Para pH 6, 7,60 x 10 elevado a menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco

Para pH 7, 9,76 x 10 elevado a menos 6 micromoles/ min x gramo peso fresco Para pH 8, 9,58 x 10 elevado a Ia menos 6 micromoles /min x gramo peso fresco.

Para pH=9, 24,95 x 10 elevado a Ia menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco.

Para el desarrollo de Ia actividad enzimática "in situ" se utilizaron los siguientes tampones:

Para pH de 4 y 5 usamos el sistema tamponado Acético/Acetato.

Para pH de 6 y 7 usamos el sistema tamponado fosfato potásico monobásico/fosfato potásico dibásico.

Para pH de 8 y 9 usamos el sistema tamponado con tris.

Todos los medios se emplean a Ia concentración de 0,1 molar.

Si representamos los datos obtenidos veremos como existe una zona lineal en Ia que Ia variación de Ia absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde calculamos Ia pendiente y con ella Ia actividad específica de Ia PPO, aplicando Ia ecuación de Ia Actividad Enzimática Específica.

La actividad de Ia fenoloxidasa (PPO) se expresa como moles de DL-DOPA transformados por minuto y por mg a, 475 nm, a diferentes pH y a temperatura ambiente en las condiciones descritas. La oxidación de Ia DOPA a DOPACROMO, catalizada por Ia PPO conlleva un apreciable cambio de color que es Io que medimos en el espectrofotómetro a 475 nm.

De una muestra de cabeza de gamba se obtuvo el extracto, el cual fue incubado con tripsina 1% durante 15 minutos en agitación y se midió a Io largo del tiempo Ia variación de absorbancia a 475 nm frente a DL-DOP.

Los valores presentados en Ia Tabla 2 son Ia media de 3 ensayos ± Ia desviación estándar (SD), los cuales representamos gráficamente y obtenemos Ia actividad enzimática específica de Ia zona lineal de Ia Figura 3

Tabla 2

Si representamos los datos obtenidos (ver FIG. 3) veremos como existe una zona lineal en Ia que Ia variación de Ia absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde calculamos Ia pendiente y con ella Ia actividad específica de Ia PPO, aplicando Ia siguiente fórmula:

Pendiente de Ia recta=0.0339, R2=0,994

Actividad específica =30,65 x 10 "6 μmoles.m¡n-1.mg-1

Producción de bacterias lácticas v medios bacterioαénicos.

Se ensayaron medios de cultivo diferentes, selectivos de bacterias lácticas, en el cual las bacterias crecen satisfactoriamente tales como Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio MRS y Medio Pobre (MP).

Cuando se incubaron estos microorganismos a 37 0 C, en estos medios, al cabo de 24 horas se obtuvieron concentraciones entre 100 y 1.000 millones de bacterias por mililitro de medio, siendo el nuevo pH entre 3.5 y 4.0, de Io que se deduce que el metabolismo bacteriano ha sido el que ha generado esa bajada drástica de pH.

Tanto MEM como MRS, proporcionaron medios adecuados para el desarrollo del cultivo, sin embargo el medio MP es el que otorgó una mayor inhibición enzimática y ausencia de ennegrecimiento del marisco, y con propiedades organolépticas de los crustáceos excelentes.

Ejemplo de pruebas realizadas con medio MEM

Se tomó una solución salina de cloruro sódico 0,7% y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio heptahidratado (0,005%), pH inicial 6.2. y se inoculó con bacterias ácido lácticas de Lactobacillus helveticus y se incubaron a 37 0 C, observándose un crecimiento lento de dichas bacterias. A las 76 horas Ia disolución presentó concentraciones deseadas para nuestra experiencia, concretamente de 10 a 100 millones de bacterias por mililitro de medio. El pH inicial del medio era de 5,82, mientras que a las 76 horas de incubación de las bacterias el pH es de 3.3, en todas las experiencias. El medio es inodoro e incoloro, no apreciándose mal sabor. El marisco se trató a temperaturas de refrigeración, concretamente a 3 0 C, a diferentes tiempos de residencia; 10, 20, 30, 60 y 120 minutos por inmersión en el medio bacteriogénico descrito. Una vez extraído los crustáceos de Ia disolución se procede a repetir ciclos de inmersión hasta cinco veces consecutivas. A continuación se procedió a estudiar Ia evolución de Ia melanosis, observando que a las 24 horas el marisco tratado permanece inalterado, a temperatura ambiente 18-20 0 C, mientras que en el marisco control (marisco sin ningún tratamiento) ya se observan principios de melanosis en cabeza e incluso en las patas. Después de 12 días de permanecer los crustáceos en el refrigerador a 3-5 0 C no se apreció aparición de melanosis. La Figura 3 representa el tanto por ciento de inhibición de las bacterias ensayadas en diferentes medios de cultivo como Medio Pobre (MP) y Medio Esencial Mínimo (MEM).