Material

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von

Kohlenhydratspaltprodukten, insbesondere Zuckern , wie Pentosen und Hexosen, aus einem lignocellulosischen Material. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Alkohol aus den Zuckern. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung und

Patentansprüche soll der Begriff„Zucker" auch„Zucker-Oligomere" umfassen.

Im Zusammenhang mit der Verknappung von Rohöl und der Diskussion um Getreide als Energielieferant gewinnt der nachwachsende Rohstoff Lignocellulose (Stroh, Holz,

Papierabfälle etc.) als Ausgangsmaterial für Treibstoffe oder chemische Produkte sehr an Bedeutung. Die Konversion der Lignocellulose kann nach zwei grundlegend verschiedenen Wegen erfolgen: 1 ) der„Thermochemical Platform", bei der die Lignocellulose zuerst vergast und die Synthesegase zu gewünschten Produkten synthetisiert werden, und 2) die „Sugar Platform", bei der das Hauptinteresse in der Nutzung der in den Polymeren Cellulose und Hemicellulosen gebundenen Zucker besteht, während Lignin noch vorwiegend energetisch genutzt wird. Die vorliegende Erfindung ist dem zweiten Weg zuzuordnen.

Im Gegensatz zur Stärke liegen die Zucker der Lignocellulose in eng vernetzten, polymeren, kristallinen Strukturen der Cellulose und Hemicellulosen vor, die zusätzlich von einem Ligninmantel umhüllt sind, wodurch sich ein äußerst dichter Komplex ergibt. Der naheliegendste Weg, um aus Lignocellulose Zucker zu gewinnen, wäre der direkte Einsatz von Cellulasen und Hemicellulasen. Dies wird jedoch am Rohstoff Stroh oder Holz durch die Dichte des oben erwähnten Komplexes erschwert. Durch ihr hohes Molekulargewicht sind Enzyme nicht imstande durch die engen Poren in die Lignocellulose einzudringen. Dies bedeutet, dass ein erster Schritt gesetzt werden muss, der die Porosität der Lignocellulose erhöht und dadurch die weitere enzymatische Verzuckerung ermöglicht.

Dieser erste Schritt wird als„Pretreatment" (Vorbehandlung, Aufschluss) bezeichnet. Er ist durchwegs sehr aufwändig, sodass z.B. bei der Herstellung von„second generation biofuels" bis zu 1/3 der Produktionskosten dafür aufgewendet werden müssen, was die Rentabilität negativ beeinflusst. Die angewandten Verfahren zielen entweder darauf ab, primär die Hemicellulosen zu verflüssigen (z.B. steam explosion-, dilute acid-pretreatment) oder die Erhöhung der Porosität durch Verflüssigung von Lignin (z.B. Urne-, ammonia-pretreatment) zu erreichen.

Das aufgeschlossene Lignocellulose-Substrat kann zur Gewinnung von Zuckern bzw. ihrer Oligomere enzymatisch weiterbehandelt werden, wobei die Art der Vorbehandlung starken Einfluss auf die Enzymaktivität und die Ausbeute haben kann. Bei hohen

Reaktionstemperaturen entstehen vielfach toxische Abbauprodukte (z.B. Furfural), welche im Falle einer unmittelbar angeschlossenen Ethanol-Gärung, die Hefen hemmen können; siehe z. B. Chandra et al., Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 108:67, 2007; Mansfield et al., Biotechnol.Prog. 15:804, 1999.

Diese Verfahren haben den gravierenden Nachteil, dass sie energieaufwändig sind und vorwiegend bei Temperaturen knapp unter 200°C ablaufen.

Eine technologische Verbesserung in diesem Bereich, z.B. durch die Entwicklung von Niedertemperaturverfahren, (d.h. bei einer Temperatur von unter 100°C), würde einen entscheidenden Fortschritt bei jeglicher stofflicher Nutzung des Rohstoffes Lignocellulose bedeuten. Dies ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Aus der EP 1 025 305 Bl ist ein chemisches Verfahren zur Lignin-Depolymerisation (Cu- System) bekannt. Es beruht auf der katalytischen Wirkung von komplexiertem Kupfer in Verbindung mit Wasserstoffperoxid oder organischen Hydroperoxiden und ist imstande, Lignin bei Temperaturen unter 100°C oxidativ zu spalten. Die dabei eingesetzten

Komplexbildner sind Pyridin-Derivate. An synthetischen Ligninmodellen konnte nachgewiesen werden, dass bei Verwendung von H ₂ O ₂ als Oxidationsmittel eine Spaltung von Etherbindungen des Ligninmoleküls erfolgt, wodurch das Ligninpolymer zu oligomeren Untereinheiten zerfällt. Bei Einsatz des Cu-Systems mit einem Überschuss an organischen Hydroperoxiden ist es möglich, Holz zu delignifizieren. Das auf H ₂ O ₂ basierte System erscheint technisch besser umsetzbar zu sein, wurde als Bleichzusatz bei der Peroxidbleiche von Kraft-Zellstoff getestet und führte zu einer verbesserten Delignifizierungsrate und höherem Weißegrad.

Ferner ist aus„Oxidation of wood and its components in water-organic media", Chupka et al., Proceedings: Seventh International Symposium on wood and pulping chemistry, Vol. 3, 373-382, Beijing P.R. China, 25.-28.Mai 1993, bekannt, dass die Effizienz einer alkalischen Katalyse der Oxidation von Holz und Lignin beträchtlich zunimmt, wenn dem wässrigen Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel, z.B. DMSO, Aceton, Ethanol, zugegeben wird. Ferner geben die Autoren an, dass bei pH- Werten über 11 ein scharfer Anstieg der Oxidation des Holzes und des Lignins stattfindet.

Aus der WO 01/059204 ist ein Verfahren zur Herstellung von Zellstoff bekannt, bei dem das Ausgangsmaterial einer Vorbehandlung unterzogen wird, wobei das Material mit einer Pufferlösung und einem Delignifizierungskatalysator (Übergangsmetall) behandelt wird. Die Delignifizierung wird in Gegenwart von Sauerstoff, Wasserstoffperoxid oder Ozon durchgeführt.

Demgegenüber ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zuckern

gekennzeichnet durch die Kombination der Maßnahmen, dass

- lignocellulosisches Material mit einer wässrigen Lösung, welche einen Alkohol, insbesondere einen C _I-4 - Alkohol oder ein Phenol, enthält und einen pH- Wert zwischen 11,0 und 14,0 aufweist, behandelt wird, um Lignocellulose zu spalten und Spaltprodukte aus dem Material abzutrennen, wobei ein mit Cellulose und Hemicellulose angereichertes Material erhalten wird, und

- das erhaltene, mit Cellulose und Hemicellulose angereicherte Material mit mindestens einem Kohlenhydrat-spaltenden Enzym behandelt wird, um die Kohlenhydratspaltprodukte zu gewinnen.

Als Alkohol eignen sich aliphatische oder cycloaliphatische, ein- oder mehrwertige Alkohole oder Phenole, z. B. Ci _-6 - Alkohole, insbesondere ein wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, inklusive deren Isomeren; Glycole (Ethandiole, Propan-, Butan-, Pentan-, Hexandiole), Glycerin, Propenol, Butenol, Cyclopentanol, Cyclohexanol, Benzylalkohol; oder Phenole, wie Phenole, Cresole, Catechole, Naphthole, aber auch Aminoalkohole, wie Ethanolamin, Methanolamin und Hexanolamin. Bevorzugt ist ein C _1-4 - Alkohol. Für die Zwecke der vorliegenden Patentanmeldung sind Phenole in den

Gattungsbegriff„Alkohol" miteingeschlossen.

Die alkoholische Lösung des Lignin-Extraktes bietet ausserdem voteilhafte Optionen in der weiteren Aufarbeitung der Lignin-, bzw. Xylan-Spaltprodukte.

Alkohol liegt in einer wässrigen Lösung im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt in einem Ausmaß von 10 bis 70 Vol%, z. B. 20 bis 50 Vol%, bevorzugt von 30 bis 40 Vol% vor.

Im erfindungsgemäßen Verfahren liegt das lignocellulosische Material in der wässrigen Lösung vorzugsweise in einer Stoffdichte von 3-40 Gew%, wie 5-40 Gew%, insbesondere 5- 20% Gew% vor.

Bevorzugt wird die Lignocellulose bei einer Temperatur von unter 100°C, wie unter 80°C, z. B. unter 60 ⁰ C gespalten.

Der pH Wert kann mit einer Base, bevorzugt einer anorganischen Base, beispielweise Natronlauge eingestellt werden.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass ein mit einer wässrigen, basischen Lösung, welche einen Alkohol, insbesondere einen Ci _-4 - Alkohol oder ein Phenol, enthält und einen pH- Wert zwischen 11,0 und 14,0 aufweist, behandeltes lignocellulosisches Material enzymatisch in höherer Ausbeute zu Kohlenhydratspaltprodukten, wie Zuckern, verarbeitet werden kann, als ein auf eine sonstige Art delignifiziertes Material, insbesondere ohne den Zusatz von Alkohol.

Als Kohlenhydratspaltprodukte werden hauptsächlich Pentosen und Hexosen gebildet.

Bevorzugte Zucker schließen Xylose und Glucose ein. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das mit Cellulose und Hemicellulose angereicherte Material mit einer Xylanase und einer Cellulase behandelt wird, um die Zucker zu gewinnen.

Als lignocellulosisches Material wird vorzugsweise Stroh, Energiegräser, wie z. B.

Switchgrass, Elefantengras oder Abaca, Sisal, Bagasse, oder untypische

Lignocellulosesubstrate, wie Spelzen, z.B. Reisspelzen, bevorzugt Stroh, Energiegräser Bagasse oder Spelzen, besonders bevorzugt Stroh oder Bagasse, z. B. Stroh, eingesetzt. Stroh hat eine stark hydrophobe Oberfläche, sodaß die Benetzung mit wässrigen Lösungen ein Problem darstellt. Es hat sich gezeigt, dass es durch die Verwendung von Alkohol möglich ist, selbst ohne Druck die Reaktionslösung in die Poren des Substrates einzubringen und die vorhandene Luft durch Reaktionslösung zu ersetzen. Ferner hat sich gezeigt, dass Alkohol die Extraktion der Spaltprodukte aus Stroh beschleunigt und dazu beiträgt, die Ligninspaltprodukte in Lösung zu halten. Weiters hat sich gezeigt, dass im Gegensatz dazu Alkohol die Löslichkeit der Hemicellulose und deren Spaltprodukte herabsetzt und somit die Hemicellulose im Substrat gehalten wird.

Durch Abpressen der flüssigen Phase vom Substrat nach dem Aufschlussverfahren wird die Substratkonzentration erhöht, sodass geringere Enzymmengen zur enzymatischen

Hydrolyse, bzw. bei anderen enzymatischen Weiterverarbeitungen erforderlich sind.

Bei der Alkoholproduktion sind die Enzymkosten ein entscheidender Kostenfaktor.

Alkohol führt dazu, dass die Löslichkeit der im alkalischen Bereich während der Reaktion zusätzlich zum Lignin eventuell freigesetzten Hemicellulosen und deren Spaltprodukte stark herabgesetzt wird und diese an das Substrat gebunden bleiben. Die Vorteile für den Prozess sind hohe Selektivität des Ligninabbaus, für den Fall einer Abtrennung der

Extraktionslösung vom Feststoff eine sehr geringe Konzentration an Hemicellulose und deren Spaltprodukten in der Extraktionslösung, denn die Hemicellulose bleibt im

Feststoffanteil und dadurch für die enzymatische Hydrolyse und Zuckergewinnung erhalten.

Die alkoholische Lösung des Lignin-Extraktes bietet ferner verbesserte Möglichkeiten in der weiteren Aufarbeitung des Lignins und der Herstellung von Produkten aus Lignin. Es hat sich weiters gezeigt, dass durch die Verwendung von Alkohol, insbesondere eines Ci- 4- Alkohols oder eines Phenols, beim alkalischen Aufschluss unter 100°C der Abbau der Hemicellulosen weitgehend verhindert wird, sodass annähernd die gesamte Hemicellulose zur weiteren enzymatischen Spaltung und Umwandlung der Xylose zu höherwertigen Produkten zur Verfugung steht und nicht, wie bei anderen Verfahren, teilweise beim

Aufschluss mit abgebaut wird und als Lignin / Zucker-Mischung anfällt.

Durch die im Aufschluss durchgeführte Delignifizierung wird die Porosität der Zellwände des lignocellulosischen Materials erhöht, beispielsweise im Falle von Stroh so weit erhöht, dass nahezu die gesamte Xylose für die Xylanase zugänglich wird und annähernd 100% des Xylans hydrolysiert und Xylose gewonnen werden kann. Dies macht das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, in Verbindung mit einer enzymatischen Konversion der Xylose höherwertige Produkte herzustellen. Die enzymatische Konversion kann dabei entweder direkt im Gemisch aus Xyloselösung und Feststoff erfolgen, oder aber mit der vom Feststoff abgetrennten Xyloselösung.

Bei einer weiteren, nach der enzymatischen Hydrolyse des Xylans und der

erfindungsgemäßen Umwandlung der Xylose zu Xylitol folgenden Alkoholproduktion aus dem verbleibendem Feststoff, sind die Enzymkosten ein entscheidender Kostenfaktor. Diese resultieren zum Teil auch aus unspezifischen Bindungen von Enzymen an das Lignin, siehe z B. Chandra et al, 2007, ibidem. Die teilweise Entfernung des Lignins reduziert diesen Aktivitätsverlust und wirkt sich kostengünstig aus.

Die Vorteile für ein nachfolgendes enzymatisches Verfahren sind beispielsweise, dass aus der hohen Selektivität des Ligninabbaus bei fast vollständiger Erhaltung der Zuckerpolymere eine sehr geringe Konzentration an Hemicellulose und deren Spaltprodukten in der

Extraktionslösung resultiert, die Hemicellulose bleibt im Feststoffanteil und dadurch für die enzymatische Hydrolyse und Zuckergewinnung sowie deren weiterer Umwandlung erhalten. Daraus ergibt sich erfindungsgemäß eine maximale Stoffnutzungsrate und, beispielsweise in Verbindung mit dem Einsatz von Xylosedehydrogenasen, hohe Rentabilität des

beschriebenen Prozesses. Die Durchführung eines Xylose-Umwandlungsprozesses zu Xylitol kann nach

enzymatischer Freisetzung der Xylose direkt im FeststofϊTFlüssigkeitsgemisch, das gemäß dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, durchgeführt werden, was weiterhin die Rentabilität des Gesamtprozesses erhöht.

Im Falle der Umwandlung zu Xylitol kann der, nach Apressen des Feststoffes im Substrat verbleibende, Restalkohol aus dem Aufschlussprozess direkt als Substrat für die

Alkoholdehydrogenase zur Regenerierung von NAD zu NADH genutzt werden. Wenn der Prozess so ausgelegt wird, dass dazu der im Reaktionsgemisch verbleibende Restalkohol aus dem Aufschluss (teilweise) verbraucht wird, wird eine Alkoholentfernung aus der

Produktlösung (teilweise) überflüssig und die Effizienz des Gesamtprozesses dadurch weiter gesteigert.

Im Falle der Umwandlung der Ligninspaltprodukte wirkt der Alkohol als Radikal-Scavenger und Lösungsmittel für Spaltprodukte aus einer enzymatischen, biomimetischen oder chemischen Depolymerisation der höhermolekularen Lignin- Spaltprodukte zu

niedermolekularen.

Der geringe Anteil von Hemicelluose und deren Spaltprodukten im Extrakt und die erhöhte Löslichkeit des Lignins, erhöhen die Durchsatzraten bei einer Abtrennung des Feststoffes von den Umwandlungsprodukten, sowie deren Aufarbeitung durch Filtration.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt beispielsweise die Auftrennung der drei

Hauptkomponenten des Strohs, nämlich der Glucose, der Xylose sowie des Lignins in sehr störstoffarmen Stoffströmen und deren weitere Umwandlung zu höherwertigen Produkten, wie Xylitol, und erfüllt somit die Forderungen eines idealen Bioraffinerie- Verfahrens.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu anderen

Aufschlussverfahren, die vorwiegend im Temperaturbereich zwischen 150°C und 200 ⁰ C ablaufen, ist seine Reaktionstemperatur unter 100°C. Der niedrige Energieaufwand erlaubt es, das beim Aufschluss gewonnene Lignin nicht als Energiequelle für das Aufschlussverfahren, sondern als Wertstoff zu nutzen.

Nach der Behandlung mit der wässrigen, einen Alkohol, insbesondere einen C _1-4 -AIkOhOl oder ein Phenol, und H ₂ O ₂ enthaltenden Lösung, wird, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, die Lignin enthaltende Lösung abgetrennt und der aufgeschlossene Feststoff bevorzugt mit einer Xylanase, z. B. 6-72 Stunden bei 30-90°C behandelt und die Flüssigphase vom Feststoff abgetrennt, worauf die Flüssigphase bevorzugt zu

Folgeprodukten, z. B. Xylitol weiterumgesetzt wird.

Der nach Abtrennung der Flüssigphase verbleibende Feststoff wird bevorzugt mit Cellulase behandelt, wobei durch weitere Fermentation der Feststoff/ Glucoselösung Ethanol, Butanol oder andere Fermentationsprodukte erhalten werden können; oder der verbleibende Feststoff wird einer thermischen oder thermochemishcen Stoffumwandlung unterzogen und die entstandenen Produkte, wie Treibstoffkomponenten, Treibstoffzusätze und/oder andere Chemieprodukte, wie z. B. Phenole, werden abgetrennt; oder der verbleibende Feststoff wird einer mikrobiellen Stoffumwandlung durch Bakterien, Hefen oder Pilze unterzogen; oder der verbleibende Feststoff wird einem weiteren Delignifizierungsschritt zum Zwecke der Gewinnung eines Cellulose-Fasermaterials unterzogen.

Der verbleibende Feststoff kann in einer Biogasanlage fermentiert und zu Biogas

weiterverarbeitet werden.

Eines der wirtschaftlich interessantesten Folgeprodukte der Xylose ist Xylitol.

Die Hauptquellen für die Xylose-Gewinnung sind Kochlaugen aus der Zellstoffindustrie, die eine Fülle von Abbauprodukten, hauptsächlich des Lignins und der Hemicellulose enthalten, sodass Xylose erst durch aufwändige Trennungs- und Reingungsschritte gewonnen werden muß. So beschreibt z. B. H. Harms in„Willkommen in der natürlichen Welt von Lenzing, weltweit führend in der Cellulosefaser Technologie", Herbsttagung der österreichischen Papierindustrie, Frantschach (15. 11. 2007) die Gewinnung von Xylose aus der Dicklauge durch Gelfiltration, eine technisch sehr komplexe Methode, die üblicherwiese nicht für Bulkprodukte Anwendung findet. Die solcherart gewonnene Xylose wird dann katalytisch zu Xylitol umgewandelt.

In einem weiteren Aspekt wird die gemäß vorliegender Erfindung gewonnene Xylose fermentationsfrei in Xylitol umgewandelt, durch Umsetzung mit einer Xylosereduktase, z. B. einer Xylose Dehydrogenase, beispielsweise aus Candida tenuis, wobei gegebenenfalls eine Xylosereduktase und gegebenenfalls ein Co-Substrat zur Regenerierung des Co-Faktors und gegebenenfalls Alkoholdehydrogenase und gegebenenfalls NAD(P)H zur Xylose Lösung zugesetzt wird; insbesondere, wobei das erhaltene Xylitol durch Filtration von den

Ligninspaltprodukten abgetrennt wird.

Mit dem nachstehenden Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel IA wird der Einfluss der

Vorbehandlung in Gegenwart von Alkohol auf die Ausbeute an reduzierenden Zuckern nach enzymatischer Hydrolyse dokumentiert.

Beispiel 1

Vorbehandlung von Weizenstroh

Weizenstroh wird auf eine Partikelgröße von ca. 2 cm zerkleinert. 5 g zerkleinertes

Weizenstroh wird in einem 500 mL Reaktionsgefäß in 200 mL einer Lösung, bestehend aus 49,5% Wasser, 50% Ethanol und 0,5% Wasserstoffperoxid suspendiert. Die Suspension wird auf 50 °C im Wasserbad erhitzt, thermostatisiert und der pH- Wert der Suspension mit wässriger NaOH-Lösung auf einen Ausgangs-pH Wert von 12 eingestellt. Die Mischung wird bei 200 rpm, 60°C, 24 Stunden kontinuierlich magnetisch gerührt. Danach wird der Feststoffanteil abfiltriert und mit IL destilliertem Wasser gewaschen.

Zur enzymatischen Hydrolyse wurden von jedem Parallelversuch 100 mg vorbehandeltes Substrat mit 9,8 mL 50 mM Na-Acetat Puffer auf pH 4,8 gestellt und mit 200 μL Accellerase 1000 Suspension (www.genencor.com) versetzt. Accellerase ist eine Enzymmischung aus Cellulasen und Hemicellulasen. Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 50 ⁰ C in einem Schüttelwasserbad durchgeführt. Die nach 48 Stunden freigesetzten löslichen Monomere aus Hexosen und Pentosen wurden in Form reduzierender Zucker nach der DNS Methode (Miller et al., Analytical Chemistry 31(3):426, 1959) in 1 mL flüssigem Überstand bestimmt, auf die Menge eingewogenen, vorbehandelten Substrates bezogen und in Prozent der maximalen theoretischen Ausbeute ausgedrückt.

Die theoretische maximale Ausbeute reduzierender Zucker wurde gesondert bestimmt und beträgt 705 mg +/- 5% pro g unbehandeltes Stroh.

Pro Versuchsansatz wurden jeweils 5 Parallel versuche durchgeführt. Die Ausbeute an reduzierenden Zuckern betrug 99% +/- 4%.

Vergleichsbeispiel IA

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch ohne Alkoholzusatz. Die Ausbeute an

reduzierenden Zuckern betrug lediglich 64% +/- 3%.

Beispiel 2

Vorbehandlung von Weizenstroh

Weizenstroh wird auf eine Partikelgröße von ca. 2 cm zerkleinert. 2,5 g zerkleinertes Weizenstroh wird in einem 500 mL Reaktionsgefäß in 200 mL einer Lösung, bestehend aus 49,5% Wasser und 50% Isopropanol suspendiert. Die Suspension wird auf 50 °C im Wasserbad erhitzt, thermostatisiert und der pH- Wert der Suspension mit wässriger NaOH- Lösung auf einen Ausgangs-pH Wert von 13 (bzw. 14) eingestellt. Die Mischung wird bei 200 rpm, 60 ⁰ C, 24 Stunden kontinuierlich magnetisch gerührt. Danach wird der

Feststoffanteil abfiltriert und mit IL destilliertem Wasser gewaschen.

Zur enzymatischen Hydrolyse wurden von jedem Parallelversuch 100 mg vorbehandeltes Substrat mit 9,8 mL 50 mM Na-Acetat Puffer auf pH 4,8 gestellt und mit 200 μL Accellerase 1000 Suspension (www.genencor.com) versetzt. Accellerase ist eine Enzymmischung aus Cellulasen und Hemicellulasen. Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 50°C in einem Schüttelwasserbad durchgeführt. Die nach 48 Stunden freigesetzten, löslichen Monomere aus Hexosen und Pentosen wurden in Form reduzierender Zucker nach der DNS Methode in 1 mL flüssigem Überstand bestimmt, auf die Menge eingewogenen vorbehandelten

Substrates bezogen und in Prozent der maximalen theoretischen Ausbeute ausgedrückt.

Die theoretische maximale Ausbeute reduzierender Zucker wurde gesondert bestimmt und beträgt 705 mg +/- 5% pro g unbehandeltes Stroh.

Pro Versuchsansatz wurden jeweils 5 Parallelversuche durchgeführt. Die Ausbeuten an reduzierenden Zuckern betrug 97% +/- 4%.

Beispiel 3

Enzymatische Xylitol Produktion aus einer Xyloselösung, die aus Stroh nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Als Kosubstrat wird

Isopropanol verwendet.

Die Reaktionslösung enthält 5 mg/mL Xylose.

Xylosereduktase (XR) aus Candida tenuis reduziert Xylose zu Xylitol. Diese XR benötigt als Koenzym NADH (Nicotinamidadenindinukleotid reduziert), das bei der Reaktion zum Koenzym NAD ⁺ oxidiert wird. Die Regenerierung des oxidierten Kofaktors erfolgt durch parallele Aktivität einer Alkohol-Dehydrogenase(ADH: Enzym-gekoppelte Regenerierung). Als Kosubstrat wird Isopropanol eingesetzt. Isopropanol und NAD ⁺ werden durch die ADH zu NADH und Aceton umgesetzt, wie im Reaktionsschema 1 gezeigt: REAKTIONSSCHEMA 1

Xylose _{NADH + H+} NAD ⁺ Xylit

Isopropanol

Aceton

In der Tabelle 1 sind die Reaktionsverhältnisse in den 5 verschiedenen Versuchsreaktionen #049, #050, #051, #052, #053 und #054 dargestellt:

Tabelle 1

Gesamtvolumen: 1 mL

Temperatur: 26 ± 2 ⁰ C Magnetrührer: 200 rpm

Zeit: 15 Stunden

Zur Deaktivierung der Enzyme wurden alle Proben auf 95°C für 15 Minuten aufgeheizt und als Vorbereitung für die anschließende HPLC- Analyse zentrifugiert.

Analyse - HPLC:

Säule SUGAR SP0810 + Vorsäule SUGAR SP-G

Detektor: Refraktionsindex-Detektor

Eluent: entionisiertes H ₂ O

Fluss: 0.75 mL/min

Probenmenge: 10 μL

HPLC Quantifizierung Präzision: ±10%

Retentionszeit:

Xylose: 13,97 min

Xylitol: 37,73 min

Isopropanol: 16,69 min

Aceton: 16,54 min

Ergebnisse:

Die Substratkonzentration von Probe #049 wurde mittels HPLC bestimmt und lag bei 0.9 mg/mL.

Die Reaktionsmischung #050 beinhaltet nur Xylosereduktase (0.1 U/mL) und NADH (1 mM). Nach der 15 Stunden dauernden Reaktion waren 0.085 mg Xylose verbraucht. Die Xylitol Konzentration war unter dem Detektionslimit.

Die Reaktion #052 ist vergleichbar mit der Reaktion #050, jedoch mit dem Unterschied, dass hier das Regenerationssystem angewendet wird. Es kommt zum Totalumsatz der

eingesetzten Xylose. Verwendete Konzentrationen: XR (0.1 U/mL), NADH (1 mM), ADH (0.25 U/mL) und Isopropanol (5%). Die Xylosekonzentration der Probe #053 wurde mit 2.121 mg/mL bestimmt, was der erwarteten Xylosekonzentration entspricht..

Die Reaktion #054 ist vergleichbar mit Reaktion #052, beinhaltet jedoch eine um den Faktor 2 erhöhte Xylose-Startkonzentration (50 % Substrate in der Reaktion). Die Konzentration des erzeugten Xylitols wurde mit 0.945 mg Xylitol gemessen. Verwendete Konzentrationen: XR (0.1 WmL), NADH (1 mM), ADH (0.25 U/mL) und Isopropanol (5%).

In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Reaktionen basierend auf den HPLC-Messdaten zusammengefasst (Xylose verbraucht und Xylitol gewonnen;„u.D.L." bedeutet„unter dem Detektionslimit"):

Tabelle 2

Beispiel 4

Enzymatische Xylitol Produktion aus einer Xyloselösung, die aus Stroh nach dem im

Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Als Kosubstrat wird Ethanol verwendet.

Das Volumen der Substratlösung wurde (vgl. Beispiel 2) mittels eines Rotavapors auf 50% vermindert, um die Xylosekonzentration zu erhöhen (~ 10 mg/mL Xylose).

Die Regenerierung des oxidierten Kofaktors erfolgte durch die Aktivität der eingesetzten Xylose-Reduktase (XR) aus Candida tenius und die zusätzliche Aktivität einer eingesetzten Aldehyd-Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich: Katalognummer A6338; (EC) Number: 1.2.1.5; CAS Number: 9028-88-0). Dabei handelt es sich sowohl um eine Substrat-gekoppelte, als auch um eine Enzym-gekoppelte Reaktion. Als Kosubstrat wird Ethanol eingesetzt. Ethanol und NAD ⁺ werden im ersten Schritt durch die Aktivität der XR zu NADH und Acetaldehyd umgesetzt. Im zweiten Schritt werden Acetaldehyd und NAD ⁺ durch die Aktivität der Aldehyd-Dehydrogenase (AIdDH) zu Acetat umgesetzt (vgl. dazu Sigma-Aldrich: Katalognummer A6338; bzw.„Characterization and Potential Roles of Cytosolic and Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenases in Ethanol Metabolism in

Saccharomyces cerevisiae", Wang et al, Molecular Cloning, 1998, Journal of Bacteriology, p. 822 - 830). Pro Mol umgesetztes Kosubstrat würden in diesem Fall 2 Mol

Reduktionsäquivalente (NADH) entstehen (vgl. Reaktionsschema 2).

REAKTIOMSSCHEMA 2

CH ₃ COO ^■

Essigsäureanion

In der Tabelle 3 sind die Reaktionsverhältnisse der 4 veschiedenen Versuchsreaktionen 247, 249, 250 und 253 dargestellt. Es wurden unterschiedliche Ethanolkonzentrationen und AldDH-Konzentrationen verwendet. Die Kofaktor- und Subtratkonzentrationen wurden konstant gehalten.

Tabelle 3

Gesamtvolumen: 0,5 mL

Temperatur: 25 ± 2°C

Thermomixer: 500 rpm

Zeit 112 Stunden

Zur Deaktivierung der Enzyme wurden alle Proben auf 70 ⁰ C für 15 Minuten aufgeheizt und als Vorbereitung für die anschließende HPLC- Analyse zentrifugiert und filtriert (PVDF; 0,2 μm).

Analyse - HPLC:

Säule SUGAR SP0810 + Vorsäule SUGAR SP-G

Säulentemperatur: 90°C

Detektor: Refraktionsindex-Detektor

Eluent: entionisiertes H ₂ O

Fluss: 0.90 mL/min

Probenmenge: 10 μL

HPLC Quantifizierung Präzision: ±10% Ergebnisse:

Die maximalen Ausbeute (Reaktion 249) konnte mit einer Ethanolkonzentration von 1,2 Mol/L erreicht werden. Dabei wurden insgesamt 1,38 mg/mL Xylitol erzeugt, was einer Ausbeute von 21,2% der Theorie an Xylitol entspricht.

In der Tabelle 4 sind die Ergebnisse der Reaktionen basierend auf den HPLC-Messdaten zusammengefasst.

Tabelle 4

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass Ethanol als Kosubstrat verwendet werden kann. Wie durch den Vergleich der Reaktion 249 (Reaktionsgemisch beinhaltet AIdDH) und 253 (Reaktionsgemisch ohne AIdDH) eindeutig gezeigt werden kann, fuhrt die Zugabe der Aldehyd-Dehydrogenase zu einer deutlichen Erhöhung der Ausbeute an Xylitol. Der Unterschied an umgesetzter Xylose zu Xylitol beträgt ~8%. Dieses Ergebnis in Verbindung mit den oben erwähnten Literaturzitaten lässt nur den Schluss zu, dass AIdDH den in der ersten Teilreduktion entstehenden Acetaldehyd weiter zu Essigsäure oxidiert (vgl.

Reaktionsschema 2). Diese energetisch günstige Reaktion und die damit einhergehende erhöhte Konzentration an NADH verschiebt das Gleichgewicht vom Edukt in Richtung des Produktes Xylitol in der ersten Teilreaktion.