Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения из водорослей углеводов, которые могут использоваться в качестве компонентов питательной среды для получения этанола и биологически активных веществ (БАВ).

В гидросфере Земли известно более 28 тысяч видов растений - от одноклеточных микроскопических (фитопланктон) до растений со сложным строением и гигантских по размерам (макрофиты). Водные растения встречаются во всех слоях водоемов.

Водоросли - это низкоорганизованные растения, у которых отсутствуют настоящие корни, стебли и листья. В нашей стране наиболее распространены бурые и красные водоросли. Видовой состав наших морей представлен на 50% красными и на 45% бурыми водорослями. Растения содержат в тканях намного больше углеводов, чем животные. Морские водоросли в сухом обезжиренном состоянии содержат от 40 до 82% углеводов. К углеводам относят моно, ди и полисахариды, мукополисахариды и комплексные полисахариды. Полисахариды, в основном, состоят из пентоз ( арабиноза, ксилоза, рибоза и дозоксирибоза) и гексоз (глюкоза, манноза, галактоза, фукоза.) Углеродсодержащие соединения водного растительного сырья потенциально могут быть превращены в моноуглеводы с использованием комплекса ферментов или комплексных ферментных препаратов растительного или микробного происхождения, Кроме того, различные моносахара или полисахариды, могут быть использованы для получения биологически активных веществ, пищевых и кормовых продуктов или в качестве заменителей нефтехимических продуктов при получении органических химических соединений.

Известны различные способы получения углеводов из растительного сырья как химические, так и биохимические.

Наиболее активными химическими катализаторами реакции гидролиза полисахаридов растительной клетки являются минеральные кислоты и щелочи. При обработке растительного сырья кислотой лигнин остается нерастворимым, а целлюлоза и гемицеллюлоза гидролизуются. При кислотном гидролизе, кроме низкомолекулярных углеводов образуются лигнин и токсичные компоненты - фурфурол, метилфурфурол, метанол, формальдегид и низкомолекулярные кислоты и эфиры, которые делают производство экологически грязным и опасным для окружающей среды и, в частности, для обслуживающего персонала и жителей близлежащих регионов.

Проблема использования лигнина является самой трудной проблемой, которая не нашла решения до сих пор. После проведения гидролиза в гидролиз-аппарате остается 30% (от исходного растительного сырья) твердого вещества в виде лигнина, пропитанного серной кислотой. Удаляют лигнин из аппарата прямо в открытый аппарат - сцежу, т.е. в атмосферу попадает лигнин, серная кислота, метанол, уксусная кислота, фурфурол, метилфурфурол и другие низкомолекулярные летучие токсичные продукты. Все вышеперечисленное привело к закрытию предприятий основанных на химическом гидролизе растительного сырья.

При щелочном гидролизе происходит частичное растворение лигнина, но при этом происходит и разрушение углеводов, поэтому этот метод не нашел практического применения.

В патенте US 7262331 описан способ получения жидкого топлива из пульпы, которая для получения продукта подвергается воздействию высокой температуры 280 ⁰ C и затем воздействию высокого давления 100-250 бар. При этом происходит разрыв и белков и полисахаридов, но разрыв происходит беспорядочный, поэтому их нельзя использовать в качестве источника моноуглеводов .

В патенте РФ 2284355 используется способ гидролиза растительного сырья серной кислотой и нейтрализация гидролизата аммиачной водой. При таком методе получения углеводов происходит разрушение углеводов и образование токсических соединений - фурфурол, метилфурфурол, метанол и сульфатированный лигнин. При удалении которого из аппарата в окружающий воздух попадают перечисленные токсичные компоненты. В US 6908995 этанол получают из биомассы, в том числе из бурых водорослей (ламинарии) при нагревании в водном растворе щелочи (20-40 %) для разрушения лигнин - целлюлозного комплекса. При этом способе не происходит гидролиза полисахаридов до моноуглеводов, поэтому получается низкий выход и в гидролизатах содержатся токсичные компоненты - индол, низкомолекулярные эфиры, толуол и другие бензольные соединения.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, описанный в заявке EA200701127.

Известное изобретение относится к способу разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, имеющих относительно высокое содержание сухого вещества, выше 20%, и предпочтительно состоящих из относительно крупных волокон и частиц, с таким распределением размера волокон и частиц, при котором по меньшей мере 20% (масс/масс.) биомассы находится в диапазоне 26-70 мм. Кроме того, способ применим для разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, главным образом состоящих из крахмала, очищенного крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, например зерна или пшеничной соломы. В случае лигноцеллюлозных биомасс их предварительно обрабатывают, подвергая воздействию температур от ПО до 250°C в течение 1-60 мин, что обеспечивает доступность целлюлозы для ферментов и в то же время обеспечивает ограниченное содержание ингибиторов ферментации в предварительно обработанной биомассе. В настоящем изобретении объединяют ферментативный гидролиз, основанный на комбинации гидролитических ферментов, включая фермент, вызывающий гидролиз углеводов, и окислительный фермент, с перемешиванием, основанным на принципе действия силы тяжести, обеспечивающим приложение к биомассам механических сил, главным образом усилия сдвига и силы разрыва. Предпочтительными типами перемешивания являются, например, перемешивание в смесителях, работающих по принципу свободного падения, таких как смесители барабанного типа, смесители на основе опрокидывания или сходные смешивающие устройства. В основном, данный способ разработан применительно к растительным объектам, содержащим в качестве запасных полисахаридов крахмал, содержание которого может доходить до 50-60% , или биомассы, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. В этих случаях сначала проводят предварительную обработку биомассы воздействием высокой температуры от 110°C до 250°C в течение 5-15 мин, а затем ферментативная обработка окислительным и протеолитическим ферментами, что приводит к разрушению клеточной стенки, в частности, белков клеточной стенки. Это позволяет обеспечить доступ целлюлазы к фибрилам целлюлозы и амилазы к крахмалу. При этом не разрываются связи лигнина с гемицеллюлозой и пектина с целлюлозой. Такой метод обработки сопровождается окислением пόлисахаридных цепочек с получением органических кислот, а также образованием ароматических токсичных соединений. Кроме того, обработка биомассы при высокой температуре приводит к карамелизации углеводов, разрушению пептидов и серосодержащих аминокислот. При такой предварительной обработке доступ к целлюлозе обеспечивается только на 40-50%, а остальная целлюлоза остается негидролизованной и недоступной для з действия ферментов, но такой способ обработки позволяет полностью гидролизовать крахмал.

Недостатками прототипа являются: большие потери сырья за счет окисления части образовавшейся глюкозы в органические кислоты, при обработке целлюлозолигнинованного комплекса происходит не полное освобождение целлюлозы и пектина от связи их с гемицеллюлозой и лигнином, что приводит к неполному гидролизу целлюлозы и гемицеллюлозы до моносахаридов; ~ образование лигнина насыщенного серной кислотой, который не имеет применение и выбрасывается в окружающую среду, нанося вред экологии; на таких гидролизатах можно получать только технические и кормовые, но не пищевые продукты. Кроме того, чтобы дальше использовать гидролизаты в качестве компонента питательной среды необходимо вводить стадию очистки от токсичных продуктов - ароматических соединений.

Задачей данного изобретения является разработка экологически чистого и экономичного способа получения углеводов из полисахаридных комплексов водорослей, которые в дальнейшем можно было бы использовать не только для производства этанола и БАВ, но и для получения пищевых продуктов. Анализ химического состава водорослей показывает, что, прежде всего, они являются источником различных биологически активных веществ (БАВ). Так по содержанию витаминов ламинариевые и фукусовые водоросли в 100-1000 раз превосходят наземные растения.

Первоначально, интерес к водорослям возник в связи с возможностью их использования в качестве источника белка.

Большая часть морских растений представлена группой водорослей, имеющих, как правило, относительно простую структуру. Водоросли представляют собой микроскопические одноклеточные растения, но отдельные экземпляры могут достигать в длину более 80 м. В отличие от наземных растений, у которых фотосинтез происходит лишь в определенных частях растений - в листве, то у морских водорослей в фотосинтезе принимает участие вся поверхность водорослей.

Благодаря простой структуре и большому отношению площади поверхности к объему морские водоросли эффективно поглощают солнечную энергию, поэтому продуктивность некоторых морских водорослей гораздо больше, чем продуктивность наземных растений. По структуре клеточной стенки очень много общего у морских водорослей и у наземных растений, но по содержанию полисахаридов они отличаются.

Содержание воды в водорослях составляет 85-90%, сухие вещества водорослей содержат 52-65% органических веществ, т.е. lкг сухих водорослей содержит 300- 400 г полисахаридов.

У водорослей мы встречаем в качестве запасных продуктов не крахмал, а разнообразные по составу гомо- и гетерополисахариды и сульфатированные полисахариды (агар, каррагинан). В клеточной стенке водорослей находятся только целлюлоза, гемицеллюлоза и пектин, в то время как у наземных растений в состав клеточных стенок входит и лигнин, содержание которого составляет до 30%.

Органические вещества бурых водорослей состоят из углеводов (73-74%), азотистых веществ (5-15%), липидов (1- 3%), пигментов и витаминов. В различных водорослях обнаружено несколько типов полисахаридов: целлюлоза (35% от содержания углеводов), гемицеллюлоза ( 15 %), ламинаран (10 -15% от углеводов), альгиновые кислоты (15-20%), сульфатированные глюканы - фукоиданы, агар и каррагинаны (их содержание может составлять до 20-30%) и маннннит. Сульфатированные полисахариды после отделения сульфатных групп под действием ферментов - десульфатаз, как и другие полисахариды, после гидролиза гидролитическими ферментами (целлюлазами, целлобиазами, гемицеллюлазами, ксиланазами и -глюконазами) образуют моносахара - глюкозу, ксилозу, маннозу, фукозу, галактозу и пентозы..

Наибольшее содержание полисахаридов обнаруживается у Z. sассhаriпа, F. vеsisulоsus, F. Distiсhus. Причем содержание маннита в ламинариевых водорослях доходит до 30 %, а в фукосовых до 20 %. Кроме маннита ламинарии содержит до 15-20 % веществ, легко подвергающихся ферментативному гидролизу до гексоз и пентоз.

Таким образом, водоросли - хороший углеводный субстрат, который после предварительного ферментативного гидролиза маннита, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина будет содержать моносахара, хорошо усваиваемые микроорганизмами. Наряду с этим, морские водоросли представляют полноценную питательную среду, в которой содержится как источник углерода, так и органического азота (аминокислоты).

Известно, что среднее количество биомассы, которое дают водоросли, составляет 15-25 г/м.кв. сухой массы в сутки, а максимальная скорость роста водорослей достигает 30-40 г/м.кв. Для решения поставленной задачи предлагается способ получения углеводов гидролизом полисахаридных комплексов водорослей, включающем реакцию ферментативного гидролиза с получением углеводов, дополнить предварительным химическим гидролизом полисахаридных комплексов водорослей с помощью пергидроля ( H2O2 ). Реакцию ферментативного гидролиза предлагается проводить с помощью комплексов ферментов - целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ и десульфатазы. Тогда как реакции химического и ферментативного гидролиза предлагается проводить последовательно в многосекционном реакторе барабанного типа. Дополнительными отличиями является то, что

- в качестве полисахаридных комплексов водорослей используют промысловые водоросли, например бурые (Lаmiпагiаlеs jаропiса, L. Dепtiqеrа, Fuсus sр.), красные (Аhпfеltiа рliсаtа, Fuгсеllаriа tаstigiаtа), зеленые.;

- реакцию химического гидролиза проводят при температуре 50-60° С; - реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 45-80°C;

- время проведения реакции химического гидролиза составляет 30-60 минут;

- время проведения ферментативного гидролиза составляет 120 минут;

В качестве комплексов ферментов применяют комплекс, содержащийUltrаflо L (фирма Nоvоzуmеs) - термостабильный мультиактивный препарат, содержащий целлюлазу, глюканазу, ксиланазу и пектиназу, и Оллзайм Д (фирма OLTEX ) и церемикс (фирма Nоvоzуmеs), содержащие грибковую целлюлазу, экзо B- глюконазу и эндо В-глюконазу. Данные препараты вносятся в соотношении 0,1 : 0,1 : 0, Ir каждого на 100 г водорослей.

Возможно использовать другие ферментативные комплексы, например, целлолюкс (фирма Сиббиофарм ), дистицим (фирма RBSLE ) и вискафло ( фирма Nоvоzуmеs ), который содержит целлюлазу, ксиланазу, пектиназу и гемицеллюлазы из гриба Тriсhоdеrmа rеsеi, - эти препараты содержат высокоактивную ксиланазу и в- ксилозидазу и манназу. В составе этого ферментативного комплекса предлагается использовать также десульфатазу (фирма Меrс ). Данные препараты вносятся в соотношении 0,1 : 0,1 : 0,1 : 0,2 г каждого на 100 г водорослей.

В случае использования сухой биомассы перед проведением реакции химического гидролиза предлагается проводить замачивание биомассы в пропорции 1 : 5 — 1 :10 . Примеры выполнения предлагаемого изобретения.

Пример 1: Ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе.

Предварительно увлажненную морскую водоросль со средним размером примерно 3x5 см, соответствующую 100 г сухой массы, помещали в емкость типа квадрата, сплетенного из металлической сетки, которую помещаем в водяную баню. Прокачивали через нее подогретую жидкость насосом или помещали в барабанную емкость с вращающимся барабаном. В одной секции проводили обработку сырья H ₂ O ₂ в течение 30-40 мин при концентрации 0,3-0,5% H ₂ O ₂ . В следующей секции проводилась отмывка от остатков перекиси водорода. Одновременно с обесцвечиванием происходит гидролиз полисахаридов до олигосахаридов, то есть это приводит к уменьшению длины полисахаридной цепи. После отмывания сырья от перекиси водорода в следующую секцию подавался раствор комплексного фермента. Ultгаflо L (термостабильный мультиактивный препарат В-глюконазы, целлюлозная, ксиланозная, пентозаназная, арабаназная активность, Оллзайм Д и церемикс (грибковая целлюлоза, экзо В-глюконаза и эндо В-глюканаза). Перед подачей ферментативного комплекса к увлажненным водорослям добавляем IN HCE для удаления поливалентных ионов (Ca ⁺² , Mg ⁺² ). После достижения рН 5,0-5,5 раствор ферментативного комплекса приливали к водорослям ( в соотношении 0,1 :0,1: 0, Ir на 100 г водорослей ), затем водоросли промывали таким же объемом воды.

Анализ моносахаров после действия комплекса ферментов показал, что количество редуцирующих веществ увеличилось в 3,5 раза, при действии каждого фермента в отдельности количество редуцирующих веществ увеличивается значительно меньше - на 50-90 %, и в растворе определяется моносахарид манноза, примерно 2,5 г в литре раствора.

При добавлении пергидроля уровень редуцирующих веществ увеличивается на 50- 60 %.

Пример 2: Ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе.

Предварительно увлажненную морскую водоросль со средним размером примерно 3x5 см, соответствующую 100 г сухой массы, помещали в емкость типа квадрата, сплетенного из металлической сетки, которую помещали в водяную баню, и прокачивали через нее подогретую жидкость насосом или помещали в барабанную емкость. В одной секции проводили обработку сырья пергидролем (H ₂ O ₂ ) в течение 30-40 мин. при концентрации 0,3-0,5% H ₂ O ₂ . В следующей секции проводилась отмывка водой от остатков перекиси водорода. Объем подаваемой воды равен соотношению водоросли: вода - 1 :5. После завершения отмывки в емкость с водорослями подается водный раствор ферментного препарата целлолюкс, дистицим, вискофло ( соотношение ферменты : водоросли 0,1 : 0,1 : 0,1 г на 100 г водорослей ) рН 5,0 +/- 0,3. Процесс проводится при перемешивании в течение 120 мин при 50°C +/- 5°C и рН 5,0+/- 0,3 .

Анализ моноуглеводов после окончания ферментативного гидролиза показал, что количество редуцирующих веществ увеличилось в 2,5 - 3,0 раза. При действии каждого фермента в отдельности отмечалось увеличения количества редуцирующих веществ на 70 — ПО %. Следовательно, при совместном действии ферментов проявляется синергидное действие. Вероятно ферменты гидролизуют различные виды полисахаридов в водорослях, что и сопровождается явлением синергизма. При добавлении десульфатазы (0,2 г ) в растворе определяется галактоза -2,5 г/л

Пример 3. Ферментативный гидролиз в пилотном масштабе.

Предварительно взвешенную сухо-воздушную массу водорослей со средним размером примерно 5-10 мм (предварительно помещаем в дезинтегратор для размельчения до нужного размера). Помещаем в стандартную 4-х секционную стиральную машину. Каждая секция выкладывалась соответствующей металлической сеткой, не пропускающей помещенные водоросли. В I секцию после загрузки увлажненных водорослей подавали разбавленную 0,3-0,5% перекись водорода. Время обесцвечивания 30 мин при вращении барабана. По окончании стадии обесцвечивания барабан останавливается и раствор сливается. В эту же секцию подается вода в соотношении 1:5 для удаления остатка пергидроля. Затем сюда же заливается раствор ферментов - Ultгаflо L, Оллзайм Д и церемикс и десульфокиназу . Процесс гидролиза проводится при температуре 50+/- 5°C, рН 5,0+/- 0,3 в течение 120 минут, при вращающимся барабане. В этот период под действием гемицеллюлазы и ксиланазы происходит ферментативный гидролиз гемицеллюлозы и пектиновых компонентов до маннозы, галактозы, арабиногалактуроновой и манануроновой кислот. Гидролиз данных групп полисахаридов позволяет освободить фибриллы целлюлозы. На следующем этапе происходит под действием целлюлазы гидролиз целлюлозы до дисахаров и моносахаров (глюкозы). Одновременно под действием десульфокиназы происходит десульфатирование полисахарида каррагинана, который в дальнейшем гидролизуется до галактозы.

После окончания стадии ферментативного гидролиза надосадочная жидкость, содержит низкомолекулярные полисахариды и моносахара, вращение барабана останавливали, и жидкую фазу сливали в приемную емкость V=20 м ³ . Затем в эту же секцию для промывки оставшихся водорослей заливали объем воды 12 м ³ и включали вращение барабана в течение 15-20 мин. Затем барабан останавливали и жидкую фазу сливали в приемную емкость к слитой жидкой фазе. Полученный раствор моносахаридов использовали, как источник моносахаров на стадии ферментации при культивировании микроорганизмов. Проведение полного технологического процесса в пилотной установке подтвердило вышеописанные экспериментальные данные в примере 2. В частности, после окончания процесса гидролиза в присутствии комплекса ферментов содержание редуцирующих веществ увеличилось в 3,0 раза, т.е. количество углеводов было равно 5,0 г/л. В жидкой фазе методом газовой хромматографии были идентифицированы глюкоза, маноза, галактоза и фукоза. Все перечисленные углеводы хорошо утилизируются при росте микроорганизмами .

При использовании предлагаемого способа не образуются токсичные и вредные вещества, что делает данный способ безопасным и экологически чистым.

Применение материала, полученного данным способом, возможно для приготовления питательной среды для получения этанола, антибиотиков, ферментов и аминокислот, а также для получения пищевых и кормовых добавок.

При производстве биоэтанола из морских водорослей стоимость сырья снизится на 30%, если производство будет построено на берегу моря, где будут собираться водоросли (например, берег Баренцевого моря). Плантации водорослей в

Баренцевом море ориентировочно составляют 0,1 тыс. га, что обеспечит производство (90 х 200 = 18000 тыс. лит.) 18 млн. литров биотоплива. Сегодня стоимость биотоплива составляет 40-50 центов. При использовании моносахаридов, полученных из водорослей, составит 15-20 центов за литр. Внедрение данного способа позволит снизить стоимость бензина для автотранспорта в 1 ,5 - 2,0 раза.