CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con los campos técnicos de la Biotecnología y Medicina, ya que proporciona un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana, a partir de microorganismos del género Komagataeibacter, una membrana de celulosa bacteriana obtenida por dicho método; el uso de dicha membrana obtenida en procesos de cicatrización de heridas; y un producto que comprende a la membrana en cuestión, útil en aplicaciones biomédicas, tales como en el tratamiento de cicatrización de heridas en un animal, incluyendo a un humano. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La celulosa es la molécula biológica más abundante en la tierra [1,2]. Su estructura lineal está formada por 2000 a 14000 unidades de β-(1 ,4) glucosa unidas entre sí por enlaces tipo puente de hidrógeno. Es un biopolímero que posee regiones con alto ordenamiento (cristalinas), y otras donde el grado de ordenamiento es bajo (amorfas) [3,4].

Recientemente la celulosa de origen bacteriano (CB) ha tomado gran importancia y despertado el interés en su producción y uso para el desarrollo de productos de alto valor agregado [1]. La CB es sintetizada por diferentes microorganismos, siendo uno de sus productores más eficientes la bacteria Gluconacetobacter xylinus [5], ahora conocida como Komagataeibacter xylinus. Esta bacteria forma películas de CB como mecanismo de flotación en la interface líquido/aire, donde obtiene el oxigeno necesario para su crecimiento. La película es también una barrera física que protege a la bacteria de la radiación UV y de compuestos tóxicos, de igual manera, aumenta su capacidad de colonizar sustratos y le permite retener humedad [6]. Debido a su alto grado de cristalinidad, pureza, conformación reticulada, biodegradabilidad y biocompatibilidad, este polímero es atractivo en diversas aplicaciones, especialmente en el área médica [1,2].

El documento de patente CN102925514 divulga el uso de la fermentación de celulosa biológica en un medio frutal, el medio de fermentación contiene en peso un 50-90 % de zumo de mango, el contenido de azúcar del jugo de mango es de un 10 % o más. El mango es una típica fruta tropical, con un contenido de azúcar de hasta el 12-20 %, 5.56 % de proteínas, 16.1% de grasa, hidratos de carbono 67.29 %, contiene vitaminas A, B, C y similares. Como portador de azúcar, predominantemente tiene fructosa y sacarosa. Se puede apreciar que en la fermentación de bio-celulosa por producción de bacteria es una excelente fuente de carbón. Más que eso, el contenido de vitaminas y otros elementos inorgánicos en la fruta pueden ser utilizados por la fermentación para producción de bio-celulosa bacteriana, es posible mejorar la eficiencia de la fermentación.

El grado de biocompatibilidad y características de la celulosa bacteriana la sitúan como un excelente material para aplicaciones biomédicas, que van desde andamios para la regeneración de cartílago e injertos de piel, hasta material para implantes óseos [7].

La biocompatibilidad de la CB ha sido ampliamente estudiada y reportada [8], sin embargo, son pocas las aplicaciones a nivel comercial que existen actualmente. Entre los productos que actualmente se comercializan se pueden encontrar el Biofill® para cubrir heridas, y Gengiflex®, material utilizado para elaborar implantes dentales. Existen otras aplicaciones biomédicas en fase de desarrollo, tales como sustituto temporal de la piel con actividad antimicrobiana (mezclando con nanopartículas de plata) para el tratamiento de heridas, quemaduras, úlceras y abrasiones en la epidermis; implantes vasculares para microcirugía [9]; soporte en ingeniería de tejidos pues facilita el anclaje y proliferación de las células que conformarán el tejido nuevo [7]; composito con hidroxiapatita para el remplazo de tejido óseo [9] y con alcohol polivinílico (PVA), para implantes de córnea; inmovilización de enzimas y otras biomoléculas; sistemas de liberación controlada de medicamentos, entre otros [1,2].

Aplicaciones de la celulosa bacteriana en el área biomédica

A principios de 1980, la compañía Johnson & Johnson realizó por primera vez investigaciones exploratorias sobre el uso de la CB para el cuidado de heridas de la piel (patentes US4655758 y US4588400). Desde ese momento, la empresa brasileña Biofill® Industries, ha investigado las propiedades de la CB y comenzó la comercialización de productos específicos para el tratamiento de padecimientos cutáneos [10,11]. En Brasil, las membranas purificadas de CB fueron desarrolladas y comercializadas como piel artificial para el vendaje de heridas [10]. Bioprocess®, XCell® y Biofill® son productos de aplicación tópica que se han comercializado desde hace tiempo para cicatrización de heridas [10, 12], demostrando significativas ventajas con respecto a los apósitos convencionales en términos de retención de exudado de la herida, reducción del dolor, mejora de reepitelización y tiempos de curación y reducción de las tasas de infección. Además, facilita la inspección de la herida debido a su semitransparencia y reduce las cicatrices al término del tratamiento [10-12].

Además, se ha estudiado que la CB puede combinarse con materiales como quitosana, poli-etilenglicol (PEG) y gelatina para su potencial de aplicación como aposito [13].

El documento de patente CN103861146 describe un parche de celulosa bacteriana biológica y su método de fabricación. El parche biológico comprende una película de celulosa bacteriana, llamada película CB, donde el grado de polimerización de los rangos de celulosa bacteriana son de 2000 a 20000, la forma cristalina del cristal de celulosa es tipo I, el índice de cristalización es 50 a 95 %, y en parámetros de la célula, a es igual a 0.815 nm, b es igual a 1.025 nm, c es igual a 0.832 nm, y beta es igual a 85 grados. El parche biológico de celulosa bacteriana, tiene excelentes propiedades mecánicas, mejor aptitud biológica, mejor propiedad anti-adhesiva y propiedad antimicrobiana en el entorno enterocoelia, y área apropiada se puede obtener convenientemente. Por su parte el documento de patente CN202699408 U detalla un apósito médico de celulosa bacteriana. Dicho apósito comprende un recubrimiento de celulosa bacteriana, en el que el recubrimiento de celulosa bacteriana es un cuerpo masivo o un cuerpo en forma de escamas, y el espesor del cuerpo masivo o el cuerpo en forma de escamas está entre 0.5 y 8 mm. El apósito médico de celulosa bacteriana, puede ser fabricado como una vestidura seca o un apósito húmedo de acuerdo con las diferencias de las variedades del trauma. El apósito médico de celulosa bacteriana, es razonable en estructura, fuerte en la capacidad de retención de agua, buena en la función hidratante y ligero en peso, y puede ser utilizado sin ponderar sensación de presión. Dicho apósito es bueno en vestiduras justas, no se rompe o fragmenta, se puede adherir con cintas adhesivas y otras piezas de fijación para su uso, y es cómodo de usar.

Actualmente, la diabetes mellitus es una de las enfermedades crónicas de mayor prevalencia en el mundo; hasta el 2010, se estimaba que 285 millones de adultos padecían esta enfermedad, proyectándose que para el 2030 la cifra alcanzaría los 439 millones [14,15].

La diabetes es un trastorno metabólico que se caracteriza por altos niveles de glucosa en el torrente sanguíneo y por los cambios en el metabolismo de carbohidratos, Ifpidos y proteínas causados por alteraciones en la secreción de insulina [16]. Entre los diversos problemas que presentan los pacientes con diabetes está el riesgo de padecer obesidad [17], enfermedades cardio- coronarias, accidentes cerebrovasculares [18-20], nefropatía diabética [21], úlceras de pie diabético (UPD), entre otras, responsables de las altas tasas de mortalidad observadas en los pacientes diabéticos. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que involucra acción simultánea de células sanguíneas, una matriz extracelular y células parenquimales. Este proceso se puede dividir en varias fases: homeostasis/coagulación, inflamación, proliferación (formación de tejido granular), reepitelización y remodelación cutánea [22,23]. Regularmente, este proceso se presenta de forma lineal, pero el proceso de curación en los pacientes diabéticos suele estancarse en una o más etapas, convirtiendo incluso heridas comunes en heridas crónicas [24]. La neuropatía diabética y enfermedad vascular periférica son los principales factores involucrados en las UPD. Estos dos factores pueden actuar solos o en combinación con otras condiciones tales como la enfermedad microvascular, anomalías biomecánicas, movilidad limitada de articulaciones, generando una mayor susceptibilidad a la infección [25,26].

Esta neuropatía crónica afecta aproximadamente al 15 % del total de la población diabética, generando altos gastos médicos y afectando de manera significativa su calidad de vida [27]. Una vez que una UPD se desarrolla, es difícil detener la progresión de la herida, lo que puede conducir a la amputación. Existen investigaciones que demuestran que más del 85 % de las amputaciones del pie en pacientes diabéticos son causados por UPD [28].

Se ha estudiado que para mejorar los procesos de curación de las UPD, las heridas deben cubrirse con biomateriales que protejan de una posible infección y eviten la disección de la herida proporcionando un ambiente húmedo que facilite la cicatrización. En el caso de los apósitos funcionalizados, estos deben presentar una liberación prolongada y eficaz de las sustancias bioactivas aplicadas y una alta resistencia a la degradación durante el proceso de curación [29].

Terapia de regeneración para la piel Tradicionalmente, los materiales utilizados para la reparación de tejido de la piel deben ser absorbentes y permeables a los fluidos. Por ejemplo, las gasas son un material de vendaje tradicional, pero éstas pueden adherirse a la superficie de la herida e inducir trauma al término del tratamiento. Es por esto que el interés por la CB ha aumentado de forma constante debido a su potencial aplicación en la medicina y la industria cosmética [30].

Diversas investigaciones han demostrado que la celulosa y sus derivados pueden estimular la cicatrización a través de la liberación y el mantenimiento de factores terapéuticos, tales como la migración y proliferación de fibroblastos dérmicos y la inhibición del crecimiento de bacterias en las heridas [31-33].

Además, se ha logrado incrementar la biocompatibilidad de los materiales a base de celulosa mediante su combinación con otros polímeros tales como colágeno. Otro ejemplo de apósitos comerciales a base de celulosa es AquaceKB ⁾ Hydrofiber WoundDressing (ConvaTec, EE.UU.), derivado antimicrobiano de carboximetil-celulosa que puede absorber fluidos de la herida y crear un gel para mantener un ambiente húmedo. Como se ha mencionado con anterioridad, las características intrínsecas de la CB, la convierten en un excelente producto útil para la ayuda en la cicatrización de lesiones en un animal, la cual pudiera ser aplicada de muchas manera. Por ejemplo, la CB pudiera ser aplicada en un material compuesto, tales como materiales compósitos, apósitos, vendas, cintas adhesivas, telas adhesivas, entre otros.

Los apósitos pueden ser diseñados para las etapas iniciales de la curación de heridas, durante la cual la absorción de fluidos y la aplicación de medicamentos anti-inflamatorios son particularmente benéficos.

Los apósitos con agentes antimicóticos antimicrobianos, con sustancias derivadas de las plaquetas y con las propias células madre del paciente son materiales que pueden disminuir el riesgo de infección y mejoran la cicatrización. Sin embargo, muchos de los materiales utilizados actualmente no representan una opción práctica, ya que la aplicación de estos compuestos es muy costosa, difícil de regular y controlar. Las investigaciones más recientes se centran en el desarrollo de apósitos funcionalizados biocompatibles y biodegradables más eficientes y menos costosos que pueden ofrecer importantes factores de curación para heridas como las UPD [17]. La CB es un compuesto biotecnológico de alto valor agregado, que debido a su alta pureza, biodegradabilidad y biocompatibilidad es una materia prima ideal para aplicaciones biomédicas.

Debido a sus características biológicas, la CB podría ser utilizada para facilitar la difusión y proliferación celular así como para la generación de tejido [35]. La alta resistencia mecánica de las membranas en estado húmedo y su capacidad de hidratación y permeabilidad de líquidos y gases, además de la nula o baja irritación que causa a la piel, convierten a las membranas de CB en un material útil en el cuidado y regeneración de heridas cutáneas [34] y superior al autoinjerto en pacientes con daño severo de la piel [7].

A nivel mundial, se está trabajando en varios métodos de modificación tanto en la obtención como para mejorar las propiedades de la CB para su uso en la piel, los huesos y la reparación del tejido conectivo. En conjunto, se puede suponer que a futuro el éxito de la producción en masa de CB, finalmente conducirá a que se convierta en un biomaterial de vital importancia para su uso en una amplia variedad de productos de consumo, dispositivos médicos y especialmente en la reparación de tejidos de la piel [36]. A pesar de que en el mundo se comercializan diversos productos a partir de CB para la curación de heridas, en México no se ha llevado a cabo una investigación que permita el desarrollo de esta tecnología para contribuir a mejorar la atención y calidad de vida de los pacientes que requieren de regenración de sus tejidos, específicamente los pacientes diabéticos.

Es por ello que se ha desarrollado un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana CB, a partir de bacterias de Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, donde las membranas obtenidas pueden ser útiles en distintas aplicaciones biomédicas, ya sea sola o combinada con otras sustancias. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Análisis por HPLC de azúcares reductores presentes en el mango

Mangifera indica.

Figura 2. Viabilidad celular en andamies de PCL y biocompositos de PCL/CB a

1, 3 y 7 días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los detalles característicos de la presente invención se muestran claramente en la descripción, figuras y ejemplos, que se acompañan en la presente solicitud de patente de invención, los cuales se incluyen con la finalidad de ilustrar algunas de las realizaciones preferentes de la invención en cuestión, por lo que no deben ser considerados como una limitante para dicha invención. En primera instancia, la presente invención tiene como objeto un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana (CB), a partir de microorganismos del género Acetobacter, reclasificado como Gluconacetobacter y actualmente conocido como Komagataeibacter, más específicamente la especie Acetobacter xylinum, reclasificada como Gluconacetobacter xylinus y actualmente conocida como Komagataeibacter xylinus. Por lo que en este caso, durante la presente descripción, nos referiremos a los géneros Acetobacter, y a la especie Gluconacetobacter xylinus, como Komagataeibacter y Komagataeibacter xylinus, respectivamente, debido a que estas últimas denominaciones son los nombres científicos actuales de los microorganismo utilizados en esta invención.

El método para la producción de celulosa bacteriana, de la presente invención, comprende: inocular un pre-inóculo de un microorganismo del género Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, en un medio de cultivo que contiene: azúcares reductores provenientes del mango Mangifera indica, y extracto de levadura como fuente de nitrógeno; después se incuba a 30 °C, durante 15 días; para después purificar la membrana de celulosa bacteriana obtenida, lavándola con agua destilada a una agitación de 3,200 rpm, para después sumergirla en una solución de NaOH 0.1 M, manteniéndola a 90 °C por 30 min; y finalmente, lavar la membrana de celulosa bacteriana con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado es 7. Una modalidad del método de la presente invención, es cuando la relación pre- inóculo y medio de cultivo, es de 1 :20; o más preferentemente, cuando el pre- inóculo del microorganismo de la cepa DSMZ 2004 está en una cantidad de 1 mL y el medio de cultivo en una cantidad de 20 ml_. Una variante más del método en cuestión, es cuando el medio de cultivo contiene 25 g/L de azúcares reductores provenientes del mango (2 g/L glucosa, 6 g/L fructosa, 12 g/L sacarosa) y 10 g/L de extracto de levadura; donde los azúcares reductores provenientes del mango, tienen un pH de 6.5. Una variante más del método en cuestión, es que puede comprender opcionalmente la deshidratación de las membranas de celulosa bacteriana, hasta una humedad de, al menos, un 3 %; para después proceder a moler a dichas membranas, para convertirlas en polvo. Donde el secado de las membranas puede ser por cualquier via, por ejemplo, el secado en horno de vacío a 60 °C y 0.8 MPa, y el otro es liofilizado a -45°C y 0.8 Mpa. Mientras que la molienda también puede llevarse de cualquier manera convencional, por ejemplo como en un molino de bolas (RETSCH MM 400) utilizando una frecuencia 30 1/s y un tiempo de 2 min, para convertir a las membranas en una presentación de polvo.

Un objeto más de la presente invención es una menbrana de celulosa bacteriana (CB) obtenida de conformidad con el método de la presente invención. Donde dicha membrana de celulosa puede tener muchos usos. Por ejemplo, en aplicaciones biomédicas la membrana puede utilizarse en húmedo como apósitos para la curación y recubrimiento de heridas de la piel; por otro lado, dicha membrana puede ser deshidratada y molerse para formar bio- compositos en conjunto con una matriz polimérica.

Por lo tanto, un objeto más de la presente invención es un producto útil en aplicaciones biomédicas, donde dicho producto comprende, al menos, una membrana de celulosa bacteriana en húmedo; y/o membrana de celulosa deshidratada y molida.

Por lo tanto, el producto útil en aplicaciones biomédicas, puede ser: apósitos, compósitos, biocompósitos, vendas, telas y/o cintas adhesivas, entre otros. Donde dicho producto útil en aplicaciones biomédicas puede usarse para ayudar en el tratamiento de cicatrización de heridas, úlceras, quemaduras, llagas, etc., de un paciente animal, incluyendo al humano, y más específicamente en un paciente diabético.

Una modalidad preferente, del producto útil en aplicaciones biomédicas, es que dicho producto sea un biocomposito, el cual a su vez comprenda un 1 % de membrana de celulosa bacteriana en polvo.

El producto útil en aplicaciones biomédicas de acuerdo con la presente invención, puede ser aplicado en una gran cantidad de traumas o heridas de un paciente animal, incluyendo al humano, específicamente pacientes con problemas de diabetes. Algunos de esos traumas o heridas pueden ser, por citar algunos ejemplos, cicatrices, úlceras, heridas, llagas, y toda a quella lesión que requiera de cicatrización. Un objeto más de la presente invención es el uso de la celulosa bacteriana obtenida por el método descrito en la presente invención, para la preparación de un producto útil en aplicaciones biomédicas. Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran el desarrollo y los resultados obtenidos de algunas realizaciones de la presente invención, los cuales, no deben ser considerados como una limitante en el alcance de la presente invención. Estos ensayo se realizaron en el Departamento de Madera, Celulosa y Papel, del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías, de la Universidad de Guadalajara.

Ejemplo 1. Propagación de la cepa Komagataeibacter xylinus.

Se utilizó una cepa de Acetobacter xylinum, reclasificada como Gluconacetobacter xylinus, y actualmente conocida como Komagataeibacter xylinus), la cual fue depositada con el número de acceso DSMZ 2004. La cepa se propagó en un medio Hestrim-Schramm (H-S) convencional. En la mayoría de los casos, el tiempo mínimo para la correcta propagación de la cepa fue de dos semanas, hasta obtener la cantidad requerida.

Para los pre-inóculos se utilizaron 50 mL de medio H-S que se agitaron durante 24 h. De ellos se tomaron 100 microL, los cuales se depositaron en viales con 1 mL de medio H-S convencional, se incubaron durante 48 h, a una temperatura de 30 °C y se congelaron en una solución de glicerol 50%, a una temperatura de -30 °C.

Ejemplo 2. Determinación de la mejor fuente de azúcares, a partir de mango

Mangifera indica.

Para conocer cual era la parte más rica en azúcares reductores del mango Mangifera indica, se sometió a un análisis por HPLC, la pulpa sola del mango y la mezcla de pulpa más fibra de mango. En la figura 1 se gráfico la concentración de los azúcares reductores presentes en el mango. Como se muestra en dicha figura 1, la pulpa de mango tuvo un mayor contenido de azúcares reductores, por lo que fue la materia prima utilizada para la producción del medio de cultivo a utilizar.

Ejemplo 3. Preparación del medio de cultivo idóneo, para la producción de membranas de celulosa bacteriana (CB). Para determinar cual era el medio de cultivo idóneo, se prepararon 6 diferentes medios de cultivo utilizando la pulpa del mango Mangifera indica con una concentración inicial de 25 g/L de azúcares reductores y se evaluó la adición de distintas fuentes de nitrógeno (5:5 g/L de peptona más extracto de levadura, 10 g/L peptona, 10 g/L extracto de levadura, 2.4 g/L urea, 5.3 g/L sulfato de amonio y sin fuente de nitrógeno). El pH inicial de todos los medios se ajustó a 6.5 y fueron esterilizados previos a su inoculación con Komagataeibacter xylinus. Como control se utilizaron medios con mezcla de sacarosa, fructosa y glucosa en la proporción que se encuentran en el mango (12 g/L de sacarosa, 6 g/L de fructosa, 2 g/L de glucosa, 5 g/L peptona, y 5 g/L de extracto de levadura). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Ejemplo 4. Producción de membranas de celulosa bacteriana, a partir de

Komagataeibacter xylinus. El cultivo estático se llevó a cabo en recipientes de 100 mL (10 cm de diámetro) con 20 mL de medio de cultivo inoculados con 1 mL de pre-inóculo (medio HS) de K. xylinus, incubándose a 30 °C durante 15 días, al término de los cuales se cuantificó la producción de membranas CB y el consumo de azúcares. De esta manera se obtuvieron membranas de celulosa bacteriana después de 15 días de incubación estática a 30 °C en un medio de cultivo que contiene 25 g/L de azúcares reductores provenientes del mango (60 % de sacarosa, 30 % de fructosa y 10 % de glucosa) a pH 6.5 y 10 g/L de extracto de levadura como fuente de nitrógeno. El rendimiento del producto con respecto al consumo de sustrato (Yp/s) fue de 0.3565 g de celulosa bacteriana por cada gramo de azúcar consumido durante la fermentación. Para purificación, la CB obtenida se lavó con agua destilada agitándola con un vortex a 3200 rmp, para después sumergirla en una solución de NaOH 0.1 M, manteniendo a 90 °C por 30 minutos. Posteriormente se lavó con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado fue 7. Para la cuantificación de membrana CB producida, se pesaron las membranas obtenidas, luego de la purificación (peso húmedo), posteriormente se congelaron a una temperatura de -30 °C, y se liofilizaron a -45 °C y 0.8 MPa para deshidratarlas a una humedad de un 3%, y volverse a pesar (peso seco), el resultado de esta medición fue la cantidad neta obtenida de CB.

Ejemplo 5. Biocompatibilidad de compositos producidos mediante manufactura aditiva utilizando membrana de celulosa bacteriana como refuerzo.

Se utilizaron membranas de celulosa deshidratadas, obtenidas a partir del medio de cultivo con mango como fuente de carbono, las cuales se molieron en un molino de bolas (RETSCH MM 400) utilizando una frecuencia 30 1/s y un tiempo de 2 min, con lo cual las membranas se convierten en polvo.

Los biocompositos utilizados en este ensayo se obtuvieron por bioimpresión y están formados por policaprolactona (PCL) PM 14000 a 10000 de Sigma Aldrich y 1 % de membrana de celulosa bacteriana (CB) en polvo.

La viabilidad celular se probó utilizando la técnica Alamar Blue, que cuantifíca la actividad metabólica en el andamio. Alamar Blue (AB) es un colorante soluble en agua que ha sido utilizado durante muchos tiempo para la cuantificación in vibro de viabilidad de distintos tipos de células [37,38]. Cuando el reactivo se agrega al cultivo celular, genera una reacción de óxido-reducción en la cual el AB entra en el citosol, aceptando electrones provenientes del NADPH, FADH, FMNH, NADH y de los citocromos. Esta reacción es responsable del cambio en el color del medio de cultivo, que va del azul índigo al rosa fluorescente, el cual puede ser medido fácilmente por colorimetría o lectura por flourométrica [39].

El ensayo se llevó a cabo utilizando fibroblastos de ratón (3T3 cells) sembradas sobre el biocomposito con una densidad de 40 mil células por muestra.

En la gráfica 2 se muestran los resultados de los ensayos 1 , 3 y 7 de cultivo celular para los biocompositos PCL/CB y los andamios de PCL.

Como se muestra en dicha figura 2, existe un incremento significativo en la actividad metabólica para los biocompositos PCL/CB con respecto a las muestras de PCL puro, incluso desde el primer día. Se sugiere que este cambio se deba al incremento en la hidrofilidad del biocomposito dado por la CB, promoviendo una mayor adherencia y desdoblamiento de proteínas y con ello, mayor adhesión celular.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Chavez-Pacheco JL; Martinez-Yee S; Contreras-Zentella M; Escamilla- Marván E. (2004). Celulosa Bacteriana en Gluconacetobacter xylinus: Biosíntesis y aplicaciones. D.R. TIP Revista especializada en Ciencias Quimico-Biologicas. Vol. 7:18-25.

[2] Joñas R; Farah L. (1998). Production and applications of microbial cellulose.

Polymer Degradation and Stability. Vol. 59: 101 - 106.

[3] Akerholm M; Salmón L. (2002). Dynamic FT-IR Spectroscopy for carbohydrate analysis of wood pulps. Journal of Pulp and Paper Science. Vol. 7: 245 - 249.

[4] Akerholm M; Hinterstoisser MB; Salmón L. (2004). Characterization of the crystalline structure of cellulose using static and dynamic FT-IR spectroscopy. Carbohydrate Research. Vol. 3: 569-578. [5] Yamada Y; Yukphan P; Lan Vu HT; Muramatsu Y; Ochaikul D; Tanasupawat S; Nakagawa Y. (2012). Description of Komagataeibacter gen. nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae). Journal of General and Applied Microbiology. Vol. 58:397-404

[6] Jung J; Park J; Chang H. (2005). Bacterial cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in an agitated culture without living non- cellulose producing cells. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 3: 347 - 354.

[7] Petersen N; Gatenholm P. (2011). Bacterial cellulose-based materials and medical devices: current state and perspectives. Applied Microbiology Biotechnology. Vol. 91:1277-1286.

[8] Helenius G; Báckdahl H; Bodin A; Nannmark U; Gatenholm P; Risberg B.

(2006) In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Material Research. Vol. 76A: 431-438.

[9] Esguerra M; Fink H; Laschke MW; Delbro D; Jeppsson A; Gatenholm P;

Menger MG; Risberg B. (2010). Intravital fluorescent microscopio evaluation of bacterial cellulose as scaffold for vascular grafts. Journal of Biomedical Material Research. Vol. 93A: 140-149.

[10] Fontana JD, Desouza AM, Fontana CK, Torriani IL, Moreschi JC, Gallotti BJ, Desouza SJ, Narcisco GP, Bichara JA, Farah LF (1990) Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute. Appl Biochem Biotechnol 24-25:253-264. doi: 10.1007/ BF02920250

[11] Czaja W, Krystynowicz A, Bielecki S, Brown RM (2006) Microbial cellulose— the natural power to heal wounds. Biomaterials 27:145-151.

[12] Czaja WK, Young DJ, Kawecki M, Browm RM (2007) The future prospecte of microbial cellulose in biomedical applications. Biomacromolecules

[13] Ougiya H, Watanabe K, Morinaga Y, Yoshinaga F (1997) Emulsión effect of bacterial cellulose. Biosci Biotech Biochem 61 : 1541-1545.

[14] Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. (2010) Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract; 87:4- 14. [15] Whiting DR, Guariguata L, Weil C, Shaw J. (2011) IDF Diabetes Atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract;84:311-21.

[16] Ahmed I, Glodstein B. Diabetes mellitus. (2006) Clin Dermatol;24:237-46.

[5]

[17] Moura, L. I. F., Días, A. M. A., Carvalho, E., & De Sousa, H. C. (2013).

Recent advances on the develpment of wound dressing for diabetic fbot ulcer treatment - A review. Acta Biomaterialia, 9(7), 7093-7114.

[18] Kyaw Tun, T., McGowan, A., Phelan, N., Correia, N., Boran, G., O'Connor, A. L, Gibney, J. (2016). Obesity and Insulin Resistance Are the Main Determinants of Postprandial Lipoprotein Dysmetabolism in Polycystic Ovary Syndrome. International joumal of endocrinology.

[19] Srikanth S, Deedwania P. (2011) Primary and secondary prevention strategy for cardiovascular disease in diabetes mellitus. Cardiovasc Clin;29:47-70.

[21] Giménez M, López JJ, Castell C, Conget I. (2012) Hypoglycaemia and cardiovascular disease in Type 1 Diabetes. Results from the Catalán National Public Health registry on insulin pump therapy. Diabetes Res Clin Pract;96:e23-5.

[22] Enoch S, Leaper DJ. (2008) Basic science of wound healing.

Surgery;26:31-7.

[23] Li J, Chen J, Kirsner R. (2007) Pathophysiology of acute wound healing.

Clin Dermatol;25:9-18.

[24] Falanga V. (2005) Wound healing and its impairment in the diabetic foot.

Lancet;366: 1736-43

[25] Rathur HM, Bloulton AJM. (2005) Recent advances in the diagnosis and management of diabetic neuropathy. J Bone Joint Surg;87:1605-10.

[26] Snyder BJ, Waldman BJ. (2009) Venous thromboembolism prophylaxis and wound healing in patients undergoing major orthopedic surgery. Adv Skin Wound Care ;22:311-5

[27] Brem H, Tomic-Canic M. (2007) Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. J Clin Invest; 117:1219-22. [28] Snyder BJ, Waldman BJ. (2009) Venous thromboembolism prophylaxis and wound healing in patients undergoing major orthopedic surgery. Adv Skin

Wound Care;22:311-5

[29] Jannesari M, Varshosaz J, Morshed M, Zamani M. (2011) Composite poly(vinyl alcohol)/poly(vinyl acétate) electrospun nanofibrous mats as a novel wound dressing matrix fbr controlled reléase of drugs. Int J

Nanomed ¡6:993-1003.

[30] Hornung, M., Biener, R., & Schmauder, H. P. (2009). Dynamic modelling of bacterial cellulose formation. Engineering in Life Sciences, 9(4), 342-347.

[31] Jung K, Kim Y, Kim H, Jin H. (2009). Antimicrobial properties of hydrated cellulose membranes with silver nanoparticles. J Biomater Sci Polym

Ed;20:311-24.

[32] Seráfica G, Mormino R, Oster GA, Lentz KE, Koehler KP. (2010) Microbial cellulose wound dressing for treating chronic, wounds. US7704523 B2.

[33] Cullen MB, Silcock DW, Boyle C. (2010) Wound dressing comprising oxidized cellulose and human recombinat collagen. Patent US 20107833790 B2.

[34] Keshk, S. M. A. S. (2014). Bacterial Cellulose Production and its Industrial Applications, 4(2).

[35] Kirdponpattara, Suchata, Khamkeaw, Arnon, Sanchavanakit, Neeracha, Pavasant, Prasit, Phisalaphong, Muenduen. (2015). Structural modification and characterization of bacterial cellulose-alginate composite scaffolds for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 132:146-155.

[36] Lina Fu, Jin Zhanga, Guang Yang (2013). Present status and applications of bacterial cellulose-based materials for skin tissue repair. Carbohydrate Polymers 92:1432-1442

[37] Ahmed, S. A., Gogal, R. M , & Walsh, J. E. (1994). A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an altemative to [3H] thymidine incorporation assay. Joumal of immunological methods, 170(2), 211 -224.

[38] Fields, R. D., & Lancaster, M. V. (1993). Dual-attribute continuous monitoring of cell proliferation/cytotoxicity. American biotechnology laboratory, 11(A), 48. [39] Al-Nasiry, S., Geusens, N., Hanssens, M., Luyten, C, & Pijnenborg, R. (2007). The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of viability, migration and invasión of choriocarcinoma cells. Human reproduction, 22(5), 1304-1309.