Herstellungsverfahren von Produkten auf Kohlenstoffbasis aus Sekundär rohstoffen, welche pH-Stellmittel enthalten

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur fermentativen Umwandlung von mindestens ei nem Zellulose und/oder Hemizellulose enthaltenden Sekundärrohstoff in ein Produkt auf Kohlen stoffbasis, wobei der Sekundärrohstoff mindestens ein pH-Stellmittel enthält.

Hintergrund der Erfindung

Für die fermentative Produktion von Substanzen haben die verwendeten kultivierten Organismen meist einen begrenzten pH-Toleranzbereich mit einem pH-Optimum. Der pH-Wert wird meist über pH-Sensor gekoppelte Pumpen durch pH Stellmittel reguliert, die je nach Bedarf zur Ernied rigung des pH-Wertes Säuren wie Phosphorsäure (H3PO4], Salzsäure (HCl] und weitere oder zum Erhöhen des pH-Werts Laugen wie zum Beispiel Natronlauge (NaOH], Calciumhydroxyd (Ca(0H] ₂ ], und weitere in den Bioreaktor pumpen.

Zudem kann der pH-Wert einer Lösung durch Substanzen, welche ein hohes Säurebindungsver mögen aufweisen, d.h. Wasserstoffionen zu binden, in einem Bereich konstant gehalten werden. Als Beispiel ist hier die Substanz Calciumcarbonat (CaCOs] zu nennen, welche häufig in biotech nologischen Anwendungen, z.B. in der fermentativen Produktion von Milchsäure, eingesetzt wird.

Diese pH Stellmittel sind somit notwendig, um eine optimale fermentative Produktion von Sub stanzen zu ermöglichen.

PH-Stellmittel erzeugen jedoch für die fermentative Produktion von Substanzen Kosten für die Produktion, den Erwerb, den Transport und die Lagerung. Mit diesen Kosten gehen Belastungen für die Umwelt einher. So entsteht zum Beispiel durch den Transport der pH Stellmittel durch Verbrennungsmotoren zusätzliche Mengen von Kohlendioxyd. Durch die notwendige Lagerung von pH Stellmitteln werden Grundstücksflächen benötigt, wodurch sich die Versiegelung des Bo dens erhöht

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es unter anderem Verfahren bereitzustellen, die eine Re duzierung des Stellmittels ermöglichen. Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur fermentativen Umwandlung von mindestens ei nem nicht enzymatisch vorbehandelten Zellulose und/oder Hemizellulose enthaltenden Sekun därrohstoff in ein Produkt auf Kohlenstoffbasis, wobei der Sekundärrohstoff mindestens ein pH- Stellmittel enthält, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Sekundärrohstoffs mit ei nem Mikroorganismus für eine Zeitspanne bei einer Anfangstemperatur und einem anfänglichen pH-Wert, wodurch eine Menge an Milchsäure und/oder einem anderen auf Kohlenstoff-basierten Produkt erzeugt wird.

Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von bereits vorhandenen Stoffströmen in Fermentationsverfahren wie zum Beispiel dem Substrat (verwertbare Kohlen stoffquellen] als pH Stellmittel insgesamt oder Teile von pH Stellmitteln. Sekundärrohrstoffe kön nen somit neben der Nutzung als Kohlenstoffquelle für die fermentative Produktion von Substan zen (zum Beispiel Milchsäure] auch Stellmittel als Komponenten zur Einstellung des pH-Werts in dem Fermentationsverfahren direkt mit einbringen. So kann die Zugabe des pH Stellmittels wie zum Beispiel Calciumhydroxid im Verfahren reduziert oder ganz vermieden werden.

Überaschenderweise konnte festgestellt werden, dass beispielsweise unter der Verwendung von Papierschlämmen als Substrat eine effiziente Herstellung von Produkten auf Kohlenstoffbasis, insbesondere Milchsäure unter Einsatz von Mikroorganismen wie Caldicellulosiruptor und/oder Thermoanaerobacter möglich ist, wobei das pH Stellmittel, welches normalerweise äquimolar zur produzierten Milchsäure eingesetzt werden muss, in einer deutlich unteräquimolare Menge ein gesetztwerden bzw. sogar darauf verzichtet werden kann.

Beispielsweise können stellmittelhaltige Reststoffe aus der Papierherstellung, insbesondere Dein- kingschlämme, welche Zellulose und Hemizellulose als Polymere und Substrate enthalten, von Gruppen von Mikroorganismen, wie die Gruppe der Thermoanaerobacteriales (z.B. Caldicellulosi ruptor spec.], Clostridiales (z.B. Clostridium thermoceiium ] Milchsäure aus Zellulose und/oder He mizellulose produzieren.

Ferner kann eine Co-Kultur aus zwei Organismen der Gruppe der Thermoanaerobacteriales (z.B. Caldicellulosiruptor spec. und Thermoanaerobacter spec.] Stellmittelhaltige Reststoffe aus der Pa pierherstellung, insbesondere Deinkingsschlämme, welche Zellulose und Hemizellulose als Poly mere und Substrate enthalten, in Milchsäure überführen. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Beschrieben werden Verfahren/Prozesse zur fermentativen Umwandlung von mindestens einem nicht enzymatisch vorbehandelten Zellulose und/oder Hemizellulose enthaltenden Sekundärroh stoff in ein Produkt auf Kohlenstoffbasis, wobei der Sekundärrohstoff mindestens ein pH-Stellmit- tel enthält, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Sekundärrohstoffs mit einem Mik roorganismus für eine Zeitspanne, bei einer Anfangstemperatur und einem anfänglichen pH-Wert, wodurch eine Menge an Milchsäure und/oder einem anderen auf Kohlenstoff-basierten Produkt erzeugt wird.

Substrate in Fermentationsverfahren können organische Reinstoffe, organische Nebenprodukte und organische Sekundärrohstoffe sein.

• Als Reinstoff bezeichnet man in der Chemie einen Stoff, der einheitlich aus nur einer che mischen Verbindung oder einem chemischen Element zusammengesetzt ist

• Nebenprodukt nennt man traditionell alles, das bei der Herstellung eines (Haupt-] Pro dukts nebenbei und oft auch unerwünscht anfällt.

• Sekundärrohstoffe sind Rohstoffe, die durch Aufarbeitung (Recycling] aus entsorgtem Ma terial gewonnen werden. Sie dienen als Ausgangsstoffe für neue Produkte und unterschei den sich dadurch vom primären (aus der Natur gewonnenen] Rohstoff. Im Bereich der Nutzung nachwachsender Rohstoffe als Substrate betrifft dies vor allem Papier (Altpapier] und Holz (Altholz].

Substrate wie Reinstoffe oder Nebenprodukte z.B. aus der Landwirtschaft im Fermentationsver fahren mit Stellmittel gezielt zu versetzen ist wenig zielführend, weil dieses Verfahren eine auf wändige Vorbehandlung wie das Mischen des Substrates erforderlich macht und so das Verfahren kommerziell unattraktiv wird. Zudem wird hier durch das Verschneiden bzw. das Verdünnen des Substrates mit dem Stellmittel insgesamt höhere Mengen des Gemisches von Substrat und Stell mittel benötigt

Manche Sekundärrohstoffe (z. B. Deinkingreststoffe], welche die als Substrate nutzbare Polymere Hemizellulose und Zellulose aufweisen, stammen aus dem Papierrecycling.

Die vorliegende Erfindung richtet sich somit auf Verfahren zur fermentativen Umwandlung von mindestens einem nicht enzymatisch vorbehandelten Zellulose und/oder Hemizellulose enthal tenden Sekundärrohstoff in ein Produkt auf Kohlenstoffbasis, wobei der Sekundärrohstoff min- destens ein pH-Stellmittel enthält, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Sekundär rohstoffs mit einem Mikroorganismus für eine Zeitspanne, bei einer Anfangstemperatur und ei nem anfänglichen pH-Wert, wodurch eine Menge an Milchsäure und/oder einem anderen auf Kohlenstoff-basierten Produkt erzeugt wird.

Die mit dem hier vorliegenden Verfahren hergestellten Produkte auf Kohlenstoffbasis sind insbe sondere Carbonsäuren, vorzugsweise Milchsäure, oder ein Salz oder Ester davon.

Insbesondere werden unter Milchsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung Hydroxycarbonsäu- ren verstanden, die sowohl eine Carboxygruppe als auch eine Hydroxygruppe besitzen, und die insbesondere auch als 2-Hydroxypropionsäure bezeichnet werden. Ferner werden auch die nach den Nomenklaturempfehlungen der IUPAC als 2-Hydroxypropansäuren bezeichneten Hydro- xycarbonsäuren als Milchsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden. Ferner umfasst das vorliegenden Verfahren auch die Herstellung der Salze und Ester der Milchsäuren (Lactate]

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Produkt auf Kohlen stoffbasis ein Alkohol, vorzugsweise Ethanol, sein.

Sekundärrohstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise Reststoff aus der Pa pierherstellung, insbesondere Deinkingschlamm aus der Papierrecycling. Sekundärrohstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise Reststoff aus der Papierherstellung, insbe sondere Faserabfall, Faser-, Füller und Überzugsschlamm aus der mechanischen Abtrennung,

Sekundärrohstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise Reststoff aus der Pa pierherstellung, insbesondere Schlamm aus der Abwasserbehandlung aus der Papierproduktion,

Sekundärrohstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise Altpapier, insbesondere Verpackungspapier.

Sekundärrohstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Kunststoffe wie biologisch abbaubare Kunststoffe aus nachwachsenden Rohstoffen, insbesondere Kunststoffe auf Zellulosebasis mit Kompositanteil.

Die Deinkingreststoffe, sogenannte Deinkingschlämme, bestehen aus Füllstoffen (Calciumcarbo nat, Kaolin, Silikate], Faserstoffen (Zellulose, Hemizellulose und weiteren Polymeren], Extrakt- stoffen (Fette, lösliche Druckfarben- und Strichbindemittelbestandteile] sowie Feinstoffen (unlös liche Druckfarben- und Streichfarbenbestandteile, Klebstoffbestandteile]. Bei der Verwertung dieser Stoffe spielt die thermische Behandlung (Abfallverbrennung] eine zentrale Rolle. Fast alle Reststoffe der Papierindustrie fallen mit relativ niedrigen Feststoffgehalten an, bringen jedoch wegen des hohen Gehalts an organischen Komponenten in der Regel noch einen so hohen Heiz wert mit, dass sie ohne Stützfeuer brennen, also Energie gewonnen wird. Deshalb werden mehr als 55 % der Deinkingreststoffe als Ersatzbrennstoff in den eigenen Kraftwerken der Papierfabri ken oder extern verbrannt, um so Energie zu erzeugen. Die nicht brennbaren Bestandteile bleiben als (eventuell verwertbare] Asche, als Schlacke und als Filterstaub zurück.

Somit enthalten manche Sekundärrohstoffe, zum Beispiel alle Deinkingschlämme aus dem Papier- recycling bzw. alle Faserabfälle, Faser-, Füller- und Überzugsschlämme aus der menchanischen Abtrennung bereits das Stellmittel Calciumcarbonat

So können diese Sekundärrohrstoffe neben der Nutzung als Kohlenstoffquelle für die fermenta tive Produktion von Substanzen (zum Beispiel Milchsäure] auch Stehmittel als Komponenten zur Einstellung des pH-Werts in das Fermentationsverfahren direkt mit einbringen. So kann die Zu gabe des pH Stellmittels wie zum Beispiel Calciumhydroxid im Verfahren reduziert oder ganz ver mieden werden. So können die Produktionskosten gesenkt werden.

Derzeit werden viele Sekundärstoffe aus der Papierproduktion wie Deinkingschlämme aus der Papierrecycling und Faserabfälle, Faser-, Füller- und Überzugsschlämme aus der mechanischen Abtrennung verbrannt. Durch die Nutzung als pH-Stellmittel werden diese Rohstoffe nicht mehr der thermischen, sondern der stofflichen Nutzung überführt. Somit wird ein Umweltproblem durch die Verringerung des Kohlenstoffeintrags (als CO2] in die Atmosphäre reduziert .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden dem Verfahren neben dem im Sekundärrohstoff bereits enthaltenen pH-Stellmittel kein zusätzliches pH-Stellmittel oder nur pH-Stellmittel in unteräquimolarer Menge zur produzierten Milchsäure zugesetzt

Wie schon zuvor beschreiben ist das im Sekundärrohstoff enthaltene pH-Stellmittel beispiels weise CaCCU., wodurch der Prozess verbessert wird und durch den Prozess eine Kostenreduktion erfolgt Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur fer mentativen Umwandlung von mindestens einem nicht enzymatisch vorbehandelten Zellulose und/oder Hemizellulose enthaltenden Sekundärrohstoff in ein Produkt auf Kohlenstoffbasis, wo bei der Sekundärrohstoff mindestens ein pH-Stellmittel enthält.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden bei dem vor liegenden Verfahren keine oder niedrigere oder gleiche Aktivitäten von Zellulose- und/ oder He mizellulose abbauenden Enzymen dem Verfahren zugegeben, wie beispielsweise bei fermentati ven Verfahren bei gleichzeitiger enzymatischer Verzuckerung und Fermentation (simultaneously saccharification and fermentation (SSF]

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Verfah ren Hydrolasen wie Proteasen, Peptidasen, Phytasen, Glycosidasen; Cellulasen, Hemicellulasen o- der Kombinationen dieser zugegeben,

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Verfah ren Isomerase wie Racemasen, Epimerasen und Mutasen oder Kombinationen dieser zugegeben,

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Verfah ren Lyasen wie Aldolasen, Fumarasen oder Kombinationen dieser zugegeben,

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ferner der Zellu lose und/oder Hemizellulose enthaltende Sekundärrohstoff nicht vor dem Verfahren mit Zellu lose- und/ oder Hemizellulose abbauenden Enzymen vorbehandelt Bisher werden beispielsweise Papierschlämme mittels Cellulasen im Stand der Technik vorbehandelt.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören die im bean spruchten Verfahren verwendeten Mikroorgansimen zu der Gruppe der Thermoanaerobacteria- les, insbesondere zu der Gattung Caldicellulosiruptor, wie beispielsweise Mikroorgansimen aus Tabelle 1 oder zur Gattung Thermoanaerobacter, wie beispielsweise Mikroorgansimen aus Ta belle 2. Tabelle 1

Tabelle 2

Die in den Tabellen 1 und 2 aufgelisteten Stämme DIB004C, DIB041C, DIB087C, DIB101C, DIB103C, DIB104C, DIB107C DIB004G, DIB087G, DIB097X, DIB101G, DIB101X, DIB103X, DIB104X und DIB107X wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zu den mit geteilten Depositionsdaten bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell kulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter den oben genannten angemeldeten DSMZ - Zugangsnummern hinterlegt. Der Stamm Caldicellulosiruptor sp. Blu- ConL60 wurde am 29. August 2019 unter der Inventarnummer DSM 33252 gemäß den Anforde rungen des Budapester Vertrags bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul turen (DSMZ], Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE] von dem Unternehmen BluCon Bio- tech GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Köln (DE] hinterlegt

Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren bei denen der Mikroorganismus ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus DIB004C hinterlegt als DSM 25177, DIB041C hinterlegt als DSM 25771, DIB087C hinterlegt als DSM25772, DIB101C, hinterlegt als DSM 25178, DIB103C hinterlegt als DSM 25773, DIB104C hinterlegt als DSM 25774, BluConL60 hinterlegt als DSM 33252 und DIB107C hinterlegt als DSM 25775 ist

Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren bei denen der Mikroorganismus ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus DIB004G hinterlegt als DSM 25179, DIB101G hinterlegt als DSM 25180, DIB101X hinterlegt als DSM 25181, DIB097X hinterlegt als DSM 25308, DIB087G hinterlegt als DSM 25777, DIB103X hinterlegt als DSM 25776, DIB104X hinterlegt als DSM 25778 und DIB107X hinterlegt als DSM 25779 ist

Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren bei denen der Mikroorganismus in ei ner Co-Kultur enthaltend mindestens von zwei unterschiedlichen Mikroorgansimen der Gruppe der Thermoanaerobacteriales, insbesondere zu der Gattung Caldicellulosiruptor, wie beispiels weise Mikroorgansimen aus Tabelle 1 oder zur Gattung Thermoanaerobacter, wie beispielsweise Mikroorgansimen aus Tabelle 2.

Daher umfassen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch Verfahren, bei denen der Mikroorganismus und ein weiterer Mikroorganismus in Form einer Co-Kultur mit dem Sekundär rohstoff in Kontakt gebracht werden. Insbesondere kann der weitere Mikroorganismus ein Stamm aus Tabelle 1 oder Tabelle 2 sein.

In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wachsen und produzieren die Mikroorganismen, die in den Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, am ef fizientesten das Produkt auf Kohlenstoffbasis bei einer bestimmten Anfangstemperatur. In beson deren Ausführungsformen ist es ein Vorteil der Verfahren der vorliegenden Offenbarung, dass die Temperatur hoch sein kann, vorzugsweise höher als 60 ° C, bevorzugter 70 ° C und höher, bis eine maximale Temperatur von 90 ° C, vorzugsweise 80 ° C erreicht wird bevorzugter 75 ° C, da die verwendeten Mikroorganismen thermophil sind. Dies führt zu einem geringeren Kontaminations risiko und zu kürzeren Reaktionszeiten.

In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Zeitspanne etwa 10 Stunden bis etwa 300 Stunden beträgt In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Zeitspanne etwa 50 Stunden bis etwa 200 Stunden beträgt In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei der Zeitraum etwa 80 Stunden bis etwa 160 Stunden beträgt In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offen barung eines der oben genannten Verfahren, wobei die Zeitspanne etwa 80 Stunden, etwa 85 Stunden, etwa 90 Stunden, etwa 95 Stunden, etwa 100 Stunden, etwa 105 Stunden, etwa 110 Stun den, etwa 115 Stunden, etwa 120 Stunden, etwa 125 Stunden, etwa 130 Stunden, etwa 135 Stun den, etwa 140 Stunden, etwa 145 Stunden, etwa 150 Stunden, etwa 155 Stunden oder etwa 160 Stunden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Zeitspanne 70 h bis 120 h.

In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Zeitspanne etwa 120 Stunden beträgt. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Anfangstempe ratur etwa 45 ° C bis etwa 80 ° C beträgt. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Anfangstemperatur etwa 65 ° C bis etwa 80 ° C beträgt In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei die Anfangstemperatur etwa 70 ° C bis etwa 75 ° C beträgt. In be stimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfah ren, wobei die Anfangstemperatur etwa 72 ° C beträgt.

In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung irgendeines der oben genannten Ver fahren, wobei der anfängliche pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 9 liegt. In bestimmten Ausfüh rungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei der an fängliche pH-Wert zwischen etwa 6 und etwa 8 liegt. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung ein beliebiges der oben genannten Verfahren, wobei der anfängliche pH-Wert etwa 5, etwa 5,5, etwa 6, etwa 6,5, etwa 7, etwa 7,5, etwa 8 ist B. etwa 8,5 oder etwa 9 ist. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Offenbarung irgendeines der oben erwähnten Ver fahren, wobei der anfängliche pH ungefähr 6, ungefähr 6,5, ungefähr 7, ungefähr 7,5 oder ungefähr 8 ist.

In einer besonderen Ausführungsform liegt die Anfangstemperatur bei 65 ° C bis 80 ° C, die Zeit spanne bei 120 Stunden oder länger und der anfängliche pH-Wert zwischen 6 und 8.

Im Folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens an hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.

Ausführungsbeispiel 1:

Mit diesem Ausführungsbeispiel zur fermentativen Produktion von Milchsäure durch Caldicellu- losiruptor spec. DIB104C wurde gezeigt, dass die mikrobielle Substratverwertung von Deinking- schlamm-Flotat- Suspensionen als Beispiel für einen hemicellulose- und zellulosehaltigen Sekun därrohstoff aus der Papierindustrie, welches das Stellmittel CaCCH enthält, im Vergleich zu Zellu lose als Reinstoff (Avicel] ohne das Stellmittel CaCCH, zu einer Reduktion des zugegebenen (exter nen] alkalischen Stellmittels führte.

Dies ist darauf zurückzuführen, dass im zellulosehaltigen Deinkingschlamm-Flotat bereits das Stellmittel, in diesem Fall CaCCH, enthalten war.

Das Stellmittel muss somit nicht oder nur in einem viel geringeren Maße hergestellt und trans portiert werden. Hierdurch wird das Verfahren umweltfreundlicher und kostengünstiger, weil das Stellmittel entweder nicht oder aber in einem viel geringeren Maße dem Verfahren zugefügt werden muss. al) Spezifikation von Deinkingschlamm-Flotat-

Ergebnis der Analyse von Deinkingschlamm-Flotat (Trockensubstanz 70,1%]. Nach Sluiter et al, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Laboratory Analytical Proce- dure (LAP] Issue Date: April 2008. Revision Date July 2011 (Version 07-08-2011] Analyse von Xylose und Glucose nach Hydrolyse enzymatisch mit D-Xylose Assay Kit (K-XYLOSE] und D-Glu- cose HK Assay Kit (K-GLUHK-220A] der FA. Megazyme, Irland.

a2 ) Spezifikation von Avicel PH-101 (Zellulosereinstoff), 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCBW4188.

Avicel PH-101 (Zellulosereinstoff] von Sigma Aldrich mit der Batchnummer BCBW4188 hat ein Trockengewicht von 95,5% (siehe Analysenzertifikat (CoA] von Sigma-Aldrich] b) Berechnung der CaC0 ₃ Menge im Deinkingschlamm-Flotat

Im Deinkingschlamm-Flotat sind 183,98g Ca / kg Trockengewicht (=18,39%] enthalten. Dies sind 4,6 mol Ca / kg Trockengewicht (Molekulargewicht Calcium 40] Sind äquimolar 4,6 mol CO ₃ (Mo lekulargewicht Carbonat 60] enthalten, sind dies 275,97 g C03 / kg Trockengewicht. Insgesamt sind so 459,95 g Calciumcarbonat / kg Trockengewicht enthalten. Der Wert 46g CaCCH / 100 g Trockengewicht im Deinkingschlamm-Flotat wurde für die Abrechnungen verwendet c) Herstellung von trockenem Deinkingschlamm-Flotat

Ca. 300 g Deinkingschlamm-Flotat mit 70,07% Trockengewicht wurde 4 Tage bei 70°C getrocknet Das getrocknete Deinkingschlamm Flotat wurde im Anschluss mit einer Kaffeemühle (Clatronic KSW3306] für 10 Sekunden vermahlen. d) Kultivierungen

dl) Kultivierungsansätze

Alle Kultivierungen wurden im Dreifachansatz in Serumflaschen mit je HOmL Volumen durchge führt:

• Kultivierungen in Ansätzen la-c: Es wurde getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (mit in ternem CaC03 als Stellmittel] als Substrat verwendet

• Kultivierungen im Ansätzen 2a-c: Es wurde Zellulose als Reinstoff, Avicel PH-101 als Sub stratverwendet

• Kultivierungen im Ansatz 3a-c: Es wurde Zellulose als Reinstoff, Avicel PH-101 und CaCCH als externes (zugegebenes] Stellmittel verwendet. d2) Zugabe von Substrat und Stellmittel

In leeren Serumflaschen mit 110 mL Volumen wurden zugegeben:

• Ansätze la-c jeweils 1,5 g getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (mit internem CaCCH als Stellmittel]

• Ansätze 2a-c jeweils 0,16 g Avicel PH-101, 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCBW4188].

• Ansätze 3a-c jeweils 0,16 g Avicel PH-101, 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCBW4188] und 0,7 g CaC03 (Fa. Roth, P013.2 Batchnummer 137253672 als Stellmittel verwendet. d3) Herstellung der Resazurinstocklösung:

Resazurin ist ein Indikator, der für Redoxreaktionen eingesetzt wird. Im nicht reduzierten Zu stand ist die Lösung blau gefärbt, unter anaeroben Bedingungen bei Zusatz von L-Cystein wird die Lösung farblos. Konzentration/Resazurin:

50 mg/50 ml VE-H2O, Lagerung bei +4°C. Resazurin, Na-Salt, Fa. Acros 418900050 d4) Herstellung der Spurenelemente-Stammlösung:

Nach Zugabe der Salzkomponenten hat die Spurenelementlösung einen pH-Wert von ca. 4,8. Zur Lösung aller Salze erfolgt eine Zugabe von HCL, 32% (Roth X896.1], in einem Volumen von 1 ml/1 Spurenelementlösung, wodurch der pH-Wert dann auf 3,2 sinkt d5) Herstellung des Basismediums

d6) Herstellung der Kultivierungsmedien /Kultivierungsansätze

• Nach Herstellung des Basismedium (s.o.] wurde der pH-Wert auf 6,5 (bei 23°C] mit 5 N NaOH eingestellt

• Unter Rühren wird 20 Minuten mit N begast Nach dem Begasen erfolgt die Zugabe von 0,5 g L-Cystein pro Liter Medium.

• Unter N Begasung 30 ml Medium unter Stickstoffzufuhr in Serumflaschen mit Substrat und Stellmittel (s.o.] dosieren. Serumflaschen mit schwarzem Butylgummistopfen und Aluminiumverschluss verschließen und für 20 Minuten bei 121°C und 1 bar Überdruck autoklavieren.

In den Kultivierungsansätzen sind somit folgende verwertbare Substrate als Polymere Cellulose und Xylan, jeweils als Glucose- und Xyloseäquivalent berechnet, und Stellmittel enthalten:

• Ansätze la-c jeweils 47,6 g/1 getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (enthält 21,9 g/1 CaCCU als Stellmittel] mit den Substraten 19,4 mM Glucoseäquivalenten, 3,8 mM Xylos- äquivalenten aus welchen maximal 45,4 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] ent stehen könnten.

• Ansätze 2a-c jeweils 5,08 g/1 Avicel ohne Stellmittel, mit dem Substrat 31,4 mM Glu coseäquivalenten, aus welchem maximal 62,7 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] entstehen könnten.

• Ansätze 3a-c jeweils 5,08g/l Avicel mit 22,2 g/1 CaCCU Stellmittel mit dem Substrat 31,4 mM Glucoseäquivalenten, aus welchem maximal 62,7 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] entstehen könnten. d7) Herstellung einer Vorkultur

100 ml Basismedium für Vorkulturen wurden mit 10 g/1 Avicel und 0,5 g/1 L-Cystein in 250 ml Serumflaschen, wie oben dargestellt, hergestellt.

Das Vorkulturmedium wurde mit 8 mL einer Working Cell Bank (Lagerung bei -30°C] von Cal- dicellulosiruptor spec. DIB104C angeimpft und für 24 h bei 70°C bei 130 rpm im Schüttelinkubator kultiviert. d8 Animpfen der Kultivierungsansätze und Probenahme

Die Kultivierungsansätze la-c, 2a-c und 3a-c wurden mit 1,5 ml der Vorkultur angeimpft und 5 Tage bei 70°C ohne Schütteln inkubiert d9) Probenahme

Aus den Kultivierungsansätzen wurden 2 ml Proben steril gezogen der pH-Wert mit einem pH Meter (Fa. inoLab] bestimmt und im Anschluss in ein Mikroreaktionsgefäß überführt und bei 16.000 g abzentrifugiert. Die Überstande wurden jeweils mit einer Pipette abgenommen und in ein neues Mikroreaktionsgefäß überführt dlO) Analysen der Überstände

Die Überstände wurden mit gleichen Volumina 1,5M HCl verdünnt und jeweils in ein HPLC Vial (1.5mL KGW Flasche Braun 1 VWR ArtikelNr. 548-0030] mit Deckel (9mm PP KGW-Kappe Rot Loch PTFE VIRG 53° VWR ArtikelNr. 548-0839] überführt. 30m1 der Probe wurde in eine HPLC Anlage (Shimadzu LabSolutions; Software: LabSolutions; Pumpe: LC-20AD; Auto-Sampler: SIL- 20AC; Ofen CTO-20Aund RI Detector: RID-20A] mit einer Rezex ROA-OrganicAcid H+ (8%]-HPLC Säule der Fa. Phenomenexund Verwendung einer Vorsäule Carbo-H4x3.0mm AJ0-4490 sowie der SecurityGuard Guard Cartridge Kit KJO-4282 injiziert. Die Konzentration von Milchsäure wurde anhand einer Referenzeichreihe mit Natrium L-Milchsäure bestimmt (der Fa. Applichem A1004,0100] 60, 30, 15, 7,5 und 3,25 g/1 Natrium L-Milchsäure, was 46,6; 23,3; 11,65; 5,83 und 2,913 g/l-Milchsäure ist Die ermittelten Konzentrationen von Milchsäure wurde von g/1 in mM umgerechnet e) Ergebnisse der Proben nach 5 tägiger Kultivierung

Die bestimmten pH-Werte sind in Tabelle 3 dargestellt:

Tabelle 3. Ergebnisse der Bestimmung der pH-Werte der Kulturen nach 5-tägiger Kultivierung.

Das Ergebnis zeigte, dass ohne die Zugabe eines Stellmittels der pH-Wert unter pH 5 sank (Ansätze 2a - 2c] Dies ist der pH Bereich, in dem Caldicellulosiruptor spec. DIB104C nicht mehr physiolo gisch aktiv ist.

In Gegenwart eines Stellmittels, welches entweder bereits im Sekundärrohstoff im Deinking- schlamm Flotat (enthält CaCCH als Stellmittel] enthalten war oder extern als CaCCH zugegeben wurde, wurde dagegen der pH-Wert im physiologischen Bereich (pH zwischen pH 6 und pH 8] für Caldicellulosiruptor spec. DIB104C gehalten (Ansätze la - lc und 3a - 3c]

Die Zugabe eines Stellmittels, entweder extern als CaCCH oder als Bestandteil des hemizellulose- und zellulosehaltigen Sekundärrohstoffs aus der Papierindustrie, war somit notwendig, um den für Caldicellulosiruptor spec. DIB104C physiologischen Bereich (pH zwischen pH 6 und pH 8] ein zustellen.

Die bestimmten Milchsäurekonzentrationen sind in Tabelle 4 dargestellt:

Tabelle 4. Ergebnisse der Bestimmung der Milchsäure in zellfreien Überständen der Kulturen nach 5-tägiger Kultivierung.

Das Ergebnis zeigte, dass ohne die Zugabe eines Stellmittels die Milchsäurekonzentration durch schnittlich bei 5,70 mM (Ansätze 2a - 2c] lag.

In Gegenwart eines Stellmittels, welches entweder bereits im Sekundärrohstoff im Deinking- schlamm Flotat (enthält CaCCH als Stellmittel] enthalten war oder extern als CaCCH zugegeben wurde, wurde dagegen eine durchschnittliche Milchsäurekonzentration von 12,58 mM im Dein- kingschlamm Flotat (Ansätze la - lc] bzw. mit CaCCU (extern zugegeben] eine höhere Milchsäu rekonzentration als 12 mM erreicht. Das sind mehr als die doppelten Konzentrationen, welche ohne Stellmittel erreicht wurden.

Die Zugabe eines Stellmittels führte somit als Konsequenz der Einstellung des pH-Wertes durch das Stellmittel, in den für Caldicellulosiruptor spec. DIB104C physiologischen pH-Bereich und zu einer Erhöhung der Milchsäurekonzentration. Die Zugabe des Stellmittels ist somit notwendig für eine effiziente Produktion von Milchsäure.

Sowohl die Zugabe des Stellmittels extern zum Substrat Avicel als auch die Verwendung von ei nem Substrat, Deinkingschlamm-Flotat, welches bereits das Stellmittel enthält, führten zu einer Erhöhung der Milchsäurekonzentration. Somit war es im vorliegendem Beispiel vorteilhaft das Substrat, Deinkingschlamm-Flotat, welches bereits das Stellmittel enthält, zu verwenden, weil dies zu einer zu einer Reduktion des extern zugegebenen Stellmittels CaCCU führte.

Das extern zugegebene Stellmittel musste somit nicht oder nur in einem viel geringeren Maße hergestellt und transportiert werden. Hierdurch wird das Verfahren umweltfreundlicher und kos tengünstiger, weil das Stellmittel entweder nicht oder aber in einem viel geringeren Maße dem Verfahren zugefügt werden muss.

Ausführungsbeispiel 2:

Im Ausführungsbeispiel 2 wurde der Mikroorganismus Caldicellulosiruptor sp. Stamm BluConL60, welcher am 29. August 2019 unter der Inventarnummer DSM 33252 gemäß den Anforderungen des Budapester Vertrags bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ], Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE] von dem Unternehmen BluCon Biotech GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Köln (DE] hinterlegt wurde, verwendet.

Mit diesem Ausführungsbeispiel zur fermentativen Produktion von Milchsäure durch Caldicellu losiruptor sp. Stamm BluConL60 wurde gezeigt, dass die mikrobielle Substratverwertung von Deinkingschlamm-Flotat- Suspensionen als Beispiel für einen hemicellulose- und zellulosehalti gen Sekundärrohstoff aus der Papierindustrie, welches das Stellmittel CaCCU enthält, im Vergleich zu Zellulose als Reinstoff (Avicel] ohne das Stellmittel CaCCU, zu einer Reduktion des zugegebenen (externen] alkalischen Stellmittels führte.

Dies ist darauf zurückzuführen, dass im zellulosehaltigen Deinkingschlamm-Flotat bereits das Stellmittel, in diesem Fall CaCCU, enthalten war. Das Stellmittel muss somit nicht oder nur in einem viel geringeren Maße hergestellt und transportiert werden. Hierdurch wird das Verfahren um weltfreundlicher und kostengünstiger, weil das Stellmittel entweder nicht oder aber in einem viel geringeren Maße dem Verfahren zugefügt werden muss.

al) Spezifikation von Deinkingschlamm-Flotat-

Ergebnis der Analyse von Deinkingschlamm-Flotat (Trockensubstanz 70,1%]· Nach Sluiter et al, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Laboratory Analytical Proce- dure (LAP] Issue Date: April 2008. Revision Date July 2011 (Version 07-08-2011] Analyse von Xylose und Glucose nach Hydrolyse enzymatisch mit D-Xylose Assay Kit (K-XYLOSE] und D-Glu- cose HK Assay Kit (K-GLUHK-220A] der FA. Megazyme, Irland.

a2 ) Spezifikation von Avicel PH-101 (Zellulosereinstoff), 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCCB8451.

Avicel PH-101 (Zellulosereinstoff] von Sigma Aldrich (Produktnummer 11365] mit der Batch nummer BCCB8451hat ein Trockengewicht von 96% (siehe Analysenzertifikat (CoA] von Sigma- Aldrich] b) Berechnung der CaC0 ₃ Menge im Deinkingschlamm-Flotat

Im Deinkingschlamm-Flotat sind 183,98g Ca / kg Trockengewicht (=18,39%] enthalten. Dies sind 4,6 mol Ca / kg Trockengewicht (Molekulargewicht Calcium 40] Sind äquimolar 4,6 mol CO ₃ (Mo lekulargewicht Carbonat 60] enthalten, sind dies 275,97 g C03 / kg Trockengewicht. Insgesamt sind so 459,95 g Calciumcarbonat / kg Trockengewicht enthalten. Der Wert 46g CaCCH / 100 g Trockengewicht im Deinkingschlamm-Flotat wurde für die Abrechnungen verwendet c) Herstellung von trockenem Deinkingschlamm-Flotat

Ca. 300 g Deinkingschlamm-Flotat mit 70,07% Trockengewicht wurde 4 Tage bei 70°C getrocknet Das getrocknete Deinkingschlamm Flotat wurde im Anschluss mit einer Kaffeemühle (Clatronic KSW3306] für 10 Sekunden vermahlen. d) Kultivierungen

dl) Kultivierungsansätze

Alle Kultivierungen wurden im Dreifachansatz in Serumflaschen mit je HOmL Volumen durchge führt:

• Kultivierungen in Ansätzen la-c: Es wurde getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (mit in ternem CaC03 als Stellmittel] als Substrat verwendet

• Kultivierungen im Ansätzen 2a-c: Es wurde Zellulose als Reinstoff, Avicel PH-101 als Sub stratverwendet

• Kultivierungen im Ansatz 3a-c: Es wurde Zellulose als Reinstoff, Avicel PH-101 und CaCCH als externes (zugegebenes] Stellmittel verwendet d2) Zugabe von Substrat und Stellmittel

In leeren Serumflaschen mit 110 mL Volumen wurden zugegeben:

• Ansätze la-c jeweils 1,5 g getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (mit internem CaCCH als Stellmittel]

• Ansätze 2a-c jeweils 0,16 g Avicel PH-101, 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCCB8451]

• Ansätze 3a-c jeweils 0,16 g Avicel PH-101, 11365, Fa. Sigma-Aldrich, Batchnummer BCCB8451] und 0,7 g CaC03 (Fa. Acros Organics, 450680010] als Stellmittel verwendet

Alle Flaschen mit den Ansätzen la-c, 2a-c und 3a-c wurden jeweils etwa 20 Sekunden unter Stick stoffzufuhr begast, im Anschluss jeweils mit einem Butylgummistopfen verschlossen und dann für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert d3) Herstellung der Resazurinstocklösung:

Resazurin ist ein Indikator, der für Redoxreaktionen eingesetzt wird. Im nicht reduzierten Zu stand ist die Lösung blau gefärbt, unter anaeroben Bedingungen bei Zusatz von L-Cystein (Fa. Roth 1693.3] wird die Lösung farblos. Konzentration/Resazurin:

50 mg/50 ml VE-H2O, Lagerung bei +4°C. Resazurin, Na-Salt, Fa. Acros Organics 418900050 d4) Herstellung der Spurenelemente-Stammlösung:

Nach Zugabe der Salzkomponenten hat die Spurenelementlösung einen pH-Wert von ca. 4,8. Zur Lösung aller Salze erfolgt eine Zugabe von HCL, 32% (Roth X896.1], in einem Volumen von 1 ml/1 Spurenelementlösung, wodurch der pH-Wert dann auf 3,2 sinkt

d5) Herstellung der Vitamin-Stammlösung:

Alle Komponenten werden in 1 Liter entionisiertem Wasser gemischt; Die Vitaminstammlösung ist aufgrund von Riboflavin trüb. Die Lösung wird unter Verwendung eines Filters mit einer Po rengröße von 0,2 um steril filtriert. Die Stammlösung ist dann transparent. Die Lagerung der Vi taminstammlösung erfolgt bei +4 ° C. D6) Herstellung des Basismediums

d7) Herstellung der Kultivierungsmedien /Kultivierungsansätze

• Nach Herstellung hat das Basismedium (s.o.] einen pH-Wert von 6,38.

• Unter Rühren wird 20 Minuten mit N2 begast Nach dem Begasen erfolgt die Zugabe von 0,5 g L-Cystein pro Liter Medium.

• Nach Zugabe von L-Cystein hat das Medium einen pH-Wert von 6,53.

• Unter N2 Begasung 30 ml Medium unter Stickstoffzufuhr in Serumflaschen mit Substrat und Stellmittel (s.o.] dosieren. Serumflaschen mit schwarzem Butylgummistopfen und Aluminiumverschluss verschließen und für 20 Minuten bei 121°C und 1 bar Überdruck autoklavieren.

In den Kultivierungsansätzen sind somit folgende verwertbare Substrate als Polymere Cellulose und Xylan, jeweils als Glucose- und Xyloseäquivalent berechnet, und Stellmittel enthalten:

• Ansätze la-c jeweils 47,6 g/1 getrocknetes Deinkingschlamm Flotat (enthält 21,9 g/1 CaCÜ3 als Stellmittel] mit den Substraten 19,4 mM Glucoseäquivalenten, 3,8 mM Xylos- äquivalenten aus welchen maximal 45,4 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] ent stehen könnten.

• Ansätze 2a-c jeweils 5,08 g/1 Avicel ohne Stellmittel, mit dem Substrat 31,4 mM Glu coseäquivalenten, aus welchem maximal 62,7 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] entstehen könnten. • Ansätze 3a-c jeweils 5,08g/l Avicel mit 22,2 g/1 CaCÜ ₃ Stellmittel mit dem Substrat 31,4 mM Glucoseäquivalenten, aus welchem maximal 62,7 mM Produkte (wie Milchsäure und andere] entstehen könnten. d8 Herstellung einer Vorkultur

100 ml Basismedium für Vorkulturen wurden mit 10 g/1 Avicel und 0,5 g/1 L-Cystein in 250 ml Serumflaschen, wie oben dargestellt, hergestellt

Das Vorkulturmedium wurde mit 8 mL einer Working Cell Bank (Lagerung bei ca. -30°C] Caldicel- lulosiruptor sp. Stamm BluConL60 angeimpft und für 24 h bei 70°C bei 130 rpm im Schüttelinku bator kultiviert. d9) Animpfen der Kultivierungsansätze und Probenahme

Die Kultivierungsansätze la-c, 2a-c und 3a-c wurden mit 1,5 ml der Vorkultur angeimpft und 11 Tage bei 70°C ohne Schütteln inkubiert dlO ) Probenahme

Aus den Kultivierungsansätzen wurden nach 5 und nach 11 Tagen 2 ml Proben steril gezogen der pH-Wert mit einem pH Meter (Fa. inoLab] bestimmtund im Anschluss in ein Mikroreaktionsgefäß überführt und bei 16.000 g abzentrifugiert Die Überstande wurden jeweils mit einer Pipette ab genommen und in ein neues Mikroreaktionsgefäß überführt dll) Analysen der Überstände

Die Überstände wurden mit gleichen Volumina 2,5 mM H ₂ SO ₄ verdünnt und jeweils in ein HPLC Vial (1.5mL KGW Flasche Braun 1 VWR ArtikelNr. 548-0030] mit Deckel (9mm PP KGW-Kappe Rot Loch PTFE VIRG 53° VWR ArtikelNr. 548-0839] überführt. 30m1 der Probe wurde in eine HPLC Anlage (Shimadzu LabSolutions; Software: LabSolutions; Pumpe: LC-20AD; Auto-Sampler: SIL- 20AC; Ofen CTO-20Aund RI Detector: RID-20A] mit einer Rezex ROA-OrganicAcid H+ (8%]-HPLC Säule der Fa. Phenomenex und Verwendung einer Vorsäule Carbo-H4x3.0mm AJ0-4490 sowie der SecurityGuard Guard Cartridge Kit KJO-4282 injiziert. Die Konzentration von Milchsäure wurde anhand einer Referenzeichreihe mit Natrium L-Milchsäure bestimmt (der Fa. Applichem A1004,0100] 60, 30, 15, 7,5 und 3,25 g/1 Natrium L-Milchsäure, was 46,6; 23,3; 11,65; 5,83 und 2,913 g/l-Milchsäure ist Die ermittelten Konzentrationen von Milchsäure wurde von g/1 in mM umgerechnet e) Ergebnisse der Proben nach 5 tägiger und 11-tägiger Kultivierung

Die bestimmten pH-Werte sind in Tabelle 5 dargestellt: Tabelle 5. Ergebnisse der Bestimmung der pH-Werte der Kulturen nach 5-tägiger und 11- tägiger Kultivierung.

Das Ergebnis zeigte, dass ohne die Zugabe eines Stellmittels der pH-Wert unter pH 5.1 sank (An sätze 2a - 2c] Dies ist der pH Bereich, in dem Caldicellulosiruptor sp. Stamm BluConL60 nicht mehr physiologisch aktiv ist

In Gegenwart eines Stellmittels, welches entweder bereits im Sekundärrohstoff im Deinking- schlamm Flotat (enthält CaCCH als Stellmittel] enthalten war oder extern als CaCCH zugegeben wurde, wurde dagegen der pH-Wert im physiologischen Bereich (pH zwischen pH 6 und pH 8] für Caldicellulosiruptor sp. Stamm BluConL60 gehalten (Ansätze la - lc und 3a - 3c]

Die Zugabe eines Stellmittels, entweder extern als CaCCH oder als Bestandteil des hemizellulose- und zellulosehaltigen Sekundärrohstoffs aus der Papierindustrie, war somit notwendig, um den für Caldicellulosiruptor sp. Stamm BluConL60 physiologischen Bereich (pH zwischen pH 6 und pH 8] einzustellen.

Die bestimmten Milchsäurekonzentrationen sind in Tabelle 6 dargestellt:

Tabelle 6. Ergebnisse der Bestimmung der Milchsäure in zellfreien Überständen der Kulturen nach 5-tägiger und 11-tägiger Kultivierung.

Das Ergebnis zeigte, dass ohne die Zugabe eines Stellmittels die Milchsäurekonzentration durch schnittlich bei 7,00 mM nach 5 Tagen und 7,37 mM nach 11 Tagen (Ansätze 2a - 2c] lag.

In Gegenwart eines Stellmittels, welches entweder bereits im Sekundärrohstoff im Deinking- schlamm Flotat (enthält CaC0 ₃ als Stellmittel] enthalten war oder extern als CaC0 ₃ zugegeben wurde, wurde dagegen eine durchschnittliche Milchsäurekonzentration von 9,73 mM nach 5 Ta gen bzw. 20,18 mM nach 11 Tagen im Deinkingschlamm Flotat (Ansätze la - lc] bzw. mit CaC0 ₃ (extern zugegeben] eine höhere Milchsäurekonzentration als 20 mM nach 5 und 11 Tagen erreicht (Ansätze 3a bis 3c] Das sind mehr als die doppelten Konzentrationen, welche ohne Stellmittel erreicht wurden.

Die Zugabe eines Stellmittels führte somit als Konsequenz der Einstellung des pH-Wertes durch das Stellmittel, in den für Caldicellulosiruptor sp. Stamm BluConL60 physiologischen pH-Bereich und zu einer Erhöhung der Milchsäurekonzentration. Die Zugabe des Stellmittels ist somit not wendig für eine effiziente Produktion von Milchsäure.

Sowohl die Zugabe des Stellmittels extern zum Substrat Avicel als auch die Verwendung von ei nem Substrat, Deinkingschlamm-Flotat, welches bereits das Stellmittel enthält, führten zu einer Erhöhung der Milchsäurekonzentration.

Somit war es im vorliegendem Beispiel vorteilhaft das Substrat, Deinkingschlamm-Flotat, welches bereits das Stellmittel enthält, zu verwenden, weil dies zu einer zu einer Reduktion des extern zugegebenen Stellmittels CaCCH führte.

Das extern zugegebene Stellmittel musste somit nicht oder nur in einem viel geringeren Maße hergestellt und transportiert werden. Hierdurch wird das Verfahren umweltfreundlicher und kos tengünstiger, weil das Stellmittel entweder nicht oder aber in einem viel geringeren Maße dem Verfahren zugefügt werden muss.