Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mittels eines Temperaturregulationselements sowie Vorrichtungen und Geräte zur Durchführung dieser Verfahren.

In der Analytik, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, beginnen sich immer mehr Verfahren zu etablieren, welche auf Nachweisen und Synthesen von Nukleinsäuren be¬ ruhen. Nukleinsäuren sind als z. B. sehr spezifisches Erkennungsmittel für Organismen zur Diagnose von Krankheiten gut geeignet. Während dieser Nachweisverfahren sind verschiedenste Bearbeitungsschritte, wie Denaturierung, Hybridisierung, Synthesen und Immobilisierung von Nukleinsäuren, sowie deren enzymatische Behandlung üblich. Ein Problem bei solchen Verfahren war lange Zeit die geringe Menge an Nukleinsäuren in den Proben.

Eine Lösung für dieses Problem, mit der eine Vielzahl von Analyten für einen Nachweis zugänglich gemacht wird, brachte die Amplifikation von Nukleinsäuren. Ein solches Verfahren ist in der EP-A-0200362 beschrieben, nämlich die Polymerase Chain Reaction (PCR). Dabei wird durch mehrfache Verlängerung von Primern in einer Reaktionslösung eine Vielzahl von Kopien der ursprünglichen Nukleinsäure hergestellt. Diese können beispielsweise durch Hybridisierung mit einer markierten Nuklein- säuresonde gemäß EP-A-0201 184 nachgewiesen werden. Die dabei verwendeten Reaktionslösungen werden zur Trennung von Doppelsträngen und für die Extensions- reaktion jeweils in Intervallen auf bestimmte Temperaturen erhitzt bzw. wieder abge¬ kühlt. Dadurch, daß es sich um relativ große Volumina handelt, bedingen die Zeiten für die Temperaturregulierung eine relativ lange Zeit für die Durchführung des gesamten Amplifikationsverfahrens.

Eine Abhilfe versucht hier die sogenannte Kapillar-PCR zu schaffen. Dabei befindet sich die Reaktionsmischung in Glaskapillaren mit einem geringen Durchmesser. Dadurch kann die Zeit für die Durchführung einer Amplifikationssequenz auf ca. 30 min gesenkt wer¬ den. Ein Problem bei der Kapillar-PCR ist die Anfälligkeit des mitzuerhitzenden Glases der Kapillare und die schwer handhabbare Probenapplikation.

In jüngerer Zeit werden auch immer mehr Amplifikationsverfahren beschrieben, bei denen die Amplifikationsreaktionen in einem geschlossenen System, d. h. ohne Zufuhr von Reagenzien während der Zyklen, durchgeführt werden kann. So ist in WO 92/07089 ein System beschrieben, bei dem die Amplifikationsmischung solange wie erforderlich in einem Kreislaufsystem geführt wird, indem die Reaktionsmischung immer wieder erhitzt und abgekühlt wird. Durch Wahl des Durchmessers kann die Verweilzeit der Mischung in den einzelnen Zonen des Systems beeinflußt werden. In EP 0511712A1 ist ein Ampli¬ fikationsverfahren beschrieben, bei dem die Amplifikationsmischung cyclisch auf ganz bestimmte Temperaturen gebracht wird, um relativ kurze Zykluszeiten zu erreichen. Auch hier ist die Probenhandhabung erschwert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es unter anderem, die bestehenden Nuklein- säurebearbeitungsverfahren zu verbessern und insbesondere Verfahren bereitzustellen, bei denen die Amplifikation in besonders kurzer Zeit abgeschlossen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bearbeitung und insbesondere Vermehrung von Nukleinsäuren in einer Reaktionsmischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur einer an die Reaktionsmischung angrenzenden Oberfläche und deren unmittelbaren Umgebung reguliert wird, jedoch der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm verbleibt.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind eine Vorrichtung zum Bearbeiten und Vermeh¬ rung von Nukleinsäuren mit einem Temperaturregulationselement sowie ein Gerät, welches diese Vorrichtung enthält.

Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind alle Arten von Nukleinsäuren, modifizierte oder unmodifizierte. Unmodifizierte Nukleinsäuren sind beispielsweise die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Modifizierte Nukleinsäuren können durch Austausch von Gruppen der natürlichen Nukleinsäuren durch andere chemische Reste entstehen. Bei¬ spiele sind Nukleinsäure-Phosphonate, oder -Phosphothioate und an den Zuckerresten oder den Basen durch chemische Gruppen, die auch nachweisbar sein können, modifi¬ zierte Nukleinsäuren.

Die Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält bevorzugt mindestens einen bei erhöhter Temperatur, zumindest aber von der Umgebungs¬ temperatur abweichenden Temperatur, ablaufenden Reaktionsschritt. Solche Reaktions¬ schritte sind beispielsweise die thermische Denaturierung von teilweise oder vollständig doppelsträngigen Nukleinsäuren. Dabei werden, um Einzelstränge herzustellen oder um

Sekundärstrukturen aufzuschmelzen, die Nukleinsäuren auf Temperaturen oberhalb des entsprechenden Schmelzpunktes erhitzt. Ein weiterer Bearbeitungsschritt von Nuklein¬ säuren ist die Hybridisierung von zueinander komplementären Nukleinsäuren in einzel- strängigen Bereichen zu einem Nukleinsäuredoppelstrang (Hybrid). Dieser findet bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunktes des Hybrides statt. Um eine Hybridisierung zu erreichen, muß daher oft eine Abkühlung der Reaktionsmischung vorgenommen werden. Insbesondere in Amplifikations- oder Sequenzierungsverfahren wird ein weiterer Bearbeitungsschritt durchgeführt, nämlich die Verlängerung (Extension) eines an eine sogenannte Matrizen-Nukleinsäure (template) hybridisierten Primers mit Hilfe weiterer Mono- oder Oligonukleotide. Hierbei wird bevorzugt die Temperatur eingestellt, bei der das entsprechende verwendete Enzym sein Aktivitätsoptimum aufweist, bzw. Kon¬ kurrenzreaktionen vermindert sind. Diese Temperatur kann auch mit der Hybridisations¬ temperatur identisch sein (2-Stufen-PCR).

Ein Spezialfall der Bearbeitung von Nukleinsäuren ist die Vermehrung von Nuklein¬ säuren. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung praktisch alle Amplifikations- verfahren, z. B. zielsequenzabhängige Amplifikationen (insbesondere nicht-isotherme Amplifikationen wie die Polymerase Chain Reaction, Ligase Chain Reaction oder ähn¬ liche) durchgeführt werden. Auch während dieser Vermehrungsverfahren findet mindestens einer der oben genannten temperatursensitiven Bearbeitungsschritte statt.

Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die Änderung der Temperatur nicht in der gesamten Reaktionsmischung, sondern nur in einem sehr kleinen Teil der Reaktionsmischung stattfindet. Dies hat zur Folge, daß das Aufheizen bzw. das Abkühlen dieses relativ kleinen Bereiches sehr schnell vor sich gehen kann und damit die Bearbeitung der Nukleinsäuren stark beschleunigt wird. Zur Durchführung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens wird daher die Reaktionsmischung mit einer temperaturregu¬ lierbaren Oberfläche in Kontakt gebracht. Durch Änderung der Temperatur der Ober¬ fläche wird die unmittelbare Umgebung dieser Oberfläche erhitzt, angeglichen oder abge¬ kühlt, je nach Bearbeitungsschritt und Temperatur der Reaktionsmischung. Man kann hier mehrere Fälle unterscheiden.

Für den Fall daß die Temperatur der Reaktionsmischung höher liegt als die Schmelz¬ temperatur der zu bearbeitenden Nukleinsäuren, kann die Oberfläche gekühlt werden, um in der angrenzenden Umgebung eine Hybridisierung der Nukleinsäuren zu erreichen.

Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung niedriger ist als die Schmelz¬ temperatur und die Temperatur, die für eine Verlängerung eines Primers an der Nuklein- säure erforderlich ist, kann die Oberfläche und damit die unmittelbare Umgebung zu¬ nächst auf eine Temperatur erhitzt werden, bei der die Extension des Primers stattfinden kann. Anschließend kann die Temperatur über den Schmelzpunkt der Nukleinsäuren er¬ höht werden, wodurch eine Denaturierung und Strangtrennung der gebildeten doppel- strängigen Nukleinsäuren stattfinden kann. Daran kann sich eine Abkühlung auf eine Temperatur, bei der die Einzelstränge mit neuen Primern hybridisieren können, an¬ schließen. Dieser Zyklus kann mehrfach durchlaufen werden.

Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen der für die Extension optimalen Temperatur und der Schmelztemperatur liegt, wird die Temperatur an der Oberfläche zunächst erhöht, um Doppelstränge zu trennen. Anschließend wird die Temperatur auf eine Temperatur gesenkt, bei der die Einzelstränge mit Primern hybridi¬ sieren. Daraufhin wird die für die Extension optimale Temperatur eingestellt und ge- wünschtenfalls der Zyklus wiederholt.

Die gewünschte Temperatur kann über einen festgelegten Zeitraum aufrechterhalten werden, z. B. solange, bis die gewünschten Reaktionen an der Oberfläche abgelaufen sind. Dazu kann die Temperatur der Oberfläche auch durch bekannte Kontrollmaßnah¬ men und angeschlossene Regelmaßnahmen (Nachheizen, -Kühlen) konstant gehalten werden. Die Zeiträume hängen, wie bei bekannten Verfahren üblich, von der Länge der zu bearbeitenden Nukleinsäuren und deren Homologie sowie den speziellen Hybridisie- rungsbedingungen ab. Der Fachmann kann jedoch durch einfache Versuche die optimalen Zeiträume ermitteln. Die Zeiträume liegen, je nach Bearbeitungsschritt, zwischen Sekundenbruchteilen und wenigen Sekunden.

Bei den oben geschilderten Fällen verbleibt der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm, während sich die in unmittelbarer Umgebung der Oberfläche be¬ findliche Reaktionsmischung den an der Oberfläche eingestellten Temperaturen anpaßt.

Zur Regulierung der Temperatur und zum Einstellen spezifischer Temperaturen an der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung empfiehlt es sich, als Oberfläche die Oberfläche einer Vorrichtung zu wählen, die aus einem Heizelement und einem Kühl¬ element besteht. Das Heizelement hat bevorzugt eine relativ große Oberfläche bei ver¬ gleichsweise geringer Wärmekapazität. Als geeignet haben sich beispielsweise Metall¬ folien erwiesen, die auf geeignete Weise erhitzt werden können, z. B. durch elektrischen

Strom. Als Materialien für die Metallfolie sind gut wärmeleitende Materialien, z. B. Gold, bevorzugt.

Das Kühlelement sollte eine vergleichsweise hohe Wärmekapazität haben. Als Kühl¬ medium kommen feste, flüssige oder gasförmige Stoffe in Frage. Bevorzugt sind flüssige Kühlmedien, z. B. Wasser. Eine gute Wärmeleitfähigkeit ist von Vorteil.

Die Anordnung des Heizelements und des Kühlelements kann entsprechend der Tempe¬ ratur des Reaktionsmediums verändert werden, je nach dem, ob die Vorrichtung mehr zum Erhitzen oder zum Kühlen der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung be¬ nutzt werden soll. Im allgemeinen wird jedoch das Heizelement in unmittelbarer Nähe der Oberfläche lokalisiert sein. Die Oberfläche des Heizelementes kann auch direkt an die Reaktionsmischung angrenzen. Es ist jedoch auch möglich, das Heizelement durch eine dünne, wärmeleitfahige Schicht von der Reaktionsmischung zu trennen.

Das Kühlelement kann prinzipiell an jeder Stelle positioniert sein, mit der eine Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung möglich ist. Als bevorzugt hat es sich jedoch erwiesen, das Kühlelement auf der der Reaktionsmischung abgelegenen Seite des Heizelements zu positionieren. Für den Fall daß das Heizelement eine geringe Wärmekapazität hat, ist die Tatsache, daß das Heizelement ebenfalls abgekühlt werden muß, nicht von entscheidendem Nachteil.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mit Hilfe des Heizelements so lange geheizt, bis die Oberfläche und ihre unmittelbare Umgebung auf die gewünschte Temperatur erhitzt ist. Dabei wird sich ein starker Temperaturgradient in der Nähe der Oberfläche ausbilden, während der restliche Teil des Reaktionsgemisches isotherm bleibt. Dies gilt insbe¬ sondere, wenn kein bemerkenswerter Flüssigkeitsaustausch während des Auf heizvor¬ ganges realisiert wird, aber auch, wenn ein Flüssigkeitsaustausch stattfindet. Der Auf¬ heizvorgang kann innerhalb von Sekundenbruchteilen, in günstigen Fällen sogar Milli¬ sekunden, abgeschlossen sein. Dasselbe gilt für die Kühlung. Der Reaktionsraum, welcher auf die gewünschte Temperatur erhitzt wird, kann sehr klein sein, bevorzugt ist er weniger als 0,2 mm, besonders bevorzugt weniger als 0,5 μm tief. Die auf die Reak¬ tionsmischung hingerichtete Fläche des Heizelements beeinflußt die Tiefe des Tempera¬ turgradienten und seine Aufbaugeschwindigkeit. Aus den gewünschten Anwendungen des Verfahrens kann sich eine bevorzugte Größe der Oberfläche ergeben. In der Regel ist die Oberfläche < 2 cm^, besonders bevorzugt zwischen 0,2 cm^ und 0,2 mm^. Die Oberfläche kann glatt oder auch rauh sein. Für den Fall, daß die Oberfläche gleichzeitig

als Träger von Mitteln für die Bearbeitung der Nukleinsäuren genutzt wird, ist es vor¬ teilhaft, diese Oberfläche durch Oberflächenstrukturen zu vergrößern.

Das Volumen der Reaktionsmischung ist für die Erfindung praktisch nicht von großer Bedeutung. Es kann sich hierbei um einen Tropfen mit einem Volumen von 20 μl, jedoch auch um ein beliebig großes Volumen handeln. Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die das Heiz- und das Kühlelement enthaltende Vorrichtung beispiels¬ weise auch in ein großes Gefäß mit Reaktionsmischung eingebracht werden kann, wobei die wesentlichen Reaktionen nur in einem sehr kleinen Grenzbereich der Oberfläche stattfinden, während der übrige Reaktionsraum praktisch keinen Einfluß auf die Reaktion ausübt. Andererseits stellen die erhältlichen Proben und Reagenzmengen ein praktisches Limit für die Größe der Reaktionsmischung dar. Die Reaktionsvolumina werden sich daher meist in einem Bereich zwischen 1 ml und 30 μl, bevorzugt zwischen 100 μl und 50 μl, bewegen, jedoch läßt sich zum Beispiel durch Aufbringen des Reaktionsansatzes auf die temperaturregulierende Oberfläche auch mit sehr viel kleineren Volumina arbei¬ ten.

Zur Bearbeitung der Nukleinsäuren werden diese an die temperaturregulierbare Ober¬ fläche oder deren unmittelbare Umgebung gebracht. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, beispielsweise mechanisch oder durch Diffusion. Bevorzugt werden die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden. Diese Bindung wiedemπf kann unterschied¬ licher Art sein. Bevorzugt ist eine chemische Bindung, entweder über Adsorption oder biospezifische Wechselwirkungen. Im Falle einer Bindung durch Adsorption kann die Oberfläche mit einem nukleinsäurebindenden Reagenz belegt sein. Biospezifische Wechselwirkungen können Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und den zu bear¬ beitenden Nukleinsäuren sein (Hybridisierung, komplementärer Teil dieser Nuklein¬ säuren), jedoch auch Wechselwirkungen zwischen Antigenen oder Haptenen mit dagegen gerichteten Antikörpern und Rezeptor-Ligand- Wechselwirkungen. Eine bevorzugte Art der Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren an die Oberfläche geschieht über Oligonukleotide, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind und zumindest zu einem Teil der zu bearbeitenden Nukleinsäure komplementär sind. Diese Oligonukleotide können jedoch auch über biospezifische Wechselwirkungen, z. B. Biotin-Streptavidin, an die Oberfläche gebunden sein.

Die Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren ist gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt reversibel. Die Nukleinsäuren können nach einer von dem durchzuführenden Vorgang abhängigen Zeit durch Erhitzen der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umge-

bung wieder freigesetzt werden. Zwischen dem Binden und Freisetzen der Nukleinsäure können beliebige Schritte vorgenommen werden, z. B. Durchführung chemischer Reak¬ tionen, jedoch auch eine Trennung der gebundenen Nukleinsäuren von der ursprüng¬ lichen Reaktionsmischung und Überführung in eine neue Reaktionsmischung.

Für den Fall einer Vermehrungsreaktion der Nukleinsäuren können die an die Oberfläche gebundenen Oligonukleotide als Primer für die Elongarion oder Extension unter Verwendung der zu bearbeitenden Nukleinsäure als Matrize verwendet werden. Dadurch bildet sich ein an die zu bearbeitende Nukleinsäure gebundener verlängerter Primer. Die als Matrize benutzte Nukleinsäure kann durch Temperaturerhöhung von dem Verlängerungsprodukt gelöst werden und kann im nächsten Temperaturzyklus für einen neuen, bisher noch nicht verlängerten immobilisierten Primer als Matrize wirken. Auf diese Weise ist es möglich, eine große Menge an an der Oberfläche immobilisierten Primern zu verlängern und somit Kopien von Teilen der zu bearbeitenden Nukleinsäure herzustellen. Die extendierten (verlängerten) oberflächenbehafteten Primer dienen wie¬ derum mittels komplementärer Primer zu einer Vermehrung der als Matrize dienenden Moleküle. Die für die durchzuführenden Reaktionen erforderlichen Reagenzien sind in der gesamten Reaktionsmischung vorrätig zu halten oder diese sind nach Bedarf zuzuge¬ ben. Für eine Vermehrungsreaktion nach dem Prinzip der Polymerasereaktion (EP-B-0201 184) sind daher die Deoxyribonukleotide, eine DNA-Polymerase und ein weiterer Primer und geeignete Puffer-Reagenzien in der Reaktionsmischung zu halten. Zur Darstellung anderer Nukleinsäuretypen (z. B. RNA), sind andere Reagenzien, z. B. Ribonukleotide oder RNA abhängige Polymerasen vorgesehen. Dieser Schritt des Ver¬ fahrens kann besondere Rücksicht auf die Arbeitstemperatur des bearbeitenden Enzyms nehmen.

Die zu bearbeitenden Nukleinsäuren können jedoch auch über physikalische Methoden an die Oberfläche gebunden werden, z. B. mittels eines Magneten. Hierzu müssen die Nukleinsäuren jedoch an ein magnetisierbares Teilchen gebunden werden. Die Bindung von mit Nukleinsäure beladenen magnetischen Teilchen kann dadurch reversibel gestaltet werden, daß sich ein Magnet hinter der Oberfläche befindet oder induziert wird. Durch Anlegen eines Wechselfeldes können die magnetischen Teilen an die Oberfläche gebunden bzw. von ihr entfernt werden.

Spezielle Ausführungsformen, die teilweise vorteilhafte Wirkung aufweisen, sind eben¬ falls denkbar. So kann die Effizienz gesteigert werden, indem die Diffusion der Nuklein¬ säuren in der Reaktionsmischung durch Konvektion verstärkt wird. Es kann auch vor-

teilhaft sein, gegenüber den üblicherweise verwendeten Reaktionsmischungen höhere Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer einzusetzen. Außerdem kann die zu bearbei¬ tende Nukleinsäure zu Beginn der Reaktion durch Vorhybridisierung an der Oberfläche konzentriert werden.

Im Falle einer Amplifikation oder Vermehrung der Nukleinsäuren kann es sein, daß die Anzahl der zu durchlaufenden Zyklen, z. B. bei einer PCR, erhöht werden muß, damit genügend Amplifikationsprodukt erzeugt wird. Wegen der sehr kurzen Zykluszeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dies jedoch nicht von Nachteil.

Für den Fall, daß die Reaktionsmischung auf einer relativ niedrigen Temperatur gehalten wird, bedeutet dies, daß an die Hitzestabilität der Reagenzien weniger Ansprüche gestellt werden müssen als bei mehrmaliger Erhitzung der gesamten Reaktionsmischung. Eine thermostabile Polymerase ist daher für eine Vermehrungsreaktion nicht unbedingt erforderlich und dennoch muß nicht in jedem Amplifikationszyklus neues Enzym zu der Reaktionsmischung zupipettiert werden.

An die erfindungsgemäße Bearbeitung der Nukleinsäuren können sich beliebige weitere Schritte anschließen. So können die Nukleinsäuren entweder im an die Oberfläche ge¬ bundenen Zustand oder im wieder freigesetzten Zustand untersucht oder mit weiteren Reagenzien bearbeitet werden.

Mit Hilfe des geschilderten erfindungsgemäßen Vermehnmgsverfahrens läßt sich somit auf einfache Weise ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe bilden. Hierzu wird die Oberfläche, an welche die als Primer fungierenden Oligonukleo¬ tide gebunden sind, mit der Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht. Danach wird die Temperatur der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung auf eine Temperatur ge¬ bracht, welche über dem Schmelzpunkt der in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure liegt. Nach Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung wird die nachzuweisende Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid hybridisieren. Durch Zyklusfiihrung wird, wie oben beschrieben, mit Hilfe der nachzuweisenden Nukleinsäure eine Vielzahl von Kopien hergestellt, die am Ende der Vermehrungsreaktion an die Oberfläche gebunden bleiben können. Durch Hybridisierung mit markierten Nuklein- säuresonden und deren Detektion mit Hilfe der Markierung kann die Menge an Nuklein¬ säuren an der Oberfläche bestimmt werden. Bei Verfahren, die einen direkten Nachweis von Nukleinsäurehybriden ohne Markierung oder von verlängerten Einzelsträngen (Primern) erlauben (z. B. nach dem Prinzip der Oberflächen-Plasmonenresonanz), ist

auch ein direkter Nachweis möglich. Verwendet man für die Vermehrungsreaktion markierte Primer oder Mononukleotide, entfallt die Hybridisierung mit einer nachweisbar markierten Nukleinsäuresonde. Es ist auch ein Ansatz denkbar, bei dem im Ansatz eine höhere Temperatur gehalten wird und die Oberfläche, die für weitere Schritte nötigen tieferen Temperaturen annimmt.

Da die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens zur Vermehrung der Nuklein¬ säuren praktisch an einer Oberfläche abläuft, führen wir für diese Vermehrungsreaktion die Bezeichnung 2D-Amplifikation ein.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die zum Einsatz im oben ge¬ nannten Bearbeitungsverfahren verwendet werden kann. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zum Bearbeiten von Nukleinsäuren mittels eines Tempera¬ turregulationselements, wobei dieses Element zur Temperaturregulation der Oberfläche und der unmittelbar angrenzenden Umgebung geeignet ist und wobei an diesem Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren gebunden werden können. Diese Mittel können Oligonukleotide sein, und beispielsweise als Primer dienen. Diese Vorrichtung enthält be¬ vorzugt ein Kühlelement sowie ein Heizelement, wobei die Anordnung bevorzugt wie im oben beschriebenen Bearbeitungsverfahren vorliegt. Diese Vorrichtung ist bevorzugt sehr klein. Sie kann beispielsweise eine Dicke von < 5 mm und eine Fläche von < 10 cm ² haben. Die darin befindlichen Elemente, wie das Kühlelement oder das Heizelement, sind einfache Bauteile. Daher ist diese Vorrichtung ausgezeichnet geeignet zur einmaligen Verwendung (Disposable), was die für wiederverwendbare inherente Kontaminations¬ gefahr reduzieren kann. Soll die Vorrichtung für eine Mehrfachbenutzung geeignet sein, ist es auch möglich, das Heizelement durch ein sehr dünnes Bauteil vom Raum, welcher die Reaktionsmischung enthält, zu trennen und dieses Bauteil von der Vorrichtung abtrennbar zu machen. Für eine weitere Bearbeitungsstufe kann dann ein neues Bauteil eingesetzt werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Gerät zur Bearbeitung von Nukleinsäuren, welches ein Steuerelement für eine zeitabhängige Temperaturregulierung sowie eine er¬ findungsgemäße Vorrichtung enthält. Als Steuerelement kann das Steuerelement eines sogenannten Thermocyclers gemäß EP-A-0236 069 verwendet werden, bevorzugt wird jedoch eine Steuerung nach dem Prinzip von Tintenstrahldruckern , da sie eine höhere Steuerungsgeschwindigkeit aufweisen. Das Steuerelement muß in der Lage sein, das Heizelement in vorbestimmten Intervallen so lange zu erhitzen, bis die Umgebung der Oberfläche eine ausreichende Temperatur aufweist. Ebenso muß es in der Lage sein, über

das Kühlelement in vorbestimmten Intervallen für eine Kühlung an der Oberfläche zu sorgen. Dazu kann beispielsweise eine Kühlflüssigkeit durch die Vorrichtung geleitet werden. Sofern die Wärmekapazität des Heizelementes gering, die Wärmeleistung jedoch relativ hoch ist, ist auch eine kontinuierliche Kühlung möglich. Als Oberfläche kann man verschiedene Formen in einer ohmisch temperierbaren Version dieses Geräts verwenden, die abhängig von der Spannung und der Dauer des Stromflusses thermisch erhitzt werden. In einer abweichenden Version befindet sich die zu temperierende Oberfläche auf einer vorzugsweise schwarzen Unterlage, bevorzugterweise einer Plastikfolie, die von der zu temperierenden Oberfläche distalen Seite her durch einen Laserstrahl, be¬ vorzugterweise einem Infrarotlaser, erwärmt wird. Sowohl die zu temperierende Ober¬ fläche, als auch das wärmeabsorbierende und wärmeleitende Material können dabei auf einer Trägerfläche, bevorzugterweise infrarotdurchlässiges Glas, angebracht sein.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann verschiedenste Ausführungsformen haben. Bei¬ spielsweise kann sie für ein Eintauchen in ein Gefäß ausgelegt sein. Sie kann jedoch auch so gestaltet sein, daß die die zu bearbeitende Nukleinsäure enthaltende Flüssigkeit auf die Oberfläche aufgetropft oder in ein durch die Oberfläche gebildetes Gefäß eingefüllt werden kann. Dieser Reaktionsraum kann auch nach Einfüllen der Flüssigkeit ver¬ schlossen werden, so daß Kontaminationsprobleme verringert werden können.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von Nuklein¬ säuren. Dabei handelt es sich, wie in Beispiel 3, z. B. um eine als Polymeraseketten- reaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion mit anschließender Detektion.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Anreicherung von Nukleinsäuren z. B. durch Hybridisation. Bei kovalent an die Ober¬ fläche adsorbierten Primern mit einer ausreichenden Spezifität läßt sich durch Vorwahl der Hybridisierungstemperatur, bei bekannter Zusammensetzung (ionischer Zusammen¬ setzung, Konzentration von Reagenzien) der zu analysierenden Reaktionslösung eine Hybridisationstemperatur dergestalt vorgeben, daß eine spezifische Bindung der zu analysierenden Nukleinsäure an die zur Hybridisierung eingesetzten kovalent an die Oberfläche gebundenen Primer stattfindet. Dieses Verfahren kann dazu eingesetzt wer¬ den

a) eine genaue Auswertung der tatsächlichen Hybridisationstemperatur vorzunehmen,

b) eine genaue Konzentration der zu analysierenden Nukleinsäuren im Reaktionsge¬ misch vorzunehmen,

c) auf das Vorhandensein kreuzhybridisierender Sequenzen zu testen.

Diese kurze Auflistung ist nicht abschließend.

Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Nukleinsäuren von einer Lösung in eine andere zu überführen. Dann findet im ersten Gefäß eine Hybridisierung (niedere Temperatur) und im zweiten Gefäß eine Denaturierung (höhere Temperatur) statt.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Se¬ quenzierung von Nukleinsäuren. Eine Möglichkeit der Anwendung der Erfindung im Zu¬ sammenhang mit Sequenzanalysen ist die sogenannte Minisequenzanalyse. Dabei kann jeweils die genaue Sequenzbestimmung des an den Primer anschließenden Nuklein- säurenukleotids vorgenommen werden, indem in der Lösung die zur Sequenzierung be¬ reitgestellt wird, ausschließlich Dideoxynukleotide und keine Deoxynukleotide zur Se¬ quenzierung zugesetzt werden. Die vier möglichen Dideoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert. In jedem Fall führt also der Einbau des jeweils nächsten Nukleotids zum Abbruch der Sequenz¬ reaktion und nach Auf einigung des extendierten an der Oberfläche befindlichen Primers kann durch Analyse der spezifischen Fluoreszenz die Sequenz des auf dem Primer be¬ findlichen Nukleotids bestimmt werden.

Ein Spezialfall der Möglichkeiten der Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die zuvor in einer PCR-Reaktion amplifiziert worden sind. Nach der Amplifikation liegt das vermehrte Produkt über den Primer kovalent gebunden in doppelsträngiger Form an der reaktiven Oberfläche vor. Durch kurzes Durchlaufen einer Höhentemperaturphase wird durch Denaturierung dieses Amplifikat einzelsträngig vorliegen, läßt sich durch Überführen in eine Waschlösung reinigen und ist danach wiederum durch Überführen diesmal in eine Sequenzierreaktion einsetzbar für eine darauffolgende Sequenzierung. Diese Sequenzierung verläuft be¬ sonders effizient, da nun nur einzelsträngiges Matrizenmaterial vorhanden ist, an das ein Sequenzierpaar besonders effizient binden wird. Durch die Sequenzierreaktion liegt anschließend wieder ein doppelsträngiges Molekül vor, dessen markierte (sequenzierte) Hälfte nun zur Analyse durch Gelchromatographie zur Verfügung steht. Bei Einsatz ver¬ schiedener markierter (mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Dideoxy- nukleotiden) lassen sich alle vier für eine Sequenzanalyse notwendigen Reaktionen auf einmal durchführen, bei der konventionellen Methode muß diese Analyse viermal wiederholt werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der beiliegenden Figuren näher erläutert:

Figur 1 zeigt das Aufbauschema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (1), welche in ein mit Reaktionsgemisch (2) gefülltes Reaktionsgefaß (3) eintaucht. Die Vorrichtung ent¬ hält ein Kühlelement (4) und ein mittels Strom heizbares Heizelement (5). An die Ober¬ fläche des Heizelements sind Oligonukleotide (6) kovalent gebunden. Sowohl das Kühl- wie das Heizelement sind über Anschlüsse (7; 8) an Steuereinheiten regulierbar.

In Figur 2 ist ein beispielhafter Temperaturverlauf für eine Vermehrungsreaktion nach der Art der PCR gezeigt. In einer ersten Phase (A) werden die Nukleinsäuren bei einer Temperatur von etwas unterhalb 100 °C denaturiert. In einer Phase (B) findet bei etwa 50 °C die Hybridisierung der zu vermehrenden Nukleinsäuren mit den immobilisierten Oligonukleotiden an der Festphase statt. In einer dritten Phase (C) findet bei ca. 70 °C die Extension der Primer unter Verwendung der Nukleinsäure als Templat statt.

In Figur 3 sind die in unmittelbarer Nähe der Oberfläche ablaufenden Reaktionen (Phasen A bis C) gezeigt. Für Phase (A) sind drei Isothermen in ihrem schematischen Verlauf, für Phase (B) und (C) jeweils nur eine Isotherme angezeigt. In Phase (A) wer¬ den Nukleinsäuren denaturiert und diffundieren über eine gewisse Zeit einzelsträngig, in Phase (B) hybridisieren Vorlagen und Primer und in Phase (C) werden Primer entlang der Matrizen extendiert.

Figur 4 zeigt einen möglichen Prototypen einer für die erfindungsgemäße Anwendung geeigneten Oberflächentemperierung.

Die Heizeinheit, die die auswechselbaren beheizten Goldoberflächen sowie die phy¬ sischen Voraussetzungen zur Kühlung bzw. Erwärmung (Kühlmittelanschluß, Stroman¬ schluß) enthält, ist über Steckverbindungen (7; 8) an die eigentlichen Meßeinheiten (1) mit den ebenfalls daran angebrachten Halterungen für Reaktionsgefäße (11) angebracht, in denen die für die Durchführung der Reaktion notwendigen Matrizenmoleküle, Puffer¬ bestandteile und Primer in Lösung sind sowie die Polymerase vorliegen.

Die Meßfühler (9), hier in Form einesTeststreifens, enthalten in FIG 4 beispielhaft Gold¬ oberflächen (5), die nicht mit denselben Primern (6) beschichtet sein müssen.

Figur 5 zeigt Vergrößerungen der Meßeinheiten mit auswechselbaren Teststreifen aus FIG 4, wobei die Meßeinheit (1, bestehend aus 9 und 10) aus Elektronikanschluß und Kühlaggregat (oberer, grauer Teil der Abbildung) und dem Teststreifen (= Meßhülle) be-

steht. Ein Querschnitt durch diese Meßeinheit ist im unteren Teil der Abbildung darge¬ stellt, auf dem man den zur Kühlung verwendeten Kühlkreislauf (4) mit Rührmechanis¬ mus (12) und Kühlflüssigkeit (13) sowie die Reaktionsoberflächen (5, 6) mit Elek¬ tronikanschluß erkennen kann. Im rechten Teil der unteren Abbildung ist eine weitere Vergrößerung des Kathodenanschlusses der Goldmembran (5) mit Unterstützungs- und Trennfilter (14) sowie Haftschicht für die Oligonukleotide (6) erkennbar.

Figur 6 besteht aus einer Schemazeichnung des sich in unmittelbarer Umgebung der Haftschicht mit Oligonukleotiden ausbildenden Temperaturgradienten und dem zu er¬ wartenden Temperaturprofil, hier am Beispiel einer 3 stufigen PCR, bei der die Tempera¬ turen 96 ° für 0,1 Sekunden, 54 °für 0,5 Sekunden und 72 ° für ebenfalls 0,5 Sekunden dargestellt sind.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1:

Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche (Variante a).

Eine beispielhafte zyklisch temperierbare Goldoberfläche läßt sich dadurch erhalten, daß in eine dünne Leiterplatte zwei ca. 1 mm breite und 3 mm lange Langlöcher im Abstand von 3 mm parallel zueinander ausgefräst werden. Auf der einen Seite, die der Lösung zugewandt ist und daher proximale Seite genannt wird, werden diese Langlöcher durch Bedampfen mit Gold leitend miteinander verbunden. Auf der distalen Seite wird eines dieser Langlöcher über die Leiterplattenbahnen mit der Anode, das andere ebenfalls über die Leiterplattenbahnen mit der Kathode verbunden.

Die Goldschicht auf der proximalen Seite wird dadurch aufgebracht, daß eine Maske in der gewünschten Größe, in diesem Fall 3 x 3 mm bündig, über die beiden Längsflächen aufgebracht wird. Die Innenseiten der Längsfläche sind galvanisch bündig bis zur Ober¬ fläche mit Kupfer beschichtet. In dem folgenden Bedampfungsverfahren, das wie branchenüblich durchgeführt wird, werden nun die beiden elektrisch leitenden Längs¬ löcher mit einer wenige μm dicken Goldschicht beschichtet. Das Beschichtungsverfahren ist im Folgenden beschrieben:

Die Herstellung der Goldoberfläche erfolgte durch Aufdampfen auf "Lexan" Polycarbo- natfolien (Hersteller: General Electric, Dicke 0.75 mm) mit den Abmessungen 8x8 cm über eine Metallmaske (d = 0.5 mm, Aluminium) in einer Leybold Hochvakuum-Be- schichtungsanlage (Univex 450). Die Oberflächen liegen in regelmäßigen Abständen, die ein Zerlegen der bedampfteil Platte in mehrere Einheiten zulassen. Die Schichtdicke des Goldes beträgt 300 nm. In einem weiteren Schritt erfolgte die Beschichtung der Multi- Goldsportplatte mit "verdünnten" Biotinthiol-Bindeschichten unter Bildung einer hydro¬ phoben SAM-Schicht. Die Biotinthiolverbindung (HS-C12-DADOO-Biotin; N,N"-(12- mercaptodc^ecylyl-biotmylyl^jT-diaminoethyl-glycoldiether; 2.94 mg; 5x10-5 m) und der Verdünner (12-Mercaptoundecanol, 9.2 mg, 4.5x10"^ m) wurden in 100 ml Ethanol p.a. gelöst. In diese Lösung wurden die frisch beschichteten Polycarbonatfolien getaucht. Nach 4 h wurden die Platten entnommen, 2mal mit Ethanol p.a. gewaschen und sofort mit Streptavidin beschichtet. Dazu wurden die Goldspots und die S AM-beschichteten Folien 1 h in eine Streptavidinlösung getaucht (Konzentration Streptavidin: 0.5 mg/ml in 0.05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.2). Die so behandelten Oberflächen wurden danach mit einer Waschlösung (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.2, 2 % Saccharose,

0.9 % NaCl, 0.3 % Rmderserumalbumin Fraktion H) behandelt und anschließend 20 h getrocknet (25° C und 40 % Luftfeuchtigkeit).

Durch die sehr geringe Dicke der Goldschicht resultiert ein sehr geringer leitender Gold¬ querschnitt (3 mm x 3 μm über eine Strecke von 3 mm). Diese Goldschicht stellt daher einen relativ hohen Widerstand im Vergleich zu den Leiterbahnen dar.

Die Leiterbahnen werden nun an einen Stromversorger angeschlossen, der computerge¬ stützt eine Kontrolle der ohmisch induzierten Temperatur der Goldoberfläche zuläßt.

Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche (Variante b)

In einer Variante zur Herstellung einer zyklisch temperierbaren Oberfläche wird die Ab- deckschicht, die den Meßmäander aus Platin isoliert, eines allgemein im Handel befind¬ lichen Platintemperatursensors (PT 100) mit einer Goldschicht bedampft. Schließt man diesen Meßsensor nun an eine reglergesteuerte Spannungsquelle an, so läßt sich dieser Sensor auch als Thermoquelle für die aufgedampfte Goldschicht verwenden. Dazu ist es nötig, Strom und Spannung am Platinsensor über einen Analogdividierer an einen Regler weiterzuleiten. Regelgröße des Reglers ist der Widerstand des beheizten Platinelements, was eine exakte Temperatursteuerung zuläßt, wenn eine Normierung der Goldober¬ flächentemperatur mit der Temperatur des Platinmäanders stattgefunden hat.

Beispiel 2:

Eine beispielhafte Vorrichtung zur Messung der Oberflächentemperatur der Goldfolie (Variante a).

Eine Goldfolie gemäß Beispiel 1, Variante a, wird mit einer Maske abgedeckt, die das Bedampfen der Goldfolie mit einem ca. 1 mm breiten Goldfaden, der über diese Gold¬ oberfläche hinausragt und an einen Meßpunkt anschließbar ist, zuläßt. Eine weitere Maske, die das Bedampfen mit einem zweiten Faden, z. B. aus Nickel, Wismut oder einer anderen zur Temperaturmessung geeigneten Legierung, zuläßt, wird ebenfalls be¬ reitgestellt. Der Metallfaden liegt auf derselben Stelle der Goldoberfläche wie der Gold¬ faden beim (200 nm dick), trennt sich jedoch in seinem Verlauf beim Verlassen der zu temperierenden Goldoberfläche und führt als getrennter Metallfaden (300 nm dick) zu einem zweiten Meßpunkt. Diese Anordnung der Meßsonden aus Gold und einem weite¬ ren, zur Temperaturmessung geeigneten Metall oder Legierung erlaubt die Messung der Thermospannung (2,2 mV/100 ° Kalvin) in dem Bereich der Goldfolie, wo die beiden

Meßsondenfaden überlappen. Die Temperatur an der Vergleichsstelle (Cold Junction) wird mit einem Thermopräzisions PT 1000-Element gemessen (Genauigkeit > 1 %) und auf 10 V normiert (0 V entspricht 0 °, 10 V entspricht 100 °), ausschließlich verstärkt und ebenfalls auf 10 V normiert. In einem Summenverstärker wird die Summe beider Temperaturen gebildet und zur elektronischen Steuerung der jeweiligen Oberflächen¬ temperatur verwendet.

Beispiel 2b

Eine beispielhafte Vorrichtung zur Messung der Oberflächentemperatur der Goldfläche aus Beispiel 1, Variante b.

Zur exakten Ermittlung der Oberflächentemperatur der Goldschicht besteht die Möglich¬ keit, die Oberflächen zweier wie in Beispiel 1, Variante b, beschriebener goldbedampfter PT 100-Meßsensoren in der Art aneinander zur pressen, daß jeweils die Hälfte der gold¬ bedampften Flächen des Heizsensors und des Meßsensors einander abdecken und sich die jeweils verbleibende Fläche im umgebenden Medium befindet. Wird nun nur der eine Sensor zur Messung, der andere zur Erwärmung verwendet, so laß sich damit exakt die Temperatur der Goldoberflächen berechnen. Die Temperatur an der Oberfläche der Sen¬ soren entspricht exakt dem Mittelwert der Temperatur des beheizten und des nicht-be- heizten Sensors, die beide über Widerstandsmessungen genau definieFbar sind. Auf diese Weise können mittels eines zur Messung verwendeten Temperatursensors eine ganze Reihe von temperierbaren Oberflächen geeicht und für die Durchführung von PCR- Reaktionen vorbereitet werden. Der Temperaturgradient zweier so angeordneter Ober¬ flächen beträgt zwischen der beheizten und nicht-beheizten Oberfläche ca. 3 °C.

Beispiel 3:

Durchführung einer zweistufigen PCR mit einem oberflächenfixierten Primer.

Eine beispielhafte Durchführung einer Polymerasekettenreaktion verwendet einen ober¬ flächenfixierten, biotinmarkierten Primer (5 -GAAGGGAGGAAGGAGGGAGCGGAC- 3'). Dieser Primer ist über seine am 5'-Ende befindliche Biotingruppe an eine oberfläch¬ liche Streptavidin- bzw. Goldstreptavidinoberfläche gekoppelt. Die molare Menge von Streptavidin bzw. Biotin/Quadratmillimeter beträgt etwa 0.2 pmol/mm ² . In Lösung be¬ finden sich Nanogramm-Mengen oder weniger des folgenden doppel- oder einzelsträngi- gen Matrizenmoleküls (nur ein Strang zitiert: 5'- GAAGGGAGGAAGGAGGGAGCGGACGTCCACCACCACCCAACCACCCCACCC

-3') und ein Gegenprimer in der Konzentration von zwischen 0,5 μM bis 2 μM. Die Re¬ aktion findet in handelsüblichem PCR-Puffer (Boehringer Mannheim, Beipackzettel zum Enzym, 8. Ausgabe, Identnummer 1146165) bei 1,5 mMMg ²⁺ statt. Als Polymerase wurde eine handelsübliche Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Identnummer 1146165) in der Konzentration von 20 nM eingesetzt. Der in Lösung vorhandene Gegenprimer (5 3GGTGGGGTGGTTGGGTGGTGGTG-3') war an seinem 5'-Ende Digoxigenin-markiert (Patent EP 0324474).

Die PCR-Reaktion fand bei einer konstanten Lösungstemperatur von 68 ° und einer zwischen 96 und 68 ° zyklisch variierenden primerbeschichteten Oberfläche statt. Die zyklische Dauer der höheren Temperatur variierte in unserem Beispiel zwischen 0,1 Sekunden, 10 Sekunden und 1 Minute, die der niedrigeren Temperatur zwischen 0,5 Sekunden, 20 Sekunden und 1 Minute.

Nach Abschluß der zyklischen Temperierung wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, wobei ausschließlich die komplementären elongierten biotin- und elongierten digoxigenin-markierten Primer miteinander hybridisieren und doppelsträngige DNA- Fragmente bildeten. Nach Waschen mit PCR-Pufferlösung wurden die Oberflächen anti- Dig-POD umgesetzt, 30 Minuten inkubiert, erneut gewaschen und mit ABTS versetzt (Färbeprotokoll gemäß Beipackzettel Punkt 3 zum Boehringer Mannheim Reverse- Transkriptase-Assay, non-radioaktiv, Identnummer 1468120). Das entstandene farbige Produkt wurde in einem ELISA-Photometer bei einer Wellenlänge von 405/490 Nanometem quantitativ bestimmt. Die erhaltenen Extinktionswerte belegen eine Amplifikation eines Bereichs des Templates, gemessen als extendierter Gegenprimer, der an den an die Festphase gekoppelten Primer hybridisiert. In typischen Experimenten erhielten wir Extinktionswerte um 0.4 bei Messung im Elisareader und nach Korrektur um den digoxigeninfreien Leerwert. In Kontrollexperimenten ohne Template lagen nach Leerwertkorrektur die Werte bei 0.04 und in Kontrollen ohne Polymerase bzw. ohne Temperaturerhöhung jedoch im kompletten Reaktionsansatz lagen die Werte bei 0.07. Selbst mehrminütiges (5 Minuten) Erhitzen der Oberfläche erhöhte die Um¬ gebungstemperatur in der konstant temperierten Lösung nicht mehr als 7 C, selbst wenn eine wesentlich (lOOfach) größere Oberfläche (3 cm ² ) erhitzt wurde.

Beispiel 4:

Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung

Eine beispielhafte Vorrichtung gemäß dieser Erfindung besteht aus drei Strukturunter¬ einheiten. Bei diesen drei Struktureinheiten handelt es sich um

1. die in das flüssige Reaktionsmillieu eindringende heizbare und temperaturregu¬ lierbare Oberfläche,

2. um die zur Heizung und Kühlung notwendigen Bauteile, die an

3. die elektronische Steuerung angeschlossen sind.

Die in diesem Beispiel beschriebene Elementoberfläche, besteht aus einer dünnen Gold¬ folie mit einer Dicke von weniger als einem halben Millimeter, die mit einer Streptavidin- schicht fest verbunden ist. Durch Affinitätskopplung läßt sich an diese Dextranschicht wiederum die für die weiteren Bearbeitungsschritte notwendigen biotinmarkierten Oligonukleotide anbringen. Diese Oligonukleotide sind dann über ihr 5'-Phosphatende kovalent an die Oberfläche gekoppelt und besitzen somit ein reaktives, fürΕnzyme zu¬ gängliches 3 '-Ende.

Diese Goldfolie, die durch ein unterstützendes Plastiknetz strukturell stabilisiert werden kann, und die eine reaktive Oberfläche von etwa 5 x 5 mm besitzt, dient auch zugleich als Heizelement, da sie an eine elektrische Stromquelle angeschlossen ist, die bei Stromfluß zu einer spontanen Erhitzung dieser Goldfolie führt. Distal zum Reaktionsansatz, hinter der Goldfolie, befindet sich das Kühlelement. In diesem Fall besteht das Kühlelement aus einem in Plastik ausgesparten Kanal mit einer an die Goldfolie grenzenden 7 mm breiten Fläche. Der Kanal ist 2 mm tief und erstreckt sich über die ganze Länge des hier als Meßfühler bezeichneten Teil des Gerätes, der in diesem Fall die Heiz- und Kühlelemente sowie die reaktive Oberfläche umfaßt. Dieser Kanal erstreckt sich von einem Ende des Meßfühlers bis zum anderen Ende des Meßfühlers, an dem die reaktive Oberfläche angebracht ist, und zurück indem er einen die beiden Kanäle trennenden Steg umfaßt. In diesem, als Kühlschleife zu bezeichnendem Bauteil, wird eine geeignete Kühlflüssigkeit, z. B. Wasser, umgewälzt. Die gesamte Einheit ist in Hartplastik eingegossen und recyclebar, d. h. sowohl die Goldfolie als auch das Plastik sind wiederverwertbar.

Die Steuerung sowohl der Erhitzung der reaktiven Oberfläche, als auch der Umwälzge¬ schwindigkeit und Vorkühltemperatur der Kühlflüssigkeit wird über einen elektronischen

dritten Bauteil, der außerhalb des Meßfühlers angebracht ist, vorgenommen. Diese dritte Einheit umfaßt auch das Vorratsbehältnis sowie die Verbindungsanschlüsse für die Kühl¬ flüssigkeit. In dieser dritten Einheit befindet sich weiterhin eine Mikropumpe, die für die Umwälzung der Kühlflüssigkeit zuständig ist. Durch Anflanschen der Kühlflüssigkeits- schläuche an die Meßeinheit sowie durch das Anschließen der Stromzufuhr an die reak¬ tive Oberfläche wird der Meßfühler einsatzbereit. Über eine Eingabeeinheit, die an der Oberfläche der Steuereinheit angebracht ist, die über einen digitalen Display verfügt, sind sowohl die einzelnen Temperaturbereiche, als auch die Dauer ihrer Einwirkung auf diese Oberfläche vorwählbar.

Beispiel 5:

Durchführung einer Vermehrungsreaktion mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Bei dem hier als Beispiel einer erfindungsgemäßen Anwendung der Vorrichtung handelt es sich um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion von einer vorgegebenen Nukleinsäuresequenz. Für diese Nukleinsäuresequenz sind zwei Primer mit einer Länge von jeweils 16 Basen, die im Abstand von 4 Nukleotiden zuein¬ ander codieren, ausgewählt worden. Der eine Primer ist in seiner Sequenz identisch, der andere komplementär zur analysierenden Sequenz. Der hier als identisch bezeichnete Primer ist dabei über seine am 5' -Ende vorliegenden Biotinmarlάerung an die reaktive Oberfläche gekoppelt. Der andere, komplementäre Primer sowie alle weiteren Rea¬ genzien, die üblicherweise in einer sogenannten PCR-Reaktion zum Einsatz kommen, sind dem Reaktionsansatz zugegeben. Durch Eingabe der entsprechenden Reaktions¬ temperaturen die in unmittelbarer Nähe der reaktiven Oberfläche herrschen sollen, und durch Eintauchen der reaktiven Oberfläche bzw. des Meßfühlers (siehe Beispiel 4) in den Reaktionsansatz, wird die Reaktion gestartet. Die Temperaturänderungen in der reaktiven Oberfläche sind so programmiert, daß die Durchführung von 50 Erwärmungs¬ und Abkühlungszyklen in ca. 1 Min. durchgeführt werden kann. Durch anschließendes Eintauchen des Meßfühlers in eine Lösung mit destilliertem Wasser und kurzfristiges Er¬ hitzen, wird die Oberfläche von allen nicht kovalent gebundenen Reaktionspartner ge¬ reinigt. Die so gereinigte Oberfläche, die nun nur noch Primermoleküle und extendierte Primermoleküle enthält, wird zur Analyse, zusammen mit dem Meßfühler, in ein Gerät eingeführt, das nach dem Prinzip der Plasmonenresonanz, eine direkte Bestimmung der Menge des extendierten Produkts zuläßt.

Bezugszeichenliste

1. erfindungsgemäße Vorrichtung, Meßeinheit

2. Reaktionsgemisch

3. Reaktionsgefaß

4. Kühlelement

5. Heizelement/Oberfläche

6. Oligonukleotide

7. Anschlüsse für Kühlelement

8. Anschlüsse für Heizelement

9. auswechselbarer Meßfühler

10. Elektronikanschluß und Kühlaggregat

11. Halterung für Reaktionsgefaß

12. Rührer

13. Kühlflüssigkeit

14. Unterstützungs- und Trennfilter (Abtrennung des Kühlmittels)