Verfahren zur Konservierung von Lebensmitteln

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiell stabilisierten Lebensmitteln, insbesondere Getränken mittels Elektroporation.

Die Kaltentkeimung von Getränken ist in der Literatur vielfach beschrieben. Sie kann einerseits über chemische Zusätze wie Konservierungsmittel oder durch physikalische Verfahren wie thermische Sterilisation realisiert werden. Nachteile dieser Verfahren sind häufig unerwünschter Geschmack durch die Zusätze und/oder Zerstörung oder Veränderung von wichtigen Inhaltsstoffen beispielsweise durch die thermischen Verfahren.

Die Verwendung von Kombinationen von einzelnen Konservierungmitteln für Getränke ist bereits bekannt. So wird in US-A- 5738888 Natamycin zusammen mit Dimethyldicarbonat (DMDC) zur Sterilisation von Getränken verwendet. In US-A-6136356 bedarf es gar einer Kombination von 3 Konservierungsmitteln wie Natamycin, Sorbat und Dimethyldicarbonat, um akzeptable Stabilisierungsergebnisse zu erzielen.

Natamycin ist ein Antimykotikum, wirkt also von daher hauptsächlich gegen Pilze Gegenüber Gärhefen, die sich durch gefährlichen Kohlendioxiddruckaufbau bis zum Zerplatzen von Glasflaschen als Getränkeschädlinge auszeichnen, hat es dagegegen eine unzureichende Wirksamkeit.

Aus US-A-6803064 sind Ca-haltige Getränke beschrieben, die auch konserviert werden können, wobei alternativ ein oder mehrere Konservierungsmittel wie Sorbate, Benzoate oder DMDC oder Pasteurisierungverfahren wie PEF eingesetzt werden können. Beispielhaft kommt jedoch lediglich eine Mischung von K-Benzoat und K-Sorbat im Verhältnis 26:7 zur Konservierung zum Einsatz.

Auf der Suche nach Produkt schonenden Verfahren ist in US-A-2005/0112251 die Kombination von Elektroporationsverfahren wie der Pulsed Electric Field (PEF) Methode in Kombination mit persistenten Fungiziden wie Natamycin oder Sorbat beschrieben. Nachteilig bei diesem Verfahren ist allerdings, dass die persistenten Konservierungsmittel allen voran Sorbinsäure, in solch hohen Konzentrationen eingesetzt werden, dass sie in vielen Ländern die gesetzlichen Höchstmengen für spezielle Lebensmittel übersteigen. Trotz der hohen Einsatzmengen an Konservierungsmitteln wurde beim Schimmelpilz nur eine Sporeneinsaat von 10 KBE/ mL (siehe Beispiel 2) und bei der vegetativen Hefe eine Keimeinsaat von nur 10 ⁴ KBE/ mL (siehe Beispiel 2) untersucht. Insbesondere die schwache Wirkung von Natamycin gegenüber Gärhefen kann zu den oben beschrieben Nachteilen führen. - -

Auch WO03/070026 beschreibt die Kombination von persistenten Fungiziden wie Natamycin oder Sorbat/Sorbinsäure in Kombination mit der PEF-Methode. Bevorzugt wird beispielhaft das Natamycin verwendet, das aber neben den oben beschrieben Nachteilen auch in einigen Länder wie bspw. in Deutschland im Hinblick auf seinen Einsatz auch in der Humanmedizin für den Lebensmittelbereich nur für spezielle Wurst- und Käsesorten zugelassen ist.

Als weitere bevorzugte Fungizide wird Sorbat/Sorbinsäure genannt, das aber in sehr großen Mengen von 500-2000 ppm empfohlen wird und auch in den Beispielen mit 800 ppm sehr hoch dosiert wird. Die in WO03/070026 eingesetzten Konservierungmittel sind daher entweder in Getränken enwtweder nicht erwünscht oder selbst in Kombination mit PEF sehr hoch dosiert einzusetzen. Ähnliches findet sich für Kombinationen von PEF und bspw. Nisin für bestimmte Bakterienstämme in Galvez A., et al:„Bacterioncinbased strategies for food biopreservation" International Journal of Microbio logy, 2007, Seiten 51-70.

In US2008/311259 wird eine ganz andere Art der Sterilisation die Hochdruckpasteurisierung bei Getränken beschrieben, bei der auch chemische Konservierungsmittel mitverwendet werden können. Nachteilig bei der Hochdruck-Pasteurisierung ist die lange Behandlungszeit unter Hochdruck, was für Getränke in großen Abfüllanlagen zu zeitintensiv ist.

Aufgabe war es daher, ein Verfahren zur Stabilisierung von Lebensmitteln, insbesondere Getränken zu finden, das die beschriebenen Nachteile nicht aufweist und darüber hinaus nicht nur gegen Schimmelpilze und Hefen sondern auch gegen andere, vorzugsweise in Getränken vorkommenden Mikroorganismen eingesetzt werden kann.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung mikrobiell stabilisierter Lebensmittel, insbesondere Getränke gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Lebensmittel, enthaltend Dialkyldicarbonat mittels Elektroporation behandelt.

Es wurde eine Wirkverstärkung gefunden, die überraschend ist. Während sich die Wirkung der auch oder ausschließlich an der Membran von Mikroorganismen reagierenden, persistenten

Konservierungsmitteln wie Sorbate oder Natamycin durch den Einfluss von PEF verstärken lässt, wirkt DMDC erst nach dem Durchtritt durch die Membran im Inneren der Zelle durch Inaktivierung von Enzymen. Ein Prozess, der folglich nicht durch kurzzeitige, reversible Einflussnahme auf die

Membran beeinflusst werden sollte. Die Wanderungsgeschwindigkeit von DMDC durch die Membran ist ungleich höher als die normalerweise im Millisekundenbereich liegende PEF

Behandlung. Insofern war eine Wirkverstärkung nicht zu erwarten, wie bei den

Konservierungsmitteln, die bereits an der Membranoberfläche ihre Wirkung entfalten (siehe auch - -

„Antimicrobials in Food", P.M. Davidson, J.N. Sofos and A.L. Branen 2005, S. 49-50 (für Sorbate), S. 277 und 280 (für Natmycin) und S. 305 und 313 (für DMDC).,

Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Dialkyldicarbonat um eine Verbindung der Formel (I) woπn

R ¹ und R ² unabhängig voneinander für geradkettiges oder verzweigtes Ci-Cg-Alkyl, Cycloalkyl,

C ₂ -Cg-Alkenyl, C ₂ -Cg-AIkUIyI oder Benzyl stehen, welches jeweils gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden substituiert ist durch Halogen, Nitro, Cyano, Ci-Cβ-Alkoxy und/oder Dialkylamino, oder für Phenyl stehen, welches gegebenenfalls ein bis mehrfach, gleich oder verschieden substituiert ist durch

Halogen, Nitro, Cyano, Alkyl, Halogenalkyl, Alkoxy, Halogenalkoxy, Acyl, Acyloxy, Alkoxycarbonyl und/oder Carboxyl, bevorzugt

R ¹ und R ² unabhängig voneinander für geradkettiges oder verzweigtes Ci-Cg-Alkyl, C ₂ -C ₈ - Alkenyl oder Benzyl stehen, besonders bevorzugt

R ¹ und R ² unabhängig voneinander für geradkettiges oder verzweigtes Ci-C ₅ -Alkyl, C ₃ -Alkenyl oder Benzyl stehen, und ganz besonders bevorzugt R ¹ und R ² unabhängig voneinander für Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert.-Butyl, tert.-Amyl, AHyI oder Benzyl stehen.

Ganz besonders bevorzugt ist als Dialkyldicarbonat Dimethyldicarbonat (DMDC).

Das Dialkyldicarbonat wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 300 ppm, insbesondere von 10 bis 260 ppm, bezogen auf das Lebensmittel, insbesondere Getränk zugesetzt. Die Substanzklasse der Dialkyldicarbonate hat die besondere Eigenschaft, in Kontakt mit entsprechenden (wässrigen) Lebensmitteln, insbesondere Getränken in die abgeleiteten Alkohole und - -

Kohlendioxid zu hydrolysieren. In Abhängigkeit von der Temperatur der Getränke während der Anwendung ist deshalb schon nach relativ kurzer Zeit die eigentlich aktive Substanz nicht mehr im Getränk vorhanden. Bei den üblichen Temperaturen der Kaltabfüllung von Getränken von 0 bis 25 ⁰ C ist dies nach einigen Stunden der Fall. Die Wirkung von Dialkyldicarbonaten durch verschiedene Methoden oder Kombinationen zu verbessern ist bereits in der Patentliteratur vielfach beschrieben beispielsweise in DE-A-4434314, US-A-5738888, WO 200187096 oder US-A-2001046538.

Bei der Erfindung handelt es sich vorzugsweise um ein bei Raumtemperatur pumpbares Lebensmittel. Unter Lebensmittel werden im Rahmen der Erfindung Stoffe oder Erzeugnisse verstanden, die dazu bestimmt sind oder von denen nach vernünftigem Ermessen erwartet werden kann, dass sie in verarbeitetem, teilweise verarbeitetem oder unverarbeitetem Zustand von Menschen aufgenommen werden. Zu„Lebensmitteln" zählen auch Getränke, Kaugummi sowie alle Stoffe - einschließlich Wasser -, die dem Lebensmittel bei seiner Herstellung oder Ver- oder Bearbeitung absichtlich zugesetzt werden.

Besonders bevorzugte Lebensmittel sind Getränke, insbesondere Tee-basierte Getränke, einschließlich grünem Tee, schwarzem Tee sowie anderen Tee-Sorten, sowie um sauer eingestellte Getränke, insbesondere mit einem pH < 4.2, karbonisierte und nicht-carbonisierte alkoholfreie Erfrischungsgetränke, Fruchtsäfte, Fruchtnektare, Fruchsaft-haltige Getränke, Frucht-zubereitungen, Weine, alkoholfreie Getränke, Ciders, Eistees, alkoholische Mischgetränke, aromatisierte Wässer oder Sportgetränke bzw. isotonische Getränke. Weiterhin bevorzugt ist es, keine oder weitere antimikrobiell wirkende Stoffe, insbesondere persistente Konservierungsmittel, vorzugsweise ausgenommen Natamycin, mit zu verwenden. Es ist daher bevorzugt, dass dem zu behandelnden Lebensmittel, insbesondere Getränk weitere dieser Stoffe, insbesondere zusätzlich wenigstens ein weiteres antimikrobiell wirkendes Konservierungsmittel aus der Gruppe der polyenen Antimykotika, wie beispielsweise Nystatin, Lucensomycin oder Amphotericin B, organischen Säuren, wie beispielsweise Benzoesäure, Sorbinsäure, Propionsäure, oder Milchsäure, Salze der genannten Säuren, wie beispielsweise Benzoate, Sorbate, Propionate oder Laktate Imidazole oder deren Salze, insbesondere Imazalil, Schwefeldioxid, EDTA und Lysozym zugegeben werden. Besonders bevorzugt sind Natriumbenzoat und Kaliumsorbat.Bevorzugt ist es im Fall einer Mitverwendung weiterer antimikrobiell wirkender Konservierungsmittel solche einzusetzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzoesäure, Sorbinsäure, Propionsäure, oder Milchsäure, Salze der genannten Säuren, wie beispielsweise Benzoate, Sorbate, Propionate oder Laktate Imidazole oder deren Salze, insbesondere Imazalil, Schwefeldioxid, EDTA und Lysozym. Ganz bevorzugt ist es im Fall einer Mitverwendung weiterer antimikrobiell wirkender Konservierungsmittel solche einzusetzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzoesäure, Sorbinsäure, Propionsäure, oder Milchsäure, Benzoate, insbesondere Natriumbenzoat, Sorbate, insbesondere Kaliumsorbat, Propionate und Laktate. Besonders bevorzugt ist es im Fall einer Mitverwendung weiterer antimikrobiell wirkender Konservierungsmittel solche einzusetzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumbenzoat und Kaliumsorbat.

Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren bei dem keine weiteren antimikrobiell wirkenden Stoffe dem Lebensmittel zugegeben wird. Vorzugsweise enthält das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu behandelnde Lebensmittel, insbesondere Getränk wenigstens ein weiteres antimikrobiell wirkendes Konservierungsmittel, insbesondere eines aus der oben genannten Gruppe.

Im Falle einer Mitverwendung von weiteren antimikrobiell wirkenden Stoffen werden diese vorzugsweise in einer Menge von (bei Salzen bezogen auf die freie Säure) 1 bis 2000 ppm, insbesondere von 25 bis 500 ppm, vorzugsweise 25 bis kleiner 500 ppm, bezogen auf das Lebensmittel, insbesondere Getränk eingesetzt.

Die Zugabe der Dialkyldicarbonate, insbesondere von Dimethyldicarbonat erfolgt üblicherweise in flüssiger Form, portionsweise oder kontinuierlich zu dem Lebensmittel, insbesondere Getränk. Bevorzugt ist es, dass die Zugabe von Dialkyldicarbonat vorzugsweise kontinuierlich mittels einer Düse, insbesondere mit einem Druck von 0,1 bis 40bar, vorzugsweise von 0,5 bis 40 bar, insbesondere 10 bis 35 bar gegenüber dem Getränkedruck erfolgt. Insbesondere DMDC wird bevorzugt mittels einer Dosierpumpe über eine beheizte Düse, in den Getränkestrom verdüst. Verbesserungen entsprechender Pumpen wurden in der Patentliteratur beschrieben beispielsweise in der DE-A-2910328 oder in der DE-A-2930765. Verbesserungen der Düse bzw. der davor liegenden Mischkammer wurden beispielsweise in der DE-A-1557043 beschrieben. Entsprechende Dosiervorrichtungen bestehen üblicherweise aus Vorratsgefäßen, elektromagnetisch betriebener Do sierpumpe, Eindüsungsbereich und einem elektronisch gekoppelten induktiven Durchflussmessgerät, sowie selbstverständlich Ansaugvorrichtungen, Belüftung bzw. Temperierung, Verbindungen, Ventilen, Sensoren etc. samt verbindenden und steuernden Elektronikelementen. Die Dosierleistungen der Pumpen betragen üblicherweise 0,1 bis 20 Liter DMDC pro Stunde. - -

Die Zugabe von Dialkyldicarbonat, insbesondere DMDC zum Lebensmittel, insbesondere Getränk erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von -5 bis 30 ⁰ C, insbesondere bei 0 bis 25°C, besonders bevorzugt bei 5 bis 22°C.

Bei Mitverwendung von weiteren antimikrobiell wirkenden Stoffen kann diese entweder getrennt oder gemeinsam mit dem Dimethyldicarbonat zum Getränk erfolgen.

Bevorzugt erfolgt nach der Zugabe des anderen antimikrobiell wirkenden Stoffes die Zugabe der Dialkyldicarbonatverbindung.

Aufgrund des Zerfalls der Dialkyldicarbonatverbindung im Lebensmittel, insbesondere Getränk ist es bevorzugt, nach der Zugabe der Dialkyldicarbonatverbindung die Elektroporation möglichst kurz danach anzuschließen. So erfolgt bevorzugt weniger als 15 Minuten nach der Dialkyldicarbonat- Zugabe, vorzugsweise nach weniger als 5 Minuten, die Elektroporation. Die Elektroporation, insbesondere das als PEF (pulsed electric field) bekannte Verfahren, das auch als high intensity pulsed electric field bezeichnet wird, im Sinne der Erfindung ist ein Verfahren, das vorzugsweise dadurch gekennzeichnet ist, dass man gepulste elektrischer Felder auf das Lebensmittel einwirken lässt. Verfahrensparameter sind primär die elektrische Feldstärke und der Elektroenergieeintrag.

Bei dem Elektroporations-Verfahren PEF werden Lebensmittel mit Hochspannungspulsen vorzugsweise mit Feldstärken von 0,5 bis 100 kV/cm zwischen zwei Elektroden behandelt. Das PEF -Verfahren wird vorzugsweise bei -10 bis 60 ⁰ C, insbesondere bei 15 bis 25°C durchgeführt. Das Lebensmittel ist dabei vorzugsweise für weniger als 1 s der Energie ausgesetzt, wobei die Erhitzung des Lebensmittels minimiert wird. Im Gegensatz zu den thermischen Verfahren wird die PEF- Technologie als besseres Verfahren betrachtet, da hierdurch die sensorischen und physikalischen Eigenschaften von Lebensmitteln nicht oder nur kaum beeinflusst werden

Die hohe Feldstärke bei der PEF Technologie wird im allgemeinen dadurch erreicht, dass ein großer Teil der Energie in einer Kondensatorbank eines Gleichstromnetzteils gespeichert wird, welches sich dann in Form von Hochspannungspulsen entlädt.

Beispiele solcher PEF-Geräte, bzw. der Beschreibung ihrer Funktionsweise können beispielsweise der DE-A-3413583 entnommen werden.

Bei der Elektroporation, insbesondere dem PEF-Verfahren kommen erfindungsgemäß vorzugsweise

Energiedichten von 1 bis 1000 J/ml Lebensmittel, insbesondere Getränk zum Einsatz, vorzugsweise 15 bis 200 J/ml. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind Feldstärken von vorzugsweise 0,5 bis 100 kV/cm, insbesondere 3 bis 50 kV/cm vorteilhaft. Die Frequenz der elektrischen Impulse beträgt vorzugsweise 10 bis 800 Hz, vorzugsweise 60 bis 500 Hz.

Die Dauer der Pulse (Pulsbreite) beträgt vorzugsweise 1 bis 100 μs, insbesondere 5 bis 50 μs.

Die Energiedichte ist dabei wie folgt definiert.

3600 * Wirkungsgrad * aufgenommeneLeistung[W]

Energiedichte =

Durchfluss[l / h] * 1000

Der Wirkungsgrad beträgt beispielsweise bei dem in den Beispielen eingesetzten Elcrack" -Gerät ca. 85 %. Die aufgenommene Leistung in Watt wurde während des Behandlungsverfahrens vom PEF- Gerät abgelesen. Der Durchfluss betrug 70 l/h.

Das behandelte Lebensmittel, insbesondere Getränk wird in der Regel in Abhängigkeit von dem Elektroenergieeintrag um ca. 1 bis 20 ⁰ C erwärmt.

Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren gegen folgende Stämme eingesetzt: Bakterien (z. B. Bacillus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Acetobacter spp., Gluconacetobacter spp., Alicyclobacillus spp.), Hefen (z. B. Saccharomyces spp., Zygosaccharomyces spp., Trichoderma spp., Candida spp., Brettanomyces spp., Pichia spp.) und Schimmel (z. B. Penicülium spp., Byssochlamys spp., Aspergülus spp., Fusarium spp.). Überraschenderweise wurde gefunden, dass das erfmdungsgemäße Verfahren zu einer deutlichen Verbesserung der Entkeimung führt, was zur Folge hat, dass entweder höhere Anfangsverkeimungen von Getränken mit gleichen Mengen an Dialkyldicarbonat ggf. in Kombination mit persistenten Konservierungsmitteln bekämpft werden können oder bei normaler Verkeimung geringe Mengen bereits ausreichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit den Vorteil Mikroorganismen effektiv zu bekämpfen, ohne bzw. ohne hohe und ggf. gar nicht zugelassene Mengen an persistenten Konservierungsmitteln auszukommen.

Zusätzlich wurde gefunden, dass Bakteriensporen und Bakterien, die Schleimbildner sind und somit in der Lage, Biofilme zu produzieren, welche große Probleme in der Lebensmittelindustrie darstellen (z.B. Lactobacillus frigidus) effektiv bekämpft werden können. Außerdem wurden endosporenbildende Bakterien am Beispiel von Bacillus subtilis untersucht. Endosporen sind Überdauerungsformen von Bakterien (z. B. Bacillus, Clostridium), die im Vergleich zu vegetativen - -

Bakterienzellen in der Regel 100 ⁰ C mehrere Stunden überdauern können und erst nach einer mehrere Minuten langen Erhitzung auf 120 ⁰ C sicher abgetötet werden. Auch gegen diese Mikroorganismen konnte das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich eingesetzt werden.

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Beispiele:

In den folgenden Beispielen wurde für die PEF-Behandlung das Gerät Elcrack" des Deutschen Instituts für Lebensmitteltechnik e. V. eingesetzt.

Die Behandlungszelle des Gerätes hatte dabei einen Durchmesser von 5 mm und einen Elektrodenabstand von 7 mm. Die Behandlung erfolgte bei unterschiedlichen Feldstärken und Energiedichten, wobei die Pulsbreite 20 μs und die Pulsfrequenz 400 Hz betrugen.

In den nachfolgenden Beispielen wurde jeweils klarem Apfelsaft unter Rühren mittels eines Propellerrührers eine Keim- bzw. Sporensuspension, dann nach ca. 3 Minuten ggf. weitere antimikrobiell wirksamen Stoffe und danach nach ca. 2 Minuten DMDC. Die Keim- bzw. Sporensuspenison wurde so zugesetzt, dass sich im Apfelsaft eine bestimmte Menge an Zellen in der Regel 10 ³ bis 10 ⁵ KBE/ mL befanden.

Der Apfelsaft wurde danach PEF behandelt (mit dem oben beschriebenen Elcrack" Gerät). Als weitere mikrobiell wirksame Stoffe kamen Natriumbenzoat bzw. Kaliumsorbat zum Einsatz.

Bei unterschiedlichen Energiedichten und Feldstärken wurden die in der Tabelle angegebenen Temperaturen der endbehandelten Getränke festgestellt.

Als Maß für die Keimreduzierung wurde die mittlere logarithmische Keimreduzierung (MLK) bestimmt. Hierbei wird der Logarithmus der Überlebendkeimzahl vom Logarithmus der Anfangskeimzahl subtrahiert. Je höher der MLK- Wert, desto höher die Keimreduzierung und desto besser die Wirkung. V steht für Vergleichsbeispiel

Die verwendeten Mikroorganismen waren die folgenden.

A: Bacillilus subtilis DSM 347 (ATCC 6633)

B: Penicillium roqueforti DSM 1079 (ATCC 34908)

C: Lactobacillus frigidus DSM 6235 D: Saccharomyces cervisiae DSM 70449 (ATCC 18824) - -

Tabelle:

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1) Menge Sorbat und Benzoat sind jeweils als freie Säure angegeben

2) Für den Wert„mind. 7" gilt: Die Keimeinsaat bei den vegetativen Zellen betruglO ⁵ KBE/ mL. Für die mikrobiologischen Untersuchungen wurden 100 mL der Probe membranfiltriert und analysiert, weshalb sich dann ein Wert von mind. 7 ergibt, da nichts gewachsen war.