DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention s'applique à l'analyse des sécrétions broncho-pulmonaires d'un sujet. La présente invention concerne plus précisément un procédé de traitement d'un échantillon de sécrétions broncho-pulmonaires d'un sujet ainsi qu'un procédé de mesure rhéométrique réalisé à partir de l'échantillon préalablement traité par le procédé de traitement.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les sécrétions broncho-pulmonaires, également appelées « sputum », sont obtenues par expectoration d'un sujet. Leur analyse rhéométrique permet potentiellement de dépister un grand nombre de maladies chez les sujets, de suivre leur évolution dans le temps ainsi que d'évaluer l'efficacité des traitements administrés au sujet ou l'effet de traitement appliqué in vitro sur le sputum.

En particulier, il peut être utile de réaliser des mesures rhéomériques sur le sputum dans plusieurs cas, notamment dans le cadre du dépistage de pathologies avec atteinte pulmonaire. Il peut s'agir par exemple du dépistage précoce de la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), du suivi de l'évolution de la BPCO ou de la mucoviscidose dans le temps afin de prévoir l'occurrence de crises d'exacerbation, du suivi de l'efficacité d'un traitement antibiotique en cas d'infection des bronches, ou encore de la qualification de candidats médicaments dans le cadre d'essais cliniques dans l'industrie biotechnologique et pharmaceutique. En recherche fondamentale ou thérapeutique, le traitement in vitro de sputum suivi de son analyse est source d'information, de la physiopathologie au criblage de molécules (études de pharmacodynamique et d'efficacité).

Un premier obstacle à la réalisation de mesures rhéométriques sur un échantillon de sputum concerne la répétabilité de ces mesures. A l'heure actuelle, il n'est pas possible de réaliser des mesures de rhéométrie répétables sur un échantillon de sputum directement obtenu par expectoration d'un sujet sans traitement préalable de cet échantillon. En effet, l'échantillon prélevé chez le sujet contient une quantité variable et parfois non négligeable et non contrôlable de salive en plus du sputum. En référence à la Figure 1 , l'échantillon 1 comprend alors une phase de salive 2 et une phase de sputum 3 sous-jacente et au contact de la phase de salive. La frontière entre ces deux phases est représentée par la courbe 4 sur la Figure 1. Du fait que la salive possède des propriétés rhéologiques différentes de celles du sputum, une mesure rhéométrique de l'échantillon serait faussée par la présence de salive. En particulier, la salive engendre une dilution non souhaitable du sputum, en plus de comprendre des bulles.

Un deuxième obstacle à la réalisation de mesures rhéométriques sur un échantillon de sputum est la présence de « bouchons muqueux » dans le sputum. Ces bouchons muqueux sont des sécrétions denses et épaisses de la muqueuse bronchique qui se présentent sous la forme d'amas de grande taille par rapport au contenu biologique de l'échantillon. Ces bouchons sont composés notamment de mucus partiellement déshydraté (par l'action répétée du passage de l'air sur du mucus statique lors de la respiration), de bactéries, de biofilms, de pus, et de cellules sanguines, et leur composition varie en fonction des sujets. Ils sont particulièrement nombreux dans des échantillons de sputum prélevés sur des sujets atteints de pathologies respiratoires chroniques telles que la BCPO et la mucoviscidose par exemple.

Les bouchons muqueux sont répartis de façon hétérogène dans le sputum, ce dernier étant un milieu aux propriétés viscoélastiques d'environ dix à cent fois inférieures à celles des bouchons muqueux. De plus, la taille des bouchons muqueux est très variable. Il en résulte une forte hétérogénéité du sputum.

Lors d'une mesure rhéométrique d'un échantillon de sputum par un appareil de mesure rhéométrique adéquat, la forte hétérogénéité du sputum a pour effet une répartition inégale des bouchons muqueux sur la géométrie de mesure de l'appareil.

Or de manière bien connue, un appareil de rhéométrie classique couramment utilisé pour la réalisation d'une telle mesure comprend une cellule de mesure comportant un rotor et un stator. Le rotor comprend une géométrie « basse » ou « haute » de rotor et le stator comprend une géométrie « basse » ou « haute » de stator (en fonction des différentes technologies), selon un axe vertical correspondant à une utilisation courante de l'appareil, ces deux géométries étant coaxiales et au contact de l'échantillon lorsque ce dernier est introduit dans la cellule de mesure. Les géométries de rotor et de stator peuvent avoir des formes géométriques différentes d'un appareil à l'autre, tels qu'un cône ou un cylindre par exemple.

L'échantillon 1 de sputum est placé sur la géométrie basse 7 représentée sur la Figure 2 dont la surface a généralement une forme de disque. Le rotor applique un cisaillement à l'échantillon via la rotation contrôlée d'une des géométries, et l'appareil mesure la contrainte résultante appliquée par l'échantillon via le couple exercé sur une des géométries. Le rapport du couple mesuré (dont on déduit la contrainte) et de la vitesse de rotation du rotor (dont on déduit le cisaillement) permet de déduire les caractéristiques rhéologiques ou propriétés viscoélastiques de l'échantillon.

Ainsi, la zone la plus sensible de la mesure est la zone périphérique 18 de la cellule de mesure (le couple étant directement proportionnel au bras de levier), qui s'étend entre le cercle schématique 8 et la bordure 9 de la cellule. Or, la répartition des bouchons muqueux 6 dans la cellule est quasiment aléatoire et la proportion de bouchons muqueux dans la zone périphérique 18 n'est pas contrôlable, cette dernière pouvant être plus ou moins élevée que la proportion moyenne de bouchons muqueux dans l'échantillon. Ceci se traduit soit par une surestimation des propriétés viscoélastiques de l'échantillon, soit par une sous-estimation de celles-ci. Il en résulte une importante disparité des mesures de rhéométrie sur un même échantillon et donc une très mauvaise répétabilité des mesures.

Un troisième obstacle à la réalisation de mesures rhéométriques sur un échantillon de sputum est la taille importante des bouchons muqueux par rapport à celle de la cellule de mesure. En effet, par application de l'hypothèse des milieux continus qui est une base aux calculs en rhéologie, la taille caractéristique des particules ou inclusions présentes dans un matériau doit être négligeable par rapport aux dimensions de la cellule de mesure de l'appareil de rhéométrie. En théorie, un facteur de 100 est communément admis, mais en pratique, il est nécessaire qu'un facteur de dix au minimum existe entre la taille des inclusions et la taille de l'entrefer de la cellule de mesure.

Compte tenu de ce qui précède, il est donc nécessaire d'avoir un procédé de traitement d'un échantillon de sputum permettant la réalisation ultérieure de mesures rhéométriques précises et répétables, et ceci tout particulièrement dans le cas où le sputum de l'échantillon contient des bouchons muqueux.

Le document WO 94/10567 propose un procédé de mesure du culot de centrifugation d'un échantillon de sputum obtenu sur un sujet atteint d'une maladie respiratoire, dans lequel l'échantillon est centrifugé afin de se fractionner en une phase dite « pellet phase » et un surnageant. Les « pellets » sont des bouchons muqueux qui sont ensuite mesurés conformément au procédé décrit.

Dans ce document, la centrifugation permet simplement de concentrer les constituants solides dans la « pellet phase », et donc de séparer plusieurs phases de l'échantillon en fonction de leur densité. Ce procédé est donc spécifiquement adapté à la réalisation de mesures rhéométriques sur les bouchons muqueux, mais pas sur l'ensemble du sputum incluant de tels bouchons muqueux. EXPOSE DE L'INVENTION

L'invention a donc pour but de remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un procédé de traitement d'un échantillon de sputum permettant d'obtenir ultérieurement des mesures rhéométriques précises et répétables, et ceci tout particulièrement dans le cas où le sputum de l'échantillon contient des bouchons muqueux.

Un autre but de l'invention est de proposer un tel procédé de traitement dont la réalisation ne dégrade pas les propriétés viscoélastiques du sputum.

L'invention vise également à proposer un procédé de mesure rhéométrique d'un échantillon de sputum traité selon le procédé de traitement précédent, et dont la réalisation permet d'obtenir des mesures rhéométriques précises et répétables, et ceci tout particulièrement dans le cas où le sputum de l'échantillon contient des bouchons muqueux.

A cette fin, selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de traitement d'un échantillon de sputum issu d'un sujet comprenant une phase de salive et une phase de sputum sous-jacente à la phase de salive et comprenant des bouchons muqueux, le procédé comprenant les étapes suivantes :

• la séparation de la phase de sputum et de la phase de salive par prélèvement de la phase de sputum et transfert de celle-ci dans un récipient muni d'un fond plat,

• l'homogénéisation du sputum par fractionnement des bouchons muqueux au moyen d'une agitation dudit sputum par vortex, la vitesse d'agitation étant ajustée de sorte que le sputum prenne dans le récipient une forme générale torique qui s'étend dans un plan parallèle au fond dudit récipient.

Un tore désigne en géométrie la surface engendrée par la révolution d'un cercle autour d'une droite non diamétrale coplanaire avec le cercle, et par extension, le volume limité par cette surface. Le terme « forme générale torique » traduit le fait qu'en pratique, conformément au procédé de l'invention, le sputum adhère à la paroi latérale et au fond du récipient dans lequel il se trouve. Il épouse alors au moins en partie les contours de la paroi latérale et du fond du récipient, ce qui engendre une légère déformation du tore. Le tore peut être ouvert si la quantité de sputum est faible ou si les propriétés viscoélastiques du sputum sont très prononcées (haute viscosité) de sorte que le sputum forme un ensemble fortement cohésif. Dans le cas contraire, le tore est fermé.

Dans un souci de concision, la forme générale torique est désignée par le terme « tore » dans la suite de la description.

Selon d'autres aspects, le procédé de traitement proposé présente les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs combinaisons techniquement possibles : le récipient possède avantageusement une section circulaire de diamètre compris entre 30 millimètres et 50 millimètres, au niveau de la zone d'agitation du sputum ; la vitesse d'agitation est de préférence inférieure ou égale à 6000 tours par minute ; l'homogénéisation du sputum est réalisée en imposant un taux de cisaillement prédéterminé au sputum dont la valeur est inférieure à une valeur critique en dessous de laquelle les propriétés viscoélastiques du sputum ne sont pas dégradées ;

la valeur critique du taux de cisaillement est égale à environ 50 s ^"1 ;

lors de la mise en œuvre de l'étape de séparation de la phase de sputum et de la phase de salive, le sputum est soumis à un taux de cisaillement dont la valeur est inférieure à la valeur critique décrite précédemment. En d'autres termes, l'étape de séparation est réalisée de manière à ne pas imposer au sputum un taux de cisaillement dont la valeur est supérieure à la valeur critique ;

la phase de sputum est intégralement prélevée et transférée dans le récipient avec une pipette à déplacement positif ;

L'invention propose également un procédé de mesure rhéométrique d'un échantillon de sputum, comprenant les étapes suivantes :

• le traitement de l'échantillon de sputum conformément au procédé de traitement décrit précédemment, afin d'obtenir un sputum homogène,

• le transfert du sputum homogénéisé dans une cellule de mesure d'un appareil de mesure rhéométrique,

• la réalisation d'une ou plusieurs mesures rhéométriques d'au moins un paramètre rhéologique du sputum.

Selon d'autres aspects, le procédé de mesure rhéométrique proposé présente les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs combinaisons techniquement possibles :

l'étape de transfert du sputum homogénéisé dans la cellule de mesure est réalisée en imposant au sputum un taux de cisaillement dont la valeur est inférieure à une valeur critique en dessous de laquelle les propriétés viscoélastiques du sputum homogénéisé ne sont pas dégradées ;

- la valeur critique du taux de cisaillement est égale à environ 50 s ^"1 ;

le sputum homogénéisé est transféré dans la cellule de mesure avec une pipette à déplacement positif. DESCRIPTION DES FIGURES

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif, en référence aux Figures annexées qui représentent :

- La Figure 1 , une image d'un échantillon de sputum prélevé sur un sujet atteint de mucoviscidose ;

La Figure 2, un schéma d'une géométrie basse d'une cellule de mesure rhéométrique contenant un sputum non homogénéisé, conformément à l'état de l'art ;

- La Figure 3, un schéma illustrant l'agitation d'un sputum, préalablement séparé de la salive, par vortex, le sputum prenant la forme d'un tore ;

La Figure 4, un schéma d'une cellule de mesure rhéométrique contenant un sputum traité conformément au procédé de traitement de l'invention ;

La Figure 5, un schéma d'une géométrie basse d'une cellule de mesure rhéométrique contenant un sputum homogénéisé par le procédé de traitement de l'invention ;

La Figure 6, un graphique illustrant l'évolution du module viscoélastique du sputum en fonction du taux de cisaillement pour cinq échantillons, selon un premier protocole de mesure ;

- La Figure 7, un graphique illustrant l'évolution du module viscoélastique du sputum en fonction du taux de cisaillement pour un échantillon, selon un second protocole de mesure.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier aspect de l'invention concerne un procédé de traitement d'un échantillon de sputum. En référence à la Figure 1 , un échantillon 1 de sputum comprend deux phases superposées, une première phase sus-jacente composée de salive 2 et une phase sous- jacente composée de sputum 3. La frontière entre ces deux phases est représentée par la courbe 4 sur la Figure 1.

La phase de salive 2, ou plus simplement « salive », comprend majoritairement de la salive et se retrouve de manière systématique dans l'échantillon de sputum obtenu par expectoration d'un sujet.

Il est cependant possible de réduire la quantité de salive dans l'échantillon prélevé, par exemple en plaçant des éléments de protection en coton dans la bouche du sujet lors du prélèvement, le coton permettant d'absorber une grande quantité de salive, ou bien en demandant au patient de cracher un maximum de salive, ou bien de boire un verre d'eau puis cracher à nouveau, avant l'expectoration (la sensation doit être d'avoir la bouche sèche lors de l'expectoration).

A titre indicatif, l'expectoration spontanée et l'expectoration induite sont des méthodes de prélèvement couramment utilisées, l'expectoration induite consistant à faire inspirer au sujet un mélange d'air et de fines particules de sérum salé hypertonique entre 3 et 5% pendant dix à vingt minutes environ à l'aide d'un nébuliseur, dans le but d'irriter légèrement les bronches et de produire une sécrétion plus importante de sputum.

La phase de sputum 3, ou plus simplement « sputum », comprend majoritairement du sputum, c'est-à-dire des sécrétions broncho-pulmonaires. Lorsque le sujet sur lequel est réalisé le prélèvement est atteint d'une maladie entraînant des complications bronchopulmonaires, telles que la BPCO ou la mucoviscidose par exemple, la phase de sputum comprend une phase liquide 5 dans laquelle nagent des bouchons muqueux 6 se présentant sous la forme de granules ou d'amas dont la taille est suffisamment grande pour être visibles à l'œil nu.

La présence de bouchons muqueux 6 confère au sputum 3 une forte hétérogénéité, ce qui fausse toute mesure de rhéométrie ultérieure de l'échantillon. Le procédé proposé permet de régler ce problème.

A partir d'un échantillon 1 de sputum prélevé sur un sujet sain ou atteint d'une maladie respiratoire, on commence d'abord par séparer le sputum 3 de la salive 2. Pour ce faire, on aspire le sputum 3 à l'aide d'un dispositif de prélèvement, sans aspirer la salive surnageante. L'orifice d'aspiration du dispositif de prélèvement est positionné dans le sputum, en-dessous de la frontière entre le sputum et la salive. On veillera de préférence à positionner l'orifice d'aspiration du dispositif au fond de l'échantillon à la base du sputum, afin de s'assurer que la salive ne soit pas aspirée avec le sputum. Le sputum 3 est ensuite transféré dans son intégralité dans un récipient adapté 10, tel qu'un pot stérile par exemple (Figure 3).

Un aspect important de cette étape de prélèvement est d'aspirer les bouchons muqueux 6. En effet, il convient de ne pas simplement prélever la phase liquide 5 de sputum en « triant » les bouchons muqueux (effet lié au pipetage, qui aspire préférentiellement la phase liquide moins consistante), mais bien de prélever le sputum 3 dans son entièreté.

On veillera donc dans l'idéal à utiliser un dispositif de prélèvement adapté à ce but, et en particulier un dispositif de la sorte muni d'un orifice d'aspiration dont la taille caractéristique (généralement le diamètre, dans le cas d'un orifice circulaire) est au moins de l'ordre de grandeur de la taille caractéristique des bouchons muqueux afin de permettre le passage des bouchons muqueux au travers de l'orifice d'aspiration. En effet, de par leur nature fortement viscoélastique, les bouchons muqueux ont tendance à rester intègres et à relativement peu se déformer lors de l'aspiration. Si leur taille caractéristique est très supérieure à celle de l'orifice d'aspiration, ils ne sont pas préférentiellement aspirés et sont triés. Ainsi, la proportion de bouchons muqueux dans le sputum transféré par la suite dans le récipient prévu à cet effet est faible et non représentative de celle présente initialement dans l'échantillon prélevé sur le sujet.

De manière avantageuse, on utilisera une pipette munie d'un embout à large orifice d'aspiration pour prélever le sputum, et plus particulièrement une pipette à déplacement positif munie d'un embout à large orifice d'aspiration.

Une pipette à déplacement positif (non représentée) offre l'avantage de transférer le sputum prélevé avec un minimum de pertes. Une telle pipette est en effet spécialement conçue pour le pipetage des liquides denses et visqueux. Elle comprend un piston en contact direct avec le liquide qui se déplace dans un embout, et l'action d'essuyage positif du piston contre la paroi interne de l'embout empêche qu'une partie du liquide reste collée à celle-ci. Il est en effet nécessaire de réduire au minimum les pertes de sputum lors du traitement de l'échantillon afin de s'assurer de la bonne faisabilité d'une mesure rhéométrique subséquente, notamment dans le cas relativement fréquent où la quantité d'échantillon prélevée sur le sujet est faible et tout juste suffisante pour réaliser la mesure rhéométrique. De plus, dans une pipette traditionnelle, l'aspiration se faisant par dépression créée par le déplacement d'un piston qui n'est pas en contact direct avec l'échantillon, la colonne d'air qui surplombe ledit échantillon peut connaître des variations de volume plus ou moins importantes du fait de sa forte compressibilité. Il en résulte que le volume d'un fluide très consistant aspiré dépend de ses propriétés mécaniques, ce qui peut rendre les pipetages successifs non répétables. Une pipette à déplacement positif s'affranchit de ce problème puisque le piston est directement en contact avec l'échantillon, éliminant ainsi le volume tampon d'air.

Le sputum débarrassé de la salive est ensuite homogénéisé par agitation au moyen d'un dispositif d'agitation. L'homogénéisation consiste à imposer un cisaillement au sputum, auquel correspond un taux de cisaillement prédéterminé, afin de fractionner les bouchons muqueux. Il en résulte un sputum contenant le liquide de sputum dans lequel se trouvent des fractions de bouchons muqueux bien distribuées dans ledit liquide, et dont la taille est considérablement réduite par rapport à celle des bouchons muqueux dont elles sont issues.

L'étape d'homogénéisation est réalisée au moyen d'une agitation par vortex. Ce type d'agitation permet d'accroître l'occurrence d'écoulements secondaires efficaces qui permettent une meilleure homogénéisation du sputum comparativement à une agitation au moyen d'autres agitateurs mécaniques (rotatifs ou secoueurs) ou au moyen d'agitateurs magnétiques, et sans nécessiter l'introduction d'un mobile. De plus, l'agitation par vortex offre l'avantage de pouvoir constater visuellement que le sputum est homogénéisé de manière optimale. Plus en détail, une homogénéisation optimale du sputum par vortex se traduit par le fait que le sputum 3 forme un tore dans le récipient 10, ainsi que représenté sur la Figure 3.

Le tore 3 tourne autour de son axe de révolution A, qui correspond à l'axe de révolution du récipient (lequel est perpendiculaire au fond du récipient 10), selon un écoulement dit « écoulement primaire » représenté par la flèche 1 1 dans un plan P1 , et tourne également sur lui-même selon un mouvement transversal (ou méridien) dit « écoulement secondaire » dans un plan P2 sensiblement orthogonal au plan P1 et orienté du centre du tore vers l'extérieur du tore et inversement selon les flèches 12 et 13.

La présence de l'écoulement secondaire 12, 13 améliore les transferts de masse au sein du sputum 3. Il en résulte alors une meilleure homogénéisation de ce dernier.

Agiter le sputum par vortex revient à lui imposer un cisaillement, auquel correspond une valeur de taux de cisaillement. Et de manière générale, le taux de cisaillement est également appelé « gradient de vitesse », et permet de mesurer le cisaillement appliqué au sein d'un fluide. Pour un fluide visqueux tel que le sputum, le taux de cisaillement γ ^' s'exprime en s ^"1 (seconde inverse) et est relié à la contrainte de cisaillement τ et à la viscosité η du fluide par la relation suivante : τ = η χ γ ^' . De plus, la contrainte de cisaillement τ correspond à l'application d'une force tangentielle sur une surface de fluide.

On comprend donc que le taux de cisaillement imposé au sputum dépend de la vitesse d'agitation, des propriétés structurelles du récipient 10 qui contient le sputum (notamment la forme et le volume du récipient), et des propriétés physico-chimiques du sputum (notamment le volume de sputum dans le récipient et ses propriétés viscoélastiques).

Dès lors, on ajuste la vitesse d'agitation, en tenant compte des propriétés structurelles du récipient et des propriétés physico-chimiques du sputum, jusqu'à l'obtention d'un tore 3.

De manière optionnelle, on peut ensuite continuer de faire varier la vitesse d'agitation de manière à obtenir une gamme de vitesse pour laquelle le sputum forme un tore. Tant que la vitesse d'agitation est choisie de manière à être incluse dans cette gamme, le sputum est homogénéisé de manière optimale.

Lorsque que le tore est formé, l'agitation est réalisée pendant une durée généralement comprise entre 20 secondes et une minute, en particulier une durée voisine de 20 secondes, afin de bien homogénéiser le sputum.

On précise que dans certains cas, notamment lorsque l'échantillon est volumineux (plus de 5 ml), il peut être utile de retirer un certain volume de sputum du récipient 10 afin de pouvoir former un tore lorsque sa formation n'a pas lieu à une vitesse d'agitation donnée, et en particulier, lorsque sa formation n'a pas lieu pour l'ensemble des valeurs de vitesse d'agitation de la gamme.

Le récipient 10 dans lequel est transféré et homogénéisé le sputum possède quant à lui une section circulaire et se présente avantageusement sous la forme d'un cylindre. Il est muni d'un fond plat et possède préférentiellement un diamètre compris entre 30 et 55 millimètres au niveau de la zone d'agitation du sputum, et donc de la formation du tore. La présence d'un fond plat (par opposition à un fond conique) permet d'obtenir un écoulement fluide homogène sur la surface du fond, ce qui en fait une caractéristique nécessaire à la formation d'un tore. Un diamètre compris entre 30 et 55 millimètres permet de former un tore à des vitesses d'agitation raisonnables, c'est-à-dire, des vitesses d'agitation qui ne sont pas trop élevées et dans la gamme de vitesse permise par les appareils d'homogénéisation classiques, afin que l'homogénéisation puisse être réalisée dans des conditions d'analyse standards de laboratoire.

Ainsi que décrit précédemment, ajuster la vitesse d'agitation du sputum permet d'ajuster le taux de cisaillement. Et agiter le sputum en lui imposant un taux de cisaillement prédéterminé permet de fractionner les bouchons muqueux, d'une part afin que ces derniers aient une taille caractéristique suffisamment faible pour que l'hypothèse des milieux continus détaillée précédemment soit satisfaite lors d'une mesure rhéométrique ultérieure du sputum ainsi homogénéisé, et d'autre part afin que ces derniers soient répartis de manière homogène sur la géométrie de mesure, ce qui garantit la faisabilité, la fiabilité, ainsi que la reproductibilité de la mesure.

Le taux de cisaillement est préférentiellement ajusté de manière à ce que sa valeur soit inférieure à une valeur critique en dessous de laquelle le sputum, et en particulier ses propriétés viscoélastiques, ne sont pas dégradés. En effet, il est souhaitable que les bouchons muqueux soient fractionnés en vue de permettre une analyse rhéologique ultérieure, tout en s'assurant que le sputum conserve ses propriétés viscoélastiques initiales. Ce faisant, en plus de garantir la faisabilité d'une mesure rhéométrique sur un sputum, le procédé de traitement proposé permet d'obtenir des résultats rhéométriques conformes à l'état du sujet.

Pour ce faire, on ajuste la vitesse d'agitation du sputum de sorte que ce dernier forme un tore et que le taux de cisaillement qui lui est imposé soit inférieur à la valeur critique. En détail, on agite le sputum avec une vitesse d'agitation donnée jusqu'à l'obtention d'un tore et on détermine le taux de cisaillement correspondant. Si ce taux de cisaillement est inférieur à la valeur critique, on poursuit le procédé. Sinon, on continue d'ajuster la vitesse d'agitation dans une gamme de vitesse permettant la formation d'un tore, jusqu'à avoir un taux de cisaillement inférieur à la valeur critique.

On choisira de préférence une valeur critique de taux de cisaillement égale à environ 50 s ^"1 . Agiter le sputum en lui imposant un taux de cisaillement égal ou inférieur à cette valeur de 50 s ^"1 permet d'obtenir une bonne homogénéisation du sputum tout en évitant de le détériorer. Le choix de cette valeur a été fait suite à la réalisation d'essais expérimentaux détaillés dans l'exemple en fin de texte.

On précise également que la valeur critique est déterminante dans l'étape de séparation de la phase de sputum et de la phase de salive décrite précédemment. Lors de la mise en œuvre de l'étape de séparation, le sputum est sujet à un taux de cisaillement qui lui est imposé de fait lors de son prélèvement. On veillera à ce que le sputum soit prélevé et que les deux phases soient ainsi bien séparées tout en s'assurant que le taux de cisaillement du sputum soit inférieur à la valeur critique définie ci-dessus.

Obtenir un tore, sans dégrader les propriétés viscoélastiques du sputum résulte donc d'un ajustement judicieux de la vitesse d'agitation, fait en fonction : des propriétés structurelles du récipient qui contient le sputum, des propriétés physico-chimiques du sputum, et du taux de cisaillement dont la valeur doit être inférieure à la valeur critique.

A titre indicatif, pour un récipient dont le volume est de l'ordre de quelques dizaines à quelques centaines de millilitres, on choisira une vitesse d'agitation comprise entre 200 tours par minute et 6000 tours par minute. Par exemple, un volume de 3 millilitres de sputum dans un pot stérile de 40 millilitres et de 12 millimètres de rayon, agité à une vitesse de 4000 tours par minute sur un vortex commercial, est susceptible de subir un taux de cisaillement d'environ 10 s ^"1 . De même, un volume de 3 millilitres de sputum dans un pot stérile de 40 millilitres et de 12 millimètres de rayon, agité à une vitesse de 6000 tours par minute, est susceptible de subir un taux de cisaillement d'environ 15 s ^"1 . On notera que dans les deux cas, la valeur du taux de cisaillement est inférieure à la valeur critique préférentielle de 50 s ^"1 .

Après agitation, on examine visuellement si des bouchons muqueux sont encore présents dans le sputum. Si c'est le cas, on renouvelle l'agitation autant de fois que nécessaire jusqu'à ne plus apercevoir de bouchon muqueux. Sinon, le sputum est suffisamment homogène pour effectuer une mesure rhéométrique.

Cet examen visuel est pertinent car l'œil humain est en moyenne capable de détecter une granulosité minimum correspondant à un dixième de millimètre. Par conséquent, si les bouchons muqueux ne sont pas détectables à l'œil nu, cela signifie qu'ils ont été fractionnés en particules dont la taille caractéristique est inférieure à un dixième de millimètre. Le sputum homogénéisé est ensuite transféré dans une cellule de mesure d'un appareil de mesure rhéométrique. On pourra utiliser tout dispositif de prélèvement adapté, tels que ceux utilisés pour l'étape initiale de prélèvement du sputum dans l'échantillon prélevé sur un sujet qui ont été décrits précédemment. On préférera une pipette à déplacement positif muni d'un embout large afin d'une part de limiter les pertes de sputum, et d'autre part de s'assurer que, dans le cas où des bouchons muqueux dont la taille réduite les rendrait non détectables à l'œil nu, ces derniers soient bien transférés dans la cellule de mesure avec le reste du sputum.

En référence à la Figure 4, on place l'orifice d'aspiration dans le fond du récipient 10 afin de ne pas générer de bulles d'air lors de l'aspiration, et on aspire le sputum 3 afin de remplir une cellule 15 de mesure de l'appareil de mesure rhéométrique, c'est-à-dire afin de remplir l'entrefer 17 de la cellule de mesure. Le volume de l'entrefer 17 correspond au volume compris entre la géométrie haute 16 et la géométrie basse 7 de la cellule 15 de mesure.

On prévoira avantageusement un entrefer 17 d'une taille caractéristique de 1 millimètre environ pour la mesure rhéométrique. De ce fait, il y a un facteur égal à dix entre l'entrefer 17 et la taille limite des particules à partir de laquelle ces dernières sont détectables à l'œil nu, et on se trouve en limite empirique haute de l'hypothèse des milieux continus.

Le sputum 3 est injecté dans la cellule 15 de mesure, dans une région donnée de cette dernière en fonction du type de cellule. Par exemple, le sputum est injecté au centre de la cellule pour une cellule de type « plan-plan » ou « cône-plan », et au fond de la cellule pour des cellules de type « couette ». On veillera à ce que le sputum soit réparti dans la cellule de manière régulière, et à ne pas créer de bulles d'air lors de l'injection, afin de ne pas fausser la mesure.

Lorsque le volume de sputum 3 injecté correspond au volume de la cellule 15, le sputum 3 occupe tout le volume de l'entrefer 17 et sa périphérie est au droit de la géométrie haute 16 et de la géométrie basse 7 de la cellule.

Lorsqu'une quantité trop importante de sputum a été injectée dans la cellule de mesure, la périphérie du sputum dépasse à l'extérieur de la géométrie haute et de la géométrie basse de la cellule. On peut dans ce cas procéder à un ébavurage, qui consiste à racler la périphérie du sputum avec une spatule afin de mieux répartir le sputum au sein de la cellule.

En référence à la Figure 5, le sputum homogène se présente sous la forme d'un liquide 5 dans lequel nagent des fractions de bouchons muqueux de très faible taille devant celle des bouchons muqueux desquels elles proviennent. Le sputum 3 s'étend alors de manière homogène sur l'ensemble de la géométrie basse 7 de la cellule 15 de mesure, et en particulier dans la zone périphérique 18, permettant ainsi une mesure rhéométrique précise et répétable du sputum.

EXEMPLE

Evolution du module viscoélastique du sputum en fonction du taux de cisaillement et détermination de la valeur critique du taux de cisaillement.

Les essais présentés ci-après ont été réalisés afin de déterminer une valeur critique de cisaillement au-dessus de laquelle les propriétés viscoélastiques du sputum risquent d'être détériorées. Pour ce faire, on a mesuré le module viscoélastique de cinq échantillons de sputum, qui ont été préalablement séparés de la salive et homogénéisés conformément au procédé décrit précédemment, avant et après l'application de contraintes de cisaillement.

Les cinq échantillons sont chacun placés dans une cellule de mesure d'un rhéomètre de type « DHR3 » commercialisé par la société « TA INSTRUMENTS », la cellule étant de type plan-plan rugueux de 25 millimètres de diamètre. La cellule est maintenue à environ 37°C ± 0,5°C grâce à un élément Peltier.

Par la suite, on réalise pour chacun des cinq échantillons les étapes successives suivantes :

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 0,43 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 4,3 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 43 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon.

Le module viscoélastique mesuré précédemment pour différentes valeurs de cisaillement imposées s'écrit selon l'expression suivante : G = G' + iG" dans laquelle :

- G' représente la partie réelle de G, et caractérise le comportement élastique de l'échantillon. G' est généralement désigné en tant que module de conservation ;

G" représente la partie imaginaire de G, et caractérise le comportement visqueux de l'échantillon. G" est généralement désigné en tant que module de perte ou module de dissipation.

Les résultats des mesures du module viscoélastique de l'échantillon en fonction du taux de cisaillement imposé sont représentés par le graphique de la Figure 6. A chaque valeur de taux de cisaillement correspond une valeur du module de conservation G' et une valeur du module de perte G". Les valeurs de G' et G" sont les valeurs moyennes obtenues pour les cinq échantillons.

Nous faisons l'hypothèse qu'il y a détérioration par le cisaillement des propriétés viscoélastiques de l'échantillon lorsque le module de conservation G' diminue en-dessous de sa valeur de référence obtenue avant tout cisaillement (0 s ^"1 ), avec un écart supérieur ou égal à 10% de ladite valeur de référence, après un cisaillement. La valeur de 10% correspond à la précision estimée de la mesure en rhéométrie.

D'après les résultats obtenus, on constate que le module de conservation G' passe d'environ 23 Pa pour un taux de cisaillement de 0 s ^"1 à environ 21 ,5 Pa pour un taux de cisaillement de 0,43 s ^"1 , soit une diminution d'environ 6,5% par rapport à la valeur de référence de 23 Pa à 0 s ^"1 , qui est inférieure à 10%.

De plus, le module de conservation G' augmente à environ 30 Pa pour un taux de cisaillement de 4,3 s ^"1 , et environ 25 Pa pour un taux de cisaillement de 4,3 s ^"1 , par rapport à la valeur de référence de 23 Pa à 0 s ^"1 .

Ainsi, il n'y a pas de diminution de G' ou de G" de plus de 10% de la valeur de référence de 23 Pa à 0 s ^" .

Par conséquent, un taux de cisaillement allant jusqu'à 43 s ^"1 ne dégrade pas les propriétés viscoélastiques de l'échantillon.

Pour observer le comportement de l'échantillon à un cisaillement plus important, on place un unique échantillon dans une cellule de mesure d'un rhéomètre, la cellule étant de type plan-plan rugueux de 25 millimètres de diamètre. La cellule est maintenue à environ 37°C ± 0,5°C grâce à un élément Peltier. Ces conditions de mesures correspondent à celles des cinq échantillons du protocole précédent.

On réalise pour cet unique échantillon les étapes successives suivantes :

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 1 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 10 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon,

- on applique un taux de cisaillement de 100 s ^"1 à l'échantillon,

- on mesure en oscillation le module viscoélastique de l'échantillon.

Les résultats des mesures du module viscoélastique de l'échantillon en fonction du taux de cisaillement imposé sont représentés par le graphique de la Figure 7.

D'après les résultats obtenus, on constate que le module de conservation G' augmente entre 0 s ^"1 et 10 s ^"1 , passant d'environ 6,3 Pa pour un taux de cisaillement de 0 s ^"1 à environ 7,5 Pa pour un taux de cisaillement de 1 s ^"1 , puis à environ 9,5 Pa pour un taux de cisaillement de 10 s ^"1 .

En revanche, le module de conservation G' diminue fortement entre 10 s ^"1 et 100 s ^"1 , passant d'environ 9,5 Pa pour un taux de cisaillement de 10 s ^"1 à environ 5,2 Pa pour un taux de cisaillement de 100 s ^"1 , soit une diminution d'environ 17,5% par rapport à la valeur de référence de 6.3 à 0 s ^"1 qui est supérieure à 10%.

Ainsi, un taux de cisaillement de 100 s ^"1 dégrade les propriétés viscoélastiques de l'échantillon.

Par conséquent, la valeur critique de taux de cisaillement au-delà de laquelle les propriétés viscoélastiques de l'échantillon sont dégradées se situe entre 43 s ^"1 et 100 s ^"1 . Compte-tenu de la valeur élevée du module de conservation G' à 10 s ^"1 et de l'écart important entre les valeurs de taux de cisaillement de 10 s ^"1 et 100 s ^"1 , on considère qu'une valeur de taux de cisaillement d'environ 50 s ^"1 correspond à une valeur critique à ne pas dépasser pour ne pas dégrader les propriétés viscoélastiques de l'échantillon de sputum pendant l'homogénéisation.

REFERENCES

· WO 94/10567