способ получения апирогенного иммуномодулятора

описание область техники

изобретение относится к новым высокопроизводительным технологиям, позволяющим получать высокоэффективные и безопасные препараты природного происхождения на основе натрия дезоксирибонуклеата.

изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности и биотехнологии, а получаемый лекарственный препарат - иммуномодулятор - в медицине, ветеринарии, парфюмерии, косметологии, научно-исследовательской практике и т.д.

производство лекарственных препаратов должно осуществляться в асептических условиях. препараты на основе натрия дезоксирибонуклеата в водном растворе солей выпускаются в стерильной форме с использованием консерванта.

международные правила производства фармацевтических препаратов жестко ограничивают содержание балластных и примесных веществ в них.

предшествующий уровень техники

известен ряд способов получения лекарственных препаратов на основе натрия дезоксирибонуктеата. основным недостатком большинства из них является то, что эти способы не учитывают повышенные современные требования предъявляемые к фармацевтическим производствам и медицинскому оборудованию, а также повышенные требования по эффективности и безопасности лекарственных препаратов.

известен способ выделения натриевой соли днк (патент RU 61 к 35/60, с 07 H 21/04 JN° 2017496, 1990 г.) сущность которого состоит в увеличении выхода целевого продукта. однако получаемый продукт содержит высокое содержание белка 1,5%, полисахаридов 2%, рнк 2%. эти примеси вызывают пирогенные реакции, что не совместимо с главным требованием безопасности применения лекарственных средств. инъекционная форма препарата из

заменяющий лист (правило 26)

выделяемой натриевой соли днк производится не может в следствие высокой пирогенности.

известен способ получения стерильного раствора нативной натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты в растворе натрия хлорида (патент RU с 07 H 21/04 N° 2055837, 1996 г.). данный способ осложнен двукратной ультразвуковой обработкой, однако получаемый продукт характеризуется повышенным содержанием примесей. конечный продукт содержит высокое количество белков (0,09 г/л) и других балластных веществ, что не допускает его использование для производства лекарственных препаратов. стерильный раствор по данному патенту не может использоваться для внутривенного введения препарата.

известен способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья и установка его осуществления (патент RU C07 P 21/04 Ns 2005724, 1993 г.). однако технология производства продукта по патенту не отвечает всем современным требованиям биотехнологического производства, полученный продукт не может использоваться для препаратов внутривенного введения, вследствие высокого содержания белка и полисахаридов, что приводит к высоким пирогенным реакциям в организме.

наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ производства иммунотропного стерильного апирогенного толерантного препарата на основе натриевой соли низкомолекулярной нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты (патент RU с 07 H 21/04 JSгs 2236853, 2003 г.). однако получаемый препарат не может использоваться для внутривенного введения, вследствие ряда параметров (степень нативности, допустимые примеси, рн и др.).

раскрытие изобретения

задачей настоящего изобретения является разработка промышленного, высокопродуктивного способа производства фармацевтического препарата на основе натриевой соли нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты,

заменяющий лист (правило 26)

соответствующего современным повышенным требованиям по терапевтической эффективности и безопасности, предъявляемым к фармацевтическим препаратам, на оборудовании, соответствующем современным требованиям фармацевтических производств: минимальными потерями, оптимальным расходом реагентов, позволяющими снизить экологическую нагрузку производства на окружающую среду, с учетом современных требований к организации соответствующих производств, касающихся защиты продукта от микробной контаминации в ходе процесса. и получением продукта с высокой фармацевтической эффективностью и безопасностью использования при введении в организм пациента.

поставленная задача достигается новыми техническими решениями:

1. введение стадии гомогенизации при повышенной скорости гомогенизатора (12000 об/мин), вызывающем разрушение клеток молок и выделение ядерной массы, практически полное выделение рибонуклеиновой кислоты (рнк) и жирных кислот.

2. расчетом оптимального материального баланса способа получения при различных объемах производства. дополнительным введением расчетного количества додецилсульфата натрия (ддц) после 3-4 кратной гомогенизации, центрифугирования, и декантации, гомегената, причем центрифугирование проводят при повышенной скорости вращения центрифуги (3500 об/мин) с созданием воздушно-жирового пенообразования способствующего полному отделению остаточных жировых масс, полисахаридов и рнк.

3. введение додецилсульфата натрия в этиловом спирте в оптимальном соотношении вызывает полный лизис оболочек ядер с образованием комплекса днк-Nа - детергент - белок.

4. введение ультразвуковой обработки реакционной очищенной массы с параметрами: частотой колебаний 21,7-23 кгц, при амплитуде колебания не менее 9 мкм, при мощности генератора 1,5-2 квт в установленном временном интервале, обеспечивает высокий выход днк-Nа с заданным диапазоном фрагментов молекулярной массы и степенью нативности свыше 2.

заменяющий лист (правило 26)

5. узкий интервал рн (7,9-8,0) в процессе фильтрации способствует полному отделению белковых соединений, т.к. белки сохраняют нативную структуру.

6. проведение сушки субстанции в интервале температур 40-60 ⁰ C в расчетном ламинарном потоке стерильного воздуха, исключает возникновение бактериальных эндотоксинов и повышает категорию чистоты получаемого продукта.

технический результат изобретения заключается в создании способа промышленного производства лекарственного препарата из природного сырья, соответствующего современным требованиям фармацевтического производства с повышенной эффективностью производства и высоким выходом высокоэффективного, безопасного лекарственного продукта.

современные требования, предъявляемые к производству фармацевтических субстанций, диктуют более жесткие условия как к осуществлению технологического процесса (использование инертных материалов оборудования, асептических условий производства, минимизация отходов и т.д.), так и к качеству целевого продукта (высокое содержание основного вещества, минимально-допустимые примеси) для использования его в фармацевтической промышленности для производства лекарственных препаратов.

способ осуществляют следующим образом: животное сырье (молоки осетровых или лососевых рыб) размораживают, очищают, гомогенизируют в цитратно-солевом растворе с отделением ядер. затем гомогенат центрифугируют в отстойной охлаждаемой центрифуге, декантируют и удаляют надосадочную жидкость, полученный субстрат многократно гомогенизируют, центрифугируют с получением воздушно- жировой пены и декантируют (при этом происходит лизис оболочек ядер и образование комплекса днк - детергент - белок). очищенный гомогенат обрабатывают в течение 2 часов раствора детергента в этиловом спирте и далее - 1,5 часа концентрированным раствором натрия хлорида, при повышенной температуре; (происходит разрушение комплекса, днк остается в растворе, белок выпадает в осадок), затем реакционную смесь

заменяющий лист (правило 26)

охлаждают до 10-15°C, обрабатывают ультразвуком в ваннах с пьезокерамическими излучателями с частотой колебаний 21,7-23 кгц, амплитудой колебаний до 12 мкм, при мощности генератора 1,5-2 квт для фрагментации днк-Nа по молекулярной массе свыше 80 минут, "озвученную" массу смешивают с кизельгуром в соотношении соответственно 10:2-30:2 (мае.) (для отделения днк-Nа от белка), жидкую фазу отделяют фильтрованием, фильтрующий осадок дополнительно промывают пермеатом (со стадии концентрирования), суммарный фильтрат концентрируют баромембранной фильтрацией и концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр; натрия дезоксирибонуклеат осаждают из концентрата этиловым спиртом и осадок высушивают в асептических условиях при 40-60°C, в течение 4 ч, при непрерывной подаче в сушильную камеру расчетного количества стерильного воздуха/азота. апирогенный иммунномодулятор получают растворением расчетного количества субстанции в изотоническом растворе натрия хлорида.

асептические условия - герметичное помещение с контролируемыми параметрами воздуха: кратность воздухообмена не менее 20, температура 21- 24 ⁰ C, запыленность - не более 350000 частиц/м ³ (зона с) и не более 3500 ч/м ³ (зона а), содержание микробов не более 100 кое/м ³ (зона с) и менее 1 кое/м ³ (зона а).

выход стерильной фармацевтической субстанции натрия дезоксирибонуклеата в виде аморфного белого порошка без запаха, хорошо растворимого в водных растворах натрия хлорида, по предлагаемому изобретению составляет до 7,5% от загруженного сырья и данная субстанция имеет содержание основного вещества не менее 99,6-100%, причем при содержании основного вещества не менее 99,6% фармацевтическая субстанция может содержать: балластные вещества в количестве: белок до 0,1%, рнк до 0,2%,

заменяющий лист (правило 26)

полисахариды до 0,1%;

при этом фармацевтическая субстанция имеет остаточную влажность 5-5,5%; и rиперхромный эффект свыше 40%.

субстанция используется для производства стерильных растворов 15 мг/мл натрия дезоксирибонуклеата в 0,9-0,95% водном растворе натрия хлорида.

пример аппаратурной схемы производства субстанции и аппаратурной схема производства готовой лекарственной формы может быть показан на чертежах.

краткое описание чертежей

фиг. 1 - аппаратурная схема производства субстанции. она включает: морозильная камера (1,2), весы (3, 8, 11, 14, 16, 19, 37, 41), стол разделочный (4), мясорубка (5), измельчитель (6), гомогенизатор (7), центрифуга (9, 38), сборник (10, 20, 26, 28, 32, 33, 36), реактор варки (12), реактор охлаждения (13), смеситель (15, 17, 23), фильтр (18, 27, 35), уз-ванна (21,1-21,7), уз- генератор (22,1-22,7), нутч-фильтр (24,25), водонагреватель (29), насос циркуляционный (30), установка концентрирования (31), кристаллизатор (34), сушильный шкаф (39,1-39,2), анализатор влажности (40), ламинарный шкаф (42).

фиг. 2 аппаратурная схема производства готовой лекарственной формы. она включает роторную автоматическую мойку флаконов (1), стерилизационный туннель (2), машина разлива, укупорки и закатки флаконов (моноблок) (3), установка стерилизующей фильтрацией (4), реактор приготовления раствора (5, 6), емкость хранения стерильного раствора (7), парогенератор (8), стерилизатор паровой (9), машина мойки резиновых пробок (10), ламинарное укрытие 6000x4800мм (11), ламинарное укрытие 2400xl200мм (12), инспекционная машина просмотра флаконов (13), этикетировочная машина (14), автомат нанесения маркировки 1 на картонную пачку (15), автомат для складывания инструкций (16), картонажная машина (17), установка получения воды очищенной (18), установка получения воды инъекционной

заменяющий лист (правило 26)

(19), компрессор сжатого воздуха (20), весы (21), холодильник карантинного хранения полупродукта (22).

аппаратурное и технологическое усовершенствование производства натрия дезоксирибонуклеата позволяют повысить объем выпуска технологической линии с проектной мощностью 20 кг/год до 30 кг/год.

контролируемая молекулярная масса, сохранность вторичной структуры и высокая степень очистки гарантируют высокую биологическую активность, высокую иммунотропность и пролонгированную стабильность лекарственного препарата.

ниже изобретение поясняется на конкретных примерах его выполнения:

пример 1. 1 кг очищенных молок лососевых рыб измельчают на мясорубке, гомогенизируют в 2 литрах цитратно-солевого раствора, при 12000 об/мин; далее гомогенат центрифугируют в отстойной охлаждаемой центрифуге при 3500 об/мин, надосадочную жидкость декантируют и удаляют, субстрат повторно гомогенизируют в 2 литрах цитратно-солевого раствора с последующим центрифугированием и декантацией надосадочной жидкости 3 раза, гомогенат помещают в реактор с подогретым цитратно-солевым раствором (7 литров), добавляют 1,9 кг 3% раствора додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте и выдерживают массу при 60°C в течение 1,5 часов с перемешиванием. затем добавляют 14.1 кг 5M раствора натрия хлорида и продолжают перемешивание при той же температуре 1,5 часа. после этого реакционную массу охлаждают до температуры 10-15°C. охлажденную массу (26 кг) обрабатывают ультразвуком в ваннах с пьезокерамическими излучателями с частотой колебаний 21,7-23 кгц и амплитудой колебания 9 мкм, при мощности генератора 1,5-2 квт в течение 85 мин. озвученную массу смешивают с кизельгуром в соотношении 10:2 (мае). для отделения днк-Nа от белка далее отделяют жидкую фазу на нутч-фильтре, осадок промывают пермеатом (10 л) и объединяют с фильтратом. после дополнительной микрофильтрации фильтрат концентрируют (баромембранным методом) на мембране с размером пор 0,04 мкм. получают 5 кг концентрата, содержащего 2,0 мac.% натриевой

заменяющий лист (правило 26)

соли дезоксирибонуклеата. целевой продукт осаждают из концентрата этиловым спиртом. полученный осадок отделяют центрифугированием и сушат при 40°C в течение 4 часов.

получают 70 г натриевой соли дезоксирибонуклеата, имеющей следующие характеристики: мол. масса 480 кд, содержание белка 0,1%, содержание (рнк+полисахариды) - 0,2%, влажность 5%, гиперхромный эффект 44%. расчетное количество порошка для получения 1,5% концентрации препарата отвешивают в асептических условиях при непрерывной подаче стерильного осушенного воздуха в камеру-сушку, растворяют в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида и стерильно разливают в терапевтических дозах.

аналитический паспорт полученного препарата:

подлинность - соответствует;

цветность - бесцветный;

прозрачность - соответствует;

стерильность - стерилен;

токсичность - нетоксичен;

пирогенность - апирогенен;

степень нативности - 2,4;

содержание натрия дезоксирибонуклеата -0,016 г/мл; pH-8;

содержание натрия хлорида 0,9%;

гиперхромный эффект 44%;

содержание рнк 0,2%;

содержание белка 0,1%.

пример 2. 1 кг очищенных молок осетровых рыб измельчают на мясорубке, гомогенизируют в 2 литрах цитратно-солевого раствора, при 12000 об/мин гомогенат центрифугируют в отстойной охлаждаемой центрифуге при 3500

заменяющий лист (правило 26)

об/мин, надосадочную жидкость декантируют и удаляют, субстрат гомогенизируют 3 раза в 2 литрах цитратно-солевого раствора с последующим центрифугированием и декантацией надосадочной жидкости; гомогенат помещают в реактор с подогретым цитратно-солевым раствором (7 литров), добавляют 1,9 кг 6% раствора додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте и выдерживают массу при 60°C в течение 1,5 часов при перемешивании. затем добавляют 14.1 кг 5M раствора натрия хлорида и продолжают перемешивание при той же температуре 1,5 часа; далее реакционную смесь охлаждают до температуры не выше 15°C, далее в течение 90 мин обрабатывают ультразвуком в ваннах с пьезокерамическими излучателями с частотой колебаний 21,7-23 кгц и амплитудой колебания 11 мкм, при мощности генератора 1,5-2 квт. озвученную массу смешивают с кизельгуром в соотношении 30:2 (мае), и отделяют жидкую фазу на нутч- фильтре. осадок на фильтре промывают пермеатом (10 кг), промывную жидкость объединяют с фильтратом.

после дополнительной микрофильтрации фильтрат концентрируют (баромембранным методом) на мембране с размером пор 0,04 мкм. получают 5 кг концентрата, содержащего 1,8 мac.% натриевой соли дезоксирибонуклеата. натрия дезоксирибонуклеат выделяют осаждением из концентрата этиловым спиртом. полученный осадок отделяют центрифугированием и сушат при 60°C, в течение 4 часов.

получают 66 г натриевой соли дезоксирибонуклеата, имеющей следующие характеристики: мол. масса 500 кд, содержание белка 0,1%, содержание (рнк+полисахариды) 0,2%, влажность 5,5%, гиперхромный эффект 46%. расчетное количество порошка (для приготовления 1,5% раствора) отвешивают в асептических условиях, растворяют в 0,95% стерильном растворе натрия хлорида и стерильно разливают в терапевтических дозах.

аналитический паспорт полученного препарата: подлинность - соответствует; цветность - бесцветный;

заменяющий лист (правило 26)

прозрачность - соответствует;

стерильность - стерилен;

токсичность - нетоксичен;

пирогенность - апирогенен;

степень нативности - 2,3;

содержание натрия дезоксирибонуклеата 0,015 г/мл; рн - 7.9;

содержание натрия хлорида 0,95%;

гиперхромный эффект 46%;

содержание рнк 0,2%;

содержание белка 0,1%.

пример 3. 3 кг размороженных, очищенных молок лососевых рыб измельчают, гомогенизируют в 6 литрах цитратно-солевого раствора при 1200 об/мин. гомогенат центрифугируют в отстойной центрифуге с охлаждением при 3500 об/мин, надосадочную жидкость декантируют и удаляют, повторяют операцию декантации и удаления надосадочной жидкости 4 раза, далее гомогенат помещают в реактор с цитратно-солевым раствором (21 л), добавляют 5,7 кг 3% раствора до децил сульфата натрия, растворенном в 45% этиловом спирте. полученную массу выдерживают в течение 2-х часов при T=55-60°C с постоянным перемешиванием и добавляют 5M раствор натрия хлорида (43 кг), продолжают выдержку с перемешиванием еще 2 часа при T=60°C.дaлee реакционную массу охлаждают до T=I 0-15 ⁰ C и подвергают обрабатывают ультразвуком в ваннах с пьезокерамическими излучателями с частотой колебаний 21,7-23 кгц и амплитудой колебания 12 мкм, при мощности генератора 1,5-2 квт. озвученную массу обрабатывают кизельгуром в соотношении 20:2, отделяют жидкость на нутч-фильтре и концентрируют ее баромембранным методом. из концентрата 96% этиловым спиртом выделяют осадок натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты в количестве 225г со следующими

заменяющий лист (правило 26)

характеристиками: мол. масса -490 кд, рнк+полисахариды - 0,2%, белок- менее 0,1%, гиперхромный эффект - 46%, влажность- до 10,5%.

таким образом, заявленный способ производства стерильной фармацевтической субстанции натрия дезоксирибонуклеата позволяет получать продукт более высокого качества очистки (снижение содержания балластного белка до не более 0,1%, рнк+полисахариды до 0,2%, влаги до 5,5%) с улучшенными физико-химическими свойствами (степень нативности, пирогенность, подлинность), снизить потребление дорогостоящих и экологически небезопасных реагентов, увеличить технологичность оборудования и облегчить его обслуживание (ванны с пьезокерамическими излучателями не выделяют токсичные примеси, дольше служат и лучше дезинфицируются), получить продукт, соответствующий современным повышенным требованиям к фармацевтическим субстанциям и препаратам (использование стерилизующего оборудования и помещений с асептическими условиями исключает возможность микробной контаминации готового продукта и увеличивает срок хранения субстанции и срок действия препарата). содержание влаги от 5-5,5%% является необходимым условием изготовления лекарственного препарата, субстанция с пониженным содержанием влаги не растворима в воде и водных растворах натрия хлорида.

предлагаемая установка позволяет осуществить заявленный способ производства апирогенного иммунотропного стерильного препарата для внутривенного введения и для безболезненного внутримышечного введения.

в таблице N° 1 представлены характеристики прототипа и препарата по предлагаемому изобретению. из таблицы следует, что качество препарата по предлагаемому изобретению превосходит прототип по физико-химическим характеристикам .

полученный иммуномодулятор, в следствие высокой чистоты и повышенной нативности, характеризуется высокой иммунотропностью и восстанавливает иммунный статус на клеточном и гуморальном уровнях, может использоваться для внутривенного введения пациентам. при внутримышечном введении препарат характеризуется безболезненным

заменяющий лист (правило 26)

введением. кроме высокой терапевтической активности препарат характеризуется высокой степенью безопасности и может использоваться в качестве профилактического средства для восстановления иммунного статуса человека. все существующие, в настоящее время, субстанции натрия дезоксирибонуклеата не могут быть использованы для создания препарата для внутривенного введения.

таблица JVs 1

в таблице N° 2 представлен сравнительный терапевтический эффект реаферона, интepлeйкинa-2 и иммуномодулятора по предлагаемому изобретению.

заменяющий лист (правило 26)

таблица JVs 2

заменяющий лист (правило 26)