Zur Synthese von Peptiden sind dem Fachmann verschiedene Verfahren bekannt. Es handelt sich dabei zum einen um Flüssigphasenmethoden, welche auf Shemyakin (Tetrahedron Lett. (1965), 2323 f.) zurückgehen, und zum anderen um Festphasenverfahren, welche erstmals von Merrifield (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149) beschrieben wurden.

Die Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasensynthese sind seither weiterentwickelt und erheblich verbessert worden, es wird hierzu beispiels- weise auf"Peptide, Chemie und Biologie", Hans Dieter Jakubke, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg-Berlin-Oxford, 1996, ISBN 3-8274-0000-7 verwiesen. Dieses Lehrbuch beschreibt Methoden der klassischen als auch der Merrifield-Peptid-Synthese. Derzeit wird zur Peptidsynthese in erster Linie die Peptidsynthese in Lösung angewandt. Insbesondere bei der Synthese von Peptiden, welche mindestens eine Disulfidbrücke ausbilden sollen, besteht im Hinblick auf die Synthese in Lösung allerdings der der Methode inhärente Nachteil, daß diese Disulfidbrücke durch Oxidation in hoher Verdünnung gebildet werden muß. Dies ist im klassischen Verfahren der Peptidsynthese in Lösung nötig, um die erforderliche örtliche Trennung der einzelnen Reaktionszentren zu bewirken und damit eine effektive Cyclisierung zu ermöglichen.

Das Peptid Biostatin (TT-232) ist ein Analogon des Somatostatins und weist starke in vitro und in vivo Antitumoraktivität auf.

Somatostatin ist ein natürlich vorkommendes Tetradecapeptid, weiches die Bildung von Wachstumshormon und die Sekretion weiterer endokriner Moleküle, wie z. B. Glucagon, Insulin und Gastrin, inhibiert. Somatostatin inhibiert oder reguliert einige Zellfunktionen und es wurde darüber hinaus festgestellt, daß es wichtige endogene antiproliferative Aktivität entfaitet.

Es wurde außerdem ein inhibitorischer Effekt von Somatostatin und seinen Analoga auf Tumoren gezeigt. In den letzten Jahren wurden einige Somatostatinanaloga entwickelt, welche längere Wirkungszeiten als das native Hormon und bessere Antitumorwirksamkeit aufweisen. Es wurde daher vie ! Mühe aufgewandt, tumorselektive Somatostatinanaloga zu entwickeln, wobei insbesondere auch die leichte Herstellbarkeit eine Rolle spielt.

Eines dieser Analoga ist ein Molekül mit einer 5-Ringstruktur mit der folgenden Sequenz : Das fvioteküt wurde TT-232 bzw. Biostatin genannt. Dieses Somatostatin- analogon hat praktisch keinen inhibitorischen Effekt auf die Wachstumshor- monsfreisetzung, zeigt aber starke Antitumorwirksamkeit in vivo und in vitro und induziert die Apoptose. Die Verbindung inhibiert die Tyrosinkinase- Aktivität verschiedener menschlicher Darmtumorzellinien, wobei diese Inhibition sehr gut mit der beobachteten Inhibition der Zellproliferation übereinstimmte.

Die Herstellung von Octa- bzw. Heptapeptid-Derivaten wird beispielsweise in der EP-A-0 505 680 beschrieben. Dort wird aber für eine effektive Cyclisierung über die beiden Cystein-reste das Peptid zuerst von der festen Phase abgetrennt, die Lösung stark verdünnt und dann die Oxidation bewirkt. Diese Art der Herstellung erfordert aber weitere Aufkonzentrations- und Reinigungsschritte.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzu- stellen, durch welches Biostatin besonders leicht und mit besonders hoher Ausbeute an freigesetztem Peptidamid nach der Disulfidoxidation erhalten werden kann.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Synthese von Biostatin (TT 232) mittels Festphasensynthese an einem polymeren Träger durch stufenweises Aufbau des Peptids unter Verwen- dung von mit Schutzgruppen derivatisierten Aminosäuren, wonach die Schutzgruppen abgespalten und das Peptid von der Festphase abgelöst wird, wobei die Disuifidbrücke durch Oxidation des vollständig oder teilweise aufgebauten Peptids in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmit- tels geschlossen wird solange das Peptid noch an die feste Phase gebunden vorliegt.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandte Festpha- sensynthese kann in dem Fachmann an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die hierfür geeigneten Festphasenmaterialien, die benötigten Reagenzien, Puffer, Reaktionsbedingungen und einzusetzenden Schutz- gruppen für die Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Feststellung, daß die örtliche Trennung der Reaktionszentren bei der Bildung der Disulfidbrücken in Biostatin in ausreichender Weise gewährleistet ist, wenn die Oxidation erfolgt, solange das Peptid noch an die feste Phase gebunden ist. lm Rahmen der Erfindung ist es sowohl möglich, direkt nach Synthese desjenigen Teils von Biostatin, welcher die zu verbrückenden Sulfhydryl- gruppen enthält, eine Oxidation und damit Ausbildung der Disulfidbrücke zu bewirken, und dann das Peptid fertig zu synthetisieren, als auch zuerst das vollständige Peptid zu synthetisieren und danach die Oxidation durchzufüh-

ren. Maßgeblich ist jedoch, daß die Oxidation erfolgen muß, solange das Peptid festphasen-gebunden vorliegt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die Oxidation vor Abspaltung der Schutzgruppen des Peptids durchzuführen.

Zur Oxidation können alle auch bisher bereits für in Lösung durchgeführte Verfahren bekannte Oxidationsmittel eingesetzt werden. Geeignete Oxidationsmittel sind dem Fachmann daher bekannt. Beispiele für derartige Oxidationsmittel sind Silber-, Quecksilber- oder Thalliumsalze, Jod, Peroxide oder Sauerstoff. Diese Oxidationsmittel werden in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches angewandt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt als Oxidationsmittel Jod, beispielsweise in essigsaurer Lösung oder in einem Lösungsmittel auf Basis von N, N-Dimethylformamid eingesetzt.

Nach abgeschlossener Oxidation erfolgen Waschungen des polymergebun- denen Peptids mit verschiedenen Lösungmittetn bzw. Lösungsmittelgemi- schen. Hierzu können z.B. N,N-Dimethylformamid, Methanol, Essigsäure und Wasser oder aber auch Lösungen von komplexierenden Reagenzien oder Reduktionsmitteln, wie insbesondere Thiosulfat oder Ascorbinsäure eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft an einer festen Phase durchgeführt, welche eine säurelabile Ankergruppe (acid labile anchoring bond, ALAB) aufweist. Besonders bevorzugt wird als feste Phase ein Polymer, insbesondere Polystyrol, eingesetzt. Vorteilhaft können auch modifizierte Harze verwendet werden, wie Aminomethylpolystyrol (AMPS), Benzhydrylamin- (BHA-PS) und Methylbenzhydrolamino-polystyrol (MBHA- PS). Die feste Phase kann dabei in für die Festphasensynthese übticher Form

eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Festphase in Form von Kügelchen, sogenannter"Beads", eingesetzt.

Geeignete Ankergruppen sind in der Festphasenchemie übtiche Anker, welche die Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger in einfacher Weise erlauben. Besonders bevorzugt sind im Rahmen der Erfindung Ankergruppen, welche die Abspaltung des Peptids als Amid ermöglichen.

Beispielhafte mit einer säuretabifen Ankergruppe derivatisierte Polymere (ALAB-P) sind 5- (9-amino) xanthen-2yl-) oxyveryl-4'-methyl-benzhydrylamino- polystyrol und 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) -aminomethyl-phenoxyacetyl-4"- methyl benzhydrylamino-polystyrol.

Besonders bevorzugte Ankergruppierungen sind desweiteren 4-Hydroxyme- thyl-benzoesäure (HBMA),9-Amino-xanthenyl-3-hydrol (Xant) oder p(R,5)- a- (I - (9H-Fluoren-9-yl) methoxyformamidoj-2, 4-dimethoxybenzylj-phenoxy- essigsäure MEOBP. Am meisten bevorzugt sind im Rahmen der Erfindung die Xant- und die MEOBP-Gruppierung.

Die Synthese wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt mit der Fmoc-/tert. Butyl-Strategie durchgeführt. Dies bedeutet, daß die zum Aufbau des Peptids benötigten Aminosäuren an der Aminogruppe mit einer Fmoc-Schutzgruppe und an den Seitenkettengruppierungen mit tert.

Butylgruppen derivatisiert sind. Die Fmoc-Schutzgruppe ist dabei eine temporäre Schutzgruppe, da sie bei der Ausbildung des Peptids abgespalten wird, und lediglich eine Fmoc-Gruppe am N-Terminus des synthetisierten, festphasengebundenen Peptids verbleibt. 0 Die Sulfhydrylgruppen der Cysteine werden vorteilhaft mit Trityl- oder Acm- schutzgruppen derivatisiert. Es ist außerdem besonders bevorzugt, die N- terminal letzte Aminosäure im Sequenzaufbau als N-alpha Boc-geschütztes Aminosäurederivat einzusetzen.

Im Rahmen des erfindungegemäßen Syntheseverfahrens werden die folgenden Schritte durchlaufen : 1. Beladung des polymeren Tragers mit dem Anker und/oder dem ersten Aminosäurederivat 2. Aufbau der Peptidsequenz 3. Knüpfung der Disu ! fidbrücke 4. Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger und/oder der Schutzgruppenabspaltung 5. Schutzgruppenabspaltung (sofern nicht bereits unter 4. erfolgt).

Zur Abspaltung der im synthetisierten Peptid enthaltenen Schutzgruppen können ! iteraturbekannte Methoden, z. B. Zugabe von verdünnter Piperidinlö- sung, angewandt werden.

Die Abspaltung der Peptide vom polymeren Träger erfolgt ebenfalls nach an sich bekannten Methoden. Im Fall der säurelabilen Ankergruppen erfolgt die Abspaltung sauer, besonders bevorzugt mit konzentrierter oder verdünnter Trifluoressigsäure.

Die Abspaltung der Schutzgruppen der von der Festphase getösten Peptide erfolgt in der Regel ebenfalls durch Säurezugabe, bevorzugt wiederum mittels Trifluoressigsäure. Nach der Abspaltung der Peptide können gewünschtenfalls weitere Reinigungs- oder/und Konzentrationsschritte durchgeführt werden. Eine Reinigung kann hierbei vorteilhaft mittels präparativer HPLC erfolgen.

Die Synthese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von Fmoc-Threonin (tert. butyl- ether) amid aus, welches kovalent an eine Polystyrol-Festphase über eine säurelabile Xanthenyl-Ankergruppierung gebunden ist.

In der Folge werden die einzelnen geschützten Aminosäuren zugegeben unter Bildung eines Festphasen-gebundenen geschützten Peptids. Zur Ausbildung der Disutfidbrücke wird das Heptapeptid sodann an der Festphase durch Zugabe von Jod/N,N-Dimethylformamid oder Essigsäure oxidiert und das cyclisierte Heptapeptid durch Säurebehandtung vom Träger abgelöst. Gleichzeitig werden alle Schutzgruppen an Seitenketten des Peptids abgespalten.

Die folgenden Beispiele sotten die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1 : Stufe 1, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe vom Linker 395g Fmoc-MEOBP-MBHA-Harz (Beladung 0, 84 mmol/g) werden unter Verwendung von 1, 5 I N. N-Dimethylformamid in ein mit einer Bodenfritte versehenes Reaktionsgefäß überführt und durch Taumeln gemischt ; nach 5 Minuten wird abgesaugt. Die Taumelbewegung wird während aller Wasch- und Reaktionsschritten aufrechterhalten. Es folgt ein DMF-Waschschritt, dazu werden 1, 5 I N. N-Dimethylformamid in das Reaktionsgefäß gefüllt, nach 5 Minuten wird das N.N-Dimethylformamid abgesaugt. Es werden 1, 5 150 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidintösung abgesaugt und erneut 1,5 1 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 30 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt und erneut 1, 5 L 50 % Piperidin in N. N-Dimethyl- formamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt, anschließend werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 2, Kupplung von Fmoc-Thr (tBu) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1) werden folgende Lösungen vorbereitet: 267,1 g (672 mmol) Fmoc-Thr(tBu)

in 375 ml N. N-Dimethylformamid, 104, 4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 215, 8 g TBTU in 750 ml N. N-Dimethylform- amid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 3, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 1 beschrieben abgespalten, wobei bei dem DMF-feuchten Harz auf den einleitenden Quelivorgang verzichtet wird.

Stufe 4, Kupplung yon Fmoc-Cys (Trt) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 3) werden folgende Lösungen vorbereitet: 393,6 g (672 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 375 N. N-Dimethylformamid, 104, 4g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 215, 8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid.

Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 3) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 196,8 g (336 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52, 2 g (336 mmol) HOBt*H2O in 125 ml N.N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114,3 ml DIEA. Nach 1 Stunde Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie

Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 5, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 6, Kupplung von Fmoc-Lys (Boc) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 5) werden folgende Lösungen vorbereitet: 314,9 g (672 mmol) Fmoc-Lys(Boc) in 500 ml N. N-Dimethylformamid, 104, 4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 215,8 g TBTU in 750 ml N. N-Dimethylform- amid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 5) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228, 7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 157,4 g (336 mmol) Fmoc-Lys (Boc) in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52, 2 g (336 mmol) HOBt*H2O in 125 ml N. N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 7, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 8, Kupplung von Fmoc-D-Trp Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 7) werden folgende Lösungen vorbereitet: 286,8 g (672 mmol) Fmoc-D-Trp in 500 ml N. N-Dimethylformamid, 104, 4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N.N-Dimethylformamid und 215,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid.

Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 7) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228, 7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 143,3 g (336 mmol) Fmoc-D-Trp in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52, 2 g (336 mmol) HOBt*H2O in 125 ml N. N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 9, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 10, Kupplung von Fmoc-Tyr (tBu) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 9) werden folgende Lösungen vorbereitet: 308,8 g (672 mmol) Fmoc-Tyr(tBu) in 500 ml N.N-Dimethylformamid, 104,4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 215, 8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylform- amid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 9) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von

228, 7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 154,4 g (336 mmol) Fmoc-Tyr (tBu) in 250 ml N.N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 125 ml N. N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114, 3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 11, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 12, Kupplung von Fmoc-Cys (Trt) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufel 1) werden folgende Lösungen vorbereitet: 393,6 g (672 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 500 ml N. N-Dimethylformamid, 104, 4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 215, 8 g TBTU in 750 ml N. N-Dimethylform- amid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 11) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unverständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 196,8 g (336 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52, 2 g (336 mmol) HOBt*H2O in 125 ml N.N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden

Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 13, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten Stufe 14, Kupplung von Boc-D-Phe Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufel 1) werden folgende Lösungen vorbereitet: 178,3 g (672 mmol) Boc-D-Phe in 500 ml N. N-Dimethylformamid, 104, 4 g (672 mmol) HOBt*H2O in 250 ml N.N-Dimethylformamid und 215,8 g TBTU in 750ml N.N-Dimethylformamid.

Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 11) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228, 7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unverständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 89,1 g (336 mmol) Boc- D-Phe in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52, 2 g (336 mmol) HOBt*H2O in 125 ml N. N-Dimethylformamid und 107, 9 g TBTU in 400 ml N.N-Dimethyl- formamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 114,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF- Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 15, Umsetzung mit Boc2O Das aus Stufe 14 resultierende Produkt wird mit 41 N.N-Dimethylformamid versetzt und 20 Minuten agititiert. Dann werden 400 g Boc2O zugegeben,

nach 5 Minuten werden in 5 Minuten Abstand 3 Portionen DIEA a 200 ml zugegeben. Nach 1000 Minuten wird abgesaugt, es folgen 5 DMF-Wasch- schritte (s. o.) a 3 1 und 3 analoge MeOH-Waschschritte wobei jeweils 2, 5 I MeOH eingesetzt werden. Nach 16 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden 833 g polymergebundenes Peptid erhalten.

Stufe 16, Knüpfung der Disulfidbrücke Zu 833 g polymergebundenem Peptid (0, 37 mmol Peptid/g Peptid-Träger- konjugat) aus Stufe 15 wird eine Lösung von 416, 5 g Jod in 6 I N.N-Di- methylformamid gegeben. Nach 60 Minuten wird abgesaugt und mit 8 1 N. N-Dimethylformamid versetzt. Nach 60 Minuten wird abgesaugt, es folgen 4 DMF-Waschschritte (s. o.) a 8 I. Folgende Prozedur wird 3 mal durchgeführt : Es werden 8 I N.N-Dimethylformamid und 2 1 10 %ige Na2S203-Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten wird abgesaugt, es folgen 3 Waschschritte mit einer Mischung aus 8 I N.N-Dimethylformamid und 2 1 Wasser sowie 2 DMF-Waschschritte a 8 I. Anschließend wird je 3 mal mit Wasser, Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 672, 4 g (0, 45 mmol Peptid/g Peptid- Trägerkonjugat).

Stufe 17, Abspaltung vom Polymer Zu 672, 4 g polymergebundenem Peptid aus Stufe 16 wird eine Lösung von je 120 ml m-Cresol und Wasser in 6 I Trifluoressigsäure (Abspaltreagenz) gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach saugt man ab und versetzt das Harz erneut mit Abspaltreagenz. Die erste Nachspaltung wird nach 30 Minuten abgesaugt, es folgen Nachspaltungen von einer bzw. zwei Stunden Dauer. Die jeweiligen Filtrate werden am Rotationsverdampfer bei 30 ° C Wasserbadtemperatur im Wasserstrahl- vakuum eingedamft. Der Rückstand wird mit 3 I Ether verrührt, über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 1,5 I Ether gewaschen. Nach 16

stündigem Trocknen im Hochvakuum werden insgesamt 231, 85 g Peptid erhalten.

Ausbeute: 13,4% d.Th. über aile Stufen, 14, 8% bezogen auf die Abspal- tung Beispiel 2 : Stufe 1, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe vom Linker 3, 64 g Fmoc-XANT-Harz (Beladung 0, 55 mmol/g) werden unter Verwen- dung von 25 ml N. N-Dimethylformamid in ein mit einer Bodenfritte versehenes Reaktionsgefäß überführt, geschüttelt ; nach 5 Minuten wird abgesaugt. Das Schütteln wird während allen Wasch- und Reaktionsschrit- ten aufrechterhalten. Es folgt ein DMF-Waschschritt, dazu werden 25 ml N. N-Dimethylformamid in das Reaktionsgefäß gefüllt, nach 5 Minuten wird das N. N-Dimethylformamid abgesaugt. Es werden 25 ml 50 % Piperidin in N.N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidin- lösung abgesaugt und erneut 25 ml 50 % Piperidin in N. N-Dimethylform- amid (v/v) zugegeben. Nach 25 Minuten wird die Piperidiniösung abgesaugt und 25 ml 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt, anschließend werden 5 DMF- Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 2, Kupplung von Fmoc-Thr (tBu) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1) werden 2, 39 g (6 mmol) Fmoc-Thr(tBu),1,12 g (7,2 mmol) HOBt*H2O und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen

und auf freie Arninogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt verständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 3, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 1 beschrieben abgespalten, wobei bei dem DMF-feuchten Harz auf den einleitenden Quellvorgang verzichtet wird.

Stufe 4, Kupplung von Fmoc-Cys (Trt) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 3) werden 3, 51 g (6 mmol) Fmoc-Cys (Trt), 1, 12 g (7, 2 mmol) HOBt*H20 und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 3) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt verständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 5, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 6, Kupplung von Fmoc-Lys (Boc) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 5) werden 2, 81 g (6 mmol) Fmoc-Lys(Boc),1,12 g (7,2 mmol) HOBt*H2O und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 5) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04mL (12mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen

und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt verständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 7, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 8, Kupplung von Fmoc-D-Trp Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 7) werden 2, 56 g (6 mmol) Fmoc-D-Trp, 1,12 g (7,2 mmol) HOBt*H2O und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 7) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 9, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 10, Kupplung von Fmoc-Tyr (tBu) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 9) werden 2, 76 g (6 mmol) Fmoc-Tyr (tBu),1,12 g (7,2 mmol) HOBt*H2O und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 9) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 11, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzrruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 12, Kupplung von Fmoc-Cys (Trt) Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 11) werden 3, 51 g (6 mmol) Fmoc-Cys(Trt), 1,12 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 11) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 13, Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.

Stufe 14, Kupplung von Boc-D-Phe Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 13) werden 1, 59 g (6 mmol) Boc-D-Phe, 1, 12 g (7,2 mmol) HOBt*H2O und 2, 12 g (6,6 mol) TBTU in 15 ml N. N-Dimethylformamid gelost. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 13) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2, 04 ml (12 mmol) DIEA.

Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.

Stufe 15, Knüpfung der D ! su) fidbrücke Zu 5 g polymergebundenem Peptid (0,30 mMol Peptid/g Peptid-Trägerkon- jugat) aus Stufe 14 wird eine Lösung von 2, 5 g Jod in 50 ml N. N-Dimethyl- formamid gegeben. Nach 60 Minuten wird abgesaugt und mit 50 ml N. N-Dimethylformamid versetzt. Nach 60 Minuten wird abgesaugt, es folgen 4 DMF-Waschschritte (s. o.) a 50 ml. Folgende Prozedur wird 3 mal durchgeführt : Es werden 16 ml N. N-Dimethylformamid und 4 ml 10 %ige Na2S203-Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten wird abgesaugt, es folgen 3 DMF-Waschschritte. Anschließend wird je 3 mal mit Wasser, Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 4, 1 g (0, 34 mmol Peptid/g Peptid-Trägerkonjugat).

Stufe 16, Abspaltung vom Polymer und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen 1 g polymergebundenes Peptid werden 10 mal für je 10 Minuten mit jeweils 5 ml 1 % Triftuoressigsäure in Dichlormethan versetzt. Anschließend wird 3 mal mit 5 % Triftuoressigsäure in Dichlormethan abgespalten. Die Abspaltlösungen werden gepoolt, eingedampft und 30 Minuten in 2, 5 ml Trifluoressigsäure gerührt. Dann wird in 20 ml Ether präzipitiert, über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 10 ml Ether gewaschen. Nach 16 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden 332 mg Peptid erhalten.

Ausbeute : 23, 9 % d.Th. über alle Stufen, 33, 0 % bezogen auf die Abspaltung Beispiel 3 : Disulfid-Oxidation mit Thallium-trifluoracetat Zunächst wird eine Festphasensynthese wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch an einem BHA-PS (Beladung 1 mmol/g) das mit

MEOBP-Linker beladen wird. Es wird FmocCys (Acm) statt Fmoc-Cys (Trt) verwendet.

136 mg Tt (TFA) g werden in 1 ml N.N-Dimethylformamid gelöst (Oxidations- lösung), 0,5 g polymergebundenes Peptid (0, 38 mmol Peptid/g Peptid-Trä- gerkonjugat) werden 5 Minuten mit 3 ml N.N-Dimethylformamid geschüttelt, dann werden 0,725 ml Oxidationslösung zugegeben. Nach 30 minütigem Schütteln bei 25 ° C wird abgesaugt, und mit je 5 ml der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 3x N. N-Dimethylformamid, 3x MeOH, 1 x 10 % HAc in N.N-Dimethylformamid, 1 x 5 % EDTA in H20, 1 x 10 % HAc in N.N-Dimethyiformamid, 1 x 5 % EDTA in H2O1 x 10 % HAc in N. N-Di- methylformamid,1 x 5 % EDTA in H2O, 1 x H2O, 3 x 10 % HAc in MeOH, 3 x 10 % HAc in H20, 3 x N. N-Dimethylformamid, 3 x MeOH, 3 x H20, 3 x MeOH. Es wird über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 420 mg (0,40 mmol Peptid/g Peptid-Trägerkonjugat).

Es werden 0, 25 ml Triethylsilan mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt (Abspaltreagenz).0,4 g polymergebundenes Peptid werden 30 Minuten mit 3 ml Abspaltreagenz geschüttelt, dann wird abgesaugt und 2, 5 ml Abspaltreagenz zugegeben. Nach 30 minütigem Schütteln wird abgesaugt, und das Harz noch 1 und 2 Stunden mit je 2,5 ml Abspaltreagenz behan- delt. Die Filtrate werden eingedampft, mit je 3 ml Ether verrieben, die dabei anfallenden Niederschlage werden über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 2 ml Ether gewaschen. Nach 16 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden insgesamt 119 mg Peptid erhalten.

Ausbeute : 8, 6 % d.Th. über alle Stufen, 8, 6 % bezogen auf die Abspaltung