CAMPO DE APLICACIÓN

La presente invención se refiere al campo de la nanotecnología, más específicamente a evaluar la interacción entre partículas de un coloide y moléculas disueltas en el mismo coloide, aún más específicamente a un proceso, una composición, un Kit y un método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los coloides son sistemas en los que partículas, con a lo menos una dimensión con tamaño entre 1 y 1 .000 [nm], se encuentran dispersas en una fase continua de composición distinta a la composición de las partículas (IUPAC).

Los coloides tienen diversas aplicaciones industriales, por ejemplo, actualmente en el desarrollo de nuevas formas farmacológicas se promueve la utilización de coloides para el desarrollo de aplicaciones biomédicas. El coloide se ve como una alternativa estable de dispersión de moléculas que pueden ser aplicadas en un tejido específico, que provee una liberación sostenida de una molécula de interés, por ejemplo, un medicamento citotóxico en un tumor, un analgésico u otro. Para poder avanzar en este campo de aplicación tan delicado se hace necesario conocer la interacción entre las partículas del coloide, y moléculas disueltas en el mismo coloide.

Las partículas de un coloide pueden ser partículas metálicas, tales como partículas de oro, plata, cobre, hierro, níquel o cobalto, las que pueden tener o no carga iónica, adicionalmente estas partículas pueden estar funcionalizadas, por ejemplo, con moléculas de ácidos mercaptoalcanoicos. Las partículas de un coloide también pueden ser partículas no metálicas, como en el caso de dendrímeros, liposomas, dispersiones de proteínas y dispersiones de ácidos nucleicos. Las moléculas disueltas en un coloide establecen interacciones reversibles con los componentes del coloide, esto es la fase continua y las partículas dispersas del coloide. Teniendo interacciones reversibles se pueden medir constantes de equilibrio, y así evaluar la interacción entre partículas dispersas y moléculas disueltas en un mismo coloide.

Durante la interacción reversible de moléculas con partículas de un coloide se generan dos poblaciones de moléculas. Una población de moléculas que interacciona con las partículas del coloide, mientras que otra población de las moléculas se mantiene disuelta en la fase continua del coloide. Esta interacción reversible puede ser mediada por distintos fenómenos como liofobia de las moléculas disueltas, fuerzas Coulómbicas de atracción o repulsión entre las partículas y las moléculas disueltas, entre otros.

La interacción reversible entre partículas dispersas y moléculas disueltas en el coloide se puede describir mediante la reacción:

donde PM _n representa al complejo formado entre las partículas de un coloide y moléculas que interaccionan con las partículas del coloide, y Mdis representa a las moléculas disueltas en la fase continua del coloide.

En el estado de la técnica existen métodos basados en técnicas de ultracentrifugación analítica y de espectrometría de resonancia del plasmón superficial localizado (PSL) que permiten evaluar la interacción entre partículas de un coloide y moléculas disueltas en el mismo coloide. Por ejemplo, el estudio del patrón de sedimentación de nanoesferas de oro en presencia de moléculas de albúmina mediante ultracentrifugación analítica acoplado a detección de resonancia de PSLs permitió inferir el número de moléculas de proteínas adsorbidas sobre las nanoesferas metálicas (Bekdemir y Stellacci, Nat Commun., 2016; 7: 13121 -28). Complejas aproximaciones matemáticas indicaron que en el equilibrio una nanoesfera de oro puede interaccionar con 2 a 27 moléculas de albúmina, dependiendo del tamaño y entorno químico de la nanopartícula. En otro ejemplo, la utilización de espectrometría de resonancia de PSLs permitió desarrollar un método que optimiza la detección de interacción entre nanocilindros metálicos y moléculas peptídicas (PharmaDiagnostics NV, Solicitud de Patente US20150024402, 22 de Enero, 2015). En este caso, se estudió la interacción siguiendo los cambios en la frecuencia del máximo de absorbancia de la banda de resonancia del PSL de los nanocilindros después de exposición de las partículas a los péptidos.

Aunque ambos métodos logran describir la interacción entre moléculas peptídicas y partículas de coloides, se basan en técnicas que limitan los estudios de interacción a condiciones experimentales restringidas. Por ejemplo, la utilización de ultracentrifugación analítica permite determinar cambios en el coeficiente de sedimentación de partículas, de esta manera excluyendo de su análisis al estudio de interacciones entre partículas de un coloide y moléculas de baja masa molecular. Por otro lado, el documento de solicitud de patente US20150024402 evalúa interacciones mediante espectrometría de resonancia de PSLs limita sus aplicaciones al estudio de partículas metálicas, excluyendo de su análisis al estudio de sistemas particulados que no poseen PSL como dendrímeros, partículas lipídicas, dispersiones de proteínas, emulsiones, dispersiones de ácidos nucleicos, dispersiones de polímeros sintéticos, etc.

De acuerdo a literatura científica (Bobo, D., Robinson, K.J., Islam, J., Thurecht, K.J., Corrie, S.R.: 'Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA- Approved Materials and Clinical Triáis to Date' Pharm. Res., 2016, 33, (10), pp. 2373-2387; 2 ^* Ragelle, H., Danhier, F., Préat, V., Langer, R., Anderson, D.G.: 'Nanoparticle-based drug delivery systems: a commercial and regulatory outlook as the field matures'Expert Opin. Drug Deliv., 2017, 14, (7), pp. 851-864), sigue siendo necesario disponer de productos y métodos que permitan medir la concentración de distintas moléculas disueltas en la fase continua de coloides para así comprender la interacción que se establece entre, por ejemplo, moléculas de fármaco y partículas de coloides, cuya composición incluya tanto a partículas metálicas como a partículas no metálicas. La presente invención entrega solución a estas limitaciones de tecnologías previas. DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La invención provee un proceso para obtener una composición líquida monofásica equivalente a la fase continua de un coloide. La composición se debe extraer desde un coloide y se utiliza para obtener muestras control durante la ejecución de un método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide.

La invención también provee a una composición líquida monofásica extraída desde un coloide.

Además, la invención también entrega los componentes de un Kit. El Kit contiene un volumen de un coloide, y un volumen composición líquida monofásica que extraída desde una fracción del mismo coloide, y que es equivalente a la fase continua del coloide. El Kit permite al usuario medir la concentración de moléculas de interés, disueltas en la fase continua del coloide provisto en el Kit. Los valores de concentración de moléculas disueltas obtenidos con los componentes del Kit se utilizan como valores referencia. Los valores referencia permiten al usuario estudiar de manera certera la interacción entre moléculas de su interés (por ejemplo moléculas de fármacos), y partículas de otros coloides también de su interés.

Finalmente, la invención provee un método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide. Para esto, el método obtiene una muestra de prueba y una muestra control. La muestra de prueba contiene moléculas disueltas en un coloide, y la muestra control contiene moléculas disueltas en una disolución libre de partículas extraída desde una fracción del mismo coloide. Para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide, se obtiene desde la muestra de prueba un volumen libre de partículas. Se mide en este volumen el valor de concentración de moléculas disueltas mediante comparación con la muestra control.

También se entregan las instrucciones para que el usuario pueda manipular los componentes del Kit. Estas instrucciones contienen la información contenida en el método de la presente invención. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Esquema de proceso para obtener volúmenes de coloide con fase continua que contiene baja concentración de compuestos residuales.

Figura 2. Esquema de método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide.

Figura 3. Esquema de proceso para obtener un volumen de disolución libre de partículas extraído desde un coloide.

Figura 4. Espectro visible de coloide AuNP@MUA estándar y de disolución estándar libre de partículas extraída desde un volumen del coloide AuNP@MUA estándar.

Figura 5. Concentración de azul de metileno, naranja de metilo y ciprofloxacino medida en las muestras control y la fase continua del coloide AuNP@MUA.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención se relaciona con un método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide, además de un proceso para obtener un volumen de disolución libre de partículas desde un volumen de coloide, una composición monofásica libre de partículas obtenida desde un volumen de coloide, y un Kit para medir la concentración de moléculas de interés disueltas en la fase continua de un coloide.

La presente invención utiliza volúmenes de coloide con fase continua que contiene baja concentración de compuestos residuales. Esto porque durante la síntesis y funcionalización de las partículas de un coloide se acumulan iones y moléculas residuales disueltas en la fase continua del coloide. Estas moléculas residuales interfieren durante ensayos de interacción entre las partículas y las moléculas de interés.

Por ejemplo, la fase continua de coloides de partículas nanométricas de oro obtenidos mediante el método de reducción de citrato trisódico contiene una alta concentración de moléculas orgánicas derivadas de la oxidación incompleta de los iones de citrato, y de oro que no se incorporó a la estructura de las partículas nanométricas. Además, después de funcionalización de las partículas nanométricas con compuestos tiolados, las moléculas no adsorbidas a la superficie de las partículas también se acumulan en la fase continua del coloide.

Entonces, se utiliza el proceso esquematizado en la Fig. 1 para disminuir la concentración de compuestos residuales en la fase continua de coloides que contienen una alta concentración de compuestos residuales. El proceso incluye ciclos repetitivos de, a) concentrar las partículas, b) descartar fase continua libre de partículas y almacenar partículas concentradas, y c) agregar volúmenes de tampón a las partículas almacenadas. Como condición, el tampón debe mantener a las partículas dispersas, evitando fenómenos de floculación o agregación. Los volúmenes de coloide así obtenidos se pueden estandarizar tomando como referencia un parámetro proporcional a la concentración de las partículas dispersas. Fracciones de coloide con fase continua que contiene baja concentración de compuestos residuales se utilizan en ensayos de medición de concentración de moléculas disueltas en la fase continua del mismo coloide, o en otros ensayos de interacción.

Como se utiliza en la presente invención, los siguientes términos se entenderán como sigue:

"molécula", representa a una especie química definida.

"partículas" se considera equivalente a "partículas dispersas", a "partículas de un coloide" y a "partículas contenidas en un coloide".

"nanopartícula" se considera equivalente a partículas con diámetro menor a 150 [nm], equivalente a "nanopartículas dispersas", a "nanopartículas de un coloide" y a "nanopartículas contenidas en un coloide".

"muestra de prueba", representa a un volumen de coloide que contiene una cantidad definida de moléculas disueltas.

"muestra control", representa a un volumen de disolución extraído desde un coloide también utilizado para la obtención de una muestra de prueba, que no contiene partículas detectables, y que contiene una cantidad definida de moléculas disueltas.

"DO" significa Densidad Óptica y representa a un parámetro proporcional a la concentración de nanopartículas en el coloide.

"g" significa intensidad del campo gravitatorio de la Tierra, cuyo valor sobre la superficie terrestre es de aproximadamente 9,8 [m/s ² ].

"disolución libre de partículas" se entiende como una composición líquida monofásica extraída desde un coloide, y que es equivalente a la fase continua del mismo coloide.

Todos los otros términos utilizados en la presente invención se deben interpretar de manera similar a lo expuesto en literatura científica. Además, se indica que en la presente invención las etapas del método y el proceso pueden operar en otras secuencias distintas a las mencionadas o ilustradas en esta descripción.

La invención provee un método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide (Fig. 2). En términos generales, se mide la concentración de moléculas disueltas en una fracción del coloide libre de partículas. Para evaluar esto, en una primera parte el método obtiene una muestra de prueba y una muestra control. La muestra de prueba contiene moléculas disueltas en un coloide, y la muestra control contiene idéntica concentración de moléculas disueltas en una disolución libre de partículas extraída desde el mismo coloide utilizado para la obtención de la muestra de prueba. Bajo este diseño, la muestra control es equivalente a una concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide, pero que no incluye el efecto de la interacción entre moléculas y partículas. Posteriormente, las muestras se exponen a condición que permite concentrar a las partículas de la muestra de prueba. Después de este proceso, si existe interacción de atracción entre las moléculas y las partículas, una porción de la muestra de prueba será enriquecida en partículas y moléculas, mientras que otra porción mayoritaria estará libre de partículas y contendrá una menor concentración de moléculas. Entonces, se recupera desde la muestra de prueba un volumen libre de partículas. La fracción recuperada es equivalente a la fase continua del coloide, e incluye el efecto de la interacción entre moléculas y partículas. Finalmente, se mide la concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide utilizando la ecuación 1 :

^{L J} @mc

donde [FC] corresponde a la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide, [ ] ₀ corresponde al valor de la concentración de moléculas utilizada durante las etapas de obtención de muestras, @ _mp corresponde al valor empírico de un parámetro proporcional a la cantidad de moléculas contenidas en un volumen de muestra de prueba libre de partículas, y @ _mc corresponde al valor empírico del mismo parámetro proporcional a la cantidad de moléculas contenidas en un volumen de muestra control. El valor de concentración obtenido con esta ecuación es equivalente a la concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide.

De acuerdo a lo anterior, el método para medir la concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide, comprende las etapas de:

a) Obtener muestra de prueba mediante mezcla de una cantidad de moléculas con un volumen de coloide;

b) Obtener muestra control mediante mezcla de una cantidad de moléculas con un volumen de disolución libre de partículas extraído desde una fracción del mismo coloide utilizado en etapa a), tal que el valor de la concentración de moléculas en la mezcla es igual al valor de la concentración de moléculas de la muestra de prueba obtenida en etapa a);

c) Someter las muestras obtenidas en etapas a) y b) a proceso para concentrar las partículas de la muestra de prueba obtenida en la etapa a); d) Recuperar un volumen libre de partículas desde la muestra de prueba obtenida en etapa c);

e) Recuperar un volumen desde la muestra control obtenida en etapa c); f) Medir al volumen de muestra de prueba recuperado en etapa d) el valor de un parámetro proporcional a la cantidad de moléculas contenidas en el volumen de muestra;

g) Medir al volumen de muestra control recuperado en etapa e) el valor del mismo parámetro proporcional a la cantidad de moléculas contenidas en el volumen de muestra;

h) Medir la concentración de moléculas en la fase continua del coloide utilizando la ecuación: donde [FC] corresponde a la concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide, [ ] ₀ corresponde al valor de la concentración de moléculas utilizada durante las etapas de obtención de muestras, @ _mp corresponde al valor empírico de un parámetro proporcional a la cantidad de moléculas contenida en un volumen de muestra de prueba libre de partículas obtenido en etapa f), y @ _mc corresponde al valor empírico del mismo parámetro pero medido a la muestra control obtenida en etapa g).

El coloide comprende dispersiones de partículas escogidas entre: partículas metálicas, óxidos metálicos, silicatos, dendrímeros, liposomas, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, ácidos fúlvicos, ácidos húmicos, o polímeros sintéticos; en especial el coloide comprende partículas de oro, plata o cobre, hierro, níquel y cobalto, funcionalizadas o no. Más especialmente, el coloide comprende partículas nanométricas de oro, plata o cobre, hierro, níquel y cobalto, funcionalizadas con moléculas que contienen un grupo funcional sulfhidrilo, o con moléculas que tienen un grupo funcional amina, o moléculas con otros grupos funcionales que pueden reaccionar covalentemente con la superficie de las partículas.

Por otra parte, en el método de la invención las moléculas disueltas poseen una masa molecular entre 50 [g/mol] y 200.000 [g/mol]. Las etapas del método de la invención se pueden realizar por cualquier método disponible en la técnica, por ejemplo la etapa c) se puede realizar mediante centrifugación, ultrafiltración o magnetización, dependiendo de las características físicas y químicas de las partículas dispersas y de la fase continua del coloide.

De modo preferente, al utilizar partículas metálicas, si se emplea centrifugación, esta se realiza entre 20.000 y 30.000 ^χ g por un tiempo entre 5 a 30 [min]. Para partículas metálicas y no metálicas, si se emplea ultrafiltración, las partículas se concentran en el retenato después de exposición del filtro a una aceleración de 1.000 a 10.000 x g, o exposición de la parte inferior del filtro a una presión menor a la presión atmosférica. No obstante, estos parámetros pueden variar dependiendo del coeficiente de sedimentación de las partículas y la viscosidad de la fase continua. Cuando las partículas poseen propiedades magnéticas, se concentran mediante exposición a un imán.

Finalmente, en la etapa g) se puede usar cualquier técnica disponible para medir la cantidad o concentración de moléculas disueltas, tales como: cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa y detección de UV visible; cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa y detección infrarrojo; cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa; cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa; espectrofotometría UV visible y espectrofluorimetría.

Además, la invención provee un proceso para obtener una composición líquida monofásica desde un volumen de coloide. La composición, también provista en el kit, es libre de partículas y equivalente a la fase continua del coloide desde donde se extrajo. Como se muestra en la Fig. 3, el proceso para obtener el volumen de disolución libre de partículas comprende las etapas de a) concentrar las partículas de una muestra de coloide, b) recuperar una fracción de la muestra libre de partículas, c) medir a la muestra recuperada parámetro proporcional a la concentración de partículas del coloide y c) almacenar la fase continua libre de partículas. Fracciones del volumen de disolución libre de partículas así obtenidas se pueden utilizar para obtención de muestras control. Las muestras control se utilizan en ensayos de medición de concentración de moléculas disueltas en la fase continua de un coloide, o en otros ensayos de interacción.

La etapa de concentración de partículas incluida en el proceso se puede realizar por cualquier método disponible en la técnica, por ejemplo la etapa a) se puede realizar mediante centrifugación, ultrafiltración o magnetización, dependiendo de las características físicas y químicas de las partículas dispersas y de la fase continua del coloide.

De modo preferente, al utilizar partículas metálicas, si se emplea centrifugación, esta se realiza a entre 20.000 a 30.000 ^χ g por un tiempo entre 5 a 30 [min]. Para partículas metálicas y no metálicas, si se emplea ultrafiltración, las partículas se concentran en el retenato después de exposición del filtro a una aceleración de 1.000 a 10.000 x g, o exposición de la parte inferior del filtro a una presión menor a la presión atmosférica. No obstante, estos parámetros pueden variar dependiendo del coeficiente de sedimentación de las partículas y la viscosidad de la fase continua. Cuando las partículas poseen propiedades magnéticas, se concentran mediante exposición a un imán.

Finalmente, la invención provee un Kit que permite medir la concentración de moléculas de interés disueltas en la fase continua de un coloide provisto en el Kit. El Kit contiene un volumen de coloide y un volumen de disolución libre de partículas extraído desde una fracción del mismo coloide. La composición se obtiene siguiendo las instrucciones del proceso descrito previamente.

Por ejemplo, los componentes del Kit se pueden obtener desde coloides de partículas nanométricas de oro funcionalizadas con moléculas de ácidos mercaptoalcanoicos. Estos coloides son estables y han sido ampliamente caracterizados en literatura científica. La estabilidad del coloide permite el almacenamiento y transporte del producto por períodos de tiempo prolongados.

La utilización de los componentes del Kit, siguiendo las instrucciones del método expuesto en la presente invención, permite al usuario laboratorista obtener valores empíricos de concentración de moléculas de interés disueltas en la fase continua del coloide provisto en el Kit. Los valores de concentración de moléculas disueltas obtenidos con los componentes del Kit se pueden utilizar como valores referencia. Los valores referencia permiten al usuario medir de manera certera la concentración de moléculas de interés disueltas en la fase continua de otros coloides de interés.

La invención puede ser comprendida mejor a la luz de los ejemplos detallados a continuación los que son ilustrativos y no limitativos de la misma. En el contexto de estos ejemplos, el ejemplo 1 y el ejemplo 2 describen la composición de una de las posibles formas que pueden adquirir los componentes del Kit en cuestión, y el ejemplo 3 describe posibles utilizaciones de los componentes del Kit para medir la concentración de distintas moléculas disueltas en la fase continua del coloide obtenido de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 1 .

EJEMPLO 1 . Obtención de coloide estándar de nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido 1 1 -mercaptoundecanoico y con fase continua que contiene baja concentración de compuestos residuales (coloide AuNP@MUA estándar).

Para obtener un volumen de coloide AuNP@MUA, nanopartículas de oro con diámetro hidrodinámico de 10 [nm] (50 [mi]) sintetizadas mediante reducción de iones de citrato se funcionalizaron mediante exposición a una concentración de ácido 1 1 -mercaptoundenoico (MUA) de 100 [μΜ]. Para disminuir la concentración de compuestos residuales en la fase continua del coloide, el volumen de nanopartículas funcionalizadas se sometió a ultrafiltración por centrifugación utilizando un filtro comercial con tamaño de exclusión igual a 100 [kDa]. La muestra se centrifugó a 4.000 ^χ g durante 15 min y se obtuvo un retenato de 1 [mi] enriquecido en nanopartículas. Se descartó el permeato, y al retenato se agregaron 9 [mi] de tampón citrato de sodio 1 ,2 [mM]. El proceso de ultrafiltración y resuspensión se repitió 6 veces, obteniendo un coloide rico en nanopartículas de oro funcionalizadas con MUA y con fase continua que contiene citrato de sodio 1 ,2 [mM], trazas de oro, y una concentración de MUA igual o menor a 1 [pM].

La funcionalización de las nanopartículas con moléculas de MUA genera una capa hidrofóbica de grupos metileno localizada justo sobre la superficie del núcleo metálico, y una capa externa que contiene cargas eléctricas negativas, debido a que el grupo carboxílico de parte de las moléculas de ácido 1 1 -mercaptoundenoico se mantiene desprotonado (potencial zeta del coloide igual a -33,5 [mV]).

La concentración de las partículas AuNP@MUA contenida en el coloide se estandarizó respecto al valor de densidad óptica del máximo de absorbancia de la banda PSL de las nanopartículas de oro (DO máximo absorbancia de la banda del plasmón = 60/cm) (Fig. 4).

Este coloide se utiliza para obtener muestras de prueba durante ensayos de medición de concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar, y en otros ensayos de interacción. EJEMPLO 2. Obtención de disolución libre de partículas estándar con composición equivalente a la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar.

Se concentraron las nanopartículas del coloide AuNP@MUA estándar mediante sedimentación. Para esto, un volumen de 1 ,5 [mi] de coloide AuNP@MUA se centrifugó a 24.000 ^χ g durante 15 [min]. Se recuperó y almacenó un volumen de 1 ,4 [mi] de fase continua libre de nanopartículas AuNP@MUA. Como se observa en la Fig. 4, el volumen de disolución libre de partículas no presentó banda de absorción asociada al PSL de las nanopartículas de oro, indicando que la disolución libre de partículas obtenida desde el coloide AuNP@MUA no contiene nanopartículas detectables.

La concentración de las partículas AuNP@MUA contenida en la disolución libre de partículas se estandarizó respecto al valor de densidad óptica del máximo de absorbancia de la banda del PSL de las nanopartículas de oro (DO máximo absorbancia de la banda del plasmón = 0/cm).

Esta disolución libre de partículas se utiliza para obtener muestras control durante ensayos de medición de concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar, y en otros ensayos de interacción. En caso de ser necesario, también se puede utilizar para diluir volúmenes del coloide AuNP@MUA estándar. EJEMPLO 3. Medición de concentración de moléculas disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar.

3.1. Molécula: Azul de metileno.

Se evaluó la interacción entre las partículas AuNP@MUA y moléculas de azul de metileno. Para esto, se midió la concentración de moléculas de azul de metileno disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar.

Para obtener la muestra de prueba se mezclaron 140 [μΙ] de coloide AuNP@MUA estándar obtenida de acuerdo al ejemplo 1 (DO máximo absorbancia de la banda del plasmón = 30/cm), con 5 [μΙ] de agua Milli-Q y con 5 [μΙ] de una solución estándar de azul de metileno 60,00 [μΜ] disuelto en agua Milli-Q. Para obtener la muestra control se mezclaron 140 [μΙ] de disolución estándar obtenida de acuerdo al ejemplo 2 (DO máximo absorbancia de la banda del plasmón = 0/cm), con 5 [μΙ] de agua Milli-Q y con 5 [μΙ] de una solución estándar de azul de metileno 60,00 [μΜ] disuelto en agua Milli-Q. Esto da una concentración 2,00 [μΜ] de azul de metileno en cada muestra.

Posteriormente, con el objetivo de separar la fase continua de las partículas del coloide AuNP@MUA, todas las muestras se centrifugaron a 24.000 ^χ g durante 15 [min]. Se recuperó desde la muestra de prueba y muestra control un volumen de 130 [μΙ] libre de nanopartículas. Se midió en todos los volúmenes recuperados la cantidad de azul de metileno mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (inglés RP-HPLC) y detección UV visible utilizando un detector con arreglo de diodos. La señal de azul de metileno se detectó a una longitud de onda de 665 [nm] (mAU). La cantidad de azul de metileno se midió como valor del área de integración de la señal correspondiente al pico de elución (mAU. min). Las muestras de prueba (n=3) y muestras control (n=3) se obtuvieron y procesaron de manera independiente. Cada muestra se midió de manera independiente.

Los resultados de medición de concentración indicaron que, después de incorporar azul de metileno 2,00 [μΜ] al coloide, la concentración promedio de azul de metileno disuelto en la fase continua del coloide AuNP@MUA es de 1 , 17 [μΜ], mientras que en las muestras control, equivalentes a la fase continua del coloide, la concentración era de 2,00 [μΜ] (Fig. 5). 3.2. Molécula: Naranja de metilo.

En segundo lugar, se evaluó la interacción entre las partículas AuNP@MUA y moléculas de naranja de metilo. Para esto, se midió la concentración de moléculas de naranja de metilo disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar. Para esto se realizaron ensayos idénticos a los realizados con azul de metileno, pero utilizando una solución estándar de naranja de metilo 60,00 [μΜ] disuelto en agua Milli-Q. Esto da una concentración 2,00 [μΜ] de naranja de metilo en cada muestra. Las muestras se siguieron procesando de manera idéntica a lo descrito previamente en el punto 3.1 para azul de metileno.

Se midió en todos los volúmenes recuperados la cantidad de naranja de metilo mediante RP-HPLC y detección UV visible utilizando un detector con arreglo de diodos. La señal de naranja de metilo se detectó a una longitud de onda de 432 [nm] (mAU). La cantidad de naranja de metilo se midió como valor del área de integración de la señal correspondiente al pico de elución (imAU.min). Las muestras de prueba (n=3) y muestras control (n=3) se obtuvieron y procesaron de manera independiente. Cada muestra se midió de manera independiente.

Los resultados de medición de concentración indicaron que, después de incorporar naranja de metilo 2,00 [μΜ] al coloide, la concentración de moléculas de naranja de metilo disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar es de 2,00 [μΜ]. La concentración de naranja de metilo en las muestras control, equivalentes a la fase continua del coloide, también era de 2,00 [μΜ] (Fig. 5).

3.3 Molécula: Ciprofloxacino.

En tercer lugar, se evaluó la interacción entre las partículas AuNP@MUA y moléculas de ciprofloxacino. Para esto, se midió la concentración de moléculas de ciprofloxacino disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar. Para esto se realizaron ensayos idénticos a los realizados con azul de metileno, pero utilizando una solución estándar de ciprofloxacino 60,00 [μΜ] disuelto en metanol 50%. Esto da una concentración 2,00 [μΜ] de ciprofloxacino en cada muestra. Las muestras se siguieron procesando de manera idéntica a lo descrito previamente en el punto 3.1 para azul de metileno. Se midió en todos los volúmenes recuperados la cantidad de ciprofloxacino mediante RP-HPLC y detección UV visible utilizando un detector con arreglo de diodos. La señal de naranja de metilo se detectó a una longitud de onda de 278 [nm] (mAU). La cantidad de ciprofloxacino se midió como valor del área de integración de la señal correspondiente al pico de elución (imAU.min). Las muestras de prueba (n=3) y muestras control (n=3) se obtuvieron y procesaron de manera independiente. Cada muestra se midió de manera independiente.

Los resultados de medición de concentración indicaron que, después de incorporar ciprofloxacino 2,00 [μΜ] al coloide, la concentración de moléculas de ciprofloxacino disueltas en la fase continua del coloide AuNP@MUA estándar es de 0,88 [μΜ]. La concentración de ciprofloxacino en las muestras control, equivalentes a la fase continua del coloide, era de 2,00 [μΜ] (Fig. 5).